Eines per al diagnòstic i l'estudi de les malalties mitocondrials

30

Per a poder transferir els mitocondris d'unpacient a les cèl∙lules ρ°, cal primer eliminar elnucli de les cèl∙lules obtingudes del pacient —és a

dir, generar citoplasts. Si els cíbrids es preparen apartir de plaquetes, aquest pas no és necessari.Sovint s'utilitzen fibroblasts extrets de biòpsia de

���������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������

�������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������

143B Tk-

cèl∙ lula delpacient

BrEt

������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������

ρ°ρ°ρ°ρ°

citocalasina B+

centrifugació

FUSIÓ

������������������������������������������������

���������������������������������������������������

���������������������������������������������

��������������������������������������������������������������������������������������������������������������������

���������������������������������������������������������

citoplast

transmitocondrial

��������������������������������

��������������������������������������������������� ����������������

������������������������������������������������

��������������������������������������������������������������������������������������������������������

��������������������������������

híbridρ°ρ°ρ°ρ°donadora

medi selectiu

FIGURA 9. GENERACIÓ DE LÍNIES CEL∙LULARS TRANSMITOCONDRIALS.Vegeu l'explicació en el text.

Mitocondri i malaltia INTRODUCCIÓ

31

pell. Els nuclis s'eliminen mitjançant untractament amb citocalasina B seguit decentrifugació de la placa amb les cèl∙lules "capper avall" (es força la sortida del nucli a través dela membrana cel∙lular), però sempre quedenalgunes cèl∙lules amb nucli que poden fusionar-seamb les ρ°. Tant si es fusionen com si no, s'aniranperdent progressivament a causa de la presènciade bromodesoxiuridina al medi selectiu.

La fusió entre els citoplasts i les cèl∙lules ρ° espot fer per microinjecció o, més freqüentment,amb polietileneglicol en un excés de cèl∙lules ρ°.Els cíbrids transmitocondrials se seleccionen ambla utilització d'un medi selectiu amb bromo-desoxiuridina i sense uridina ni piruvat. Les altrescèl∙lules presents després de la fusió (ρ°, cèl∙lulesdel pacient no enucleades, híbrids ρ°-cèl∙lules noenucleades) moriran perquè no podran créixer enel medi selectiu. Els cíbrids resultants tindranproporcions variables de molècules de mtDNAmutant, i caldrà separar els clons diferents ideterminar el grau d'heteroplàsmia de cadascun.Algunes setmanes després de la fusió es podeniniciar els estudis bioquímics i genètics per acaracteritzar els cíbrids. Si es detecten alteracions,aquestes seran conseqüència de problemes alsmitocondris del pacient, i si els cíbrids mostren unfenotip normal això serà indicatiu que l'origendels símptomes del pacient són nuclears.

TRACTAMENT DE LES MALALTIESMITOCONDRIALS

Les dades sobre la prevalença de les malaltiesmitocondrials són molt escasses. Existeix alguntreball que calcula la prevalença de mutacionsconcretes al mtDNA però manquen estimacionsmés generals. En aquest sentit l'any 2000Chinnery et al. determinaren que 12,5 de cada100.000 individus (tant adults com nens) patienalguna malaltia causada per mutacions al mtDNAo tenien risc de patir-la (Chinnery 2000a). Aquestsinvestigadors opinen que les mutacionspatogèniques al mtDNA són una causa freqüentde morbiditat crònica. És molt probable que lesmalalties mitocondrials representin una de lescategories diagnòstiques més grans dins de lesmalalties neurogenètiques en adults.

Malauradament, encara no es disposa deteràpies efectives per a guarir les malaltiesmitocondrials. El tractament aplicat als pacients esbasa majoritàriament en teràpies d'ajuda, com potser la cirurgia en casos de ptosi i cataractes, o lacol∙locació de marcapassos en malalts ambdeficiències cardíaques. En alguns casos s'han

utilitzat substàncies antioxidants per a intentarevitar l'increment de radicals lliures que semblaexistir en diverses malalties mitocondrials.L'ubiquinona s'ha fet servir amb resultats positiusen alguns pacients amb MELAS i KSS, peròmanquen estudis clínics més generals quedemostrin la seva eficàcia. Altres tractaments hanconsistit a administrar compostos que desfan elbloqueig a la CRM causat per un defecte a algundels complexos enzimàtics. Les vitamines C i E, elsuccinat, la riboflavina, i la nicotinamida en sónexemples.

A banda d'aquestes aproximacions farmaco-lògiques s'han seguit altres estratègies amb efectedirecte sobre el mtDNA. Taylor et al. sintetitzarenàcids nucleics peptídics (PNA) amb la intenciód'inhibir selectivament la replicació del mtDNAmutant (Taylor 1997). Els PNA són complemen-taris a seqüències de mtDNA humanes quecontenen una mutació puntual o el punt detrencament d'una deleció. En experiments lliuresde cèl∙lules van funcionar, és a dir, es va inhibir lareplicació del mtDNA mutant però no la delmtDNA salvatge. Per tal d'introduir el PNA dinsdels mitocondris de cèl∙lules en cultiu s'haconjugat aquesta molècula al catió trifenilfosfoni,un catió lipofílic (Muratovska 2001). Si bé s'haaconseguit la introducció de la molècula almitocondri, la proporció de mtDNAmutant/mtDNA salvatge en cultius de fibroblasts omioblasts no varia després de 30 dies d'incubacióen un excés molar de ph-PNA, probablementperquè el PNA lligat al mtDNA de cadena senzillaés desplaçat per la maquinària replicativa o béperquè els PNA no hibriden amb mtDNA decadena senzilla durant la replicació. Actualments'intenta el disseny de PNA que hibridin a mtDNAde doble cadena per a formar una triple hèlixestable.

En alguns pacients amb mutacions hetero-plàsmiques al mtDNA s'ha vist que mentre elpercentatge de molècules mutants és elevat a lesfibres musculars, a les cèl∙lules satèl∙lit que lesacompanyen és baix o insignificant. Aquestescèl∙lules romanen inactives fins que sónrequerides per al creixement o reparaciómusculars. L'any 1997 es va provar d'aprofitar lapresència de cèl∙lules satèl∙lit sense mtDNAmutant al múscul d'un pacient KSS quepresentava una mutació puntual a un dels genspels tRNA a les fibres musculars. A aquest pacientse li van practicar dues biòpsies a la mateixa zonadel bíceps dret en un interval de temps de tresmesos. La primera va mostrar que la proporció demolècules mutants era del 94% i, el que és més

Diagnòstic prenatal

32

rellevant, va provocar necrosi en el múscul, fetque va activar les cèl∙lules satèl∙lit. A la segonabiòpsia es va poder comprovar l'absència total demolècules mutants en totes les fibres analitzades(Shoubridge 1997). Per a certs pacients amb elgenotip adequat, els autors proposen com amètode alternatiu a una necrosi massivaprovocada, la realització d'un programad'exercicis que inclogui nombroses contraccionsmusculars excèntriques. Les lesions micros-còpiques que generen aquestes contraccionsprovoquen que les cèl∙lules satèl∙lit es fusioninamb les miofibril∙les danyades, i per tant podrienaturar l'increment de molècules mutants enmúscul.

La introducció d'un gen mitocondrial normalhomòleg del mutant a un pacient hauria decorregir la funció alterada, però ara per ara no éspossible introduir d'una forma efectiva gens dinsdel mitocondri en cèl∙lules en cultiu. L'alternativad'incorporar les còpies salvatges al nucli cel∙lularperquè la proteïna normal es sintetitzi alcitoplasma i es transporti més tard al mitocondriés també força complicada. Cal afegir laseqüència per a un pèptid senyal que vagi almitocondri, i cal tenir en compte les diferènciesentre els codis genètics mitocondrial i nuclear.S'han de resoldre, doncs, alguns problemestècnics prou importants abans de poder plantejaruna teràpia gènica per a les malaltiesmitocondrials.

DIAGNÒSTIC PRENATAL

Malgrat el diagnòstic prenatal per a malaltiesmitocondrials basat en l'anàlisi del mtDNA éspossible tècnicament, es coneixen pocs casos enquè s'hagi realitzat. L'heteroplàsmia és elprincipal obstacle amb el que es topa a l'hora defer un diagnòstic prenatal amb confiança per lesraons exposades anteriorment14. El percentatged'heteroplàsmia pot variar en el temps i entrediferents teixits, aleshores és lògic que hi hagidubtes sobre si la proporció de molècules mutantsen amniocentesis o vellositats coriòniques serà lamateixa que en altres teixits del fetus. A més, lasegregació mitòtica pot fer que aquesta proporcióvariï durant el desenvolupament embrionari idesprés del naixement. Afortunadament aquest nosembla ser el cas per a les mutacions 8993G i8993C (White 1999b) (associades a la síndrome

14 Vegeu l'apartat Hi ha correlació genotip/fenotip en les

malalties mitocondrials? (pàg. 22).

de Leigh i la NARP), per la qual cosa el diagnòsticprenatal és en aquest cas factible (White 1999a).

Pel que fa a moltes altres mutacions caldràrecopilar totes les dades possibles sobre l'herènciade mutacions heteroplàsmiques (estem parlant demutacions heteroplàsmiques que afecten la líniagerminal i que per tant es poden transmetre a ladescendència). La dimensió del coll d'ampollagenètic i el moment en què s'esdevé són d'unaimportància vital per a poder oferir diagnòsticprenatal. Si la selecció de les molècules demtDNA que poblaran els teixits del nounat té lloca la fase embrionària serà difícil que l'examen deles vellositats coriòniques (o dels oòcits en donesamb l'ovulació superestimulada) doni unainformació útil. En canvi, si el coll d'ampolla i lasegregació de les molècules de mtDNA mutants inormals ocorre abans, durant l'oogènesi, elpercentatge de molècules mutants a les vellositatscoriòniques o als oòcits serà representatiu del quetindrà el descendent de la mare heteroplàsmica(Poulton 1998).

El grup del doctor Arnold Munnich a França hafet diagnòstic prenatal en base a les dadesd'activitat enzimàtica dels complexos de la CRMen cèl∙lules de l'amni i del còrion (Faivre 2000).Aquesta estratègia és certament esperançadora,però té l'inconvenient que requereix una segonaamniocentesi per a evitar falsos negatius quepoden originar-se en estudiar mostres de 8 a 12setmanes de gestació.

Malalties estudiades INTRODUCCIÓ

33

7 MALALTIES ESTUDIADESEn aquest capítol es presenten les malalties que han centrat el nostre estudi des del punt devista d'un grup genètic mitocondrial. En primer lloc es tracta la neuropatia òptica hereditàriade Leber (LHON), una de les malalties mitocondrials clàssiques que s'ha descobertassociada a mutacions puntuals al mtDNA des de fa poc més de tretze anys. Moltrelacionada amb aquesta ja que els símptomes són extremadament coincidents hi hal'ambliopia alcohol-tabac (TAA). Vam tenir l'oportunitat d'estudiar el mtDNA d'un grup depacients afectats per aquesta malaltia.

La tercera malaltia presentada en aquesta memòria és la síndrome de Wolfram (WS). Elnostre grup porta anys recopilant i estudiant mostres de pacients amb WS, i aquesta tasca vapermetre identificar alteracions al mtDNA d'alguns pedigrís amb WS (Barrientos 1996b;Barrientos 1996c). Aquest darrer treball va demostrar l'existència d'un gen a la regió 4p16que predisposa a delecions múltiples al mtDNA de famílies amb WS. Dos anys més tard esva identificar un gen responsable d'aquesta síndrome al cromosoma 4 (Inoue 1998; Strom1998) i el nostre grup, a banda d'examinar el mtDNA dels nous pacients WS, va estudiar elgen nuclear de totes les famílies.

Per últim es presenten els resultats sobre una malaltia que apareix secundàriament desprésd'un procés infecciós. Es tracta de la lipodistròfia que pateixen moltes persones infectadesamb el virus d'immunodeficiència humana (HIV). Cada cop més treballs atribueixenl'aparició de la lipodistròfia a la utilització de medicaments antivírics, i el nostre grup es vaplantejar estudiar si la lipodistròfia podia ser conseqüència d'alteracions al funcionamentmitocondrial, ja que prèviament s'havia descrit que la zidovudina (o AZT, un dels primersantivírics utilitzats) provocava depleció del mtDNA en alguns pacients (Arnaudo 1991;Casademont 1996).

LHONL'atròfia òptica de Leber va ser reconeguda

com una forma de neuropatia òptica hereditària amitjans del segle XIX per Von Graefe, i més tardanomenada en honor a Theodor Leber (1840–1917), l'oftalmòleg alemany que va definir ambrigor les seves característiques clíniques i el seupatró d'herència. Aquesta malaltia representa lacausa més freqüent de pèrdua de visió en homesjoves, amb una incidència estimada d'un cas cada50.000 individus. Generalment la pèrdua de visiós'inicia a la segona o tercera dècada de vida deforma indolora i aguda o subaguda. L'afectaciódels dos ulls pot ser simultània o pot aparèixerprimer en un ull, i en un període variable de sis a22 setmanes afectar també l'altre (Riordan-Eva1995). La pèrdua d'agudesa visual acostuma a sergreu i pot arribar a la ceguesa total; a més, ésnormalment irreversible.

El primer símptoma d'un pacient LHON és lavisió borrosa que va empitjorant al llarg desetmanes o mesos fins al punt més greu de cadapacient (no poder comptar dits, ceguesa...). Lestroballes oftalmològiques més típiques són:

escotoma15 central o cecocentral, pseudoedema16

a la capa de fibres nervioses, hiperèmia17 al discòptic i microangiopatia peripapil∙lar, que normal-ment implica capil∙lars tortuosos a la retina icapil∙lars telangiectàsics18. Durant la fase agudaprimerenca (FIGURA 10, pàg. 34) els potencialsvisuals evocats19 es troben alterats, les amplitudses troben disminuïdes i les latències es pro-longuen. A la fase atròfica els potencials evocatss'han perdut pràcticament, la qual cosa indica lapèrdua de la funció de les cèl∙lules ganglionars dela retina20. En canvi, els fotoreceptors, la capa de

15 Àrea del camp visual en què la visió és nul∙la o moltfeble.

16 Estat de tumefacció sense retenció hídrica.

17 Acumulació de sang.

18 La telangièctasi és una dilatació dels vasos capil∙lars queforma una varietat d'angioma.

19 Prova que avalua la conducció d'impulsos elèctrics desdel nervi òptic al còrtex occipital del cervell.

20 La llum captada per l'ull incideix en primer lloc a la capade fibres nervioses i a la de cèl∙lules ganglionars, sota la quales localitzen els vasos sanguinis de la retina. És aquí on elsnervis comencen, recollint els impulsos de la retina i enviant-los al cervell.

LHON

34

cèl∙lules bipolars i l'epiteli pigmentari retinal21

mantenen la seva funcionalitat, d'acord amb elsresultats d'electroretinogrames i electrooculo-grames. També acostuma a mantenir-se laresposta pupil∙lar.

La participació de factors ambientals en aquestamalaltia la suggereix, entre moltes altresobservacions, un article sobre dos bessonsmonozigòtics amb mutacions LHON dels qualsun pateix la malaltia i l'altre, després de sis anys,no (Johns 1993).

Alguns treballs han investigat la neuropatologiade la LHON però normalment sobre pacients quehavien perdut la visió molts anys abans de morir.Per aquest motiu, les observacions neuro-patològiques extretes poden ser diferents a les ques'obtindrien a la fase aguda de la malaltia. Tenintaixò en compte, s'ha vist que en pacients LHONexisteix degeneració de la capa de cèl∙lulesganglionars i del nervi òptic, sense que s'hagiobservat cap procés inflamatori (Howell 1998).

MUTACIONS AL MTDNALa importància de la LHON en opinió de

Riordan–Eva i Harding rau precisament en lesseves conseqüències tan greus sobre gent jove, ien els efectes que pot tenir el diagnòstic d'aquestamalaltia hereditària en altres membres de lafamília (Riordan-Eva 1995). L'atròfia òptica deLeber s'hereta per via materna, mostra unapenetració molt variable i afecta més a homes quea dones, sense que se'n coneguin les causes. S'haassociat a més de 20 mutacions al mtDNA que esrecullen a la TAULA 4, modificada de Wallace et

21 Aquestes tres són capes cel∙lulars adjacents i

progressivament més internes de la retina.

al. (Wallace 1999b), però tan sols unes poques(mutacions primàries) contribueixen d'una maneraclara a la pèrdua de visió. La resta, consideradesmutacions secundàries, poden contribuir a laLHON augmentant la probabilitat que es donil'atròfia òptica, o potser estan associades a altresmutacions clínicament importants en el mateixhaplotip de mtDNA. En l'actualitat es consideraque hi ha quatre mutacions primàries: 11778A,3460A, 14484C i 14459A. Aquesta darrera és pocfreqüent, però és la més greu ja que causa LHONi/o distonia generalitzada. Les tres primeres s'handetectat en més del 90% dels casos LHONeuropeus. La mutació 11778A és la majoritària ies troba al 50% dels pacients, mentre que la3460A i la 14484C són presents a aproximada-ment el 15% dels afectats. En pacients asiàtics encanvi, la mutació 11778A predomina en el 95%dels casos. Wallace et al. indiquen que aquestesdiferències entre poblacions de diversoscontinents suggereixen que els backgroundsgenètics poden afectar l'expressió de lesmutacions LHON (Wallace 1999b).

La mutació 14459A canvia una alanina moltconservada per una valina a la posició 72 delpolipèptid ND6 de la NADH deshidrogenasa. Lamutació 11778A es considera la segona mutaciómés greu, i transforma una arginina moltconservada per una histidina en la posició 340 dela subunitat ND4. Va ser la primera mutacióLHON descrita, i la primera mutació al mtDNAassociada a una malaltia mitocondrial (Wallace1988). Aquesta mutació es detecta predominant-ment en homoplàsmia —només s'ha observat un15% de pacients heteroplàsmics—, i afecta amolts més homes que dones: per cada dona quela presenta n'hi ha més de quatre homes afectats.Tan sols un 4% dels pacients amb aquestamutació ha experimentat recuperació visual.

mutació primàriaal mtDNA

factorssecundaris

pèrdua de la funció delnervi òptic

neurodegeneració delnervi òptic i de lescèls. ganglionars

recuperacióvisual

fase pre-simptomàticafase aguda

fase atròfica

FIGURA 10. MODEL PER AL DESENVOLUPAMENT DE LA LHON.Modificada de (Howell 1998). Proposa que per a la pèrdua de visió és necessària la incidència de factorssecundaris sobre individus amb alguna mutació primària al mtDNA. Alguns pacients que no han arribat a la fasecrònica de la malaltia poden millorar la seva capacitat visual potser perquè part de les cèl∙lules ganglionars de laretina es mantenen viables durant cert temps tot i ser inactives.

Malalties estudiades INTRODUCCIÓ

35

La següent mutació primària en ordre degravetat és la 3460A, que canvia una alaninamoderadament conservada per una treonina a laposició 52 del gen ND1. Té un pronòstic menysgreu que la mutació 11778A perquè en un 22%dels casos s'ha observat recuperació parcial de lacapacitat visual. Tant aquesta mutació com lamajoritària 11778A han estat detectades en unpetit percentatge de pacients amb esclerosimúltiple (MS). Alguns grups han cercat aquestesmutacions primàries en individus amb MS, peròmentre uns mantenen que la relació entreaquestes malalties podria ser causada perl'associació de la MS a un determinat haplotip delmtDNA (Kalman 1998; Reynier 1999), altresafirmen que tenir una mutació LHON primària ésun factor de risc per a desenvolupar MS(Vanopdenbosch 2000). En un estudi amb 103pacients MS Mojon et al. no van detectar lesmutacions 11778 i 3460, pel que la presènciad'aquestes mutacions LHON deu ser poc freqüenten pacients amb esclerosi múltiple noseleccionats (Mojon 1999).

La mutació 14484C és la més benigna de lesmutacions primàries. Canvia una metioninadèbilment conservada per una valina, a la posició64 del gen ND6, i s'acostuma a trobar enhomoplàsmia, tot i que també s'han descrit casosheteroplàsmics. Allò que més destaca de lamutació 14484C és que un 37–50% dels pacientsque la presenten experimenten recuperació visual(Riordan-Eva 1995). La recuperació no succeeixfins passats molts mesos —fins i tot anys— delcomençament de la pèrdua de visió, generalmentsuperat un any de l'inici.

Pel que fa a les mutacions LHON secundàries,la seva patogenicitat és més qüestionada. Estroben sempre en homoplàsmia (fins i tot enindividus sans) conjuntament amb mutacionsprimàries. Algunes d'elles són relativamentfreqüents entre pedigrís LHON i també entrecontrols (per exemple les mutacions 13708A i4216C, TAULA 4). Per aquest motiu es pensa quesón polimorfismes, o bé variants que afecten elrisc de patir LHON, i aleshores serien importantsdes d'un punt de vista patogènic. En un estudi

TAULA 4. MUTACIONS ASSOCIADES A LHON

MutacióA TipusB Canvi Grau decanviC

% pacientseuropeus

%controls

Hetero–plàsmia

%Penetraciófamiliars

%Penetracióhomes

MTND6*LDYT14459A I A72V E rara 0 + 61 58

MTND4*LHON11778A I R340H E 50 0 +/- 33-60 82

MTND1*LHON3460A I A52T M 15 0 +/- 14-75 40-80

MTND6*LHON14484C I M64V B 15 0 +/- 27-80 68

MTND2*LHON5244A I G259S E rara 0 + - -

MTND5*LHON13730A I G465E M rara 0 + - -

MTCO3*LHON9804A I? A200T E 1,5 0 - ? ?

MTND3*LHON10663C I? V65A B rara 0 - 56 60

MTATP6*LHON9101C I? I192T B rara 0 - - -

MTND4*LDYT11696G I? V315I B rara 0 - ? ?

MTND6*LHON14482G I? M64I B rara 0 - ? 89

MTND6*LHON14498T I? Y59C M rara 0 + 31 50

MTND6*LHON14568T I? G36S B rara 0 - - -

MTND6*LDYT14596A I? I26M M rara 0 + ? ?

MTCYB*LHON15257A I-II D171N E 9 0,4 - - -

MTND5*LHON13708A II A458T M 30 6 - - -

MTND1*LHON3394C II Y30H E rara 0,9 - - -

MTND1*LHON4160C II L285P E rara 0 - 76 54

MTND1*LHON4216C II Y304H B ~40 13 - - -

MTND2*LHON4917G II D150N E 3 3 - - -

MTCO1*LHON7444A II Ter→K - 5 1 - - -

MTCO3*LHON9438A II G78S E 2,5 4,6 - - ?MTCYB*LHON15812A II V357M M 4 0,1 - - -

Modificada de Wallace et al. (Wallace 1999b). Les 10 primeres mutacions segueixen un ordre decreixent de gravetat.A Nomenclatura de les mutacions al mtDNA que indica el gen mutant, la malaltia a la que està associada i la posició del canvi.B I i II indiquen mutació primària i secundària, respectivament. I-II, mutació intermèdia, o primària/secundària segons els grups.C B, M i E mostren si el canvi es produeix en un residu poc, moderadament o elevadament conservat, respectivament.

LHON

36

dels haplotips de mtDNA de 37 pacients LHONitalians, el grup de Torroni et al. determinà queles mutacions secundàries 4216C, 4917G,13708A, 15257A i 15812A són polimorfismesantics, i que les mutacions primàries 3460A,11778A i 14484C són recents i resultat demúltiples successos mutacionals independents(Torroni 1997). El fet que s'hagin pogut crearrecentment pot explicar per què s'han trobat enheteroplàsmia en certes famílies.

L'anàlisi filogenètica de les tres mutacionsLHON més freqüents ha mostrat que s'handistribuït de manera diferent entre els diversoshaplogrups de mtDNA presents a Europa. D'unabanda, la mutació 3460 sembla repartida a l'atzarentre tots els haplogrups. De l'altra, les mutacions11778 i 14484 es detecten a tots els haplogrupseuropeus però amb una preferència clara perl'haplogrup J, amb una freqüència aproximada sisvegades superior a la que es podria esperar al'atzar (Brown 1997; Torroni 1997). Torroni et al.creuen que la probabilitat d'expressar la LHONaugmenta quan les mutacions 11778 i 14484 espresenten dins de l'haplogrup J, és a dir, quanestan associades als polimorfismes que defineixenaquest haplogrup. Segons la seva hipòtesiaquestes mutacions primàries ocorrerien a l'atzaren tots els tipus de mtDNA, i en donar-se al'haplogrup J s'incrementaria el risc de l'expressióde l'atròfia òptica. En fer una selecció de famíliesLHON també s'estaria seleccionant aquesthaplogrup.

L'anàlisi de l'haplogrup J indica que lacombinació de mutacions secundàries 4216 +13708 és una bona candidata per a augmentar lapenetració de les mutacions primàries. Ambduesalteren aminoàcids de la NADH deshidrogenasa ipodrien afectar la funció del complex I sicoincideixen amb les canvis provocats per lesmutacions 11778 o 14484. Malgrat l'observacióanterior, és molt difícil comprovar si la penetracióincompleta i variable de l'atròfia òptica de Leberés conseqüència dels diferents haplogrups almtDNA ja que aquesta segur es veu afectada permúltiples factors ara per ara desconeguts.

Totes les variants que coincideixen al'haplogrup J modifiquen d'alguna manera elcomplex I de la CRM. Pot tenir aquest fet algunasignificació des d'un punt de vista evolutiu?Wallace et al. es pregunten com és que essentaquest un haplogrup més deleteri que la resta hapogut assolir freqüències polimòrfiques en lapoblació europea (Wallace 1999b), i proposenque l'haplogrup J hauria estat seleccionat durantels períodes de glaciació. Cal recordar que entre

les funcions mitocondrials hi ha la producció decalor. Aquesta funció té lloc a costa de lageneració d'ATP mitjançant l'OXPHOS ja queambdós processos necessiten l'energia potencialemmagatzemada en el gradient electroquímicmantingut a través de la membrana mitocondrialinterna. En èpoques passades d'intens fred deuhaver existit un fort avantatge selectiu sobre lesmutacions que desacoblessin l'OXPHOS pergenerar calor. Contràriament, aquestes mutacionsserien neutres en condicions "d'excés calòric", iper tant es podrien mantenir a la població ambfreqüències polimòrfiques; però incrementarienl'expressió de la LHON si coincidissin amb unamutació lleument patogènica com per exemple la14484C (Wallace 1999b).

FUNCIONAMENT DE LA CRMAtès que les mutacions més freqüents

associades a l'atròfia òptica de Leber afecten asubunitats del complex I de la CRM, caldriaesperar-ne un funcionament anormal en pacientsLHON. Tanmateix, les dades obtingudes ennombrosos treballs sobre mostres d'individusLHON han estat molt més diverses del que espreveia. És probable que les causes siguindiferències de procediments entre els laboratorisen aspectes molt importants: tipus cel∙lularestudiat (leucòcits, plaquetes, limfòcits, fibro-blasts, múscul esquelètic), avaluació de larespiració sobre la cèl∙lula sencera o bé a partirdels mitocondris aïllats, mètodes per aïllar lafracció mitocondrial, substrats i tampons utilitzats,etc.

Tenint tot això molt en compte es pot dir que lamutació primària 11778A no sembla causar unareducció en l'activitat específica del complex I,però sí redueix a la meitat la velocitat delfuncionament de la CRM quan s'utilitzen substratslligats al NADH (emprats pel complex I), cosa noobservada si el substrat usat és el succinat, captatpel complex II (FIGURA 3, pàg. 11) (Larsson 1991).Quant a la mutació 3460A, s'ha detectat unadisminució de l'activitat específica del complex Id'aproximadament el 80%, també en familiars noafectes (Howell 1991), el que exemplifica lapenetració incompleta de la LHON i indica que lamutació primària és necessària però no suficientper a causar la malaltia. L'estudi de la CRM enpacients amb la mutació 14484 ha aportatresultats completament oposats en bona partcausats per les raons exposades anteriorment, itambé per la coexistència d'altres mutacions almtDNA, fet que afegeix confusió a les dadesobtingudes.

Malalties estudiades INTRODUCCIÓ

37

Un treball més recent del grup del Dr Wallaceen el qual estudien limfoblasts i cíbridstransmitocondrials amb les mutacions 11778A,3460A i 14484C en homoplàsmia presenta elssegüents resultats: els limfoblasts amb lesmutacions 11778, 3460 i 14484 tenen la capacitatrespiratòria reduïda entre 30-36%, 20-28% i 10-15%, respectivament. Pel que fa a l'activitatespecífica del complex I, les reduccions són del20 i el 79% per les mutacions 11778 i 3460,respectivament; la mutació 14484 no afectaaquesta activitat. Els cíbrids amb les mutacions11778 i 3460 també mostren reduccionssignificatives mentre que els que contenen lamutació 14484 no es veuen afectats i presentenuns valors polarogràfics dins del rang denormalitat (Brown 2000).

En considerar totes aquestes dades bioquí-miques cal tenir present que s'han obtingut apartir de teixits que no són els afectats per l'atròfiaòptica de Leber, i per tant no es pot inferir que elfuncionament de la CRM a les cèl∙lules queconformen el nervi òptic sigui el mateix quel'observat a limfoblasts o altres tipus cel∙lulars.

AFECTACIÓ DEL NERVI ÒPTIC

De quina manera el funcionament alterat de laCRM podria provocar la degeneració del nerviòptic? S'ha proposat que les anomalies de la CRMen pacients LHON produeix que s'inflin lescèl∙lules ganglionars i els àxons, mitjançant unmecanisme que activaria el porus de transiciómitocondrial (pàg. 13) i el canal NMDA (N–metil–D–aspartat) sensible al potencial redox. Sesap que quantitats excitotòxiques de glutamatpoden activar l'apoptosi en cèl∙lules nervioses,fenomen que podria estar involucrat en ladegeneració del nervi òptic i les cèl∙lulesganglionars, més que no pas la necrosi (Howell1998). En la degeneració nerviosa descrita enl'atròfia òptica de Leber no s'ha identificatinflamació, característica de processos necròticsperò no dels apoptòtics. Per contra, en diversessituacions s'ha observat mort cel∙lular programadaa les cèl∙lules ganglionars que, a més, s'inhibeixamb la sobreexpressió de Bcl–2.

Per què en el cas de la mutació 11778A elprograma de mort cel∙lular es compleix gairebéinvariablement mentre que això no és així per a lamutació 14484C? La degeneració provocada perla mutació 11778 és superior a l'originada per la14484 (FIGURA 10), però els motius encara sóndesconeguts. És possible que les diversesmutacions LHON provoquin la producció de

quantitats diferents de radicals lliures, estantaquests directament implicats en mecanismesexcitotòxics i d'apoptosi (Howell 1998).

AMBLIOPIA ALCOHOL–TABAC (TAA)L'ambliopia és una disminució de la visió no

deguda a causa orgànica de la que existeixendiversos tipus. L'ambliopia tòxica pot ser causadapel consum d'alcohol i tabac o per nutriciódeficient; no és, en realitat, una veritableambliopia ja que hi ha lesió orgànica del nerviòptic, però aquesta es detecta temps després de lapèrdua visual. L'ambliopia alcohol-tabac tambés'anomena neuritis o neuropatia tòxica alcoholo-tabàquica.

Clínicament la TAA es caracteritza peranomalies visuals, presència d'escotomes als dosulls i per una visió dels colors alterada,majoritàriament pel verd i el vermell. A més,l'agudesa visual es redueix molt substancialment(Krumsiek 1985). El mecanisme exacte pel qual elconsum d'aquestes substàncies tòxiques deriva enla pèrdua de la visió no es coneix, però se sap queel consum crònic d'etanol provoca la hipoplàsia—desenvolupament incomplet— del nervi òptic(Ferriero 1992; Pinazo-Duran 1997). Quant alsefectes directes sobre el mitocondri, afecta laintegritat estructural i funcional dels mitocondrisde fetge i augmenta el dany oxidatiu del mtDNAhepàtic (Cahill 1997), el que podria contribuir adelecions múltiples al mtDNA hepàtic (Mansouri1997). El consum crònic d'etanol alenteix elfuncionament dels ribosomes mitocondrials i,conseqüentment, la síntesi proteica disminueix. Elretard en la producció dels components de laCRM redueix la velocitat de formació d'ATP enaquests mitocondris hepàtics. Per una altra banda,s'hi produeix una quantitat superior d'espèciesROS, tant si l'exposició a l'etanol és crònica comsi és aguda (Cunningham 2001).

Paral∙lelament, l'alcohol pot comportarmalnutrició per dos motius: primer, perquè enalguns casos els malalts a penes s'alimenten isubsisteixen amb les calories que aporta l'alcohol;segon, perquè l'etanol causa malabsorció i danycel∙lular a través de citotoxicitat directa (Lieber1993). La mancança de determinades vitaminesfreqüentment observada entre alcohòlics potproduir anomalies visuals que en ocasions esredueixen sota un programa d'abstinència i dietaamb suplement de vitamines B1, B2 i B12.

Per causa de la gran semblança que existeixentre aquests símptomes i els de l'atròfia òptica deLeber certs pacients LHON —individus que

Síndrome de Wolfram o DIDMOAD

38

presenten mutacions LHON primàries— han estatdiagnosticats erròniament com a ambliòpics TAA.La disponibilitat de l'anàlisi del mtDNA haproporcionat una eina per a evitar aquestdiagnòstic equivocat i diferenciar les duesmalalties (Cullom 1993; Borruat 1994).

L'alcohol i el tabac són considerats com apotencials factors secundaris en l'etiologia del'atròfia òptica de Leber. Fins i tot s'ha suggerit unconsum superior d'aquestes substàncies tòxiquesentre pacients LHON, malgrat això no s'ha arribata demostrar (Riordan-Eva 1995). Així doncs enstrobem amb dues malalties amb una simpto-matologia molt similar, però mentre al rerafons del'ambliopia no sembla existir una causa genèticaconcreta, aquesta és molt evident en la LHON. Laconcurrència de certs factors pot desenvoluparl'atròfia òptica en individus genèticamentpredisposats. S'ha descrit el cas d'un home de 38anys que pertany a una família LHON (ell mateixpresenta la mutació 11778) que després d'untemps amb teràpia antivírica l'abandona perproblemes d'hepatotoxicitat i, cinc mesos méstard, comença a notar els primers indicis de laLHON, amb pèrdua visual en ambdós ulls (Shaikh2001).

D'una manera similar, el consum elevatd'alcohol o tabac pot desencadenar la pèrduavisual en individus amb mutacions LHON que enuna altra situació potser no la manifestarien.

SÍNDROME DE WOLFRAM O DIDMOAD

PRESENTACIÓ CLÍNICA

L'any 1938 Wolfram i Wagener van descriureuna família amb vuit fills en la qual quatregermans presentaven atròfia òptica i diabetismellitus (Wolfram 1938). Des d'aquesta primeradescripció hi ha hagut més d'un centenard'articles que directa o indirectament s'han referita la síndrome de Wolfram (WS, MIM 222300).Aquesta síndrome és coneguda també perl'acrònim DIDMOAD, que correspon a les inicialsen anglès de diabetis insípida, diabetis mellitus,atròfia òptica i sordesa, ja que aquestes quatremalalties afecten molt freqüentment als pacientsWS.

22La majoria de pacients pateix primer ladiabetis mellitus, a una mediana d'edat de sis

22 Les dades que es presenten seguidament corresponen a

un estudi que va identificar i caracteritzar tots els pacients WSdel Regne Unit l'any 1995 (Barrett 1995).

anys (rang: tres setmanes–16 anys). Es tracta d'unadiabetis depenent d'insulina, no autoimmune nirelacionada amb el complex principal d'histo-compatibilitat. Més tard es desenvolupa l'atròfiaòptica, a una mediana d'edat d'onze anys (rang:sis setmanes–19 anys). El malalt perd agudesavisual i la visió de colors. Els camps visuals abansde la pèrdua de visió ja revelen escotomescentrals, i els pacients cecs perden reflexespupil∙lars (Barrett 1997b). L'existència d'aquestesdos símptomes és suficient per a diagnosticar lasíndrome de Wolfram (FIGURA 11).

La diabetis insípida apareix a aproximadamentel 75% dels pacients, amb una edat mediana de

14 anys (rang: tres mesos–40 anys). La sordesaneurosensorial es diagnostica en dues terceresparts dels pacients WS a una edat mediana de 16anys (rang: 5–39 anys). A més d'aquestssímptomes, sovint es donen altres complicacionsen malalts amb la síndrome de Wolfram. Duesterceres parts dels afectats tenen problemes altracte urinari a una mediana d'edat de 20 anys.Són nombrosos els casos amb bufeta atònica23 i

23 Bufeta dilatada i amb poca capacitat de contracció, sense

que hi hagi evidència de lesió al SNC.

0

20

40

60

80

100

10 20 30 40

Edat del pacient (anys)

% d

e p

acie

nts

DM AO DI SO R

URI NEU Sup.

FIGURA 11. APARICIÓ DELS PRINCIPALSSÍMPTOMES DE LA WS.

La gràfica s'ha elaborat a partir de les dades sobre 45pacients amb la síndrome de Wolfram de Barrett i Bundey(Barrett 1997a). Les xifres són en percentatge. DM, diabetismellitus; AO, atròfia òptica; DI, diabetis insípida; SOR,sordesa; URI, complicacions del tracte urinari; NEU,complicacions neurològiques; Sup, pacients WS amb l'edatespecificada.

Malalties estudiades INTRODUCCIÓ

39

bufeta neurogènica24, amb problemes comunscom ara incontinència i infeccions repetides(Aboseif 1993). Les alteracions neurològiques sónforça freqüents i acostumen a aparèixer cap els 30anys, normalment amb atàxia truncal que causapas inestable i caigudes. També s'ha observatmiòclon25 sobtat, reflexes reduïts de lesextremitats, nistagme26 horitzontal, disàrtria27,apnees, pèrdua del gust i d'olfacte, i hemiparesi28

(Scolding 1996).

Els individus amb WS a més poden patirproblemes psiquiàtrics. En un grup de 68 afectesdels Estats Units, 41 (60%) havien tingut episodisde depressió greu, psicosi, o síndrome orgànicade cervell, i també impulsos d'agressió verbal ifísica (Swift 1990). Posteriorment s'estudià lafreqüència de trastorns psiquiàtrics entre elsfamiliars de pacients WS i es comparà ambl'exhibida pels cònjuges dels casos WS,descobrint que els primers —heterozigots pel gencausant de la WS— tenien una clara predisposicióa patir-les (Swift 1991).

Alguns pacients WS presenten hipogonadisme,problemes gastrointestinals i respiratoris.

Com a resultat d'aquesta gran quantitat desímptomes, la síndrome de Wolfram provoca lamort dels pacients als 30 anys (25–49 anys)deguda a fallades respiratòries o insuficiènciesrenals conseqüència d'infeccions (Kinsley 1995;Barrett 1997a).

EL CERVELL A LA WSLa síndrome de Wolfram és una malaltia

neurodegenerativa progressiva amb els múltiplessímptomes suara esmentats. Alguns treballs hanexaminat el cervell de pacients WS mitjançantressonància magnètica i també estudis neuro-patològics de teixits post mortem. L'observaciómacroscòpica del cervell d'un pacient WS mostraatròfia notable dels bulbs i tractes olfactoris, iatròfia dels nervis i quiasma òptics.Microscòpicament s'observa la disminució defibres nervioses als nervis òptics, quiasma i tractes

24 Qualsevol anomalia en el funcionament de la bufeta

urinària deguda a una lesió en el SNC o perifèric.

25 Contracció reflexa repetitiva d'un múscul o grups demúsculs.

26 Espasme reflex i repetitiu dels músculs motors del globusocular que provoca el moviment involuntari d'aquest endiferents sentits.

27 Dificultat per a comunicar-se mitjançant la parla.

28 Reducció de la capacitat motora d'un costat del cos.

òptics centrals; pèrdua neuronal als cossosgeniculats laterals, i també als col∙licles superiors;reducció de neurones als nervis coclears (Genis1997). En altres ocasions també s'ha descritdistròfia dels àxons generalitzada (Shannon 1999).

Galluzzi et al. creuen que el conjuntd'alteracions detectades en aquests estudisexpliquen els símptomes més freqüents a la WS(Galluzzi 1999): la diabetis mellitus pot serconseqüència de degeneració hipotalàmica, tot ique també s'ha descrit manca de cèl∙lules βproductores d'insulina als illots pancreàtics de dosmalalts amb WS (Karasik 1989); l'atròfia òpticareflecteix la degeneració nerviosa de les viesvisuals: atròfia, pèrdua axonal substancial idesmielinització dels nervis òptics, quiasmes,tractes i radiacions resulten en la degeneració delscol∙licles superiors i dels cossos geniculatslaterals; la diabetis insípida es creu relacionadaamb l'atròfia i la degeneració de l'hipotàlem, ambpèrdua de neurones secretores de vassopresina alsnuclis supraòptics i paraventriculars (Gabreels1998), i degeneració del lòbul posterior de lapituïtària.

GENÈTICA DE LA WSLa síndrome de Wolfram es transmet d'una

forma autosòmica recessiva amb una prevalençad'un cas cada 770.000 persones al Regne Unit(Barrett 1995), i d'un cada 100.000 a Amèrica delNord29 (Fraser 1977). En nombroses ocasions s'haobservat consanguinitat entre les famílies WS.

El fet que la majoria de símptomes de lasíndrome de Wolfram coincidissin amb els demoltes malalties mitocondrials va fer pensar si laWS no seria una d'aquestes. Diversos grupsinvestigaren aquesta possibilitat a partir dels casosWS disponibles. Bundey et al. detectaren en unpacient anomalies mitocondrials morfològiques ibioquímiques, però no al mtDNA (Bundey 1992).L'any següent, l'Agnès Rötig i els seuscol∙laboradors descrigueren deficiències en lesactivitats dels complexos de la CRM i una delecióde 7,6 kb al mtDNA d'una nena amb WS (Rotig1993). Bu i Rotter proposaren aleshores un modelsegons el qual la WS estaria originada perdefectes al genoma mitocondrial o bé peralteracions al genoma nuclear que interferirien enel funcionament del mitocondri (Bu 1993), modelal que donaren suport altres grups (Bundey 1993;

29 Aquesta diferència pot ser conseqüència de criteris

dispars a l'hora d'establir els criteris mínims per al diagnòsticde la malaltia.

Síndrome de Wolfram o DIDMOAD

40

Vora 1993). Més tard es descrigué l'existència dela mutació LHON 11778 a un noi de 19 anysafectat per la WS (Pilz 1994). També va aparèixerun treball en el qual s'estudiaven els mitocondrisd'un malalt des d'un punt de vista bioquímic,histològic i genètic, sense trobar-se capirregularitat excepte una mutació puntual a laposició 12308 del mtDNA, considerada unpolimorfisme (Jackson 1994).

L'any 1994 Polymeropoulos et al. determinenmitjançant anàlisi de lligament sobre 11 pedigrísWS que el gen responsable de la malaltia es trobaa la regió 4p16 (Polymeropoulos 1994). MalgratPolymeropoulos defèn que el pacient estudiat perRötig et al. no és un cas WS típic amb herènciaautosòmica recessiva, segueixen apareixentarticles als quals es detecten alteracionsmitocondrials en pacients WS (Bezold 1995;Barrientos 1996b; Barrientos 1996c). En ToniBarrientos, dins del grup de la doctora Nunes,demostrà que un locus a 4p16 predisposava adelecions múltiples del mtDNA en pacients WS, iproposà un model de transmissió semidominantsegons el qual els individus homozigots pel genmutant tindrien abundants delecions al mtDNA;els heterozigots tindrien un risc més gran de patirdelecions que els no portadors, fet que elsoriginaria alguna de les manifestacions feno-típiques característiques de la WS: diabetis isordesa, o problemes psiquiàtrics (Barrientos1996c).

Uns mesos més tard, s'acotà millor la regió enquè es trobava el gen per la WS i es demostrà laseva heterogeneïtat genètica (Collier 1996).Hofmann et al. proposaren que l'haplogrup queells anomenaren B del mtDNA (caracteritzat perles variants del mtDNA 4917, 10463, 13368,14233 i 15928) era un factor de risc per a la WS(Hofmann 1997a), i que aquesta síndrome i laLHON estaven associades a haplogrups delmtDNA diferents (Hofmann 1997b). L'anàlisi dela regió 4p en una família japonesa confirmà ellligament del gen responsable de la malaltia irevelà que l'haplotip patogènic incrementa el riscde diabetis i de sordesa en els portadors (Ohata1998). A la vegada, Swift et al. estimaren que elsheterozigots tenen una probabilitat de serhospitalitzats per problemes psiquiàtrics 26vegades superior a la dels no portadors (Swift1998).

És a finals de l'any 1998 que dos grupspràcticament a l'hora localitzen mitjançantclonatge posicional un gen a 4p16 amb mutacionsals individus amb la síndrome (Inoue 1998; Strom1998). El gen —WFS1— està compost per vuit

exons (FIGURA 12). Els set primers són petits,mentre que l'exó 8 supera les 2,5 kb. Laseqüència de cDNA prediu una proteïna de 890aminoàcids, amb una massa molecular de100 kDa. Mitjançant programes de predicciód'estructura de proteïnes s'espera que la proteïnaWFS1 tindrà tres dominis estructurals: unhidrofílic N–terminal extracitoplàsmic, unhidrofílic C–terminal intracitoplàsmic, i un dominicentral hidrofòbic amb 9–10 segmentstransmembrana (FIGURA 12). Northern blotsmostren que el gen s'expressa fortament a cor,mitjanament a placenta, pàncrees (preferentmentals illots), pulmó, i cervell, i feblement a ronyó,múscul i fetge. La proteïna WFS1 no semblapresentar homologia amb altres seqüènciespublicades de DNA o proteïna.

El–Shanti et al. han aportat proves sobrel'heterogeneïtat clínica i genètica de la WS enidentificar un segon locus per a la síndrome(WFS2) a la regió 4q22–24 en famílies WS que nopateixen diabetis insípida (El-Shanti 2000). Onzedels 16 pacients en aquest treball presentaven unanova manifestació clínica en malalts amb lasíndrome de Wolfram: hemorràgies al tractegastrointestinal (al-Sheyyab 2001).

El fet que en els més recents treballs ambpacients WS no s'hagin detectat mutacions nigrans reordenaments al mtDNA ha qüestionat laimplicació del mitocondri en aquesta síndrome(Hofmann 1997a; Strom 1998; Hardy 1999), peròaltres veus recorden que són molt escassos elstreballs que estudien un teixit de pacients WSdiferent al sanguini (Gerbitz 1999). En aquestscasos gairebé sempre s'han detectat alteracionsmitocondrials histològiques, bioquímiques ogenètiques (Bundey 1992; Bundey 1993; Rotig1993; Barrientos 1996b; Barrientos 1996c).Barrett et al. han estat dels últims investigadors apronunciar-se sobre aquest tema i, per una banda,desmenteixen que la WS estigui associada a unhaplotip del mtDNA30; a més, insisteixen adescartar qualsevol intervenció del mitocondri enla patogènesi de la WS, malgrat només hanexaminat el mtDNA obtingut de sang (Barrett2000). Són conscients d'aquest fet, peròmantenen que els individus WS als quals s'hadetectat alteracions mitocondrials presentenfenotips atípics de la síndrome.

30 En oposició a altres treballs a partir d'un nombre menor

de pacients (per exemple (Hofmann 1997b)).

Malalties estudiades INTRODUCCIÓ

41

La localització exacta de la proteïna WFS1 i elconeixement de la seva funció o funcions ha declarificar quin paper juga el mitocondri en aquestasíndrome i, el que és més important, pot ser degran ajut per a preparar tractaments destinats areduir els greus símptomes que pateixen elsmalalts WS, amb la finalitat que s'augmenti laseva qualitat i esperança de vida. També podriacontribuir al diagnòstic prenatal de la malaltia.

Ja s'estan donant les primeres passes en lacaracterització de la proteïna WFS1. Takeda et al.han preparat anticossos específics contra l'extremC–terminal de la proteïna i mitjançant centrifuga-

ció diferencial han trobat que es localitza alreticle endoplasmàtic de fibroblasts primarishumans (Takeda 2001). També han estudiat laseva distribució regional i la del mRNA en talls decervell de ratolí, determinant que hi ha una ex-pressió neuronal selectiva tant del mRNA com dela proteïna. Aquest grup ha observat que no hi hauna correspondència total entre les regions mésafectades en pacients Wolfram i les regions ambnivells elevats de proteïna en cervell de ratolí. Pera explicar aquesta discrepància proposen que amés de diferències entre les dues espècies, podenexistir altres factors intrínsecs a les cèl∙lules

1 2 3 4 5 6 7 8

A

B

~33 kb

ins141 Q136X A133T A126T

E169K

R232G Q226X Q224X del203fs

E273X

P292SI296SY302X

I333V

del350

del354 del415

Q366X

del451-56fs

R456H

del461-63

G437R

W478X

ins483fs

Ins502P504L

A559T

NH2

del508-12del508fs

del517fsQ520X

del538-42fs

del567-68 H

611R

ins722

P724L I720V

R653C

W648X

transmembrana

Q667X

E737KG736S

Q668X

Y669C

G674R

W700C G695V

del812fs R818C Q819X

del883fsdel882fs

890 P885L

E752X del754fs

C690R

Mutacions sense sentit

Mutacions de canvi de sentit

Delecions

Residus transmembrana predits

Insercions

FIGURA 12. ESTRUCTURA DE WFS1 I MODEL DE LA PROTEÏNA QUE CODIFICA.A, El gen WFS1 s'estén sobre una zona de 33,4 kb. B, predicció de l'estructura de la proteïna WFS1, modificada de (Khanim 2001).S'indica el tipus i la posició de les mutacions identificades fins aquest moment en famílies WS.

Lipodistròfia associada a teràpia antivírica

42

afectades que desencadenin processos apoptòtics(Takeda 2001).

LIPODISTRÒFIA ASSOCIADA A TERÀPIAANTIVÍRICA

La qualitat de vida dels pacients amb la SIDAha experimentat una millora molt importantgràcies a la utilització de teràpies amb molèculesantivíriques. Actualment hi ha tres tipus d'antiví-rics emprats en els tractaments de les personesinfectades amb el virus d'immunodeficiènciahumana (HIV): els inhibidors nucleòsids de latranscriptasa inversa (NRTI), els inhibidors nonucleòsids de la transcriptasa inversa (NNRTI), iels inhibidors de proteases (PI).

Tots els NRTI que s'utilitzen en l'actualitat sóndidesoxinucleòsids que es fosforilen intra-cel∙lularment i són con-vertits a ddNTP. La incor-poració d'un d'aquestsddNTP a la cadena deDNA provoca l'aturadaen la síntesi ja que elsmanca el grup hidroxil enla posició 3' del sucre ialeshores no es pot for-mar l'enllaç fosfodiésteramb el grup 5'-fosfat delsegüent nucleòtid. Latranscriptasa inversa del'HIV és inhibida peraquests ddNTP. Pel quefa als PI, aquestes droguess'uneixen al centre actiude la proteasa de l'HIV ila inhibeixen, amb el ques'impedeix el processament dels precursors deproteïnes estructurals i empaquetadores del RNAviral gag i gag-pol. Quant als NNRTI —lessubstàncies que s'han incorporat més recentmenta la teràpia contra l'HIV—, impedeixen la funcióde la transcriptasa inversa puix que s'uneixen alcentre actiu de l'enzim i el bloquegen.

L'altra cara de la moneda és la quantitatd'efectes secundaris que comporten aquestessubstàncies, alguns i algunes de les quals esrecullen a la TAULA 5, modificada de (Brinkman1998; Flexner 1998). L'aplicació dels PI i delsNNRTI és més recent que la dels NRTI, que vanser els primers fàrmacs usats per a combatre elvirus de la SIDA, en concret la zidovudina o AZT.És per això que la informació disponible sobre elsefectes secundaris d'aquests compostos es basaúnicament en el tractament d'alguns milers de

pacients per cada droga. Alguns NRTI, al contrari,es venen administrant des de fa més de 10 anys iper tant la casuística és molt superior. Existeixencentenars d'articles que descriuen els efectessecundaris d'aquesta o aquella droga o combi-nació de drogues en múltiples grups de pacientsHIV positius. Malgrat això, encara no es coneixenels mecanismes precisos d'interacció entre lesmolècules antivíriques i el metabolisme delpacient que expliquin l'afectació tan variada.

Des de fa aproximadament cinc anys elsprotocols terapèutics inclouen normalment dosNRTI i com a mínim un PI: és la teràpia antivíricaaltament activa o HAART. La teràpia exclusiva-ment amb PI s'ha desaconsellat perquè la duradade la resposta antivírica és limitada (entre d'altresmotius per l'aparició de virus resistents). En canvi,la combinació de PI amb NRTI o NNRTI és capaç

d'eliminar l'HIV durantllargs períodes de temps(Flexner 1998) i ha reduïtla mortalitat i la morbo-sitat del virus en una granproporció de pacients.Malauradament, però, laHAART també està asso-ciada a una sèrie d'efectessecundaris entre els qualsla lipodistròfia (LD) és undels més freqüents i delsque més limita la teràpiaantivírica de llarga durada(Martínez 2001).

Les definicions inicialsde la síndrome de LDassociada a teràpia anti-HIV parlaven de lipo-

atròfia perifèrica, acumulació de greix al tronc,dislipidèmia i resistència a insulina. Els primerstreballs en què es descriuen casos LD-HIV datendel 1998 (Carr 1998a; Viraben 1998). Ambdóstreballs implicaven als PI en la patogènesi de laLD, i es van proposar diverses hipòtesis per aexplicar aquesta suposada relació (Carr 1998b;Martinez 1998; Milpied-Homsi 1999). Enl'actualitat no està clar si els símptomes anteriorspertanyen a una o a dues síndromes, ni existeixuna definició consensuada de la lipodistròfiaassociada a la teràpia antivírica. En aquest sentit,el First International Workshop on Adverse DrugReactions and Lipodystrophy in HIV celebrat aSan Diego l'any 1999 tampoc va aconseguirelaborar un concepte gaire concret. Allà es vaacordar que el diagnòstic de LD havia de ser

TAULA 5. SUBSTÀNCIES ANTIVÍRIQUES IEFECTES SECUNDARIS DESCRITS

Inhibidors de proteïnesindinavir, nelfinavir, ritonavir, saquinavir

nàusees, vòmits, diarrea, fatiga, nefrolitiasi,hiperbilirrubinèmia, ↑ aminotransferases,hipertrigliceridèmia, hiperglicèmia,redistribució del greix corporal

Inhibidors nucleòsids de la transcriptasainversa

zidovudina, lamivudina, estavudina, zalcitabina,didanosina, abacavir

neuropatia, miopatia, cardiomiopatia,pancreatitis, esteatosi hepàtica, acidosi làctica,toxicitat nefrològica, hematològica idermatològica

Malalties estudiades INTRODUCCIÓ

43

confirmat pel metge31, i es va consensuar que lapèrdua de greix associada a LD s'observa sobretota les galtes i els glutis, mentre que l'acumulacióde greix ocorre al tronc, provocant un incrementdel perímetre abdominal. En alguns pacientstambé pot observar-se hipertròfia dels pits, unagepa a la part posterior del coll (o buffalo hump,vegeu la FIGURA 13), lipomes i un increment delgreix de la cara. La formulació d'un concepte mésdefinit de LD va ser posposada per a futurestrobades.

Si bé al principi es va responsabilitzar als PI dela LD, posteriorment també es va descriureaquesta complicació en pacients en règims ambNRTI que mai no havien estat tractats amb PI (Lo1998; Madge 1999; Saint-Marc 1999), per la qualcosa la mirada es va a dirigir cap els NRTI,sobretot considerant que la gran majoria depacients tractats amb PI havien estat tractats enprimer lloc amb NRTI en haver estat les primeresdrogues disponibles. Carr et al. defensen que tant

31 El diagnòstic de lipodistròfia no podia basar-se només en

la informació aportada pel pacient, malgrat en un estudi amb158 persones HIV positives tractades o no amb PI va existiruna concordança del 98% entre l'exploració física dels metgesi els informes dels mateixos pacients (Carr 1999).

les teràpies amb NRTI com les teràpies amb PIpoden causar la LD descrita en pacients HIVpositius (Carr 2000).

IMPLICACIÓ MITOCONDRIAL EN LA LD-HIVMoltes drogues antivíriques alteren el

funcionament dels mitocondris. Com ja s'ha vist,els NRTI actuen inhibint la transcriptasa inversade l'HIV. També són capaces, però, d'inhibir lesDNA polimerases humanes β i γ. La resta de DNApolimerases —α, δ i ε— no són afectades pelsanàlegs de nucleòsids (Brinkman 1998). Mentre esdesconeix l'efecte patogènic de la inhibició de laDNA polimerasa β (implicada en mecanismes dereparació del DNA), se sap que la inactivació dela polimerasa γ impedeix la replicació mito-condrial, ja que aquesta és l'única polimerasa quees troba dins d'aquests orgànuls (Lewis 1995).

L'efecte nociu dels antivírics sobre elsmitocondris és llargament conegut. In vitro podenreduir la viabilitat cel∙lular i el contingut demtDNA, i alterar la morfologia mitocondrial(Medina 1994). El grau d'aquests canvis ésdirectament proporcional a la concentració dedroga emprada. Els efectes in vivo, com quebloquegen la replicació del mtDNA, són moltsemblants als que s'observen en mitocon-driopaties d'origen genètic: miopatia, neuropatia,acidosi làctica, cardiomiopatia, etc. (Brinkman1998).

L'AZT ha provocat nombrosos casos demiopatia mitocondrial, i en alguns als que ha estatpossible practicar una biòpsia muscular s'hatrobat depleció del mtDNA (Arnaudo 1991; Mhiri1991; Casademont 1996). També és freqüent lapresència de fibres vermelles desestructurades id'inclusions paracristal∙lines. Tant els símptomesclínics com les alteracions moleculars podenrevertir si s'abandona el tractament amb AZT(Masanes 1998). García de la Asunción et al. hanobservat una producció de radicals lliures elevadaen pacients tractats amb AZT; aquest grup proposala següent hipòtesi: en no haver replicació delmtDNA no hi haurà generació de nousmitocondris, i restaran tan sols mitocondris vellsque produeixen una major quantitat de peròxids.Proposen que l'estrès oxidatiu contribueixdirectament o indirectament a les anomaliesprovocades per l'AZT, ja que han observat queamb l'administració d'antioxidants (vitamines C iE) s'evita el dany mitocondrial (de la Asuncion1998).

D'altra banda, s'han descrit anomalies en laCRM atribuïdes a l'exposició perinatal de NRTI

FIGURA 13. BUFFALO HUMP.Fotografia extreta de (Aboulafia 1998). Mostra un senyorde 52 anys infectat per l'HIV al que inicialment es vatractar amb dos NRTI. Després de 15 mesos la càrregavírica tornà a augmentar i se li va aplicar una HAARTque consistí en dos NRTI i un PI. Passat un any, elpacient va manifestar dificultats a l'hora de cordar-se lacamisa. L'observació clínica va identificar una massa degreix de 16 cm per 14 cm, sense anomalies endocrinesni al metabolisme dels lípids.

Lipodistròfia associada a teràpia antivírica

44

(Blanche 1999), tot i que alguns investigadorsqüestionen aspectes del treball (Morris 1999). ElsNRTI poden causar complicacions molts greus,com és l'acidosi làctica i esteatosi32 al fetge, casosen els quals també s'han identificat deficiènciesen els complexos de la CRM (Brivet 2000; Carr2001).

Brinkman et al. impliquen directament latoxicitat mitocondrial causada pels NRTI ambl'origen de la lipodistròfia en pacients HIV(Brinkman 1999). Kakuda et al. també ho fan, iproposen que l'afectació específica dels adipòcitspot ser deguda al funcionament particulard'aquestes cèl∙lules en les diferents zones del coshumà i a una especificitat tissular dels NRTI(Kakuda 1999). Així, com que els adipòcits deregions centrals tenen una taxa de lipòlisi méselevada que els adipòcits perifèrics, i atès queaquesta via és dependent d'energia, els primersnecessitarien un major nombre de mitocondrisque els segons. Si manca l'energia suficient, elslípids s'acumularan en les zones centrals. Lahiperlipidèmia i la resistència a insulina (queacompanyen freqüentment a la LD) poden serconseqüència d'alteracions en la funció delsadipòcits, i la pèrdua de greix perifèrica pot serdeguda a apoptosi als adipòcits més que no pasnecrosi, ja que no hi ha inflamació ni dolor. Amés, l'apoptosi dels adipòcits també podriaexplicar la hipertrigliceridèmia observada enmolts pacients amb LD.

Altres investigadors aposten per un origen de laLD multifactorial, en el qual cal considerar lesinteraccions entre la pròpia infecció vírica i elbalanç energètic o l'eliminació de triglicèrids, elsefectes dels PI en l'adipogènesi, les interaccionsamb la lipasa hepàtica, etc. D'altres, en canvi, esmostren escèptics amb el paper que pugui tenir latoxicitat mitocondrial (Moyle 2001).

Paral∙lelament a les contradiccions quant a lescauses que provoquen la síndrome de LD, tambéhi ha certes discrepàncies en els percentatges depacients HIV afectats i entre estudis que intentendeterminar els factors de risc d'aquestacomplicació. Darrerament s'estan publicantresultats a partir de treballs sobre un gran nombrede pacients tractats amb PI, en ocasionsprospectius. Els factors que poden predir la"intensitat" de la LD són la durada de la teràpia,les concentracions de triglicèrids en dejuni ipèptid C durant la teràpia (Carr 1999). Altresgrups detecten un risc més elevat per a les dones,

32 Adiposi, degeneració grassa.

tant heterosexuals com homosexuals, queaugmenta amb l'edat i la durada del règimHAART (Martínez 2001). En canvi, no troben unrisc superior associat a una exposició creixent acap dels retrovírics individuals.