Clase 3- Toxicol 2012-I
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ACTIVIDAD ENZIMTICA
Cuntos moles de sustrato son convertidos en producto por
unidad de tiempo?
setiembre 2012 1enzimas III
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FACTORES QUE AFECTAN
Temperatura
pH
[sustrato]
[enzima]
Buffers (kits comerciales)
Efectores (activadores e inhibidores)
Agentes estabilizantes (detergentes,
sales, agentes reductores, etc)??
setiembre 2012 2enzimas III
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ACTIVIDAD ENZIMTICA
UNIDAD DE ACTIVIDAD ENZIMATICA (U): mol de sustrato transformado en un minuto
ACTIVIDAD ESPECIFICA: unidades de enzima por
miligramo de protena (U/mg protena o mol min-1
mg protena-1)
CONSTANTE CATALITICA O NUMERO DE
RECAMBIO (TURNOVER): unidades de actividad
enzimtica por mol de enzima ( mol min-1 mol de enzima-1). Catalasa y alfa amilasa 5x106 y 1.9 x 104
setiembre 2012 3enzimas III
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DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD
ENZIMTICA
setiembre 2012 4enzimas III
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DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA
[E]constante y [S]
diferentes
La velocidad de
reaccin permanece
constante cuando la
enzima se satura
setiembre 2012 5enzimas III
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Cmo se mide la velocidad de reaccin?
(sustrato producto en el tiempo)
Debemos hacer la reaccin in vitro ?
1. Determinar el sustrato y anlogos
2. Determinar los parametros cinticos de
reaccin (pH, T, [S], [E], [Ef])
3. Disear un ensayo para visualizar la reaccin
4. Medir la velocidad de reaccin
setiembre 2012 6enzimas III
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Ejemplo de actividad enzimtica
-galactosidasa
-enlace
Nitrofenilglucosa nitrofenol + glucosa
(incoloro) (amarillo)
Medir la velocidad de aparicin de color amarillo
(sustrato) (productos)
setiembre 2012 7enzimas III
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Alcohol Deshidrogenasa (ADH)
CH3CH2OH + NAD+ CH3CH2O + H
+ + NADH
Catalisa la conversin de etanol a
aldehido usando la co-enzima NAD+
NAD+ oxidado a NADH reducido
NADH SE LEE A 340 NM
setiembre 2012 8enzimas III
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Efecto de la concentracin de enzima (relacin
lineal)
v
[E]
. . .. . .
. . .. .
setiembre 2012 9enzimas III
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v[s]
Efecto de la concentracin de substrato
..
.. . . .
.
setiembre 2012 10enzimas III
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E + S ES E + Pk+1
k-1
k+2
Una cintica hiperblica implica un proceso
saturante:
nmero limitado de sitios en la enzima
para fijar substrato; una vez que estn ocupados
todos, por mucho que aumente la concentracin
de substrato, la velocidad permanecer constante
tendiendo un valor asinttico
setiembre 2012 11enzimas III
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Se considera la reaccin en el equilibrio:
E + S ES E + P
setiembre 2012 12enzimas III
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Velocidad inicial (Vo)
Iniciar con [S] bajas e incrementar
Mantener la [E] saturante
Medir la velocidad de reaccin Vo hasta que la
velocidad sea constante Vmax
Cuando la enzima se mezcla con altas [S]
estado estacionario no permite caracterizacin
setiembre 2012 13enzimas III
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Velocidad inicial (Vo)
setiembre 2012 14enzimas III
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E + S ES E + Pk1 k2
k-1k-2
1. Enzima y sustrato se combinan para formar el complejo ES
2. Las reacciones son reversibles k-2, es despreciable
3. Asume que [ES] esta constante, estado estacionario :
d[ES]/dt = 0
4. [E]
-
E + S ES E + Pk1 k2
k-1
V0 = K2 [ES]
K2 [Et] [S]
= ------------------
[S] + km
velocidad mxima (Vmax) ocurre cuando [ES] = [Et]
As, Vmax = K2 [Et]
Vmax [S]
V0 = ------------------ (Ecuacin Michaelis-Menten)
km + [S]
setiembre 2012 16enzimas III
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E + S ES E + Pk1 k2
k-1
Vmax [S]
V0 = ------------------
km + [S]
Cuando V0 = 1/2 Vmax
Vmax Vmax [S]
--------------- = ------------------
2 km + [S]
Km = [S] cuando V0 = 1/2 Vmax
setiembre 2012 17enzimas III
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E + S ES E + Pk1
k2k-1
Km = [S] a 1/2 Vmax
Concentracin de substrato a la cual se alcanza
la mitad de la velocidad mxima
El Km ms bajo (menor sustrato para alcanzar la 1/2 Vmax)
El Km mide la afinidad de la enzima por el sustrato. A
bajo Km alta afinidad.
Una enzima con un Km de 10-6 M tiene mayor afinidad
por su sustrato que otra que tiene Km de 10-4 M
setiembre 2012 18enzimas III
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Cmo determinar Km y Vmax?
setiembre 2012 19enzimas III
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La ecuacin de Michaelis-Menten genera una
parbola .- no permite extrapolar los valores de
Km y Vmax facilmente
Convertir la ecuacin de Michaelis-Menten a su
inversa.- grfico de Lineweaver-Burk
setiembre 2012 20enzimas III
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Vmax [S]
V0 = ------------------ (ecuacin de Michaelis-Menten )
km + [S]
1 km + [S]
--------- = ------------------
V0 Vmax [S]
1 km [S]
---------- = ------------ + ------------
V0 Vmax [S] Vmax [S]
1 km 1 1
---------- = ------ ------ + ------ (ecuacin de Lineweaver-Burk)
V0 Vmax [S] Vmax
setiembre 2012 21enzimas III
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En el caso de la ecuacin Lineweaver-Burk
y = mx + c 1 km 1 1---------- = ------ ------ + ------
V0 Vmax [S] Vmax
Variables: y = 1/ V0 , x = 1 / [S]
Constante: c = 1 / VmaxPendiente: m = km / Vmax
setiembre 2012 22enzimas III
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Determinacin del Km
setiembre 2012 23enzimas III
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Determinacin de la Km
setiembre 2012 24enzimas III
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Determinacin de Vmax
setiembre 2012 25enzimas III
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Representacin recproca doble(Lineweaver - Burk)
1/s
-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6
1/v
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
1 1 1
v
K
V s Vm
mx mx
-1/Km
1/Vmax
setiembre 2012 26enzimas III
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Representacin s -s/v(Eadie - Hofstee)
s
-20 0 20 40 60 80 100 120
s/v
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
s
v Vs
K
Vmx
m
mx
1-Km
setiembre 2012 27enzimas III
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Representacin v/s - v(Wong - Hanes)
v/s
0 2 4 6 8 10 12 14 16
v
0
20
40
60
80
100
v Kv
sVm mx
Vmax
setiembre 2012 28enzimas III
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Km de algunas enzimas
setiembre 2012 29enzimas III
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setiembre 2012 30enzimas III