Construcción de una biblioteca genómica

• Cada fragmento en un vector que entra en una célula bacteriana = libro

• Clonado de todos los fragmentos del genoma de un organismo = library genómica

• La colección de todos los clones es la library genómica

Una library genómica tiene:

• sec. representativas de todo el genoma

• N° manejable de clones

• fragm. clonados largos

• solapamiento de sec. entre los clones

• fácil de construir

• fácil de hacer el screening

• ser amplificables

Digestión parcial

Construcción de una biblioteca genómica

• Para asegurar que los fragmentos de DNA sean del tamaño adecuado para clonado– Digestión con enzima de restricción con sitio

de reconocimiento con 4bp– Hacer digestión parcial (no todos los sitios

clivados)– Ligar los fragmentos al vector

Preparación del inserto

Preparación de fragmentos

Digestión parcial con ER variable o tiempo variable

Library genómica

Números

Equivalente genómico= largo total genoma/tamaño promedio del inserto

Para el genoma humano, usando un tamaño promedio de inserto de 6 kb en un vector1 equivalente genoma = (3 x 109 bp) / (6 x 103 bp)= 5 x 105 vectores.Para el genoma humano usando un fago l de reemplazo con insertos de 20 kb1 genome equivalent = (3 x 109 / (2 x 104 bp) = 1.5 x 105 fagos.

 

Cálculo más preciso:

Una ER six-cutter (e.g. Eco RI) cortará en promedio cada 4.1 Kb. La completa digestion de DNA humano resultará en aproximadamente 1 x 106 fragmentos únicos.

Cuál es la probabilidad de encontrar un clon en una library?

N = ln(1 -P)/ln(1 - f)

P probabilidad deseada

f fracción proporcional del genoma en un solo recombinante

N número necesario de recombinantes

N = ln(1 - 0.99)/ln(1 - (4096/3x109)) N = 3.37 x 106 clones

Vectores empleados

– Cosmid 30 - 45 kb – Phage P1 80 - 100 kb – P1 phage (PAC) 50 - 150 kb– F factor (BAC) 50 - 300 kb– YAC (yeast) 200 - 1000 kb

Construcción de una biblioteca genómica

Vectores empleados

– Cosmid 30 - 45 kb – Phage P1 80 - 100 kb – P1 phage (PAC) 50 - 150 kb– F factor (BAC) 50 - 300 kb– YAC (yeast) 200 - 1000 kb

Construcción de una biblioteca genómica

Cosmid Cloning

Cosmid Cloning

Vectores empleados

– Cosmid 30 - 45 kb – Phage P1 80 - 100 kb – P1 phage (PAC) 50 - 150 kb– F factor (BAC) 50 - 300 kb– YAC (yeast) 200 - 1000 kb

Construcción de una biblioteca genómica

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YAC vectors for cloning large DNA inserts

CEN4ori

URA3

TEL TEL

TRP1

CEN4ori

SUP4

TRP1

URA3TEL TEL

pYAC3

BB

S

Cut with restrictionEnzymes S + B

Ligate to very largeFragments of genomicDNA

Large insert, 400 to as much as 1400 kb

11.4 kb

Yeast artificial chromosome = YAC

Not to scale.

Vectores empleados

– Cosmid 30 - 45 kb – Phage P1 80 - 100 kb – P1 phage (PAC) 50 - 150 kb– F factor (BAC) 50 - 300 kb– YAC (yeast) 200 - 1000 kb

Construcción de una biblioteca genómica

BAC son derivados del plásmido F de E. coli y contiene los siguientes elementos:

parA y parB para asegurar una segregación apropiada

oriS y repE involucrados en la replicación unidireccional

un marcador que otorga resistencia a ampicilina

el sitio cosN de P1 para el clivado sitio específico via P1-Ter

el sitio loxP de P1 para el clivado sitio específico via P1-Cre

inactivación del gen lacZ

• el clonado se realiza directamente en el plásmido circular (cortado con 1 ER) o en el vector cortado con 2ERs (2 brazos)

• la mezcla de DNA ligado se transfiere en E.coli via electroporación

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BAC vectors for large DNA inserts

Cut with restriction enzyme E, remove “stuffer”

Ligate to very large fragments of genomic DNA

SacBII

promoter

oriF

Cm(R)

pBACe3.6

EES

11.5 kb

SacB+: SacBII encodes levansucrase, which converts sucrose to levan, a compound toxic to the bacteria.

Large insert, 300kb

oriFCm(R)

promoter

SSacBII

SacB-: No toxic levan produced on sucrosemedia: positive selection for recombinants.

Not to scale.

Screening de una library

• Sondas (probes) para hibridización

un gen vecino un gen relacionado evolutivamenteotro miembro de la familia génica una mezcla de oligos degenerados

derivados de una secuencia conservada de aminoácidos

un exón conocido del gen

• PCR con pooles de clones