Clase Metodos Cuantitativos y Cualitativos (Analisis de Decision)
clase 8 Metodos espectrofotometricos
Transcript of clase 8 Metodos espectrofotometricos
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
1/56
BIO 368
ANALISIS INSTRUMENTAL
METODOS ESPECTROFOTOMETRICOS
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
2/56
QUE SON LAS RADIACIONES ELECTROMAGNETICAS?
Las radiaciones electromagnticas son ondas autopropagadas que
poseen un componente elctrico y otro magntico. Ellos oscilan
en planos perpendiculares uno de otro y de la direccin de propagacin,
y se encuentran en fase. Es lo que se denomina vulgarmente luz.
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
3/56
Estas ondas se diferencias unas de otras en su longitud de onda.
La longitud de onda es la distancia que hay entre los picks de 2ondas, y puede ir desde distancias muy grandes, de kilmetros, hasta
distancias muy pequeas, del orden de millonsimas de milmetro
llongitud de onda
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
4/56
Para representar el espectro de radiacin
electromagntica se utiliza una escala logartmica, es
decir una escala que de un punto al siguiente semultiplica por 10.
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
5/56
4.- La radiacin UV puede afectar a las molculas biolgicas al incidir sobre ellas ,pudiendo afectar al genoma y producir mutaciones (cncer).
5.- Los rayos X y Gamma son tan pequeo que por fuerza chocan con los tomos si se
interpone materia en su trayectoria. De ah su uso en radiografas e investigacin demateriales.
1.- Algunos tipos deradiacin son capaces
de atravesar la
atmsfera.
2.- Las ondas de radioson las ms largas
(kms).
3.- Las microondas,son de onda larga,ms larga que la
radiacin visible, se
utilizan en los radares
y telfonos mviles.
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
6/56
CLASIFICACION DE LAS ONDAS ELECTROMAGNETICAS
Se las clasifica de acuerdo a la FRECUENCIA o LONGITUD
de la onda. Ordenadas de mayor a menor longitud de onda ():
- Ondas de radio >100 cm
- Microondas 400 m - 30 cm
- Radiacin infrarroja 0,8 - 25 m
- Luz visible 400 - 700 nm-Luz ultravioleta 10 - 400 nm
UV A 320 - 400 nm
UV B 280 - 320 nm
- Rayos X 0,1 - 1 nm- Rayos gama < 0,1 nm
Nos referiremos en este curso principalmente a la espectrofotometra
ultravioleta y visible, reas ms utilizadas en Bioqumica.
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
7/56
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
8/56
PROPIEDADES DE LAS RADIACIONESELECTROMAGNETICAS
Las radiaciones electromagnticas presentan:Energa
Frecuencia (longitud de onda)
Intensidad (fotones)
Muy bien ejemplificadas en los espectros electrnicos:
Un electrn para pasar de su estado basal de energa a
un estado de mayor energa (o estado excitado) debe recibir
energa, lo que da lugar a un espectro de absorcin si la energa
proviene de radiaciones electromagnticas.
Cuando un electrn cae de un nivel de excitacin mayor a
uno menor, se emite energa, dando lugar a un espectro de emisin.
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
9/56
Espectro de Absorcin
Cada elemento quimico posee lneas de
absorcin en algunas longitudes de onda,
hecho que est asociado a las diferencias deenergia de sus distintos orbitales atomicos.
De hecho, se emplea el espectro de
absorcin para identificar los elementoscomponentes de algunas muestras.
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
10/56
EJEMPLO DE NIVELES DE ENERGIA QUE PUEDE
ALCANZAR UN ELECTRON
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
11/56
Aplicaciones de la espectroscopa de absorcin uv-vis
Cualitativa, Identificacin de cromforos por el espectro
A vs
Cuantitativa, medir la concentracin del cromforo
A = b C
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
12/56
UV
Visible
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
13/56
Las protenas absorben en el uv-vis?
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
14/56
ABSORBANCIA
max(nm)
(M-1 cm-1)
Triptofano 278
287
5600
4500
Tirosina 275 1400
Fenilalanina 258 200
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
15/56
Absorcin uv-vis de Protenas
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
16/56
Absorcin en el uv de residuos aromticos
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
17/56
Estimacin del coeficiente de absortividad molar de una protena
280 (M-1 cm-1) = 5500 x n(Trp) + 1490 x n(Tyr) + 125 x n(SS)
n(Trp) = nmero residuos de triptofano en la secuencia
n(Tyr) = nmero residuos de tirosina en la secuencia
n(SS) = nmero de enlaces disulfuro en la protena
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
18/56
Cambio espectral de la tirosina cuando se desprotona (pKa = 10.9), el
mximo de absorcin pasa de 280 nm a 295 nm
Titulacin espectrofotomtrica
de Ribonucleasa pancratica
bovina
RNasa tiene 6 residuos de tirosina
Espectro uv de la RNasa en funcin del pH
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
19/56
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
20/56
Absorcin en
el UV lejanode los cidos
nucleicos
Cromforo, responsable
de la absorcin, las
bases nitrogenadas
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
21/56
Espectro de absorcin de 2 bases nitrogenadas que formanparte de los cidos nucleicos a diferentes pHs
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
22/56
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
23/56
Aplicaciones espectroscopa de absorcin uv-vis
Identificacin
Cuantificacin
Cintica
Determinacin de parmetros estructurales:
desnaturalizacin
ubicacin de residuos
ionizacin de residuosasociacin con ligandos
ALGUNOS CONCEPTOS FUNDAMENTALES DE
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
24/56
La razn entre la intensidad de la luz transmitida (I) y la luz incidente(I
o
) en
una solucin es lo que se denomina la transmitancia (T):
T = (I/ Io) x 100(La intensidad se expresa como el nmero de fotones interactuando
en la unidad de tiempo).
Una sustancia totalmente transparente tiene una transmitancia de 100%,
mientras que una sustancia totalmente opaca tendr transmitancia 0.
Para valores intermedios de transmitancia se prefiere utilizar el conceptode extincin o absorbancia, que es el logaritmo del recproco de la
transmitancia:
ALGUNOS CONCEPTOS FUNDAMENTALES DEESPECTROFOTOMETRIA
A = log (1/T) = log ( Io/I)
A, por ser un logaritmo, carece de unidades y tiene un rango de valoresque va de 0 a infinito.
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
25/56
LA LEY DE LAMBERT-BEER
Esta ley relaciona la absorcin de luz con la concentracin de la
sustancia absorbente y el grosor de la capa de solucin que debe cruzarla luz, y establece que hay una proporcionalidad entre ambas :
A = x c x l
:coeficiente de extincin molar o absorbancia molar a una longitud deonda () dada.
c:concentracin de la solucin absorbente (Molar)l:paso de la luz a travs de la solucin (en cm)
(A menudo se usan otras unidades para expresar estos valores; hay que
ser cuidadoso en su uso)
Si bien la ley de Lambert-Beer establece una relacin lineal entre
absorbancia y concentracin, ello se pierde a altas concentraciones.
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
26/56
0
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
27/56
LIMITACIONES DE APLICABILIDAD DE LA LEY DE BEER
A) Limitaciones reales de la ley
B) Limitaciones Qumicas
C) Limitaciones Instrumentales
La proporcionalidad directa entre absorbancia y
concentracin cuandob
es cte presenta desviaciones:
La atenuacin de una radiacin es cuantitativamenteproporcional a ala concentracin de la especie absorbente
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
28/56
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
29/56
LIMITACIONES DE APLICABILIDAD DE LA LEY DE BEER
C) L im i t a c ione s I n s t r umen ta l e s
El cumplimiento estricto de la Ley de Beer slo se observa pararadiaciones monocromticas (radiacin formada por una solalongitud de onda) y stas en la prctica no se consiguen, ya quecon los dispositivos disponibles (filtros, monocromadores) seobtienen una banda de longitudes de onda ms o menos simtrica
entorno a la deseada.Otra desviacin: Presencia de radiacin parsita o dispersa.
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
30/56
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
31/56
IMPORTANCIA DEL BLANCOEN ESPECTROFOTOMETRIA
Debe contener todos los componentes de la muestra excepto la
sustancia cuya absorbancia se desea medir. Este valor debe sustraerse
en cada lectura, ya sea restndole su valor de absorbancia o ajustando
el instrumento a cero con el blanco.
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
32/56
INSTRUMENTACION UTILIZADA
- Colormetro de filtro
- Espectrofotmetro de simple haz
- Espectrofotmetro de doble haz
- Espectrofotmetro de arreglo de diodos
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
33/56
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
34/56
APLICACIONES
CARACTERSTICAS DE LOS MTODOSESPECTROFOTOMTRICOS- Amplia aplicabilidad.
- Elevada sensibilidad: los lmites deteccin 10-4 a 10-5 M.- Selectividad de moderada a alta.
- Buena exactitud: errores de concentracin 1-5% o incluso menores.
- Facilidad y comodidad en las medidas espectrofotomtricas.
- Se prestan a una fcil automatizacin.
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
35/56
ESQUEMA CON LA ESTRUCTURA BASICA DE UNCOLORIMETRO O ESPECTROFOTMETRO
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
36/56
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
37/56
LA FUENTE LUMINOSA
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
38/56
LA FUENTE LUMINOSA
-Lmpara de tungsteno (luz visible; de 350 a 800 nm)
-Lmpara de deuterio o hidrgeno (luz ultravioleta; de 190 a 380 nm)
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
39/56
Abertura de la rendija de entradade la luz
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
40/56
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
41/56
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
42/56
El MONOCROMADOR
Es un dispositivo ptico que selecciona y transmite una banda estrecha
de longitudes de onda de luz a partir de la luz generada por la lmpara.
Tipos de monocromadorusados:
- Filtro (banda ancha; poco selectivo). Utilizado en los colormetros.Filtros diferentes para distintas aplicaciones. Ms econmico.
- Prisma. Resuelve el espectro en sus componentes porrefraccin.
- Red de difraccin (grating). Descompone el espectro pordifraccin.
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
43/56
El monocromador separa una luz incidentepolicromtica en sus componentes y genera
la luz monocromatica.
El i f i d l l
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
44/56
Refraccin: cambio enla direccin de una onda
por cambios de su velocidad
al pasar a un medio dedistinta densidad.
diafragma
El prisma genera refraccin de la luz
La refraccin es el cambio de direccin que experimenta una onda al pasar de unmedio material a otro.
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
45/56
La radiacin se reflejada y se esparce las ondas
cuando encuentran un obstculo o al atravesar una
rendija.
DIFRACCION:
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
46/56
LA RED DE DIFRACCIONEspejo al que se le han grabado una serie de hendiduras paralelas (>5 000/cm).
La radiacin reflejada por una hendidura se sobrepone a las de las hendiduras
vecinas, produciendo interferencias. Si la distancia entre las hendiduras es un
nmero entero de , se refleja luz; de otro modo se interfieren.Las reflejadas estn determinadas por el ngulo que forma la luz con
la red. El ngulo de desviacin de los haces de luz en una red de difraccin
depende de la longitud de onda de la luz. As, la red de difraccin
separa una luz incidente policromtica en sus componentes de
distinta longitud de onda.
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
47/56
CUBETAS PARA LAS MUESTRAS
-Vidrio: luz visible (> 350 nm)-Plstico: desechables; luz visible-Cuarzo: luz ultravioleta y visible (muy caras)
EL DETECTOR
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
48/56
EL DETECTOR
- Fotovoltaicos (La luz genera cambios en la intensidad de
corriente)
Resumen
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
49/56
A= a. b. C El espectrofotmetro convencional enfoca la luz policromtica de la
fuente en un monocromador. Este tiene como componentesprincipales una ranura de entrada, un elemento que dispersa la luz en
sus longitudes de onda componentes (en general una red dedifraccin), y una ranura de salida que permite seleccionar la longitudde onda deseada.
Esa luz monocromtica atraviesa la muestra, y llega al detector. Lasmediciones fotomtricas se hacen en base a la relacin entre la
potencia de luz que alcanza al detector cuando est interpuesta lamuestra (P) y cuando no lo est (P0) o cuando est interpuesto unblanco.
detector
fuente
Resumen
E f d l d
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
50/56
Espectrofotmetro de arreglo de
diodos El espectrofotmetro de arreglo de diodos (diode array) fue
introducido a mediados de los aos 1970. Es una variacinde los espectrofotmetros de la regin ultravioleta.
Utiliza una ptica invertida respecto del convencional: todala luz de la fuente atraviesa la muestra, y luego esdispersada en un monocromador que, en lugar de una ranurade salida, tiene en el plano focal un dispositivo que integraen unpequeo circuito varios cientos de detectores tipo
fotodiodo de silicio.
Este espectrofotmetro se compone de una serie de diodosfotosensibles lugar lado a lado y aislados unos de otros enforma de capas mltiples sndwich.
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
51/56
ESTRUCTURA ESQUEMATICA DE UNESPECTROFOTOMETRO DE ARREGLO DE DIODOS
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
52/56
Cada elemento del dispositivo recibe luz de un rangoparticular de longitudes de onda, y un ordenador procesalos datos recibidos. Las principales ventajas delespectrofotmetro de dispositivo de fotodiodos son que paraobtener un espectro no hace falta mover ningn elemento, ylos espectros se obtienen en forma casi instantnea.
0.1nm de resolucin2 nm de resolucin
diodos
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
53/56
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
54/56
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
55/56
ESQUEMA DE UNESPECTROFOTOMETRO
DE DOBLE HAZ
ESQUEMA DE UNESPECTROFOTOMETRODE SIMPLE
-
8/3/2019 clase 8 Metodos espectrofotometricos
56/56