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Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la producción diferencial de metabolitos
especializados
Paola Andrea Martínez Buitrago
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Departamento de Química
Bogotá, Colombia
2019
Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la producción diferencial de metabolitos
especializados
Paola Andrea Martínez Buitrago
Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:
Maestría en Ciencias - Química
Director:
Ph. D. Leonardo Castellanos Hernández
Línea de Investigación:
Productos Naturales de Microorganismos
Grupo de Investigación:
Estudio y Aprovechamiento de Productos Naturales Marinos y Frutas de Colombia
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Departamento de Química
Bogotá, Colombia
2019
“Sucess is like failure, it’s how you perceive
it, it’s what you do with it, not how you
achieve it”
Merrily We Roll Along, Stephen Sondheim
Agradecimientos
A la Universidad Nacional por brindarme mi formación de pregrado y maestría.
A Colciencias y a la División de Investigación de la sede Bogotá de la Universidad Nacional por
el financiamiento que permitió el desarrollo de esta tesis. A la Facultad de Ciencias y al
Departamento de Química por la beca Auxiliar Docente.
Al ANLA y al Ministerio de Ambiente y Desarrollo Sostenible por otorgar los permisos de
colecta e investigación (Contrato de Acceso a Recurso Genético No. 108 del 10 de febrero de
2010 y Contrato Marco de Acceso a Recurso Genético y sus Productos Derivados No. 121 del
22 de enero del 2016).
Al laboratorio de Resonancia Magnética Nuclear, en especial a Katherine Jaramillo por su
ayuda en el registro de los experimentos
Al profesor Leonardo Castellanos por su compromiso, orientación y apoyo en el desarrollo de
esta tesis. Al profesor Freddy Ramos por el apoyo brindado durante mi estancia en el grupo
de investigación.
A Zulma Suárez y Fernanda Oliveira Chagas que me brindaron valiosos consejos en el diseño
experimental de este trabajo.
A Luz Adriana Betancur y Diana Vinchira por solucionar todas mis dudas microbiológicas.
Al grupo de investigación “Estudio y Aprovechamiento de Productos Naturales Marinos y
Frutas de Colombia” que es la muestra de que la investigación es fruto de un trabajo arduo e
interdisciplinario. Un agradecimiento a todos aquellos integrantes del pasado y del presente
que me colaboraron siempre que lo necesité.
A Javier por toda la ayuda en “Mastering my master” y por todas las discusiones
enriquecedoras.
VIII Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la producción
diferencial de metabolitos especializados
A Camilo por mantenerme alejada de la monotonía y por todas aquellas conversaciones sobre
los temas más inesperados.
A mis perros y mis gatos por hacer mis días más felices.
A mi familia, en especial a mi mamá por su amor y apoyo incondicional .
Resumen
Uno de los desafíos actuales en el estudio de productos naturales de microorganismos es el re-
aislamiento frecuente de compuestos conocidos. De otro lado, es conocido que múltiples
clústers de genes que pueden codificar para metabolitos permanecen silenciados en
condiciones estándares de laboratorio. Con el fin inducir la expresión de estos genes, se han
desarrollado varios métodos que incluyen el co-cultivo de microorganismos, cuyo uso se ha
incrementado en los últimos años. En este contexto, esta tesis de maestría se propuso
implementar metodologías de selección y estudio co-cultivos de microorganismos que
condujeran a la identificación de compuestos inducidos por la interacción de los
microorganismos seleccionados.
Como primer paso se revisaron 100 artículos de co-cultivos, buscando identificar los criterios
más usados para la selección de microorganismos. Se encontró que, en la mayoría de los
reportes, los co-cultivos seleccionados provienen de un screening de múltiples parejas de un
cepario o que los autores no reportan cómo se llevó a cabo el proceso de selección. En los
demás reportes se pudieron identificar los siguientes seis criterios: conocimiento previo de
los microorganismos, criterio ecológico o parejas formadas por microorganismos recuperados
de la misma muestra biológica, Actinobacteria vs. bacteria con ácido micólico en su pared
celular, bacteria del género Streptomyces sp. vs. bacteria del género Streptomyces sp., bacteria
del género Streptomyces sp. vs. Proteobacteria, y enfrentamiento con patógenos.
Algunos de estos criterios se emplearon para seleccionar 15 microorganismos a partir del
cepario del grupo de investigación, que contiene más de 200 microorganismos. Este set de
microorganismos estaba conformado por 14 bacterias y un hongo, para su inclusión se
emplearon como criterios de selección al menos uno de los que se mencionan a continuación:
conocimiento previo de su producción química y/o actividad biológica, bacteria con ácido
micólico en su pared celular, microorganismos recuperados de la misma muestra, y bacteria
perteneciente al género Streptomyces.
X Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la producción
diferencial de metabolitos especializados
Posteriormente, se evaluaron todas los posibles co-cultivos binarios (105) en medio líquido a
una escala de 15mL. Los extractos orgánicos de estos cultivos fueron analizados por UHPLC-
DAD-ELSD, y se seleccionaron 5 parejas que mostraban cambios inducidos por la interacción.
Estas 5 parejas fueron cultivadas en una escala de 100mL, donde se encontró que en ninguna
de las parejas se observaban los cambios detectados a una escala de 15mL. Sumado a esto, en
ninguno de los 5 co-cultivos se garantizó la coexistencia de ambos microorganismos.
Teniendo en cuenta estos resultados, se decidió realizar un screening de interacciones en
medio sólido, empleando 4 medios de cultivo (PDA, ISP2, ISP3, LB), y evaluando interacciones
a distancia e interacciones por contacto. Las primeras permitían evaluar las interacciones
debidas a compuestos difusibles; las segundas permitían evaluar interacciones debidas a
contacto célula-célula. Se evaluaron cambios fenotípicos inducidos por el co-cultivo y se
evaluaron los extractos orgánicos por HPLC-DAD. Las interacciones promisorias fueron
analizadas por RMN (experimentos RMN 1H y COSY). A partir de estos resultados se
identificaron 7 co-cultivos cuya expresión metabólica era diferente respecto a los
monocultivos respectivos, es decir parejas promisorias para el estudio de su producción
metabólica. Estas parejas corresponden a: Streptomyces sp. PNM-161a y Rhodococcus sp.
RKHC-26 (contacto, LB): Purpureocillium sp. PNM-67 y Paenibacillus sp. PNM-123 (distancia,
PDA); Purpureocillium sp. PNM-67 y Rhodococcus sp. RKHC-26 (contacto, PDA);
Purpureocillium sp. PNM-67 y Streptomyces sp. IBUN-5.1 (distancia, ISP3); Purpureocillium sp.
PNM-67 y Paenibacillus sp. PNM-115 (distancia, ISP3); Purpureocillium sp. PNM-67 y
Paenibacillus sp. PNM-123 (distancia, ISP3); y Purpureocillium sp. PNM-67 y Paenibacillus sp.
PNM-210 (distancia, ISP3). Los espectros de RMN y los cromatogramas sugieren que en los 4
co-cultivos en medio ISP3, se induce la producción de compuestos iguales o similares pero en
concentraciones diferentes.
El co-cultivo entre la bacteria Streptomyces sp. PNM-161a y la bacteria con ácido micólico
Rhodococcus sp. RKHC-26 por contacto, y en medio LB, se analizó empleando LC-MS/MS y se
construyeron redes moleculares que permitieron observar que el co-cultivo induce la
producción de una familia molecular. La derreplicación de esta red sugiere la producción de
compuestos tipo macrólido y péptido con actividad antibiótica. El estudio del cultivo en mayor
volumen (380 cajas) fue seguido por RMN, y permitió evidenciar algunos cambios menores,
pero no permitió el aislamiento de compuestos inducidos por el co-cultivo. A partir del
extracto orgánico del co-cultivo se aislaron el ácido 5-(2-amino-3-hidroxi-1-(1H-indol-3-
Contenido XI
il)propil)-2-hidroxibenzoico (4.1) y el ácido antranílico (4.2.). Estos compuestos son
producidos por Streptomyces sp. PNM-161a en monocultivo por lo que su producción no es
exclusiva al co-cultivo.
El co-cultivo entre el hongo Purpureocillium sp. PNM-67, y la bacteria con ácido micólico
Rhodococcus sp. RKHC-26 por contacto y en PDA, fue analizado por LC-MS/MS. El uso de
análisis multivariado, y la construcción de redes moleculares integrado con derreplicación (a
partir del GNPS y el Dictionary of Natural Products), permitieron observar que el co-cultivo
incrementa la concentración de la leucinostatina A y leucinostatina B, e induce la producción
de 4 leucinostatinas ya reportadas. Este co-cultivo constituye el primer reporte de un co-
cultivo exitoso entre un hongo y una bacteria con ácido micólico.
Los dos co-cultivos por contacto que fueron estudiados demostraron ser poco reproducibles.
Es necesario el mejoramiento de las condiciones experimentales con el fin de mejorar la
reproducibilidad de estos experimentos.
El co-cultivo entre el hongo Purpureocillium sp. PNM-67 y la bacteria Paenibacillus sp. PNM-
123 a distancia, y en PDA, fue realizado en mayor volumen (450 cajas de Petri). A partir de su
extracto orgánico se aislaron los alcaloides tipo withasomnina de nombres 5,6-dihidro-2-(sec-
butil)-4H-pirrolo[1,2b]pirazol (5.1) y 5,6-dihidro-2-isopropil-4H-pirrolo[1,2b]pirazol (5.2),
siendo el primero por primera vez reportado en esta tesis. Estos compuestos son inducidos
por el co-cultivo, y probablemente producidos por la bacteria Paenibacillus sp. PNM-123
teniendo en cuenta el gradiente de difusión de los mismos. Este tipo de compuestos son poco
comunes en la literatura científica de productos naturales obtenidos de microorganismos.
El co-cultivo entre el hongo Purpureocillium sp. PNM-67 y la bacteria Streptomyces sp. IBUN-
5.1. a distancia, y en medio ISP3, fue realizado en mayor volumen (450 cajas de Petri) teniendo
en cuenta que de las 4 interacciones promisorias observadas en medio ISP3, ésta era la que a
juzgar por RMN producía mayor cantidad de el(los) compuestos inducidos por el co-cultivo. A
partir del extracto orgánico del co-cultivo se aisló el compuesto alternariol (5.3), una
micotoxina ampliamente estudiada por estar presente en cultivos de alimentos. Este
compuesto es producido por el hongo tanto en esta interacción, como en sus interacciones con
las bacterias Paenibacillus sp. PNM-115, Paenibacillus sp. PNM-123 y Paenibacillus sp. PNM-
210. Los extractos orgánicos de la zona de la interacción para estos 4 co-cultivos fueron
analizados por LC/MS-MS, y se construyeron redes moleculares. Según estos análisis el co-
XII Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la producción
diferencial de metabolitos especializados
cultivo del hongo con la bacteria Paenibacillus sp. PNM-115 es el más prometedor para su
posterior evaluación en mayor volumen pues es el que genera una mayor cantidad de features
asociadas exclusivamente a él.
Esta tesis es el primer reporte, hasta donde llega nuestro conocimiento, de un estudio químico
de co-cultivo de microorganismos como estrategia de inducción de productos naturales en
Colombia.
Palabras clave: co-cultivo, fermentación mixta, interacción interespecies, productos
naturales.
Resumen y Abstract XIII
Abstract
One of the current challenges in the study of natural products from microorganisms is the
frequent reisolation of known compounds. Multiple gene clusters that may encode metabolites
remain silent under standard laboratory conditions. In order to induce the expression of these
genes, several methods have been developed, including microorganism co-culture, its use has
increased in recent years. In this way, this master’s thesis was seeking to implement
methodologies of selection and study of co-cultures that lead to the identification of
compounds due to interaction.
As a first step, 100 co-culture articles were reviewed, in order to identify the most commonly
used criteria for microorganism selection. It was found that in most of the reports, the selected
co-cultures came from a screening of multiple couples of a collection of microorganisms, or
the authors did not report how the selection process was carried out. In the other reports the
following six criteria were identified: prior knowledge of microorganisms, ecological criteria
or couples of microorganisms recovered from the same biological sample, Actinobacteria vs.
mycolic acid containing bacteria, bacteria of the genus Streptomyces sp. vs. bacteria of the
genus Streptomyces sp., bacteria of the genus Streptomyces sp. vs. Proteobacteria and use of
pathogens.
Some of these criteria were used to select 15 microorganisms from the collection of
microorganisms of the research group. This set included 14 bacteria and a fungus, for their
inclusion at least one of the following selection criteria were used: prior knowledge of its
chemical production and/or biological activity, mycolic acid containing bacteria,
microorganisms recovered from the same sample, and bacteria from genus Streptomyces.
Subsequently, binary co-cultures (105) were evaluated in liquid media on a 15mL scale.
Organic extracts from these cultures were analyzed by UHPLC-DAD-ELSD, and 5 couples that
XIV Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la producción
diferencial de metabolitos especializados
showed changes due interaction were selected. These 5 couples were cultured on 100mL scale,
where it was found that none of the couples had the detected changes at 15ml scale. In
addition, none of the five co-cultures guaranteed the coexistence of both microorganisms.
Taking into account these results, an interactions screening in solid media was performed
using 4 different culture media (PDA, ISP2, ISP3, LB), and two different methodologies:
distance assays and contact assays. The former allowed to evaluate the interactions due to
diffusible compounds; the latter allowed to evaluate interactions due to cell-cell contact.
Phenotypic changes induced by co-culture were evaluated and organic extracts were analyzed
by HPLC-DAD. Promising interactions were analyzed by NMR (NMR 1H and COSY
experiments). From these results, 7 co-cultures were identified as promising because their
metabolic production was different from their respective monocultures. These couples are:
Streptomyces sp. PNM-161a and Rhodococcus sp. RKHC-26 (contact, LB), Purpureocillium sp.
PNM-67 and Paenibacillus sp. PNM-123 (distance, PDA), Purpureocillium sp. PNM-67 and
Rhodococcus sp. RKHC-26 (contact, PDA), Purpureocillium sp. PNM-67 and Streptomyces sp.
IBUN-5.1 (distance, ISP3), Purpureocillium sp. PNM-67 and Paenibacillus sp. PNM-115
(distance, ISP3), Purpureocillium sp. PNM-67 and Paenibacillus sp. PNM-123 (distance, ISP3),
and Purpureocillium sp. PNM-67 and Paenibacillus sp. PNM-210 (distance, ISP3). NMR spectra
and HPLC chromatograms suggest that the four ISP3 co-cultures produce equal or similar
induced compounds but in different concentrations.
The co-culture between Streptomyces sp. PNM-161a and the mycolic acid containing bacteria
Rhodococcus sp. RKHC-26 (contact, LB) was analyzed using LC-MS/MS. Molecular networks
showed that co-culture induces the production of a molecular family. Dereplication of this
network suggests the production of macrolide and peptide compounds with antibiotic
activity. The study of this co-culture (in 380 Petri dishes) was followed by NMR, and allowed
to show some minor changes, but did not allow the isolation of induced compounds by co-
culture. 5-(2-amino-3-hydroxy-1-(1H-indol-3-yl)propyl)-2-hydroxybenzoic acid (4.1) and
anthranilic acid (4.2.) were isolated from the organic extract of the co-culture. These
compounds are produced by Streptomyces sp. PNM-161a in monoculture so their production
is not exclusive to co-culture.
The co-culture between Purpureocillium sp. PNM-67 and the mycolic acid containing bacteria
Rhodococcus sp. RKHC-26 (contact, PDA) was analyzed by LC-MS/MS. Multivariate data
Contenido XV
analysis and the construction of molecular networks were integrated with dereplication
(using GNPS and the Dictionary of Natural Products). This analysis showed that the co-culture
increases the concentration of leucinostatin A and leucinostatin B and induces the production
of 4 leucinostatins previously reported. To our knowledge, the co-culture between
Purpureocillium sp. PNM-67 and Rhodococcus sp. RKHC-26 is the first successful example of an
interaction between a fungus and mycolic acid-containing bacteria.
The two co-cultures whose interaction is due to cell-cell contact lack reproducibility.
Improvement of experimental conditions is needed for the establishment of contact co-
cultures in order to improve the reproducibility of experiments.
The co-culture between Purpureocillium sp. PNM-67 and Paenibacillus sp. PNM-123 (distance,
PDA) was cultured in 450 Petri dishes and from its organic extract withasomnine-type alkaloid
compounds were isolated: 5,6-dihydro-2-(sec-butyl)-4H-pyrrolo[1,2b]pyzole (5.1) and 5,6-
dihydro-2-isopropyl-4H-pyrrolo[1,2b]pyrazole (5.2). Compound 5.1. has not been reported
previously. These compounds are induced by co-cultivation and are probably produced by
Paenibacillus sp. PNM-123 taking into account their diffusion gradient. This kind of
compounds is rare in the scientific literature of natural products obtained from
microorganisms.
The co-culture between Purpureocillium sp. PNM-67 and Streptomyces sp. IBUN-5.1. (distance,
ISP3) was performed in 450 Petri dishes taking into account that of the 4 promising
interactions observed in ISP3 medium, this couple was the one that produced the highest
amount of the induced compounds according to NMR analysis. Alternariol (5.3) was isolated
from the organic extract of the co-culture. This compound is produced by the fungus due
interaction in this co-culture, and in co-cultures with Paenibacillus sp. PNM-115, Paenibacillus
sp. PNM-123 and Paenibacillus sp. PNM-210. Organic extracts from the interaction zones of
these 4 co-cultures were analyzed by LC/MS-MS, and molecular networks were built.
According to these analyses, the co-culture of the fungus with Paenibacillus sp. PNM-115 is the
most promising for further chemical studies because it induces the greatest amount of features
associated exclusively with its co-culture.
As far as we know, this thesis is the first report in Colombia of a chemical study of
microorganism co-culture as a strategy for natural products induction.
XVI Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la producción
diferencial de metabolitos especializados
Keywords: microorganism co-culture, mixed fermentation, interspecies interaction, mycolic
acid-containing bacteria, natural products.
Contenido XVII
Contenido
Pág.
Resumen ..............................................................................................................................................VII
Abstract .............................................................................................................................................. XIII
Lista de figuras ................................................................................................................................... XX
Lista de tablas ................................................................................................................................XXIII
Lista de Símbolos y abreviaturas ............................................................................................... XXV
Introducción .......................................................................................................................................... 1
1. Capítulo 1: Co-cultivo de microorganismos como estrategia de inducción de productos naturales ............................................................................................................................ 3
1.1 Técnicas de inducción, activación y regulación de genes silenciados y crípticos ..........4 1.1.1 Alteración de las condiciones físicas y químicas ........................................................................ 5 1.1.2 Modificaciones genéticas ........................................................................................................................ 6
1.2 Co-cultivo o fermentación mixta de microorganismos ................................................................6 1.2.1 Generalidades ............................................................................................................................................... 6 1.2.2 Modos de interacción ............................................................................................................................ 12 1.2.3 Consideraciones experimentales .................................................................................................... 15 1.2.4 Métodos complementarios al co-cultivo ..................................................................................... 24 1.2.5 Desafíos y futuro del co-cultivo........................................................................................................ 24
1.3 Bibliografía ....................................................................................................................................................... 25
2. Capítulo 2: Selección de microorganismos y screening de co-cultivos binarios en medio líquido ..................................................................................................................................... 37
Resumen ........................................................................................................................................................................... 37 2.1 Introducción .................................................................................................................................................... 38 2.2 Materiales y métodos ................................................................................................................................. 41
2.2.1 General .......................................................................................................................................................... 41 2.2.2 Selección de microorganismos ......................................................................................................... 42 2.2.3 Co-cultivos................................................................................................................................................... 42 2.2.4 Extracción .................................................................................................................................................... 43 2.2.5 Ensayos de actividad biológica ......................................................................................................... 44 2.2.6 Perfilado metabólico .............................................................................................................................. 44
2.3 Resultados y discusión............................................................................................................................... 45 2.4 Conclusiones ................................................................................................................................................... 54
XVIII Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
2.5 Bibliografía....................................................................................................................................................... 54
3. Capítulo 3: Screening de co-cultivos binarios a partir de microorganismos de origen marino en medio sólido ..................................................................................................... 59
Resumen ........................................................................................................................................................................... 59 3.1 Introducción .................................................................................................................................................... 60 3.2 Materiales y métodos ................................................................................................................................. 62
3.2.1 General .......................................................................................................................................................... 62 3.2.2 Selección de microorganismos ......................................................................................................... 63 3.2.3 Selección primaria de parejas a evaluar ...................................................................................... 63 3.2.4 Co-cultivos binarios ............................................................................................................................... 64 3.2.5 Extracción .................................................................................................................................................... 66 3.2.6 Perfilado metabólico .............................................................................................................................. 67
3.3 Resultados y discusión .............................................................................................................................. 68 3.3.1 Co-cultivos bacteria-bacteria ............................................................................................................ 68 3.3.2 Co-cultivos bacteria-hongo ................................................................................................................ 76
3.4 Conclusiones ................................................................................................................................................... 86 3.5 Bibliografía....................................................................................................................................................... 87
4. Capítulo 4: Análisis de la producción metabólica de dos interacciones por contacto con la bacteria con ácido micólico Rhodococcus sp. RKHC.26 ............................................... 91
Resumen ........................................................................................................................................................................... 91 4.1 Introducción .................................................................................................................................................... 92 4.2 Materiales y métodos ................................................................................................................................. 95
4.2.1 General .......................................................................................................................................................... 95 4.2.2 Cultivos ......................................................................................................................................................... 96 4.2.3 Extracción .................................................................................................................................................... 96 4.2.4 Fraccionamiento y aislamiento ........................................................................................................ 97 4.2.5 Análisis por LC/MS-MS ......................................................................................................................... 99 4.2.6 Pre-procesamiento de los datos por LC/MS-MS en MZmine ............................................ 99 4.2.7 Análisis multivariado ......................................................................................................................... 100 4.2.8 Construcción de redes moleculares ............................................................................................ 101 4.2.9 Derreplicación ........................................................................................................................................ 101
4.3 Resultados y discusión ........................................................................................................................... 102 4.3.1 Co-cultivo entre la bacteria Streptomyces sp. PNM-161a y la bacteria con ácido micólico Rhodococcus sp. RKHC-26 ............................................................................................................ 102 4.3.2 Co-cultivo entre el hongo Purpureocillium sp. PNM-67 y la bacteria con ácido micólico Rhodococcus sp. RKHC-26 ............................................................................................................ 115
4.4 Conclusiones ................................................................................................................................................ 126 4.5 Bibliografía.................................................................................................................................................... 127
5. Capítulo 5: Análisis de la producción metabólica de interacciones a distancia entre el hongo Purpureocillium sp. PNM.67 y bacterias del género Streptomyces y
Paenibacillus .................................................................................................................................... 135 Resumen ........................................................................................................................................................................ 135 5.1 Introducción ................................................................................................................................................. 136 5.2 Materiales y métodos .............................................................................................................................. 138
5.2.1 General ....................................................................................................................................................... 138 5.2.2 Cultivos en mayor volumen ............................................................................................................ 139
Contenido XIX
5.2.3 Extracción ................................................................................................................................................. 140 5.2.4 Fraccionamiento y aislamiento ..................................................................................................... 140 5.2.5 Análisis por LC/MS .............................................................................................................................. 144 5.2.6 Pre-procesamiento de los datos de LC-MS por MZmine .................................................. 144 5.2.7 Construcción de redes moleculares ............................................................................................ 145 5.2.8 Derreplicación ........................................................................................................................................ 146
5.3 Resultados y discusión............................................................................................................................ 146 5.3.1 Estudio químico del co-cultivo entre Purpureocillium sp. PNM.67 y Paenibacillus sp. PNM.123 en medio PDA ............................................................................................................................ 147 5.3.2 Estudio químico del co-cultivo entre el hongo Purpureocillium sp. PNM.67 y la bacteria Streptomyces sp. IBUN-5.1. en medio ISP3 sólido ............................................................ 154 5.3.3 Redes moleculares ............................................................................................................................... 158
5.4 Conclusiones ................................................................................................................................................ 172 5.5 Bibliografía .................................................................................................................................................... 173
6. Conclusiones y recomendaciones ...................................................................................... 183
A. Anexo: Información suplementaria Capítulo 4 .............................................................. 189
B. Anexo: Información suplementaria Capítulo 5 .............................................................. 190
Contenido XX
Lista de figuras
Pág. Figura 1-1: En rojo el número de productos naturales marinos publicados por año y en azul el
porcentaje de compuestos estructuralmente únicos respecto al total de productos naturales
marinos reportados. Tomado de Pye y colaboradores3................................................................................... 3
Figura 1-2: Hongos y bacterias productoras de metabolitos especializados: (1) Streptomyces
coelicolor, (2) Streptomyces avermitilis, (3) Saccharopolyspora erythraea, (4) Salinispora
tropica, (5) Sorangium cellulosum, (6) Myxococcus xanthus, (7) Pseudomonas fluorescens, (8)
Burkholderia pseudomallei, (9) Bacillus amyloliquefacians, (10) Anabaena sp., (11) Penicillium
chrysogenum. En barras naranjas se muestran el número de clústers de genes conocidos
basados en los metabolitos aislados y en barras verdes el número total de clústers de genes
deducidos de la secuenciación del genoma. Adaptado de Pettit4. ............................................................. 4
Figura 2-1: Co-cultivos en 15mL. Medio de cultivo empleado: (■) LB, (■) LB suplementado con
sales, (■) LB suplementado con glucosa. () Co-cultivos promisorios por el cambio en su
producción metabólica. ................................................................................................................................................. 50
Figura 3-1: Esquema del ensayo de interacción binaria empleado como herramienta de
selección primaria de parejas a evaluar en las interacciones bacteria-bacteria a distancia. .... 64
Figura 3-2: Co-cultivos bacteria-bacteria: a) interacción a distancia, b) interacción por
contacto.................................................................................................................................................................................. 65
Figura 3-3: Co-cultivos bacteria-hongo: a) interacción a distancia, b) interacción por contacto.
.................................................................................................................................................................................................... 66
Figura 3-4: Zonas delimitadas para la obtención de extractos orgánicos en interacciones a
distancia entre (1) bacteria-bacteria: (a) Zona de inoculación de la bacteria 1, (b) Zona de
inoculación de la bacteria 2 y (c) Zona de interacción; y (2) bacteria-hongo: (a) Zona de
inoculación del hongo, (b) Zona de interacción, (c) Zona de inoculación de la bacteria. ............ 67
Figura 3-5: Resumen de los cambios fenotípicos observados en las 105 interacciones bacteria-
bacteria evaluadas a distancia. (■): No hubo interacción visible, (■): Inhibición de crecimiento,
(■): Otros tipos de interacción como cambios en pigmentación, esporulación y morfología
macroscópica ...................................................................................................................................................................... 71
Figura 3-6: Criterios de inclusión de bacterias en el ensayo por contacto, (■): Streptomyces sp.
vs. Streptomyces sp., (■): Streptomyces sp- vs. bacteria con ácido micólico en su pared celular,
(■): Criterio ecológico, cepas recuperadas de la misma muestra........................................................... 72
Figura 3-7: Ensayo de interacción por contacto bacteria-bacteria, (a) Monocultivo de
Streptomyces sp. PNM-161a, (b) Monocultivo de Streptomyces sp. IBUN-5.1. y (c) Co-cultivo
entre Streptomyces sp. PNM-161a y Streptomyces sp. IBUN-5.1. ............................................................. 73
Contenido XXI
Figura 3-8: Comparación de espectros RMN 1H para los extractos orgánicos de: (a) medio de
cultivo sin inocular LB, (b) monocultivo de Streptomyces sp. PNM-161a, (c) monocultivo de
Rhodococcus sp. RKHC-26 y (d) co-cultivo de estos dos aislamientos. ................................................. 75
Figura 3-9: Ensayo de interacción a distancia bacteria-hongo. (a) Monocultivo de
Purpureocillium sp. PNM-67, (b) Monocultivo de Rhodococcus sp. RKHC-26 y (c) Co-cultivo
entre Purpureocillium sp. PNM-67 y Rhodococcus sp. RKHC-26. ............................................................. 77
Figura 3-10: Comparación de cromatogramas de HPLC-DAD (320nm) a la izquierda y
comparación de espectros RMN 1H a la derecha para los extractos orgánicos de: (a) medio de
cultivo PDA, (b) monocultivo de Purpureocillium sp. PNM-67, (c) monocultivo de Paenibacillus
sp. PNM-123 y las tres zonas de la caja del co-cultivo (d) zona del hongo, (e) zona de la
interacción y (f) zona de la bacteria. ....................................................................................................................... 80
Figura 3-11: Comparación de cromatogramas de HPLC-DAD (320nm) a la izquierda y
espectros de RMN 1H (ampliación 6-8ppm) a la derecha para los extractos orgánicos de las
zonas de interacción de los co-cultivos entre Purpureocillium sp. PNM-67 y: (a) Paenibacillus
sp. PNM-123, (b) Paenibacillus sp. PNM-115, (c) Streptomyces sp. IBUN-5.1 y (d) Paenibacillus
sp. PNM-210. En (e) monocultivo del hongo Purpureocillium sp. PNM-67. ....................................... 81
Figura 3-12: Ensayo de interacción por contacto bacteria-hongo. (a) Monocultivo de
Rhodococcus sp. RKHC-26, (b) Monocultivo de Purpureocillium sp. PNM-67y (c) Co-cultivo
entre Purpureocillium sp. PNM-67 y Rhodococcus sp. RKHC-26. ............................................................. 83
Figura 3-13: Comparación de espectros de RMN 1H para los extractos orgánicos de a) medio
de cultivo sin inocular LB, (b) monocultivo de Streptomyces sp. PNM-161a, (c) monocultivo de
Rhodococcus sp. RKHC-26 y (d) co-cultivo de estos dos aislamientos en las zonas de (1) 0-
2ppm, (2) 4-6ppm y (3) 6-8ppm. ............................................................................................................................. 84
Figura 4-1: Esquema de separación entre el hongo Streptomyces sp. PNM-161a y la bacteria
Rhodococcus sp. RKHC-26............................................................................................................................................. 98
Figura 4-2. Redes moleculares para el co-cultivo entre Streptomyces sp. PNM-161a y
Rhodococcus sp. RKHC-26 y sus respectivos monocultivos. Para los monocultivos, nodos
circulares hacen referencia a features producidas en mono y co-cultivo, mientras que nodos
cuadrados representan features exclusivas de los monocultivos. ........................................................ 103
Figura 4-3. Diagrama de Venn que muestra la distribución de los picos detectados por LC-
MS/MS. ................................................................................................................................................................................ 104
Figura 4-4. Familia molecular MN1, se destacan aquellos nodos que se identificaron
putativamente a partir de la búsqueda realizada en el Dictionary of Natural Products- .......... 105
Figura 4-5: Espectro RMN 1H para el compuesto 4.1. ............................................................................... 108
Figura 4-6: Espectro HSQC para el compuesto 4.1. .................................................................................... 109
Figura 4-7: Espectro HMBC para el compuesto 4.1. .................................................................................. 109
Figura 4-8: Espectro COSY para el compuesto 4.1. .................................................................................... 110
Figura 4-9: Correlaciones observadas para el Compuesto 4.1 en los experimentos
bidimensionales. El COSY se visualiza con enlaces con negrita y el HMBC con flechas azules.
................................................................................................................................................................................................. 111
Figura 4-10: Compuesto 4.1, con su numeración de acuerdo al nombre sistemático ............. 113
Figura 4-11. Espectro de dicroísmo circular del compuesto 4.1. ....................................................... 113
Figura 4-12. Estructura compuesto 4.2 ........................................................................................................... 114
XXII Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
Figura 4-13: Análisis PCA del perfilado en LC-MS del co-cultivo entre Purpureocillium sp. PNM-
67 y Rhodococcus sp. RKHC-26. .............................................................................................................................. 116
Figura 4-14: Co-cultivo entre Purpureocillium sp. PNM-67 y Rhodococcus sp. RKHC-26: a)
OPLS-DA, b) S-plot, resaltadas las VIPs .............................................................................................................. 117
Figura 4-15: Redes moleculares de los monocultivos del hongo Purpureocillium sp. PNM-67 y
la bacteria Rhodococcus sp. RKHC-26 y su co-cultivo. ................................................................................ 120
Figura 4-16. Leucinostatinas identificadas en MN2................................................................................... 122
Figura 5-1: Esquema de separación del co-cultivo entre Purpureocillium sp. PNM-67 y la
bacteria Paenibacillus sp. PNM-123 ..................................................................................................................... 142
Figura 5-2: Esquema de separación del co-cultivo entre Purpureocillium sp. PNM-67 y la
bacteria Streptomyces sp. IBUN-5.1...................................................................................................................... 143
Figura 5-3: Espectro de RMN 1H para el compuesto 5.1. ....................................................................... 148
Figura 5-4: Espectro HSQC del compuesto 5.1 ............................................................................................. 149
Figura 5-5: Espectro HMBC del compuesto 5.1 ........................................................................................... 149
Figura 5-6: Espectro COSY del compuesto 5.1 ............................................................................................. 150
Figura 5-7: Correlaciones observadas para el Compuesto 5.1 en los experimentos
bidimensionales. El COSY se visualiza con enlaces con negrita y el HMBC con flechas azules.
................................................................................................................................................................................................. 151
Figura 5-8: Correlaciones observadas para el Compuesto 5.2 en los experimentos
bidimensionales. El COSY se visualiza con enlaces con negrita y el HMBC con flechas azules.
................................................................................................................................................................................................. 152
Figura 5-9: Compuestos 5.1 y 5.2 aislados a partir del co-cultivo entre Purpureocillium sp.
PNM-67 y Paaenibacillus sp. PNM-123. .............................................................................................................. 153
Figura 5-10: Correlaciones observadas para el Compuesto 5.3 en los experimentos
bidimensionales. El COSY se visualiza con enlaces con negrita y el HMBC con flechas azules.
................................................................................................................................................................................................. 155
Figura 5-11: Compuesto 5.3. aislado a partir del co-cultivo entre Purpureocillium sp. PNM-67
y Streptomyces sp. IBUN-5.1. .................................................................................................................................... 156
Figura 5-12: Redes moleculares de las zonas de interacción de los co-cultivos entre el hongo
Purpureocillium sp. PNM-67 y las bacterias Streptomyces sp. PNM-9, Paenibacillus sp. PNM-
115, Paenibacillus sp. PNM-123, Paenibacillus sp. PNM-210, Streptomyces sp. IBUN-5.1. ...... 160
Figura 5-13: Redes moleculares de las zonas de interacción de los co-cultivos entre el hongo
Purpureocillium sp. PNM-67 y las bacterias Streptomyces sp. PNM-9, Paenibacillus sp. PNM-
115, Paenibacillus sp. PNM-123, Paenibacillus sp. PNM-210, Streptomyces sp. IBUN-5.1. En un
cuadrado se encuentra el nodo correspondiente al alternariol (Compuesto 5.3). ...................... 163
Figura 5-14. Diagrama de Venn de distribución de features para los co-cultivos entre el hongo
Purpureocillium sp. PNM-67 y las bacterias: Streptomyces sp. IBUN-5.1., Paenibacillus sp. PNM-
115, Paenibacillus sp. PNM-123 y Paenibacillus sp. PNM-210. .............................................................. 164
Figura 5-15. Árbol filogénetico de los aislamientos Paenibacillus sp. PNM-123, Paenibacillus
sp. PNM-210 y Paenibacillus sp. PNM-115 construido a partir del programa MEGA versión 7.0
empleando el método Neighbor-Joining. ............................................................................................................ 165
Contenido XXIII
Lista de tablas
Pág. Tabla 1-1: Algunos ejemplos de co-cultivos de microorganismos, en azul se resaltan los que
involucran microorganismos de origen marino. .................................................................................................9
Tabla 2-1: Condiciones de fermentación en 100mL de los distintos experimentos realizados
para el co-cultivo entre Brevibacillus sp. PNM-157 y Dietzia sp. RKHC-59b. .................................... 43
Tabla 2-2: Condiciones de fermentación en 100mL de los distintos experimentos realizados
para el co-cultivo entre Brevibacillus sp. PNM-157 y Streptomyces sp. IBUN-5.1. .......................... 43
Tabla 2-3: Microorganismos seleccionados para el establecimiento de co-cultivos binarios.46
Tabla 2-4: Información previa de la producción metabólica y/o actividad de los aislamientos
seleccionados. ..................................................................................................................................................................... 47
Tabla 2-5: Resultados de los 5 co-cultivos promisorios evaluados en escala de 100mL. En
negrita las parejas seleccionadas para nuevos ensayos. .............................................................................. 52
Tabla 2-6: Resultados de los distintos experimentos realizados para el co-cultivo entre
Brevibacillus sp. PNM-157 y Dietzia sp. RKHC-59b. ........................................................................................ 53
Tabla 2-7: Resultados de los distintos experimentos realizados para el co-cultivo entre
Brevibacillus sp. PNM-157 y Streptomyces sp. IBUN-5.1. ............................................................................. 53
Tabla 3-1: Resumen de los co-cultivos binarios bacteria-bacteria evaluados mediante la
metodología por contacto. Se incluye el criterio de emparejamiento, y el resultado y la
presencia de un cambio en el perfil metabólico respecto a los monocultivos correspondientes.
.................................................................................................................................................................................................... 74
Tabla 3-2: Resultados del ensayo de co-cultivo binarios entre bacterias y el hongo
Purpureocillium sp. PNM-67 en el ensayo a distancia usando diferentes medios de cultivo. ... 79
Tabla 3-3: Co-cultivos binarios seleccionados para su posterior estudio químico. ..................... 85
Tabla 4-1: Valores de los parámetros de análisis en cada uno de los módulos de MZmine para
las muestras de cada uno de los co-cultivos y sus correspondientes monocultivos. ................. 100
Tabla 4-2. Identificaciones putativas de la MN1 (nodos producidos exclusivamente en el co-
cultivo) basadas en la búsqueda en el DNP por masa exacta con un margen de error de 15 ppm.
................................................................................................................................................................................................. 106
Tabla 4-3: Datos de RMN 1H (400MHz) y RMN 13C (100MHz) del compuesto 4.1 medidos en
metanol-d4 ......................................................................................................................................................................... 112
Tabla 4-4: Iones relevantes en las redes moleculares. La identificación integró librerías del
GNPS y el DNP. En negrita se observan los iones identificados como VIPs del OPLS-DA. Para los
compuestos identificados por el GNPS, en paréntesis se observa el valor de similitud en las
XXIV Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
fragmentaciones MS/MS. Se incluye fuente biológica donde se describe los microorganismos
de donde han sido aislados los compuestos identificados putativamente. ..................................... 123
Tabla 5-1: Datos de RMN 1H (400MHz) y RMN 13C (100MHz) de los compuestos 5.1 y 5.2
medidos en metanol-d4 ............................................................................................................................................... 152
Tabla 5-2: Datos de RMN 1H (400MHz) y RMN 13C (100MHz) del compuesto 5.3 medidos en
metanol-d4 ......................................................................................................................................................................... 156
Tabla 5-3: Identificaciones putativas obtenidas a partir de la plataforma del GNPS. .............. 167
Tabla 5-4: Identificaciones putativas obtenidas a partir de la búsqueda de la masa exacta en
el DNP con un margen de error de 15ppm. ...................................................................................................... 168
Contenido XXV
Lista de Símbolos y abreviaturas
Abreviatura/Símbolo Término AcOEt Acetato de etilo bd Doblete ancho (broad doublet) COSY Correlation Spectroscopy DAD Diode Array Detector DNP Dictionary of Natural Products ELSD Evaporative Light Scattering Detector GNPS Global Natural Products Social Molecular Networking Hex Hexano HMBC Heteronuclear correlation through multiple bond HPLC High Performance Liquid Chromatography HSQC Heteronuclear single quantum correlation Hz Hertz ISP2 International Streptomyces Project Medium 2 ISP3 International Streptomyces Project Medium 3 J Constante de acoplamiento LB Luria Bertania m Multiplete (multiplet) MeOH Metanol MN Molecular Network MS Mass spectrometry m/z Relación masa carga OPLS Orthogonal Projections to Latent Structures PCA Principal Component Analysis PDA Potato Dextrose Agar ppm Partes por millón q Cuarteto (quartet) QS Quorum Sensing quint Quinteto (quintet) RMN Resonancia Magnética Nuclear s Singlete SPE Solid Phase Extraction t Triplete (triplet) UV Ultravioleta δ Desplazamiento químico
Introducción
Los productos naturales obtenidos a partir de microorganismos han sido fuente importante de
compuestos con actividades biológicas relevantes. Sin embargo, con el paso de los años la tasa
de redescubrimiento de los mismos ha aumentado significativamente. Sumado a esto, estudios
sobre el genoma de los microorganismos han demostrado que el número de compuestos
aislados de un microorganismo no corresponde en la mayoría de los casos a todos los que
potencialmente podrían ser producidos. El co-cultivo es uno de los enfoques que se ha
empleado para inducir la expresión de rutas biosintéticas silenciadas y crípticas. En la última
década, el uso de esta estrategia ha aumentado significativamente; sin embargo, todavía
presenta múltiples desafíos tanto metodológicos como analíticos.
Teniendo en cuenta esto, en la presente tesis de maestría se propuso contribuir al estudio de
co-cultivo a partir de microorganismos de origen marino. Como objetivo general se planteó
implementar metodologías de selección y estudio de co-cultivos de microorganismos que
condujeran a la identificación de compuestos debidos a la interacción. Como objetivos
específicos se plantearon: establecer una metodología de selección de microorganismos de
origen marino a co-cultivar; seleccionar al menos dos co-cultivos de microorganismos de
origen marino en función del cambio en su actividad biológica y/o el perfil metabólico respecto
a los monocultivos correspondientes; y realizar el estudio químico de al menos un co-cultivo
seleccionado.
La tesis se presenta en cinco capítulos autocontenidos. En el primer capítulo, se resume la
revisión bibliográfica realizada sobre co-cultivo de microorganismos. En el segundo capítulo
se resume la selección del set de microorganismos y los resultados encontrados a partir del
screening en líquido de los co-cultivos binarios realizados. En el tercer capítulo se resume el
screening realizado en medio sólido y la selección de co-cultivos promisorios que serán
discutidos en los capítulos 4 y 5. Así, en el capítulo 4 se encuentra el estudio de la producción
metabólica de las interacciones por contacto entre Streptomyces sp. PNM-161a y Rhodococcus
2 Introducción
sp. RKHC-26 y, entre Purpureocillium sp. PNM-67 y Rhodococcus sp. RKHC-26. Finalmente, en
el capítulo 5 se encuentra el estudio de la producción metabólica de las interacciones a
distancia que involucran al hongo Purpureocillium sp. PNM-67.
1. Capítulo 1: Co-cultivo de microorganismos como estrategia de inducción de productos naturales
A través de los años, los metabolitos secundarios aislados de microorganismos han
desempeñado un rol importante en el tratamiento de enfermedades humanas y han
revolucionado la industria farmacéutica.1 No obstante, en los últimos años la frecuencia de
aislamiento de nuevos compuestos ha disminuido significativamente2, y la tasa de re-
aislamiento de compuestos es cada vez más alta. En la Figura 1-1 se observa como con el paso
de los años la tasa de descubrimiento de compuestos nuevos ha disminuido, sumado a que la
tasa de compuestos estructuralmente nuevos que se descubren cada año ha disminuido.
Figura 1-1: En rojo el número de productos naturales marinos publicados por año y en azul el porcentaje de compuestos estructuralmente únicos respecto al total de productos naturales marinos reportados. Tomado de Pye y colaboradores3.
Avances en la secuenciación de los genes de los microorganismos, han permitido demostrar
que su potencial diversidad química no es fácilmente aprovechable, pues no se producen todos
los compuestos que potencialmente se podrían producir. Existen múltiples ejemplos que
muestran que el número de productos naturales obtenidos a partir de microorganismos es
mucho menor a los clústers de genes que potencialmente podrían codificar para metabolitos.
4 Introducción
Así, en la Figura 1-2 se observa comparativamente el número de clústers de genes conocidos
basados en los metabolitos aislados vs. el número total de clústers de genes deducidos de la
secuenciación del genoma para diferentes hongos y bacterias.
Figura 1-2: Hongos y bacterias productoras de metabolitos especializados: (1) Streptomyces coelicolor, (2) Streptomyces avermitilis, (3) Saccharopolyspora erythraea, (4) Salinispora tropica, (5) Sorangium cellulosum, (6) Myxococcus xanthus, (7) Pseudomonas fluorescens, (8) Burkholderia pseudomallei, (9) Bacillus amyloliquefacians, (10) Anabaena sp., (11) Penicillium chrysogenum. En barras naranjas se muestran el número de clústers de genes conocidos basados en los metabolitos aislados y en barras verdes el número total de clústers de genes deducidos de la secuenciación del genoma. Adaptado de Pettit4.
Por tal motivo, se han desarrollado métodos para inducir, activar y regular clústers de genes
denominados crípticos y silenciados.5 A continuación, se discutirán brevemente cada una de
estas aproximaciones. Posteriormente, se profundizará en una de ellas, el co-cultivo, por ser
el tema de principal interés para el desarrollo de esta tesis.
1.1 Técnicas de inducción, activación y regulación de genes silenciados y crípticos
Aunque existe sobrelapamiento y complementariedad entre las distintas técnicas, éstas
pueden agruparse en dos clases: alteración de las condiciones físicas y químicas y,
modificaciones genéticas.6
Introducción 5
1.1.1 Alteración de las condiciones físicas y químicas
OSMAC
El método OSMAC (One Strain Many Compounds) fue propuesto inicialmente por Bode y
colaboradores y se refiere a la habilidad de una cepa de producir diferentes compuestos
cuando crece bajo diferentes condiciones.7
Este método no está enfocado en la activación de un clúster específico de genes, sino en la
posible variación de los metabolitos secundarios del microorganismo a partir de la alteración
sistemática de parámetros de cultivo incluyendo componentes del medio (sales, aminoácidos,
fuente de carbono), pH, aireación del cultivo (incluyendo el tipo de recipiente empleado) y la
temperatura de crecimiento. Este método es accesible, versátil, barato y sencillo de usar. 6
El uso de OSMAC no ha sido exclusivo al estudio de la producción metabólica de
microorganismos de origen terrestre, sino que ha sido utilizado ampliamente para el estudio
de microorganismos de origen marino en años recientes con resultados prometedores.8
Inhibidores de las HDAC
Las histona deacetilasas (HDAC) son una familia de proteínas que desempeñan un rol
importante en la modulación de la expresión génica a través de la desacetilación de las
histonas.9 Las HDACs hacen más o menos accesible el ADN y, teniendo en cuenta que a través
de la accesibilidad al mismo se controla la transcripción, inhibidores de las HDACs pueden
tener un efecto inhibitorio o estimulador en la expresión de los genes correspondientes.10
El uso de este método ha tenido numerosos ejemplos exitosos en la activación de clústers
crípticos en hongos.11 En el caso de bacterias, existen pocos ejemplos, dónde se ha encontrado
que los inhibidores de las HDACs aumentan o reducen la concentración de productos naturales
ya conocidos. Aunque su mecanismo no es comprendido totalmente, es un método sencillo y
barato.6
Elicitores químicos
Se ha demostrado que concentraciones subinhibitorias de antibióticos (SIC) pueden regular la
expresión génica a nivel de la transcripción.12 Se han observado múltiples cambios fenotípicos
en presencia de SICs, incluyendo la formación de biofilm y el incremento de la motilidad
bacteriana.13 También se han reportado resultados prometedores empleando compuestos
inorgánicos, elementos de tierras raras y metales pesados.14
6 Introducción
Cultivo con conocimiento previo del genoma
El análisis del genoma de un microorganismo permite postular rutas biosintéticas y productos
esperados con cierto grado de confianza. Esto permite explorar condiciones de cultivo
específicas a partir de las predicciones realizadas con el conocimiento del genoma.6
Challis y colaboradores realizaron el análisis del genoma de Streptomyces coelicolor, a partir
del cual propusieron un tripéptido como producto de una de los 14 clúster crípticos
remanentes de esta bacteria. La postulación de esta estructura los llevó a especular que el
compuesto podía ser un sideróforo de hierro. A partir de esto, seleccionaron un medio de
cultivo agotado en hierro, dónde obtuvieron un tetrapéptido, la coeliquelina.15,16
Co-cultivo
Consiste en el cultivo de dos o más microorganismos en un mismo espacio.17 El co-cultivo ha
demostrado ser un enfoque útil tanto para la producción de productos naturales novedosos a
partir de clústers de genes crípticos como para el incremento en la concentración de productos
naturales silenciados, que de otra manera se producirían en una cantidad demasiado baja para
ser detectados.18
1.1.2 Modificaciones genéticas
En esta categoría se encuentran diversos métodos como la ingeniería ribosómica y alteración
de la maquinaria transcripcional, la manipulación de reguladores globales o específicos a una
ruta sintética, el empleo del quorum sensing como una herramienta de regulación y la
expresión heteróloga.6 En comparación a las alteraciones de condiciones químicas y físicas,
este grupo de métodos tiende a ser más costoso e implica mayores desafíos para ser llevado a
cabo.
1.2 Co-cultivo o fermentación mixta de microorganismos
1.2.1 Generalidades
El descubrimiento tradicional de productos naturales derivados de microorganismos
involucra frecuentemente el crecimiento de una cepa seleccionada en un monocultivo rico en
nutrientes. Esta estrategia ha sido efectiva, pero no tiene en cuenta que los microorganismos
normalmente crecen en ambientes complejos y limitados en nutrientes. Se estima, por
Introducción 7
ejemplo, que un gramo de suelo contiene 10000 diferentes especies de bacterias.19 De tal
manera, interacciones inter- o intraespecies son prevalentes en la naturaleza y no sería
sorprendente pensar que el crecimiento de un microorganismo en presencia de otros podría
alterar o estimular el metabolismo secundario de la misma.20 De hecho, se ha encontrado que
la comunicación celular es decisiva en la activación o supresión de metabolitos claves, dado
que células individuales pueden monitorear el comportamiento del grupo y a partir del mismo
modelar su transcripción y traducción.21
En efecto, cuando los microorganismos interactúan con otros, producen metabolitos
secundarios que pueden tener efectos positivos o negativos sobre los demás. En un estudio
reciente, se evaluaron las interacciones entre bacterias pertenecientes al género Streptomyces
y se encontró que dependiendo de la cepa con la que eran enfrentadas y de la disponibilidad
de nutrientes, la producción antibiótica se incrementaba y la de su competidor se reprimía.22
Este resultado apoya la hipótesis de que los metabolitos secundarios actúan como armas
contra otros microorganismos. Sin embargo, otros estudios han demostrado como los
metabolitos secundarios son claves en la comunicación entre microorganismos. Por ejemplo,
un estudio demostró que el ácido fusárico producido por el hongo Fusarium oxysporum
promovía la colonización de su hifa por la bacteria Pseudomonas fluorescens.23 Ambos
escenarios son igualmente interesantes en el descubrimiento de compuestos novedosos y en
la comprensión del rol de los metabolitos secundarios en la naturaleza.
A los frecuentemente denominados “metabolitos secundarios”, en este documento se les
denominará “metabolitos especializados”, teniendo en cuenta que, como han resaltado varios
autores, el rol de estos compuestos es clave en la supervivencia de los microorganismos en su
ambiente natural, y no es secundario ni menos relevante respecto a los normalmente
denominados metabolitos primarios24.
El co-cultivo de microorganismos consiste en el cultivo de dos o más microorganismos en un
mismo ambiente confinado.17 Algunos autores denominan a este método “co-cultivo” cuando
es realizado en medio sólido, y “fermentación mixta” cuando se realiza en medio líquido; otros
emplean el término “co-cultivo” si el cultivo se realiza con cepas específicas bajo condiciones
asépticas, y “cultivo mixto” si se realiza con cepas no identificadas bajo condiciones sépticas25.
En la mayoría de los reportes de la última década, el término más empleado es “co-cultivo”,
8 Introducción
independientemente de la naturaleza de las cepas y del medio de cultivo empleado26. Con este
significado usaremos este término en este documento.
Estudios sistemáticos de co-cultivos solo empezaron a realizarse hasta el final del siglo XX.27–
29 Como resultados del co-cultivo se podrían incluir: rendimientos incrementados de
metabolitos previamente descritos, producción de análogos de metabolitos conocidos y la
inducción de metabolitos bioactivos nuevos.30 Aunque el co-cultivo es una estrategia
prometedora que ha generado resultados positivos, aún permanece inexplorada
principalmente por su falta de reproducibilidad relacionada a la ausencia de protocolos
estandarizados y a la dificultad en la predictibilidad de los resultados generados.31,32
En general, los estudios realizados incluyen 3 sistemas: el co-cultivo de diferentes hongos, el
co-cultivo de hongos con bacterias y el co-cultivo de diferentes bacterias. Algunos ejemplos del
uso del co-cultivo se resumen en la Tabla 1-1, dónde para cada caso, se presentan los
microorganismos estudiados, los metabolitos producidos en el co-cultivo (indicando si son
compuestos nuevos) y la actividad biológica de los mismos.
Tabla 1-1: Algunos ejemplos de co-cultivos de microorganismos, en azul se resaltan los que involucran microorganismos de origen marino.
MICROORGANISMOS CO-CULTIVADOS
(B: Bacteria, H:Hongo)
METABOLITOS REPORTADOS (N: Nuevo)
ACTIVIDAD BIOLÓGICA
REFERENCIA
Pestalotia sp. (H) Thalassospira sp.(B)
Pestalona (N) Antibiótica Cueto et al.33
Streptomyces tenjimariensis (B) 12 bacterias no identificadas (B)
Istamicina Antibiótica Slattery et al.34
Acremonium sp. (H) Mycogone rosea (H)
Acremostatina A (N) Acremostatina B (N) Acremostatina C (N)
- - -
Degenkolb et al.35
Libertella sp. (H) Thalassospira sp. (B)
Libertelenonas A-D (N) Citotóxica Oh et al.36
Hongo no identificado (H) Hongo no identificado (H)
Marinamida (N) Metil éster de la marinamida (N)
Antibiótica Antibiótica
Zhu et al.37
Emericella sp. (H) Salinispora arenicola (B)
Emericelamidas A-B (N) Antibiótica Oh et al.38
Aspergillus fumigatus (H) Sphingomonas sp. (B)
Glionitrina A (N) Antibiótica Citotóxica
Park et al.39
Penicillium pinophilum (H) Trichoderma harzianum (H)
Secopenicilida C (N) Penicilida MC-141
Pestalasina A Stromemycina
- - - - -
Nonaka et al40
Aspergillus sp. (H) Aspergillus sp. (H)
Aspergicina (N) Ácido neoaspergílico
Ergosterol
Antibiótica Antibiótica
- Zhu et al.41
Aspergillus fumigatus (H) Streptomyces peucetius (B)
Fumiformamida (N) N,N’-((1Z,3Z)-1,4-bis(4-metoxifenil)buta-1,3-
dien-2,3-diil)diformamida (N) Derivados N- formil y xanthocilina
- Citotóxica
-
Zuck et al.42
10 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
MICROORGANISMOS CO-CULTIVADOS
(B: Bacteria, H:Hongo)
METABOLITOS REPORTADOS (N: Nuevo)
ACTIVIDAD BIOLÓGICA
REFERENCIA
Fusarium tricinctum (H) Fusarium begoniae (H)
Subenniatina A (N) Subenniatina B (N)
- -
Wang et al43
Fusarium tricinctum (H) Bacillus subtilis (B)
Lateropyrona Enniatina B
Enniatina B1 Enniatina A1
Fusaristatina A (-)-citreoisocumarina Macrocarpona C (N)
2-(carboximetilamino) ácido benzoico (N) (-)-citreoisocumarinol
Antibiótica -
Antibiótica Antibiótica
- - - - -
Ola et al44
Aspergillus fumigatus (H) Streptomyces bullii (B)
Ergosterol Brevianamida F
Spirotryprostatina A 6-metoxi spirotryprostatina B
Fumitremorgina C 12, 13-dihidroxi fumitremorgina C
Fumitremorgina B Verruculogeno
11-O-metilpseurotina A 11-O-metilpseurotina A2 (N)
Emestrina A Emestrina B
- -
Tripanocida-Leishmanicida Leishmanicida Tripanocida-
Leishmanicida Tripanocida-
Leishmanicida Tripanocida-
Leishmanicida Tripanocida-
Leishmanicida -
Leishmanicida - -
Rateb et al44
Saccharopolyspora erythraea (B) Fusarium pallidoroseum (H)
Análogos ácido tetrámico (N) Equisetina
- Citotóxica
Whitt et al.45
Capítulo 1 11
MICROORGANISMOS CO-CULTIVADOS
(B: Bacteria, H:Hongo)
METABOLITOS REPORTADOS (N: Nuevo)
ACTIVIDAD BIOLÓGICA
REFERENCIA
Ophiosetina -
Actinokineospora sp. (B) Nocardiopsis sp. (B)
N-(2-hidroxifenil)-acetamida 1,6-dihidroxifenazina
5a, 6, 11a, 12-tetrahidro-5a,11ª-dimetil[1,4]benzoxazino[3,2b][1,4]benzoxazina
- Antitripanosomal
-
Dashti et al.46
Streptomyces cinnamoneus (B) Tsukamurella pulmonis (B)
Arcyriaflavina E (N) Arcyriaflavina A
Alcaloide BE-13793C
Citotóxica -
Citotóxica
Hoshino et al.47
Penicillium citrinum (H) Beauveria felina (H)
Citrifelina A (N) Citrifelina B (N)
Antibiótica Antibiótica
Meng et al.48
Streptomyces sp. (B) Tsukamurella pulmonis (B)
Chojalactona A Chojalactona B Chojalactona C
Citotóxica Citotóxica
-
Hoshino et al49
Streptomyces sp. (B) Tsukamurella pulmonis (B)
Niizalactama A Niizalactama B Niizalactama C
- - -
Hoshino et al50
Streptomyces nigrescens (B) Tsukamurella pulmonis (B)
5-alquil-1,2,3,4-tetrahidroquinolinas (5aTHQs): 5aTHQ-7n 5aTHQ-8i 5aTHQ-8n 5aTHQ-9i 5aTHQ-9n
5aTHQ-10a 5aTHQ-10i 5aTHQ-10n
Antibiótica Antibiótica Antibiótica Antibiótica Antibiótica Antibiótica Antibiótica Antibiótica
Sugiyama et al51
En el caso de microorganismos de origen marino, el co-cultivo ha demostrado ser una
estrategia promisoria para el descubrimiento de nuevos compuestos bioactivos21. No obstante,
se han reportado menos ejemplos en comparación con los que involucran microorganismos de
origen terrestre.
En el caso de Colombia, los estudios realizados empleando este método son escasos. Varios de
los estudios publicados se han enfocado en la evaluación de cultivos mixtos con fines de
biodegradación y biorremediación.52–55 Un estudio reciente realizado por Conde-Martínez y
colaboradores56 evaluó la actividad antibacteriana y citotóxica de cultivos mixtos derivados de
muestras de las salinas de Manaure. La actividad biológica les permitió priorizar algunos de
los cultivos mixtos para el aislamiento de cepas puras, de las cuales se evaluó su producción
metabólica.
Es importante resaltar, que ninguno de los estudios publicados a nivel nacional, se ha enfocado
en detectar los cambios en el perfil químico de los co-cultivos en comparación con los
respectivos monocultivos, que es uno de los objetivos de la presente tesis de maestría.
El co-cultivo ha sido empleado con diversos propósitos:
La investigación de comunidades naturales en un contexto agrícola57
La comprensión del fenómeno de simbiosis (por ejemplo, la protección antibiótica de
un coral por su simbionte58)
La investigación de interacciones del microbioma humano (por ejemplo, su relación
con enfermedades59,60)
La producción de productos de fermentación específicos a nivel industrial (producción
de etanol, hidrógeno, ácido acético, ácido láctico, biopolímeros, enzimas, carotenoides,
saborizantes25)
La inducción de metabolitos secundarios con potencial farmacéutico36
1.2.2 Modos de interacción
Los efectos observados por efecto del co-cultivo pueden ser el resultado de dos tipos de
interacción: interacción debida a compuestos difusibles e interacción debida a contacto célula-
célula.20
Capítulo 1 13
Interacción debida a compuestos difusibles (química)
Las bacterias producen compuestos que se pueden difundir y que son conocidos como
moléculas difusibles. En numerosos casos, metabolitos difusibles de una cepa estimulan la
producción de metabolitos especializados de una segunda cepa. Estas moléculas difusibles
pueden actuar como nutrientes, señalizadores o antibióticos. A continuación, se mencionan
algunos ejemplos de ellos.
Un ejemplo de la provisión de nutrientes fue presentado por Ueda y colaboradores61 en un
screening binario con 76 cepas de Streptomyces. En un grupo de experimentos encontraron
que el 34% de las bacterias ensayadas inducían la producción antibiótica y/o la esporulación
del Streptomyces vecino. Estudios adicionales con una de las parejas de bacterias que
interactuaban identificaron al sideróforo desferrioxamina E como la molécula estimuladora.62
Estos resultados indicaron que el hierro, suministrado por sideróforos específicos, desempeña
un papel importante en el desarrollo de Streptomyces. Consistente con este modelo, los
sideróforos que monopolizan el hierro en lugar de proveerlo a su cepa vecina retardan el
desarrollo, como se pudo ver en el caso de Amycolatopsis sp. AA4 y Streptomyces coelicolor.63
Otro ejemplo de la modulación en la provisión de nutrientes es la interacción fúngica con
relevancia industrial entre Rhodotorula glutinis y Debaryomyces castellii que resultó en la
producción incrementada de un carotenoide respecto a los monocultivos.64 Los autores
sospecharon que D. castellii hidrolizaba los oligosacáridos del medio en mono y disacáridos,
que pueden ser utilizados más efectivamente por R. glutinis para la síntesis de carotenoides.
Las interacciones vía moléculas de señalización o antibióticos han sido las más reportadas en
la literatura. Un ejemplo es la inducción del pigmento azul actinorodina en Streptomyces
lividans por efecto de otra cepa de Streptomyces, encontrado en el ensayo de sobrenadantes de
405 cepas de actinomycetes.65 El compuesto señalizador involucrado en esta interacción fue
aislado e identificado como un oligopéptido denominado goadsporina. La goadsporina se
encontró que actuaba como un inductor general del metabolismo especializado de
Actinomycetes. Posteriormente, se evaluó frente a 42 cepas seleccionadas al azar, dónde
estimuló la producción de pigmentos en 20 cepas y la esporulación en 32 cepas. Así mismo, se
encontró que la goadsporina era un potente antibiótico específico a Streptomyces; no mostró
bioactividad frente a proteobacterias, firmicutes u hongos. En el caso de S. scabies, S. coelicolor
y S. lividans mostró una concentración mínima inhibitoria de 0.2, 3.2 y 6.4 µg mL-1
14 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
respectivamente. A concentraciones subinhibitorias, la goadsporina estimula la esporulación
y la producción de antibióticos, mientras que a altas concentraciones funciona como una
potente toxina. Este fenómeno donde una dosis baja de una molécula causa estímulo, y una
dosis alta de la misma molécula causa toxicidad se conoce como hormesis66. La hormesis es de
vital importancia en la comprensión de las interacciones presentes en los co-cultivos donde
concentraciones subtóxicas de antibióticas pueden estimular la esporulación, el desarrollo o
la biosíntesis de metabolitos especializados, mientras que altas concentraciones pueden
causar la muerte celular.13
Ejemplos de interacciones de esta categoría han demostrado que la inhibición en el
crecimiento es en muchos casos clave para la estimulación del metabolismo secundario.
Muchos microorganismos por lo general responden a moléculas inhibidoras del crecimiento
produciendo sus propias moléculas inhibidoras del crecimiento.20
Interacción debida a contacto célula-célula (física)
Esta categoría hace referencia a los co-cultivos que requieren contacto físico célula-célula para
mostrar un cambio en la producción metabólica. Uno de los primeros ejemplos reportados en
esta categoría fue el trabajo realizado por Clardy y colaboradores en la inducción de un
metabolito a través del co-cultivo del hongo marino Pestalotia sp. con la bacteria Thalassospira
sp..33 Estos estudios condujeron al aislamiento y elucidación estructural de la pestalona, una
benzofenona que no se detectó en los controles de hongo y bacteria. La pestalona mostró
importante actividad antibacterial. Un estudio similar realizado por el grupo de Fenical mostró
que el hongo marino Libertella sp. podía producir las libertelenonas cuando era co-cultivado
por una proteobacteria marina no identificada. Estos diterpenoides mostraron actividad
citotóxica de moderada a potente en contra de una línea celular de cáncer.36
En ambos estudios, se intentó replicar la interacción sustituyendo la bacteria inductora por
células de bacteria muertas, sobrenadantes libres de células o extractos de acetato de etilo; sin
embargo, todos estos ensayos fracasaron, demostrando que se requiría contacto célula-célula
para la inducción de la biosíntesis de la pestalona y las libertelenonas.
Se ha encontrado que un gran número de interacciones hongo-bacteria no están mediadas por
compuestos difusibles sino por contacto físico célula-célula. Brakhage y colaboradores
encontraron que las interacciones entre Aspergillus nidulans y Streptomyces rapamycinicus
hacen parte de esta categoría, visualizando este proceso mediante micrografía electrónica de
Capítulo 1 15
barrido.67 Cuando la inducción de metabolitos fue analizada con más detalle se encontró que
la bacteria estaba causando alteraciones de la cromatina del hongo por acetilación de las
histonas vía complejo Saga/Ada.68 En general, se ha encontrado que el metabolismo
secundario de hongos puede ser altamente sensible a las modificaciones de las histonas.20
1.2.3 Consideraciones experimentales
A continuación, se resumen algunas de las consideraciones experimentales necesarias para el
establecimiento de co-cultivos.
Selección de microorganismos
El co-cultivo como una herramienta de inducción de metabolitos bioactivos es un método
relativamente reciente, esto ha causado que no existan criterios totalmente definidos para la
selección de los microorganismos que interactuarán. Se realizó una revisión de 100 artículos
de co-cultivo con los que se determinaron los criterios de selección de microorganismos más
empleados. Así, en 48 casos la selección del co-cultivo proviene de un screening a partir de un
cepario de microorganismos, o los autores no explican el proceso de selección del co-cultivo.
En los otros 52 casos se identificaron seis criterios de selección de microorganismos para la
realización de co-cultivos entre los que se encuentran: el uso de interacciones presentes en la
naturaleza o criterio ecológico (20 casos); el enfrentamiento con una bacteria que contiene
ácido micólico en su pared celular (14 casos); el enfrentamiento con patógenos (7 casos); el
enfrentamiento entre bacterias del género Streptomyces (2 casos); el conocimiento previo de
los microoganismos (8 casos) y el enfrentamiento entre bacterias del género Streptomyces con
bacterias pertenecientes al phylum Proteobacteria (1 caso). A continuación, se explicará con
más detalle en qué consiste cada uno de estos criterios.
Un primer criterio es elegir microorganismos que interactúan en la naturaleza en una
comunidad microbiana (criterio ecológico). En la naturaleza los microorganismos pueden
interactuar de diferentes maneras mediante: interacciones positivas (comensalismo,
protocooperación y mutualismo), interacciones negativas (amensalismo y competencia) e
interacciones que son positivas para uno, pero negativas para otro (parasitismo y predación).
Para una producción eficiente de compuestos bioactivos se considera el uso de interacciones
positivas (comensalismo, protocooperación y mutualismo) entre 2 microorganismos como
una estrategia promisoria.69
16 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
Un ejemplo del uso de este primer criterio se observa en el estudio realizado por Rateb y
colaboradores44, dónde realizaron experimentos de co-cultivo con Streptomyces bullii y
Aspergillus fumigatus, obteniendo 12 compuestos que no se encontraban en los monocultivos
de ninguno de los dos microorganismos. Estos dos microorganismos se obtuvieron a partir de
la misma muestra de suelo del Desierto de Atacama en Chile 70, y su interacción era
inicialmente tan estable que se pensaba que eran un único microorganismo.
Un segundo criterio es enfrentar a una Actinobacteria con una bacteria que contenga ácido
micólico en su pared celular. Este criterio es resultado de los estudios realizados por Onaka y
colaboradores. En un primer estudio reportado en 201171 se encontró que cuando se
realizaban co-cultivos de cepas de Streptomyces aisladas de suelo con Tsukamurella pulmonis
(bacteria que contiene ácido micólico), se alteraba la síntesis de productos naturales en un
88%, se producían nuevos metabolitos secundarios en un 37% y se incrementaba la
producción de metabolitos en un 55%. También se encontró que el co-cultivo de cepas de
Streptomyces con Rhodococcus erythropolis y Corynebacterium glutamicum alteraba la
biosíntesis de los compuestos producidos en un 87% y 90% respectivamente, y se producían
nuevos metabolitos secundarios en un 32% y 34% respectivamente. Esto permitió a los
autores concluir que las bacterias que contienen ácido micólico pueden influenciar en altas
frecuencias la biosíntesis de productos naturales en Streptomyces spp.71
Empleando este precepto Onaka y colaboradores aislaron una gran variedad de compuestos
nuevos como la arcyriaflavina E47, las chojalactonas A-C49, las niizalactamas A-C50, las 5-alquil-
1,2,3,4-tetrahidroquinolinas51, los streptoaminales72, las dracolactamas A y B73, mirilactamas
C-E74 y las umezawamidas A y B75 a partir de co-cultivos de Streptomyces con bacterias que
contienen ácido micólico. También han realizado estudios para comprender el mecanismo de
esta interacción76,77, y aunque todavía no tiene total claridad al respecto, se sabe que se
requiere que haya un contacto físico célula-célula de manera que ocurra la alteración en la
biosíntesis de productos naturales.
Otro ejemplo del uso de este segundo criterio se puede observar en el estudio realizado por
Bugni y colaboradores78 dónde realizaron co-cultivos de 65 bacterias pertenecientes a la
familia Micromonosporaceae con 2 bacterias que contienen ácido micólico (Mycobacterium sp.
y Rhodococcus sp.). A partir de este estudio encontraron que 12 Micromonosporaceae
producían metabolitos diferentes en co-cultivo respecto a los presentes en el monocultivo.
Capítulo 1 17
Un tercer criterio consiste en el co-cultivo entre un microorganismo de interés, y un patógeno.
Un ejemplo del uso de este criterio se pudo observar en el estudio realizado por Sung y
colaboradores79, dónde se realizaron los co-cultivos entre un aislamiento Streptomyces sp. con
cuatro patógenos humanos que incluían a Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus (MSSA),
Staphylococcus aureus (MRSA) y Pseudomonas aeruginosa. Se observó que el co-cultivo
incrementaba la producción de tres antibióticos, y que a juzgar por lo observado por
espectrometría de masas también se producían varios análogos de estos antibióticos.
Otro ejemplo del uso de este criterio es un estudio realizado por Rathore y colaboradores
reportado en 201680. En este trabajo se realizó el co-cultivo de Streptomyces variabilis con el
patógeno Cryptococcus neoformans causante de la meningitis. S. variabilis había demostrado
actividad contra C. neoformans, y al realizar su co-cultivo con el patógeno, se llevó a cabo una
evolución adaptativa en laboratorio81. Es decir, un primer co-cultivo en medio líquido se
sembró en múltiples cajas de Petri, a cada aislamiento de S. variabilis se le evaluó la actividad
frente a C. neoformans, encontrándose que había un aislamiento de S. variabilis con actividad
incrementada, al cual se le volvió a someter a co-cultivo con el patógeno. Este procedimiento
se hizo dos veces más, y al final se obtuvieron 3 cepas mutantes de S. variabilis con actividad
incrementada respecto a C. neoformans, a las cuales se les analizaron sus metabolitos
secundarios encontrando que el proceso adaptativo había fomentado la sobreexpresión de los
metabolitos con actividad en contra de C. neoformans.
Una modificación de este criterio ha sido sugerida por Pessotti y colaboradores82, en esta se
realizan co-cultivos entre patógenos que coexisten en el mismo hospedero y compiten por los
mismos recursos. Un ejemplo del uso de este criterio es un estudio realizado por Glauser y
colaboradores83, que estableció el co-cultivo entre hongos patógenos de cultivos de uva,
incrementando en un factor de 100 el rendimiento del compuesto O-metilmeleína.
Un cuarto criterio consiste en el enfrentamiento de bacterias del género Streptomyces. Un
estudio realizado por Ueda y colaboradores61 demostró que con alta frecuencia en
Streptomyces las interacciones interespecíficas estimulan la producción de antibióticos y/o la
diferenciación celular. La validez de este criterio podría ser confirmada por un estudio
realizado en años posteriores por Russel y colaboradores84, donde se encontró que las
bacterias inhiben principalmente el crecimiento de bacterias metabólicamente similares y
relacionadas evolutivamente.
18 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
Un quinto criterio hace referencia a la existencia de conocimiento previo sobre los
microorganismos a estudiar. Así, se seleccionan microorganismos modelo o microorganismos
de los que se conoce información a nivel genómico o sobre los metabolitos que produce. Un
ejemplo de ello es el estudio realizado por Wu y colaboradores85, donde los autores
seleccionaron a Streptomyces coelicolor y Aspergillus niger, por ser microorganismos
ampliamente estudiados en su laboratorio, y con esta pareja establecieron un co-cultivo que
indujo la producción de un dipéptido cíclico y del ácido 2-hidroxifenilacético.
Un último criterio que podría emplearse sería el enfrentamiento entre una bacteria
Streptomyces sp. con una bacteria perteneciente al filo Proteobacteria. Este criterio está basado
en el estudio realizado por Carlson y colaboradores86 donde realizaron el co-cultivo de una
cepa de Streptomyces sp. con cepas del phylum Proteobacteria, Firmicutes y Actinobacteria
encontrando que las cepas del filo Proteobacteria inducían la producción del antibiótico
resistomicina en un 65%, a diferencia del phylum Firmicutes y Actinobacteria que inducían la
producción de resistomicina en un 5,9% y 9,1% respectivamente. Esto permitiría suponer que
la inducción de la producción de un antibiótico puede ser dependiente del phylum de la
bacteria, y que esto podría tenerse en cuenta en la realización de un screening sistemático de
co-cultivos.
Condiciones para el establecimiento del co-cultivo
En los co-cultivos existen numerosas variables que deben tenerse en cuenta en el momento
del establecimiento del experimento. Estas incluyen el número de microorganismos que
participan en la interacción, el grado de contacto entre los microorganismos, el medio de
cultivo y volumen del mismo, la densidad poblacional y el tiempo.
Número de microorganismos
La estrategia general consiste estudiar una interacción entre dos microorganismos bajo
condiciones controladas. Interacciones complejas que involucren varios microorganismos no
se sugiere estudiarlas directamente porque la contribución de cada individuo sería difícil de
comprender.17Más de tres microorganismos pueden conducir a un nivel inmanejable de
complejidad en términos de interacciones moleculares, que conllevan a una baja
predictibilidad e inestabilidad.87
Capítulo 1 19
Grado de contacto
En los co-cultivos, los microorganismos pueden estar perfectamente mezclados o
parcialmente separados, lo cual se logra mediante el uso de barreras físicas. En general,
escoger un modo particular para separar las poblaciones de microorganismos permite un
control estricto de las interacciones, lo que puede ser clave para la estabilidad del sistema.87
Los co-cultivos que buscan inducción de metabolitos bioactivos por lo general se realizan en
medio líquido y los microorganismos se encuentran mezclados sin ningún tipo de barrera
entre ellos.78,88 Sólo en algunos casos específicos el contacto es parcial, pues se busca
determinar el modo de interacción en un co-cultivo determinado, particularmente si se
requiere o no el contacto directo de los microorganismos para observar algún tipo de cambio.
Para estos casos, la separación puede ser lograda empleando membranas semipermeables,
geles y dispositivos microfluídicos.89,90
Como ejemplo de estos estudios se puede mencionar el co-cultivo entre Streptomyces lividans
y Tsukamurella pulmonis antes citado, en el que se deseaba conocer si la inducción de la
producción de compuestos ocurría aunque no existiera un contacto físico célula-célula. Para
esto, se estableció el co-cultivo en un envase de diálisis con dos compartimentos separados por
una membrana que permitía intercambio de metabolitos pero no el contacto directo; al
realizar este experimento no hubo inducción de los compuestos, lo que llevó a la conclusión de
que el contacto directo era necesario.71
Medio de cultivo
Para el co-cultivo de microorganismos se pueden emplear medios de cultivo sólidos o líquidos.
La selección del medio de cultivo debe tener en cuenta a los dos microorganismos
involucrados.
El cultivo de los dos microorganismos en medio sólido permite visualizar con facilidad la
morfología y patrones de interacción17. Así mismo, facilita la ubicación espacial de los
metabolitos (particularmente en la zona de confrontación) por medio de espectrometría de
masas de imágenes91. Los ensayos en medio sólido son una valiosa herramienta para evaluar
la competencia entre microorganismos, pues se pueden observar cambios en los fenotipos que
pueden incluir defectos en el desarrollo, inhibición del crecimiento, lisis, motilidad y
20 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
producción de pigmentos.92 Sin embargo, los cultivos en medio sólido se suelen hacer a
pequeña escala (caja de Petri), y producen cantidades limitadas de metabolitos.
En medio líquido, no es fácil visualizar la interacción entre los microorganismos, pero la
inducción de metabolitos secundarios es más fácilmente monitoreable, a lo que se suma la
facilidad de escalamiento del cultivo para el aislamiento de metabolitos17. En cualquier caso, la
selección del medio de cultivo dependerá de los microorganismos que se estén trabajando,
pues se han reportado casos donde los metabolitos bioactivos se encuentran en mayor
concentración en medios sólidos.93
Por lo general, es común encontrar que para el estudio de interacciones que involucran hongos
se empleen medios sólidos94, mientras que para co-cultivos que únicamente involucran
bacterias se empleen medios líquidos.46
Los co-cultivos pueden ser llevados a cabo en cualquier rango de volumen y es la aplicación la
que determina la elección de volumen. Así, por ejemplo, la disminución del volumen del medio
de cultivo a niveles de microlitros se usa para la realización de screenings de diferentes
sistemas y condiciones. Mientras que el aumento del volumen de cultivo se usa para estudios
de escalamiento que buscan determinar condiciones de cultivo a nivel industrial, con el fin de
aumentar el rendimiento en la producción de metabolitos bioactivos. El volumen determinará
el tamaño de las poblaciones empleado.87
Densidad poblacional
En co-cultivos las proporciones entre las poblaciones de microorganismos deben ser
optimizadas para obtener un cultivo estable de manera que un microorganismo no elimine al
otro.87
Tiempo
El tiempo de co-cultivo dependerá de la naturaleza de los microorganismos (hongo o bacteria)
y de la velocidad de crecimiento de cada una de las cepas involucradas en la interacción.
Todavía no se tiene claridad cuál es el tiempo óptimo de inoculación de cada uno de los
microorganismos ni cuál es el tiempo óptimo de extracción.30 Lo que frecuentemente se
reporta es que se hacen monocultivos de cada uno de los microorganismos, los cuales se
Capítulo 1 21
incuban en rangos de 24-72h para luego ser inoculados en medio estéril, donde el co-cultivo
es incubado en rangos de 5-15días.36,38,39,44,46,78,88,95
Extracción y perfilado metabólico
Debido a la gran complejidad de los extractos se hace necesario el uso de métodos analíticos
avanzados, buscando no solo la detección sino también la identificación de los metabolitos
inducidos mediante el co-cultivo. Las técnicas empleadas incluyen CCD, HPLC acoplado a
diferentes detectores, GC-MS y RMN17. En algunos casos los cambios inducidos por el co-cultivo
son tan grandes que la simple comparación de los cromatogramas (o espectros) permite
detectarlos, no obstante, muchas veces se debe hacer uso de análisis multivariado de datos.
La inducción de metabolitos primarios ha sido monitoreada con RMN 1H96, HPLC-IR97 y GC-
MS98. Para metabolitos secundarios, se han empleado CCD99, HPLC-UV100; RMN88; GC-MS101 y
HPLC-MS102, así mismo, el uso de MS/MS permite generar mayor información de los
metabolitos presentes.17
En un gran número de experimentos de co-cultivo, se ha observado sobreproducción de
pigmentos en el medio de cultivo o en la zona de confrontación83,95,103. Para estos casos se han
empleado técnicas analíticas basadas en la detección del color como (UV/VIS), CCD101 o HPLC-
UV104,105 que permiten detectar la inducción de estos compuestos para su posterior
identificación.
El uso de 1H NMR se ha popularizado en los estudios de perfilado metabólico haciendo uso de
extractos naturales crudos sin ninguna separación cromatográfica previa.106 Es un método
simple y reproducible, que no implica una preparación de muestra compleja. Provee
información estructural importante para identificación de los compuestos mediante los
espectros mono dimensionales (1H RMN) y bidimensionales (J-resolved, COSY, HMBC,
HSQC).107 Adicionalmente, provee información cuantitativa, pues la intensidad de la señal es
proporcional a la concentración molar de los metabolitos. El uso de bases de datos puede
permitir la identificación de compuestos de manera rápida.108
Las técnicas acopladas a espectrometría de masas han sido empleadas con frecuencia por su
sensibilidad, poder de resolución y su capacidad de proveer información estructural de los
metabolitos inducidos.106 La cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas
genera perfiles de alta resolución y la identificación de los metabolitos puede realizarse
22 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
rápidamente empleando bases de datos (si el modo de ionización es impacto electrónico) y el
índice de retención.106 En comparación, la resolución de la cromatografía líquida es por lo
general menor, pero cuando es combinada con un espectrómetro de alta resolución que
emplee un método de ionización como ESI, esta técnica provee una buena separación de los
constituyentes del metaboloma en términos cromatográficos y de masas.17 Además, LC-MS
tiene la ventaja de permitir analizar un rango muy amplio de metabolitos secundarios, a
diferencia de GC-MS que requiere que los compuestos sean volátiles, lo que puede implicar
pasos de derivatización.106
Por último, la espectrometría de masas de imágenes se ha empleado para el análisis de la
composición de las zonas de confrontación de co-cultivos de microorganismos en medio
sólido. Esta técnica permite obtener información respecto a la distribución espacial de
moléculas específicas. Existen diferentes métodos, según la técnica de ionización: MALDI
(matrix-assisted laser desorption ionization), DESI (Desorption electrospray ionization) y
LDPI (Laser desorption postionization). Su uso permite registrar el espectro de masas total en
posiciones definidas, y la compilación de esos datos facilita una imagen de una zona particular
del co-cultivo.109 La elección del método de ionización dependerá del tipo de metabolitos que
deseen ser detectados. MALDI es más adecuado para metabolitos de alto peso molecular
(péptidos y proteínas) mientras que DESI es adecuado para metabolitos de bajo peso
molecular.110
Análisis de datos e identificación de metabolitos
Luego de que los extractos han sido analizados, usando cualquiera de los métodos analíticos
(o combinaciones) mencionados, se debe proceder a analizar los datos con el objetivo de
identificar aquellos metabolitos secundarios que son producidos de novo o cuya producción ha
sido afectada por el co-cultivo. Dada la complejidad de los datos (tiempos de retención, valores
de m/z, desplazamientos químicos, etc.) se deben usar herramientas quimiométricas, para
identificar las señales de interés y luego correlacionarlas con la identidad del compuesto.17
Para experimentos de co-cultivo se han empleado varios métodos quimiométricos de análisis
de datos, que incluyen el análisis de componentes principales (PCA)88, el análisis de varianza
(ANOVA)111, regresión de mínimos cuadrados parciales con análisis discriminante (PLS-DA)102
y proyecciones ortogonales a las estructuras latentes con análisis discriminante (OPLS-DA)112.
Capítulo 1 23
Por lo general, lo que se desea es comparar las dos muestras control (monocultivos) con la
muestra correspondiente al co-cultivo.
Como un primer paso, por lo general, se hace un análisis de componentes principales (PCA),
esperando obtener tres clusters bien diferenciados, uno para cada cepa pura y el tercero para
el co-cultivo de las mismas. Un segundo paso consiste en el análisis mediante (O)PLS-DA con
el fin de determinar las variables diferenciadoras entre ellos. Sin embargo, estos enfoques no
están bien adaptados para el estudio de co-cultivos; el PCA describe las variaciones del
metaboloma entre las muestras, pero no resalta las modificaciones debidas al co-cultivo. De
manera similar, el (O)PLS-DA construye modelos que están enfocados en la comparación del
co-cultivo con los monocultivos, pero no considera al co-cultivo como una mezcla de dos
microorganismos, así que no describe la variación metabólica esperada en un co-cultivo de una
manera interpretable.17
Para solucionar este inconveniente se ha desarrollado el método “Projected orthogonalized
chemical encounter monitoring” (POChEMon)113, donde los datos del co-cultivo son
matemáticamente reconstruidos como una mezcla de los cultivos de las cepas puras en donde
la variación metabólica puede ser explorada. Este método permite analizar de mejor manera
la alta variabilidad que es encontrada en estos sistemas complejos.
Otros métodos que se han empleado en el análisis de datos derivados de co-cultivos son los
Self Organizing Maps (SOM) y el Molecular Networking.114 Los primeros son útiles para el
análisis de datos que son derivados de múltiples estímulos, por ejemplo, la variación de
condiciones para la optimización de producción de metabolitos en un microorganismo. El
segundo método está basado en la búsqueda de similitudes del espectro MS/MS entre
diferentes metabolitos, lo que ha llevado en algunos estudios a la identificación exitosa de
análogos estructurales basados en sus patrones de fragmentación.115
Previo a la purificación de metabolitos de metabolitos, se puede hacer dereplicación a partir
de datos de espectrometría de masas o MS/MS, empleando bases de datos de productos
naturales. En caso de que los compuestos inducidos por el co-cultivo no puedan ser
dereplicados; se deben purificar e identificar estos metabolitos mediante RMN y MS.116 Con
este propósito, se han empleado estrategias de aislamiento clásicas basadas en múltiples pasos
de fraccionamiento.44,83,100,103,104 Se han empleado fraccionamientos bioguiados para aislar
compuestos particulares de un co-cultivo cuando se observa inducción de actividad. Esto ha
24 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
llevado a la identificación de los metabolitos inducidos responsables de una actividad
particular.105
1.2.4 Métodos complementarios al co-cultivo
En ocasiones se emplean otros métodos de elicitación biológica tras el estudio de co-cultivos.
Estos pueden incluir el uso de lisados microbianos y el uso de componentes celulares
microbianos. En la primera, se usan células de un segundo microorganismo, previamente
lisadas. En la segunda, se emplean componentes microbianos como: constituyentes de la
membrana celular, hormonas microbianas, moléculas de señalización, carbohidratos o
biopolímeros.14 Estas dos estrategias buscan inducir respuestas en el microorganismo
cultivado por reconocimiento de la presencia del segundo microorganismo (aunque éste no
esté vivo). Si bien estos métodos en algunos casos han dado lugar a una respuesta en el
microorganismo, en la mayoría de casos se ha evidenciado que la presencia del segundo
microorganismo vivo es necesaria para la inducción, activación o regulación de rutas
biosintéticas silenciadas o crípticas.14
Recientemente, Mandelare y colaboradores117 realizaron el co-cultivo del mismo hongo pero
en etapas de desarrollo diferentes, es decir, evaluaron la interacción entre la forma sexual y
asexual del hongo Aspergillus alliaceus. Cada una de las formas presentaba un perfil químico
diferente. Al realizar el co-cultivo, el perfil químico de éste cambiaba drásticamente respecto
a los monocultivos, y permitió el aislamiento de la aliantrona A. Este es el primer reporte de
un co-cultivo donde ocurre una auto-modificación de la producción metabólica.
1.2.5 Desafíos y futuro del co-cultivo
Como se mencionó anteriormente el co-cultivo como técnica de inducción de metabolitos
presenta algunas desventajas como la falta de reproducibilidad y predictibilidad. Para
solucionar estos inconvenientes, este método todavía tiene el desafío de desarrollar protocolos
estandarizados.21 Se espera que la caracterización de los factores promotores producidos por
las cepas estimuladoras brinde claves para el desarrollo de condiciones efectivas de co-cultivo,
lo cual podrá llevar al descubrimiento de nuevas moléculas.18
Recientemente, se han reportado estudios de co-cultivos que pretenden hacer una evaluación
sistemática; esto los lleva a realizar una fermentación a pequeña escala que permite evaluar
Capítulo 1 25
numerosas muestras en tiempos cortos. Un primer ejemplo es el estudio reportado por
Bertrand y colaboradores118 en 2014, dónde co-cultivos de hongos fueron evaluados en medio
sólido empleando cajas de 12 pozos (2cm diámetro por pozo). Para desarrollar este protocolo
emplearon dos hongos modelo Aspergillus clavatus y Fusarium sp.. Esta estrategia permitió
evaluar un gran número de muestras con, así mismo, permitía obtener cantidad suficiente de
extracto (50mg en promedio) para realizar perfilado metabólico por métodos analíticos, así
como la evaluación de la actividad biológica. Finalmente, evaluaron con éxito la capacidad de
escalamiento del método realizando los co-cultivos prometedores en cajas de Petri de 15cm.
Un segundo ejemplo de la miniaturización de este método, fue reportado por Bugni y
colaboradores78 en 2015 dónde evaluaron las interacciones de 65 Micromosporaceae con las
bacterias Mycobacterium sp. y Rhodococcus sp. (bacterias con ácido micólico). Para esto
realizaron la fermentación de mono y co-cultivos en cajas de 96 pozos; posteriormente se
realizó una extracción de metabolitos. Con este extracto se evaluó actividad antibiótica y se
realizó un perfilado metabólico empleando HPLC-MS. La evaluación de estos resultados
permitió seleccionar las interacciones más prometedoras para el aislamiento de metabolitos
bioactivos.
Los ejemplos mencionados se enmarcan en técnicas de cultivo clásicas o miniaturización de
las mismas. Sin embargo, el uso de técnicas modernas de cultivo ha sido sugerido
recientemente, entre ellas se encuentran el uso de dispositivos microfluídicos, técnicas de
encapsulación, entre otros.119
La miniaturización de la fermentación en co-cultivos puede ser una estrategia para establecer
protocolos estandarizados en tiempos cortos, que permitan evaluar simultáneamente una
gran cantidad de interacciones. Esto puede llevar a una mejor comprensión del método que se
traduzca en criterios más específicos de selección de microorganismos.
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2. Capítulo 2: Selección de microorganismos y screening de co-cultivos binarios en medio líquido
Resumen
En la búsqueda de compuestos, a partir de la fermentación de microorganismos, se ha
observado una disminución en el número de compuestos nuevos obtenidos. Esto contrasta con
el potencial metabólico de los microorganismos sugerido por los estudios genómicos. Se han
desarrollado varios métodos para la regulación de genes siendo uno de ellos el co-cultivo.
El primer paso de este trabajo consistió en la selección del set de microorganismos de trabajo.
Par esto se escogieron 15 microorganismos del cepario del grupo de investigación “Estudio y
Aprovechamiento de Productos Naturales Marinos y Frutas de Colombia”, que contiene más
de 200 aislamientos, empleando los siguientes criterios: (1) conocimiento químico previo de
los aislamientos, (2) bacteria con ácido micólico en su pared celular, (3) criterio ecológico y
(4) bacterias pertenecientes al género Streptomyces sp.
A partir de los 15 microorganismos seleccionados se establecieron los 105 co-cultivos binarios
posibles en medio líquido (15mL), empleando como medios de cultivo LB, LBS (LB
suplementado con sales) o LBG (LB suplementado con glucosa) según los aislamientos que
estuviesen involucrados en la interacción. El sobrenadante de cada uno de los cultivos fue
separado de la biomasa por centrifugación, y fue extraído con acetato de etilo. Los extractos
orgánicos fueron analizados empleando UHPLC-DAD-ELSD. A partir de estos resultados, se
seleccionaron 5 interacciones promisorias, por tener señales claramente diferenciables
respecto a los monocultivos, las cuales fueron cultivadas en volúmenes de 100mL. Los
extractos orgánicos de estos cultivos fueron analizados por UHPLC-DAD-ELSD y RMN 1H.
El comportamiento de los co-cultivos seleccionados a una escala de 100mL varió respecto a
los co-cultivos realizados en 15mL, evidenciándose en todos los casos, que las condiciones de
38 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
fermentación no garantizaban la coexistencia de los dos microorganismos que hacían parte de
la interacción. Estos resultados muestran la necesidad de desarrollar nuevas aproximaciones
que garanticen la supervivencia de los microorganismos involucrados en la interacción.
2.1 Introducción
Investigaciones del genoma de los microorganismos han demostrado que existen rutas
biosintéticas silenciadas y crípticas, que no se expresan en condiciones estándares de
crecimiento, y que podrían dar lugar a la biosíntesis de compuestos que no se aíslan en
condiciones normales. Para promover la activación de estas rutas, se han desarrollado
diferentes métodos, siendo uno de ellos el co-cultivo de microorganismos.1
Éste consiste en el cultivo de dos o más microorganismos en un mismo ambiente confinado,2 y
tiene en cuenta que los microorganismos normalmente crecen en ambientes complejos, de tal
manera que las interacciones inter- o intraespecies son las prevalentes en la naturaleza por lo
que el crecimiento de un microorganismo en presencia de otros microorganismos, puede
alterar o estimular el metabolismo especializado del mismo.3
Como resultados del co-cultivo se han reportado: rendimientos incrementados de metabolitos
previamente descritos, producción de análogos de metabolitos conocidos, y la inducción de
metabolitos bioactivos nuevos.4 Es importante tener en cuenta que lo que se desea en el co-
cultivo es que alguno de los microorganismos modifique su producción metabólica, pero estos
compuestos exclusivos al co-cultivo no son necesariamente novedosos. Actualmente los
trabajos se han enfocado principalmente en interacciones bacteria-hongo5, pero también hay
reporte de hongo-hongo6 y bacteria-bacteria7.
El co-cultivo es un método relativamente reciente, lo que ha causado que no existan criterios
totalmente definidos para la selección de los microorganismos que interactuarán. Una revisión
bibliográfica muestra que se han empleado los siguientes criterios:
Conocimiento previo
Hace referencia a seleccionar microorganismos modelo o microorganismos de los que se
conoce información a nivel genómico o sobre los metabolitos que produce. Un ejemplo de ello
Capítulo 1 39
es el estudio realizado por Wu y colaboradores8, donde los autores seleccionaron a
Streptomyces coelicolor y Aspergillus niger, por ser microorganismos ampliamente estudiados
en su laboratorio, y con esta pareja establecieron un co-cultivo que indujo la producción de un
dipéptido cíclico y del ácido 2-hidroxifenilacético.
Criterio ecológico
Consiste en elegir microorganismos que han sido aislados de una misma comunidad
microbiana. Un ejemplo del uso de este primer criterio se observa en el estudio realizado por
Rateb y colaboradores9, dónde se estableció el co-cultivo entre los microorganismos
Streptomyces bullii y Aspergillus fumigatus10 ambos recuperados de la misma muestra de suelo
del Desierto de Atacama en Chile. Este trabajo permitió obtener 12 compuestos que no eran
producidos en los monocultivos de ninguno de los dos microorganismos.
Bacteria con ácido micólico vs. Actinobacteria
Se ha demostrado que las bacterias que contienen ácido micólico son capaces de inducir la
producción de metabolitos especializados en bacterias del género Streptomyces11. Es más,
estudios recientes han mostrado que el efecto que tienen las bacterias con ácido micólico
también se extiende a otras Actinobacterias12.
Empleando este precepto Onaka y colaboradores han aislado una gran variedad de
compuestos nuevos como la arcyriaflavina E13, las chojalactonas A-C14, las niizalactamas A-C15,
las 5-alquil-1,2,3,4-tetrahidroquinolinas16, los streptoaminales17, las dracolactamas A y B12,
mirilactamas C-E18 y las umezawamidas A y B19.
Enfrentamiento con patógenos
Consiste en el co-cultivo entre un microorganismo de interés, y un patógeno. Un ejemplo del
uso de este criterio se pudo observar en el estudio realizado por Sung y colaboradores20, dónde
se realizaron los co-cultivos entre un aislamiento Streptomyces sp. con cuatro patógenos
humanos que incluían a Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus (MSSA), Staphylococcus aureus
(MRSA) y Pseudomonas aeruginosa. Se observó que el co-cultivo incrementaba la producción
de tres antibióticos, y que a juzgar por lo observado por espectrometría de masas también se
producían varios análogos de estos antibióticos.
40 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
Streptomyces sp. vs. Streptomyces sp.
Consiste en el co-cultivo de bacterias del género Streptomyces. Un estudio realizado por Ueda
y colaboradores21 demostró que con alta frecuencia en Streptomyces las interacciones
interespecíficas estimulan la producción de antibióticos y/o la diferenciación celular. La
validez de este criterio podría ser confirmada por un estudio realizado en años posteriores por
Russel y colaboradores22, donde se encontró que las bacterias inhiben, principalmente, el
crecimiento de bacterias metabólicamente similares, y evolutivamente relacionadas.
Streptomyces sp. vs Proteobacterias
Consiste en el co-cultivo entre una bacteria Streptomyces sp. con una bacteria perteneciente al
phylum Proteobacteria. Este criterio está basado en el estudio realizado por Carlson y
colaboradores23 donde realizaron el co-cultivo de una cepa de Streptomyces sp. con cepas del
phylum Proteobacteria, Firmicutes y Actinobacteria, y encontraron que las cepas del phylum
Proteobacteria inducían la producción del antibiótico resistomicina en un 65% de los casos, a
diferencia de los phyla Firmicutes y Actinobacteria que inducían la producción de
resistomicina tan solo en un 5.9% y 9.1% de los casos, respectivamente. Esto permitiría
suponer que la inducción de la producción de un antibiótico puede ser dependiente del phylum
de la bacteria con la que se cultive la cepa de Streptomyces, y que esto podría tenerse en cuenta
en la realización de un screening sistemático de co-cultivos.
Otro aspecto importante a considerar es el medio de cultivo, pues además de su composición
se pueden emplear medios sólidos o líquidos que tendrán gran impacto en la producción
metabólica. La selección del medio de cultivo debe tener en cuenta a los dos microorganismos
involucrados, garantizando su supervivencia. En medio líquido la inducción de metabolitos es
fácil de monitorear, y usualmente el escalamiento del cultivo, para el aislamiento de
compuestos, se hace con mayor facilidad. No obstante, en medios líquidos no es fácil visualizar
la interacción entre los microorganismos2. Es común encontrar que para el estudio de
interacciones que involucran hongos se empleen medios sólidos24, mientras que para co-
cultivos que únicamente involucran bacterias se empleen medios líquidos.7
Un desafío importante en el establecimiento de co-cultivos es establecer una metodología que
permita la evaluación sistemática de una gran cantidad de emparejamientos. Esto se ha
logrado mediante fermentaciones a pequeña escala, que permiten evaluar un gran número de
Capítulo 1 41
muestras en tiempos cortos, pero que requiere metodologías analíticas sensibles. Un ejemplo
de lo anterior es el estudio reportado por Bertrand y colaboradores25 en 2014, dónde co-
cultivos de hongos fueron evaluados en medio sólido empleando cajas de 12 pozos. Esta
estrategia permitió evaluar un gran número de muestras y obtener cantidad suficiente de
extracto (50mg en promedio) para realizar el perfilado metabólico de ellas, así como la
evaluación de la actividad biológica. Finalmente, evaluaron con éxito la capacidad de
escalamiento del método realizando los co-cultivos promisorios en cajas de Petri de 15cm.
En este sentido, la miniaturización de la fermentación en co-cultivos puede ser una estrategia
para establecer protocolos estandarizados en tiempos cortos, que permitan evaluar
simultáneamente una gran cantidad de interacciones. Esto puede llevar a una mejor
comprensión del método que se traduzca en criterios más específicos de selección de
microorganismos.
El objetivo de este capítulo fue establecer una metodología de screening en medio líquido para
seleccionar las parejas más promisorias entre todas las parejas posibles a partir de un set de
15 microorganismos. Se buscó seleccionar aquellas parejas promisorias que evidenciaran
cambios en su producción metabólica y/o actividad biológica en comparación a los
monocultivos.
2.2 Materiales y métodos
2.2.1 General
Para los medios de cultivo se empleó triptosa (Scharlau), cloruro de sodio R.A. (Merck),
extracto de levadura (Oxoid), glucosa R.A. (Merck), cloruro de potasio (PanReac AppliChem),
cloruro de magnesio (Carlo Erba Reagents), sulfato de magnesio heptahidratado (Carlo Erba
Reagents), tris base (Fisher Scientific) y sal marina (Rila).
Para las extracciones se empleó acetato de etilo grado analítico (PanReac AppliChem). Para los
análisis cromatográficos se empleó acetonitrilo grado HPLC (Honeywell), y agua desionizada
y filtrada en un equipo de filtración Millipore Simplicity y luego filtrada nuevamente a través
de una membrana de nylon de tamaño de poro de 0.22 μm (CNW Technologies). Para los
análisis por resonancia magnética nuclear se emplearon como solventes CDCl3 con grado de
deuteración 99.8 % (Merck) y metanol-d4 con grado de deuteración 99.8% (Merck).
42 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
2.2.2 Selección de microorganismos
A partir de criterios reportados en la literatura, se seleccionaron 15 microorganismos (14
bacterias y 1 hongo) a partir del cepario del grupo de investigación “Estudio y
Aprovechamiento de Productos Naturales Marinos y Frutas de Colombia”. Los criterios de
selección y la información principal de estos aislamientos se resumen en la discusión.
2.2.3 Co-cultivos
Se evaluaron los 105 co-cultivos posibles entre los 15 microorganismos seleccionados en una
escala de 15 mL. Los co-cultivos seleccionados, fueron evaluados en una escala de 100mL. Los
detalles de cada uno de estos procesos se describen a continuación:
Medios de cultivo: Se emplearon los medios LB (composición por litro: NaCl 10 g, extracto de
levadura 5 g y triptona 10.0 g), LB con sales (composición por litro: NaCl 20.8 g, KCl 0.56 g,
MgCl2 4.00 g, MgSO4∙7H2O 4.80 g, Tris 0.36 g, sal marina 1.5 g, extracto de levadura 5 g y
triptona 10.0 g) y LB con glucosa (composición por litro: extracto de levadura 5g, NaCl 10g,
triptona 10g, glucosa 20g).
Inóculos: Cada uno de los microorganismos fue inoculado en 10mL del medio de cultivo
apropiado para su crecimiento en tubos falcon de 50mL hasta alcanzar un DO600nm entre 0.6 a
0.8.
Co-cultivos en 15mL: Para el establecimiento de los co-cultivos se tomaban 150µL del inóculo
preparado previamente de cada uno de los microorganismos. Los microorganismos se
colocaban simultáneamente en 15mL del medio de cultivo apropiado (Figura 2-1) en tubos
falcon de 50mL De cada co-cultivo se realizaron 3 réplicas. Monocultivos de cada una de las
bacterias fueron realizados por triplicado en las mismas condiciones. Estos cultivos fueron
incubados por 14 días, a 130 rpm y temperatura ambiente.
Co-cultivos en 100mL: Para el establecimiento de estos co-cultivos a mayor escala se tomaba
1mL del inóculo preparado previamente de cada uno de los microorganismos. Los
microorganismos se colocaban simultáneamente sobre 100mL del medio de cultivo apropiado
usando erlenmeyers de 500mL. De cada co-cultivo se realizaron 3 réplicas. Monocultivos de
cada una de las bacterias fueron realizados por triplicado en las mismas condiciones. Estos
cultivos fueron incubados por 14 días, a 130 rpm y temperatura ambiente.
Capítulo 1 43
Co-cultivos en 100mL modificados: Los co-cultivos entre las bacterias Brevibacillus sp. PNM-
157 y Dietzia sp. RKHC-59b; y entre Brevibacillus sp. PNM-157 y Streptomyces sp. IBUN-5.1. se
realizaron en diferentes condiciones que se resumen en la Tabla 2-1 y Tabla 2-2. Cada uno de
estos cultivos se realizó en 100mL de medio LB contenido en erlenmeyers de 500mL. De cada
co-cultivo se realizaron 3 réplicas. Monocultivos de cada una de las bacterias fueron realizados
por triplicado en las mismas condiciones. Estos cultivos fueron incubados por 14 días, a 130
rpm y temperatura ambiente.
Tabla 2-1: Condiciones de fermentación en 100mL de los distintos experimentos realizados para el co-cultivo entre Brevibacillus sp. PNM-157 y Dietzia sp. RKHC-59b.
Experimento Inóculo
Brevibacillus sp. PNM-157 (µL)
Inóculo Dietzia sp. RKHC-59b
(µL)
Tiempo de inoculación
1.1 1000 1000 Simultáneo
1.2 1000 1000 PNM-157 adicionada 72h
después de RKHC-59b
1.3 1000 1000 PNM-157 adicionada 120h
después de RKHC-59b 1.4 500 1000 Simultáneo 1.5 250 1000 Simultáneo
Tabla 2-2: Condiciones de fermentación en 100mL de los distintos experimentos realizados para el co-cultivo entre Brevibacillus sp. PNM-157 y Streptomyces sp. IBUN-5.1.
Experimento
Inóculo Brevibacillus sp. PNM-157
(µL)
Inóculo Streptomyces IBUN-5.1 (µL)
Tiempo de inoculación
2.1 1000 1000 Simultáneo
2.2 1000 1000 IBUN-5.1 adicionado 72h
después de PNM-157 2.3 1000 500 Simultáneo
2.2.4 Extracción
Finalizado el tiempo de fermentación, los cultivos fueron centrifugados por 15 min a 5000 rpm
y el sobrenadante fue separado de la biomasa. El sobrenadante fue filtrado por un filtro de
0.22µm. El sobrenadante fue extraído con acetato de etilo. La fase orgánica fue lavada con agua
y secada sobre sulfato de sodio anhidro. Posteriormente, el extracto en acetato de etilo fue
filtrado y secado a presión reducida.
44 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
2.2.5 Ensayos de actividad biológica
Actividad inhibitoria del Quorum Sensing: Se utilizó la cepa Chromobacterium violaceum
ATCC31532 como biosensor. En esta cepa la producción del pigmento morado violaceína está
controlado por un sistema de quorum sensing (QS), así la presencia de un compuesto inhibidor
del QS evitará la producción del pigmento violeta. Para el bioensayo se preparaba un inóculo
de esta bacteria en medio LB líquido que era crecido y ajustado a una DO600nm de 0.5. Este
inóculo era mezclado con el medio LB agar, para ser servido en cajas de Petri de 9cm. Por otro
lado, 300 μg de extracto orgánico fueron cargados en discos de papel de 5mm, usando
soluciones de los extractos en metanol. Estos discos de papel eran secados y colocados sobre
la superficie del agar previamente servido. Como controles negativo y positivo, se utilizaron
300 μL de MeOH y 200 μg de 4-hidroxibenzaldehído por disco. Las cajas fueron incubadas
durante 24 horas a 30° C. La actividad inhibitoria del QS se identificaba por la falta de
producción de violaceína alrededor de los discos, pero que mantenían células viables. Toda
esta metodología fue adaptada por Naranjo26.
Actividad antibacteriana contra Burkholderia glumae ATCC 33617 y Burkholderia
gladioli: Las bacterias fitopatógenas B. glumae y B. gladioli fueron crecidas en medio KB
líquido. Utilizando este inóculo, cajas de Petri con KB agar eran sembradas masivamente. Para
valorar la actividad bactericida de los extractos orgánicos, se emplearon discos de papel de
5mm de diámetro que fueron cargados con 300 μg de extracto orgánico. Como controles
negativo y positivo, se utilizaron 300 μL de MeOH y 200 μg de gentamicina por disco. En todos
los casos el solvente se dejaba evaporar, y luego los discos se colocaban sobre la superficie del
agar. Las cajas se incubaron durante 24 horas a 37° C. La actividad antibacteriana se
identificaba por la inhibición de crecimiento de la bacteria alrededor de los discos.
2.2.6 Perfilado metabólico
Los espectros de RMN 1H y COSY para los extractos orgánicos fueron obtenidos en un Bruker
Avance 400, empleando como solventes CDCl3 y metanol-d4. Se usó la señal residual del
solvente como referencia, tomando para el cloroformo (δH 7.26ppm) y para el metanol (δH
3.31ppm).
Para los análisis de los extractos orgánicos por cromatografía líquida se empleó un equipo
UHPLC Thermo Dionex Ultimate 3000 (Germering, Alemania) con detector DAD (empleado en
Capítulo 1 45
un rango de 200 a 600nm) y acoplado a un detector LT-ELSD Sedex 85. Los extractos disueltos
en metanol, para tener una concentración final de 2 mg/mL, se filtraron empleando filtros de
0.22 µm, y se inyectaron en el cromatógrafo (20 μL). Se empleó una columna Kinetex 2.6µm C8
(100x4.6mm). Los solventes empleados en la elución fueron: agua (A) y acetonitrilo (B). El
programa de análisis para todos los extractos fue el siguiente: un gradiente que inició con 10%
de la fase B, y se incrementó de forma linear hasta 100% en 23 minutos, manteniendo esta
proporción por 2 minutos más. El flujo se fijó a 0.5 mL/min.
Las diferencias en la producción metabólica de los co-cultivos, respecto a los monocultivos y
blancos de medio, se determinaron por comparación de los cromatogramas de UHPLC-DAD-
ELSD y de los espectros de RMN 1H.
2.3 Resultados y discusión
En el Grupo de Investigación “Estudio y Aprovechamiento de Productos Naturales Marinos y
Frutas de Colombia” se ha trabajado en química de productos naturales obtenidos a partir de
microorganismos, particularmente aislados de ambientes marinos desde el año 2008. Varios
trabajos han permitido la obtención de más de 200 bacterias y hongos que conforman el
cepario del grupo de investigación.27,28
Por otro lado, y cómo se discutió en el Capítulo 1, uno de los mayores retos en el
establecimiento de co-cultivos es la selección de la pareja de microorganismos. En la
bibliografía especializada no se suele describir de manera explícita el criterio de selección
empleado. Una revisión de 100 artículos permitió establecer los criterios más empleados como
se describió en el Capítulo 1.
A partir de esta información, se establecieron 4 criterios de selección de microrganismos para
esta tesis: (1) Conocimiento previo de la producción metabólica y/o actividad biológica del
aislamiento; (2) Bacterias con ácido micólico en su pared celular como es el caso de los géneros
Gordonia sp., Rhodococcus sp. y Dietzia sp.; (3) Bacterias pertenecientes al género
Streptomyces; y (4) Microorganismos aislados de la misma muestra (criterio ecológico).
Empleando estos 4 criterios se seleccionaron 14 bacterias (13 derivadas de ambientes marinos
y una aislada de suelos) y un hongo (recuperado de ambientes marinos) de las más de 200
cepas disponibles. La lista de los aislamientos seleccionados, la fuente de la cual fueron
recuperados y la razón de su elección se resumen en la Tabla 2-3.
46 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
Tabla 2-3: Microorganismos seleccionados para el establecimiento de co-cultivos binarios.
Aislamiento Identificación taxonómica
del aislamientoa
(% de similaridad) Origen
Criterio de inclusiónb
1 2 3 4 PNM-9 Streptomyces pratensis (100%) Alga Dictyota sp.
PNM-25 Gordonia bronchialis (98.41%) Esponja Xestospongia sp. PNM-115 Paenibacillus elgii (99.73%) Sedimento
PNM-123 Paenibacillus ehimensis
(99.71%) Alga Codium sp.
PNM-157 Brevibacillus brevis (99%) Coral Erythropodium sp.
PNM-161a Streptomyces
griseochromogenes (99.86%) Alga Bryopsis sp.
PNM-210 Paenibacillus elgii (99.9%) Coral Eunicea fusca PNM-216 No identificada Alga Dictyota sp.
RKHC-9 Bacillus cereus (100%) Coral Antillogorgia
elisabethae
RKHC-26 Rhodococcus baikonurensis
(100%) Coral Antillogorgia
elisabethae
RKHC-28 Jeotgalicoccus halophilus
(99.9%) Coral Antillogorgia
elisabethae
RKHC-59b Dietzia schimae (100%) Coral Antillogorgia
elisabethae
RKHC-62b Oceanobacillus profundus
(99.9%) Coral Antillogorgia
elisabethae
IBUN-5.1. Streptomyces sioyaensis
(98.9%) Muestra de suelo del Sur
de Tolima
PNM-67 Purpureocillium lilacinum
(99%) Esponja Niphates digitalis
aMediante secuenciación del gen 16S rARN para las bacterias, y del gen ITSs para los hongos en trabajos previos del grupo de investigación bLos criterios para su inclusión fueron: (1) estudios previos del grupo de investigación en cuanto a producción metabólica y/o actividad biológica, (2) bacteria con ácido micólico en su pared celular, (3) bacteria perteneciente al género Streptomyces y (4) microorganismos que fueron aislados de la misma muestra.
De 13 de las 15 bacterias seleccionadas se tenía algún tipo de conocimiento previo de la
producción metabólica y/o actividad biológica que se muestra en la Tabla 2-4 donde se
describen los antecedentes y la bibliografía correspondiente.
Tabla 2-4: Información previa de la producción metabólica y/o actividad de los aislamientos seleccionados.
Aislamiento Conocimiento químico previo Actividad biológica previa Referencia
Streptomyces sp. PNM-9
2-metil-N-(2'-feniletil)-butanamida
3-metil-N-(2'-feniletil)-butanamida
Ambos compuestos son activos contra Burkholderia glumae
Betancur29
Gordonia sp. PNM-25
- Actividad antibacteriana contra Burkholderia
gladioli Betancur29,
Paenibacillus sp. PNM-115
Péptido análogo de las polipeptinas
Péptido con actividad inhibitoria del QS Naranjo26
Paenibacillus sp. PNM-123
- Actividad inhibitoria del QS Naranjo26
Brevibacillus sp. PNM-157
Péptido lineal de 9 residuos
Actividad citotóxica, antibacteriana contra Burkholderia glumae, gladioli y plantarii y, antifúngica contra Fusarium oxysporum y
Colletotrichum gloesporioides
Reina30
Streptomyces sp. PNM-161a
ciclo-[L-Phe-L-Pro-L-Leu-L-Pro] ciclo-[L-Phe-L-Pro-L-Ile-L-Pro]
5 dicetopiperacinas
El péptido ciclo-[L-Phe-L-Pro-L-Leu-L-Pro] y la dicetopiperacina ciclo-[L-Pro-L-Leu]
presentan actividad antibacteriana contra B. glumae
y B. gladioli
Betancur29
Paenibacillus sp. PNM-210
- Actividad antifúngica contra Colletotrichum
gloesporioides y Fusarium oxysporum Cárdenas31
No identificada PNM-216
29 compuestos volátiles Los volátiles 5-metil-2-hexanona, cumeno, p-
cimeno y 2-nonanona presentan actividad inhibitoria del QS
Naranjo26
Bacillus sp. RKHC-9
Péptido (Hyp-Phe-βAmp-Leu) 4-(R)-hidroxisatabacina
Dicetopiperacina Phe-Leu Éster metílico del ácido p-
hidroxibenzóico
Ésteres metílico y propílico del ácido p-hidroxibenzóico tienen actividad
antibacteriana contra Staphylococcus aureus ATCC 33591 y contra Saccharomyces
cerevisiae
Pinzón32,33
48 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
Aislamiento Conocimiento químico previo Actividad biológica previa Referencia Éster propílico del ácido p-
hidroxibenzóico Éster isopropílico del ácido p-
hidroxibenzóico Rhodococcus sp. RKHC-26
No estudiada No estudiada -
Jeotgalicoccus sp. RKHC-28
4-(metiltio)fenol p-hidroxibenzaldehído
3-indolaldehído (1H-indol-3-il)oxoacetamida
2-metilpropanoamida.
Todos los compuestos presentan actividad inhibitoria del QS
Martínez34
Dietzia sp. RKHC-59b
No estudiada No estudiada -
Oceanobacillus sp.RKHC-62b
Tirosol Acetato de tirosol
Ambos compuestos presentan actividad inhibitoria del QS
Layton35
Streptomyces sp. IBUN-5.1.
- Actividad antifúngica contra Colletotrichum gloesporioides
Mosquera36
Purpureocillium sp. PNM-67
Lilacinina A Lilacinina B Lilacinina C Lilacinina D
Las lilacininas A y C presentan actividad antibacteriana contra Burkholderia gladioli.
Romero37
Con los 15 microorganismos seleccionados, se establecieron todos los 105 co-cultivos binarios
posibles. Estos 105 co-cultivos se realizaron en una escala de 15mL. Como medios de cultivo
se emplearon LB, LB suplementado con sales (para los co-cultivos que involucraban a
Jeotgalicoccus sp. RKHC-28 y Oceanobacillus sp. RKHC-62b) y LB suplementado con glucosa
(para los co-cultivos que involucraban a Purpureocillium sp. PNM-67), en la figura 2-1 se dan
los detalles. Inicialmente se seleccionó el medio de cultivo LB para realizar los co-cultivos; sin
embargo, para tres aislamientos (RKHC-28, RKHC-62b y PNM-67) fue necesario suplementar
el medio con sales o glucosa para asegurar su crecimiento adecuado.
Finalizado el proceso de fermentación, los cultivos fueron centrifugados y los sobrenadantes
fueron extraídos con acetato de etilo. Este solvente se seleccionó porque los compuestos
extraídos en él son de polaridad media, que es lo deseable según la regla de Lipinski38; y porque
extrae pocos de los componentes del medio de cultivo que son de alta polaridad. De otro lado
la mayoría de estudios químicos de las bacterias aquí estudiadas han mostrado que el extracto
en este solvente contiene los metabolitos de interés26,27.
Todos los extractos orgánicos fueron analizados por UHPLC-DAD-ELSD y comparados con los
perfiles cromatográficos de los extractos de los monocultivos de cada cepa y con el medio de
cultivo usado como blanco. Se identificaron 5 parejas que mostraban picos en los extractos
orgánicos del co-cultivos, que no estaban en los monocultivos respectivos. Estos co-cultivos
son: Brevibacillus sp. PNM-157 y Paenibacillus sp. PNM-210; Brevibacillus sp. PNM-157 y PNM-
216; Brevibacillus sp. PNM-157 y Dietzia sp. RKHC-59b; Brevibacillus sp. PNM-157 y
Streptomyces sp. IBUN-5.1; y Bacillus sp. RKHC-9 y Jeotgalicoccus sp. RKHC-28. En la Figura
2-1 se resumen los resultados de las parejas evaluadas en escala de 15mL y aquellas que
mostraron cambios en UHPLC-DAD-ELSD.
Figura 2-1: Co-cultivos en 15mL. Medio de cultivo empleado: (■ ) LB, (■ ) LB suplementado con sales, (■ ) LB suplementado con glucosa. () Co-cultivos promisorios por el cambio en su producción metabólica.
Como se puede observar 4 de las 5 parejas consisten en los co-cultivos entre la bacteria
Brevibacillus sp. PNM-157 con las bacterias Paenibacillus sp. PNM-210, PNM-216 (No
identificada), Dietzia sp. RKHC-59b y Streptomyces sp. IBUN-5.1. Al comparar los perfiles para
estos 4 co-cultivos se observa que dos de ellos (con las bacterias Dietzia sp. RKHC-59b e IBUN-
5.1) son muy similares e indican que los cambios en la producción metabólica fueron
probablemente en los compuestos producidos por PNM-157. Es importante tener en cuenta
que al estar la bacteria PNM-157 en 4 de estos co-cultivos, los cambios en la producción
metabólica podrían derivar en compuestos de naturaleza similar.
Con el fin de obtener una mayor cantidad de extracto orgánico, los 5 co-cultivos promisorios
se cultivaron en una escala de 100mL. Estos cultivos se realizaron con la misma agitación,
temperatura y tiempo de fermentación que los realizados en 15mL. El análisis cromatográfico
mostró que los perfiles de los extractos de los cultivos de 100mL eran significativamente
distintos a los encontrados para los cultivos de 15mL. Así mismo, tras realizar la comparación
de los perfiles de HPLC y los espectros de RMN 1H en ninguno de los 5 casos se encontraron
picos o señales inducidas por el co-cultivo. Es más, los perfiles, espectros y los resultados de
actividad biológica (Tabla 2-5) mostraron que tanto la producción metabólica como la
actividad biológica del co-cultivo en 100mL era muy similar a uno solo de los aislamientos que
hacían parte de la interacción. Esta información sumada a los resultados del repique en medio
sólido de cada uno de los co-cultivos en diferentes días del tiempo de fermentación, permiten
sugerir que en ninguno de los 5 casos los dos microorganismos sobrevivieron. Es decir, las
condiciones de fermentación manejadas no garantizaron la coexistencia de ambos
microorganismos. Es importante notar que los ensayos previos en 15 mL mostraban cambios
en el perfil metabólico, que sugieren que las dos cepas coexistieron al menos parte del tiempo
de fermentación.
52 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
Tabla 2-5: Resultados de los 5 co-cultivos promisorios evaluados en escala de 100mL. En negrita las parejas seleccionadas para nuevos ensayos.
Co-cultivo Aislamiento
sobreviviente
Actividad biológica del extracto del co-cultivo
Aislamiento Aislamiento Chromobacterium
violaceum B.
glumae B.
gladioli Brevibacillus sp. PNM-157
Paenibacillus sp. PNM-210
Brevibacillus sp. PNM-157
- (Bactericida) + -
Brevibacillus sp. PNM-157
PNM-216 PNM-216 - (Bactericida) + -
Brevibacillus sp. PNM-157
Dietzia sp. RKHC-59b
Brevibacillus sp. PNM-157
- (Bactericida) + -
Brevibacillus sp. PNM-157
Streptomyces sp. IBUN-5.1
Streptomyces sp. IBUN-5.1
- (Bactericida) + -
Bacillus sp. RKHC-9
Jeotgalicoccus sp. RKHC-28
Jeotgalicoccus sp. RKHC-28
- - -
Se seleccionaron para evaluar distintas condiciones de fermentación con el fin de garantizar la
coexistencia de los dos microorganismos que hacían parte de la interacción los co-cultivos
entre: Brevibacillus sp. PNM-157 y Dietzia sp. RKHC-59b; y Brevibacillus sp. PNM-157 y
Streptomyces IBUN-5.1. Estos dos co-cultivos eran interesantes pues en cada uno se
encontraba la bacteria Brevibacillus sp. PNM-157, pero mientras que, al final del tiempo de
fermentación de un co-cultivo sobrevivía, en el otro no.
En cada uno de los co-cultivos se cambiaron dos parámetros: tamaño del inóculo de la cepa
sobreviviente en los ensayos anteriores, disminuyendo su cantidad de células; y afectando el
tiempo de inoculación, dándole tiempo de ventaja de crecimiento a la cepa que no sobrevivía
en los ensayos anteriores.
Para el co-cultivo entre Brevibacillus sp. PNM-157 y Dietzia sp. RKHC-59b se cambió el tamaño
del inóculo en los experimentos 1.4 y 1.5 y se cambió el tiempo de fermentación en los
experimentos 1.2 y 1.3. Para el co-cultivo entre Brevibacillus sp. PNM-157 y IBUN-5.1. se
cambió el tamaño del inóculo en el experimento 2.3, y se cambió el tiempo de fermentación en
el experimento 2.2. Los detalles experimentales se encuentran en la sección de Materiales y
Métodos apartado 2.1.3. Los resultados de estos experimentos se resumen en la Tabla 2-6 y
Tabla 2-7.
Capítulo 1 53
Tabla 2-6: Resultados de los distintos experimentos realizados para el co-cultivo entre Brevibacillus sp. PNM-157 y Dietzia sp. RKHC-59b.
Experimento Aislamiento
sobreviviente
Actividad biológica Chromobacterium
violaceum Burkholderia
glumae Burkholderia
gladioli
1.1 Brevibacillus sp.
PNM-157 - (Bactericida) + -
1.2 Brevibacillus sp.
PNM-157 - (Bactericida) + -
1.3 Brevibacillus sp.
PNM-157 - (Bactericida) + -
1.4 Brevibacillus sp.
PNM-157 - (Bactericida) + -
1.5 Brevibacillus sp.
PNM-157 - (Bactericida) + -
Tabla 2-7: Resultados de los distintos experimentos realizados para el co-cultivo entre Brevibacillus sp. PNM-157 y Streptomyces sp. IBUN-5.1.
Experimento Aislamiento
sobreviviente
Actividad biológica Chromobacterium
violaceum Burkholderia
glumae Burkholderia
gladioli
2.1 Streptomyces sp.
IBUN-5.1 - (Bactericida) + -
2.2 Streptomyces sp.
IBUN-5.1 - (Bactericida) + -
2.3 Streptomyces sp.
IBUN-5.1 - (Bactericida) + -
A pesar de los cambios en las condiciones de fermentación, en ninguno de los dos co-cultivos
se pudo garantizar la coexistencia de los microorganismos que hacían parte de la interacción.
Adicionalmente, los cromatogramas obtenidos por UHPLC-DAD-ELSD son iguales a los
obtenidos para los monocultivos de la cepa sobreviviente (Streptomyces sp. IBUN-5.1 y
Brevibacillus sp.PNM-157), indicando que el co-cultivo no llevó a la inducción de compuestos
que es el objetivo de esta tesis. Por esta razón no se continuaron los estudios en medio líquido,
y se pasó a una estrategia de cultivo en medio sólido (Capítulo 3). En cualquier caso, el co-
cultivo en medio líquido podría ser efectivo en otras condiciones experimentales, pero el
establecimiento de las mismas se sale del alcance de la presente tesis.
54 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
2.4 Conclusiones
A partir del estudio de más de 100 artículos de la literatura se identificaron los siguientes
criterios para el establecimiento de co-cultivos binarios: (1) conocimiento o estudio previo de
los aislamientos, (2) bacteria con ácido micólico en su pared celular, (3) criterio ecológico y
(4) bacterias pertenecientes al género Streptomyces sp. Usando estos criterios se seleccionaron
15 microorganismos a partir de un cepario de más de 200 microorganismos.
Se establecieron los 105 co-cultivos binarios posibles en medio líquido (15mL), sus extractos
orgánicos se evaluaron empleando UHPLC-DAD-ELSD, y se identificaron 5 parejas promisorias
por mostrar la inducción de picos en el co-cultivo que no estaban presentes en los
monocultivos correspondientes. Estas parejas fueron cultivadas en una escala de 100mL y sus
extractos orgánicos fueron analizados por UHPLC-DAD-ELSD y RMN 1H. El comportamiento de
los co-cultivos seleccionados a una escala de 100mL varió respecto a los co-cultivos realizados
en 15mL, evidenciándose en todos los casos, que las condiciones de fermentación no
garantizaban la coexistencia de los dos microorganismos que hacían parte de la interacción.
Teniendo en cuenta estos resultados, se hace necesario establecer condiciones de
fermentación distintas que garanticen la supervivencia de ambos microorganismos.
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Capítulo 1 55
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3. Capítulo 3: Screening de co-cultivos binarios a partir de microorganismos de origen marino en medio sólido
Resumen
Los microorganismos han sido fuente importante de compuestos en las últimas décadas; no
obstante, la frecuencia de aislamiento de nuevos compuestos ha disminuido significativamente
en los últimos años. Estudios del genoma de microorganismos han evidenciado que ellos
tienen la capacidad de producir más compuestos de los que son en realidad aislados. Lo
anterior se debe a que ciertos genes no son expresados en condiciones estándares de
laboratorio, y por ello se han desarrollado varios métodos para activar estos genes, siendo uno
de ellos el co-cultivo de microorganismos.
A partir de 15 microorganismos (14 bacterias y 1 hongo) del cepario del grupo de investigación
“Estudio y Aprovechamiento de Productos Naturales Marinos y Frutas de Colombia” se
realizaron 151 co-cultivos binarios en medio sólido empleando dos metodologías diferentes:
ensayos a distancia y ensayos por contacto, el primero permitió evaluar las interacciones
debidas a compuestos difusibles, mientras el segundo permitió evaluar las interacciones por
contacto célula-célula. Los cultivos se realizaron en medio sólido empleando 4 medios de
cultivo (LB, PDA, ISP2, ISP3).
Se evaluaron los cambios fenotípicos -inhibición de crecimiento, pigmentación, esporulación,
morfología macroscópica- inducidos por el co-cultivo por comparación visual con los
monocultivos correspondientes. Los cultivos fueron liofilizados y extraídos con acetato de etilo
para obtener extractos orgánicos que fueron analizados empleando HPLC-DAD. A partir de
estos resultados, se seleccionaron las interacciones promisorias (aquellas con picos
cromatográficos claramente diferenciables respecto a los monocultivos), las cuales fueron
analizadas empleando experimentos RMN 1H y COSY. El uso de esta técnica permitió distinguir
60 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
las señales presentes únicamente en los co-cultivos, así como correlacionarlas empleando
espectros bidimensionales. La producción metabólica de los ensayos a distancia se evaluó en
3 zonas: dos correspondientes a los inóculos de los microorganismos, y una tercera zona
correspondiente a la interacción. Esta estrategia permitió observar los gradientes de difusión
y sugerir el productor del compuesto inducido.
A partir de estos resultados se seleccionaron 7 parejas para la evaluación de su producción
metabólica: Streptomyces sp. PNM-161a y Rhodococcus sp. RKHC-26 (contacto, LB),
Purpureocillium sp. PNM-67 y Paenibacillus sp. PNM-123 (distancia, PDA), Purpureocillium sp.
PNM-67 y Rhodococcus sp. RKHC-26 (contacto, PDA), Purpureocillium sp. PNM-67 y
Streptomyces sp. IBUN-5.1 (distancia, ISP3), Purpureocillium sp. PNM-67 y Paenibacillus sp.
PNM-115 (distancia, ISP3), Purpureocillium sp. PNM-67 y Paenibacillus sp. PNM-123
(distancia, ISP3) y, Purpureocillium sp. PNM-67 y Paenibacillus sp. PNM-210 (distancia, ISP3).
3.1 Introducción
A través de los años, los metabolitos secundarios aislados de microorganismos han
desempeñado un rol importante en el tratamiento de enfermedades humanas, y han
revolucionado la industria farmacéutica. No obstante, es cada vez más común el aislamiento
redundante de compuestos de origen microbiano.1
En investigaciones recientes sobre el genoma de los microorganismos se ha podido demostrar
que existen rutas biosintéticas silenciadas y crípticas, que no se expresan en condiciones
estándares de crecimiento en laboratorio. Para promover la activación de estas rutas, se han
desarrollado diferentes métodos, entre ellos se tiene el co-cultivo de microorganismos.2
Este método tiene en cuenta que los microorganismos normalmente crecen en ambientes
complejos, de tal manera, interacciones inter- o intraespecies son prevalentes en la naturaleza
por lo que el crecimiento de una bacteria en presencia de otras, puede alterar o estimular el
metabolismo secundario de la misma.3 De hecho, algunos estudios han demostrado que
cuando los microorganismos interactúan con otros, producen metabolitos especializados que
pueden tener efectos positivos (p.ej. comunicación con otros microorganismos en una relación
simbiótica) o negativos (p. ej. antibióticos) sobre los demás.4,5 Ambos escenarios son
Capítulo 3 61
igualmente interesantes en el descubrimiento de compuestos novedosos y en la comprensión
del rol de los metabolitos especializados en la naturaleza.
El co-cultivo de microorganismos consiste en el cultivo de dos o más microorganismos en un
mismo ambiente confinado.6 Uno de los primeros ejemplos exitosos del uso del co-cultivo fue
reportado por Cueto y colaboradores en el 2001.7 En este trabajo se evaluó la producción
metabólica del co-cultivo del hongo Pestalotia sp. con la bacteria Thalassospira sp.; estos
estudios condujeron al aislamiento y elucidación estructural de la pestalona, una benzofenona
que presentaba una importante actividad antibacterial, y cuya producción era únicamente
asociada al co-cultivo7. Actualmente los trabajos se han extendido a interacciones bacteria-
bacteria8, hongo-hongo9 y bacteria-hongo10. Como resultados del co-cultivo se han reportado
tanto rendimientos incrementados de metabolitos previamente descritos como la producción
de análogos de metabolitos conocidos y la inducción de metabolitos bioactivos nuevos.11
Uno de los desafíos del uso de este método es la selección de los microorganismos para el
establecimiento de los co-cultivos. Los dos criterios más ampliamente reportados en la
literatura son: (1) el uso de bacterias que contienen ácido micólico en su pared celular12, y (2)
el establecimiento de interacciones ya observadas en la naturaleza (criterio ecológico)13. Otros
criterios incluyen: el conocimiento previo de los microorganismos involucrados14, el
enfrentamiento con patógenos15; el enfrentamiento entre bacterias del género Streptomyces16;
y el enfrentamiento entre bacterias del género Streptomyces con bacterias pertenecientes al
phylum Proteobacteria17. Otros desafíos en el establecimiento de co-cultivos incluyen la
selección de factores como el medio de cultivo, el grado de contacto entre los microorganismos,
la densidad poblacional y el tiempo de fermentación.18
El grado de contacto entre los microorganismos que hacen parte del co-cultivo es relevante
pues los efectos pueden ser el resultado de dos tipos de interacción: interacción debida a
compuestos difusibles (relacionada con provisión de nutrientes o con la producción de un
antibiótico o molécula de señalización) e interacción debida a contacto célula-célula.3
Teniendo en cuenta esto, en los co-cultivos, los microorganismos pueden estar perfectamente
mezclados o parcialmente separados, lo cual se logra mediante el uso de barreras físicas, como
membranas semipermeables, geles y dispositivos microfluídicos.19,20
62 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
En cuanto al medio de cultivo, se pueden emplear medios sólidos o líquidos. La selección del
medio de cultivo debe tener en cuenta a los dos microorganismos involucrados.18
El medio sólido ha sido empleado en estudios de co-cultivos pues a diferencia del medio líquido
permite visualizar con facilidad la morfología y patrones de interacción entre los
microorganismos, permitiendo observar cambios en los fenotipos que pueden incluir defectos
en el desarrollo, inhibición del crecimiento, lisis, motilidad, producción de pigmentos, entre
otros21. Así mismo, facilita la ubicación espacial de los metabolitos (particularmente en la zona
de confrontación)22, lo que puede permitir la identificación del organismo responsable de la
producción de los compuestos inducidos por la interacción.
Aunque el co-cultivo es una estrategia prometedora que ha generado resultados positivos,
éstos han sido generalmente consecuencia de la serendipia.23 Por este motivo, esta estrategia
sigue presentado desventajas como la falta de reproducibilidad y predictibilidad. Para
solucionar estos inconvenientes, ésta estrategia todavía tiene el desafío de desarrollar
protocolos estandarizados; así como de establecer metodologías que permitan evaluar una
gran cantidad de interacciones simultáneamente.23 Esto podría derivar en criterios más
específicos de selección de microorganismos, o en la caracterización de factores promotores
producidos por las cepas estimuladoras que guíen el desarrollo de condiciones efectivas de co-
cultivo.
En este capítulo se buscó por medio de un screening de interacciones binarias en medio sólido,
identificar los co-cultivos que mostraban cambios en la producción metabólica juzgados a
partir de HPLC-DAD y RMN.
3.2 Materiales y métodos
3.2.1 General
Para los medios de cultivo se empleó agar bacteriológico (Scharlau), triptosa (Scharlau),
cloruro de sodio R.A. (Merck), extracto de levadura (Oxoid), extracto de malta (Scharlau),
glucosa R.A. (Merck), agar papa dextrosa (Scharlau), sulfato de hierro heptahidratado (Loba
Chemie), cloruro de manganeso tetrahidratado (Loba Chemie), sulfato de zinc heptahidratado
(Loba Chemie) y avena comercial (Don Pancho).
Capítulo 3 63
Para las extracciones se empleó acetato de etilo grado analítico (PanReac AppliChem). Para los
análisis cromatográficos se empleó acetonitrilo grado HPLC (Honeywell), y agua desionizada
previamente y filtrada en un equipo de filtración Millipore Simplicity y luego filtrada
nuevamente a través de una membrana de nylon de tamaño de poro de 0.22 μm (CNW
Technologies). Para los análisis por resonancia magnética nuclear se emplearon como
solventes CDCl3 con grado de deuteración 99.8 % (Merck) y metanol-d4 con grado de
deuteración 99.8% (Merck, Alemania).
3.2.2 Selección de microorganismos
A partir de criterios reportados en la literatura, se seleccionaron 15 microorganismos (14
bacterias y 1 hongo) a partir del cepario del grupo de investigación “Estudio y
Aprovechamiento de Productos Naturales Marinos y Frutas de Colombia”. Los detalles de esta
selección se discuten a mayor profundidad en el Capítulo 2.
3.2.3 Selección primaria de parejas a evaluar
Con el fin de reducir el número de parejas a evaluar en las interacciones bacteria-bacteria a
distancia, se realizó un primer ensayo que permitiera priorizar aquellas parejas que
evidenciaran cambios fenotípicos. Se adaptó la metodología desarrollada por Seyedsayamdost
y colaboradores24, cómo se ilustra en la Figura 3-1.
Cada una de las bacterias fue inoculada en 10mL de medio Luria-Bertani estéril (composición
por litro: triptosa 10g, NaCl 10g, extracto de levadura 5g) en tubos falcon de 50mL hasta
alcanzar un DO600nm entre 0.6 a 0.8. De cada uno de estos cultivos se tomaban alícuotas de 1µL
que fueron sembradas en cajas de Petri de 150*15 mm que contenían medio Luria-Bertani
sólido (composición por litro: triptosa 10g, NaCl 10g, extracto de levadura 5g, agar 14g). La
disposición de siembra de las bacterias se muestra en la Figura 3-1. En cada caja se evaluaba
la interacción de 36 parejas dispuestas en 3 columnas separadas por 1cm de distancia. En cada
pareja las bacterias se sembraban a 5mm de distancia. En el extremo izquierdo y derecho de
la caja se sembraba una columna de las bacterias solas como control. Cada una de las 91
parejas (todos los posibles emparejamientos entre las 14 bacterias seleccionadas) se evaluó
por triplicado. Las cajas de Petri se incubaron a 28°C durante 5 días. Finalizado este tiempo, se
evaluaron visualmente los cambios fenotípicos inducidos por el co-cultivo (inhibición de
64 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
crecimiento, pigmentación, esporulación, morfología macroscópica) por comparación visual
con los respectivos controles.
Figura 3-1: Esquema del ensayo de interacción binaria empleado como herramienta de selección primaria de parejas a evaluar en las interacciones bacteria-bacteria a distancia.
3.2.4 Co-cultivos binarios
Se emplearon dos métodos diferentes: el primero consistía en un ensayo a distancia que
permitía evaluar los efectos mediados por compuestos difusibles; y el segundo consistía en un
ensayo con contacto que permitía evaluar los efectos mediados por contacto célula-célula.
La metodología de establecimiento de los co-cultivos se dividió en dos tipos de interacciones:
bacteria-bacteria y bacteria-hongo. Todos los ensayos se realizaron en cajas de Petri de 90
mm*15 mm. En el caso de las bacterias el inóculo era de 105 UFC por caja, y en el caso del hongo
era de 105 conidios por caja.
Interacciones bacteria-bacteria: El medio de cultivo fue Luria-Bertania (composición por
litro: triptosa 10g, NaCl 10g, extracto de levadura 5g, y agar 14g). El volumen de medio por
caja fue de 25mL. En el ensayo a distancia los microorganismos se sembraron a una distancia
de 5mm entre sí (Figura 3-2). Para el ensayo por contacto se mezclaron alícuotas de cada uno
de los microorganismos, y esta mezcla fue inoculada de forma masiva en la superficie del agar
(Figura 3-2). De cada co-cultivo se realizaron 3 réplicas. Monocultivos de cada una de las
Capítulo 3 65
bacterias fueron realizados por triplicado en las mismas condiciones. En ambos casos las cajas
fueron incubadas a 30 ºC por 5 días.
Figura 3-2: Co-cultivos bacteria-bacteria: a) interacción a distancia, b) interacción por contacto.
Interacciones bacteria-hongo: Los cultivos se realizaron en medio sólido empleando 4
medios de cultivo diferente: a) LB suplementado con glucosa (composición por litro: triptosa
10g, NaCl 10g, extracto de levadura 5g, glucosa 20g, y agar 14g), b) PDA (composición por litro:
peptona de papa 4g, glucosa 20g, y agar 15g), c) ISP2 (composición por litro: extracto de malta
10g, extracto de levadura 4g, glucosa 4g, y agar 20g), y d) ISP3 (composición por litro: avena
20g, agar 18g, y solución de trazas 1mL). El volumen de medio por caja fue de 30mL. Para el
ensayo a distancia, la bacteria fue inoculada en el centro de la caja en una franja de 1 cm de
ancho, mientras el hongo fue inoculado en los extremos opuestos de la caja (Figura 3-3). Para
el ensayo por contacto se mezclaron alícuotas de cada uno de los microorganismos, y esta
mezcla fue inoculada de forma masiva (Figura 3-3). De cada co-cultivo se realizaron 3 réplicas.
Monocultivos de cada una de las bacterias y del hongo fueron realizados por triplicado en las
mismas condiciones de los co-cultivos. En ambos casos, las cajas fueron incubadas a 30ºC por
10 días.
66 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
Figura 3-3: Co-cultivos bacteria-hongo: a) interacción a distancia, b) interacción por contacto.
En todos los co-cultivos binarios establecidos, se evaluaron visualmente los cambios
fenotípicos inducidos por el co-cultivo haciendo énfasis en inhibición de crecimiento,
pigmentación, esporulación, y morfología macroscópica. Todo lo anterior por comparación
visual con los monocultivos correspondientes.
3.2.5 Extracción
En los ensayos por contacto el agar fue cortado en pedazos de 1cm*1cm empleando una
cuchilla estéril. En los ensayos a distancia bacteria-bacteria y bacteria-hongo se delimitaron
tres zonas diferentes: una para la zona dónde crece cada microorganismo y la tercera para la
zona de interacción, que se pueden ver en la Figura 3-4, y luego cada zona se cortó en trozos
por aparte. Cada muestra fue liofilizada empleando un liofilizador LABCONCO (FreeZone 4.5).
El material seco fue extraído dos veces con acetato de etilo, en una proporción de 70 mL de
solvente por caja. Las extracciones fueron realizadas empleando un baño de ultrasonido Cole-
Parmer a temperatura ambiente por 20 minutos. Las muestras fueron filtradas y secadas a
presión reducida.
Capítulo 3 67
Figura 3-4: Zonas delimitadas para la obtención de extractos orgánicos en interacciones a distancia entre (1) bacteria-bacteria: (a) Zona de inoculación de la bacteria 1, (b) Zona de inoculación de la bacteria 2 y (c) Zona de interacción; y (2) bacteria-hongo: (a) Zona de inoculación del hongo, (b) Zona de interacción, (c) Zona de inoculación de la bacteria.
3.2.6 Perfilado metabólico
Para los análisis de los extractos orgánicos por cromatografía líquida se empleó un equipo
UHPLC Thermo Dionex Ultimate 3000 (Germering, Alemania) con detector DAD. Los extractos
fueron previamente disueltos en metanol para tener una concentración final de 2 mg/mL, y se
inyectaron 20 μL. Se empleó una columna Kinetex 2.6µm C8 (100x4.6mm). Los solventes
empleados en la elución fueron: agua (A) y acetonitrilo (B). El programa de análisis para todos
los extractos fue el siguiente: un gradiente que inició con 10% de la fase B, y se incrementó de
forma linear hasta 100% en 23 minutos, manteniendo esta proporción por 2 minutos más. El
flujo se fijó a 0.5 mL/min.
Las diferencias en la producción metabólica de los co-cultivos, respecto a los monocultivos y
el medio de cultivo, se determinaron por comparación de los cromatogramas de HPLC-DAD,
aquellos que mostraban diferencias fueron analizados por RMN como sigue.
Los espectros de RMN 1H y COSY para los extractos orgánicos fueron obtenidos en un Bruker
Avance 400, empleando como solventes CDCl3 y metanol-d4. Se usó la señal residual del
solvente como referencia, tomando para el cloroformo (δH 7.27ppm) y para el metanol (δH
3.31ppm).
68 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
3.3 Resultados y discusión
El primer paso para el establecimiento de un co-cultivo binario consiste en la selección de las
cepas. En la literatura se han descrito algunos criterios para hacerlo, lo que es particularmente
cierto para las interacciones bacteria-bacteria, mientras que para las interacciones bacteria-
hongo no son tan claros los criterios a emplear (Capítulo 1). Inicialmente se seleccionaron 14
bacterias y 1 hongo del cepario del grupo de investigación “Estudio y Aprovechamiento de
Productos Naturales Marinos y Frutas de Colombia”, las cepas y sus criterios de selección
fueron discutidos en el Capítulo 2.
En el emparejamiento de los microorganismos se deben tener en cuenta aspectos prácticos,
tales como el medio cultivo, en el que los dos organismos deben poder crecer, y la velocidad
de crecimiento en ellos. Estos ensayos se hicieron tanto a distancia como por contacto. En el
segundo caso importará la velocidad de crecimiento de las bacterias, pues al ser la inoculación
simultánea si una bacteria crece muy rápido afectará el desarrollo de la segunda. Este
problema se puede superar en el ensayo a distancia dado que la inoculación se puede hacer en
tiempos diferentes.
3.3.1 Co-cultivos bacteria-bacteria
La primera estrategia empleada fue la realización de los co-cultivos a distancia, teniendo en
cuenta que esto permite superar los problemas de coexistencia que se evidenciaron en el
Capítulo 2 y, que para estudios en medio sólido esta es la metodología más comúnmente
empleada.22,25 Este tipo de ensayos pretendía evaluar efectos mediados por compuestos
difusibles.
El número total de emparejamientos para las 14 bacterias seleccionadas es de 91, por lo que
se decidió realizar un primer ensayo que permitiera priorizar parejas que posteriormente
serían evaluadas en cajas de Petri individuales. Con este propósito, se adaptó la metodología
propuesta por Seyedsayamdost y colaboradores24, que permite evaluar los cambios
fenotípicos asociados a la interacción, teniendo en cuenta que éstos pueden ser indicadores de
cambios en la producción metabólica.
Capítulo 3 69
Se observaron cambios fenotípicos en 27 de las 91 parejas evaluadas, resultados que se
resumen en la Figura 3-5. Se observó inhibición de crecimiento de alguna de las bacterias en
18 casos, cambios en la pigmentación y/o esporulación en 9 casos.
Las 27 interacciones que mostraron cambios fenotípicos fueron cultivadas en cajas de Petri de
9cm por triplicado con el fin de obtener extractos orgánicos que permitiesen evaluar la
producción metabólica de las mismas. El mismo procedimiento se realizó para el blanco del
medio de cultivo y para los monocultivos correspondientes.
Los extractos fueron analizados por HPLC-DAD (en el rango de 200-600nm), tal y como se
suele reportar en la literatura26–28; no obstante, no se observaron cambios evidentes en la
producción metabólica de ninguno de estos 27 co-cultivos en comparación con los
monocultivos correspondientes. Los 18 co-cultivos que evidenciaban efectos inhibitorios de
una bacteria sobre la otra fueron analizados por RMN. Esta técnica tampoco permitió
evidenciar cambios en el co-cultivo respecto a los monocultivos. Así, esta metodología no
permitió seleccionar ningún co-cultivo para evaluar su producción química.
Es importante mencionar que los co-cultivos sí pueden estar produciendo compuestos como
respuesta a la presencia del otro microorganismo, pero las técnicas analíticas empleadas
(HPLC-DAD y RMN) no permiten seguir su producción. El uso de técnicas analíticas más
sensibles que las empleadas en este trabajo, como cromatografía líquida acoplada a
espectrometría de masas (HPLC-MS), puede ser la clave para la detección de cambios en la
producción metabólica de estas interacciones a distancia25,29. Lo anterior dado que esta técnica
es varios órdenes de magnitud más sensible que RMN30. Así, la detección de compuestos por
HPLC-MS no significa que éstos puedan ser aislados, que es el objetivo de este trabajo.
El siguiente paso fue evaluar algunas parejas en ensayos por contacto, la selección de las
parejas se hizo teniendo en cuenta varios factores: primero, se descartaron los
emparejamientos que contenían a las bacterias Gordonia sp. PNM-25 y Dietzia sp. RKHC-59b
pues su velocidad de crecimiento en el medio de cultivo seleccionado era significativamente
más lento que la de los demás aislamientos. Así mismo, se descartaron las parejas que incluían
a los aislamientos Brevibacillus sp. PNM-157, Paenibacillus sp. PNM-210, Paenibacillus sp.
PNM-115 y Paenibacillus sp. PNM-123 pues en estudios previos mostraron tener propiedades
antibióticas potentes.
70 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
Entre los 28 emparejamientos restantes posibles para el ensayo por contacto directo, la
selección se hizo de acuerdo a estos 3 criterios derivados de la literatura: (1) co-cultivos que
involucraran 2 aislamientos del género Streptomyces; (2) co-cultivos que involucraran un
aislamiento del género Streptomyces y bacterias que contienen ácido micólico; y (3) co-cultivos
que involucraran 2 aislamientos obtenidos de la misma muestra (Figura 3-6).
Figura 3-5: Resumen de los cambios fenotípicos observados en las 105 interacciones bacteria-bacteria evaluadas a distancia. (■ ): No hubo interacción visible, (■ ): Inhibición de crecimiento, (■ ): Otros tipos de interacción como cambios en pigmentación, esporulación y morfología macroscópica
Figura 3-6: Criterios de inclusión de bacterias en el ensayo por contacto, (■): Streptomyces sp. vs. Streptomyces sp., (■): Streptomyces sp- vs. bacteria con ácido micólico en su pared celular, (■): Criterio ecológico, cepas recuperadas de la misma muestra.
De esta manera, las 13 parejas seleccionadas fueron cultivadas en cajas de Petri de 9cm por
triplicado. Un ejemplo de este tipo de ensayo se puede observar en la Figura 3-7.
Figura 3-7: Ensayo de interacción por contacto bacteria-bacteria, (a) Monocultivo de Streptomyces sp. PNM-161a, (b) Monocultivo de Streptomyces sp. IBUN-5.1. y (c) Co-cultivo entre Streptomyces sp. PNM-161a y Streptomyces sp. IBUN-5.1.
Los resultados obtenidos para los ensayos con contacto se resumen en la Tabla 3-1. En
términos generales se observa que las dos bacterias sobreviven, salvo en tres co-cultivos, dos
de los cuales involucraron al aislamiento RKHC-9. Los análisis por HPLC de los extractos
orgánicos de los co-cultivos y su comparación con los monocultivos respectivos, no
permitieron evidenciar cambios en la producción metabólica de los co-cultivos. El análisis
también se llevó a cabo por RMN 1H, donde se pudo evidenciar que en un co-cultivo hubo
cambios.
El co-cultivo que generó un extracto más diferente al medio y los monocultivos respectivos fue
el hecho entre los aislamientos Streptomyces sp. PNM-161a y Rhodococcus sp. RKHC-26 por lo
que fue seleccionado para estudios químicos posteriores (Capítulo 4). En la Figura 3-8 se
puede observar la comparación de los espectros de RMN 1H entre el medio sin inocular, los
monocultivos y el co-cultivo. Esta comparación permitió identificar 4 zonas del espectro que
mostraban señales atribuibles a compuestos cuya producción es consecuencia del co-cultivo,
correspondientes a protones alifáticos en δH 1.5-1.7, 2.35-2.50, y 2.95 (bt, J=7.5Hz); además de
señales para protones aromáticos en δH 7.15 (m).
74 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
Tabla 3-1: Resumen de los co-cultivos binarios bacteria-bacteria evaluados mediante la metodología por contacto. Se incluye el criterio de emparejamiento, y el resultado y la presencia de un cambio en el perfil metabólico respecto a los monocultivos correspondientes.
Co-cultivo binario Criterio de
emparejamiento Cambio
fenotípico
Cambio
Aislamiento Aislamiento RMN
1H HPLC-DAD
PNM-9 PNM-161a Bacterias género
Streptomyces — - —
PNM-9 PNM-216 Criterio ecológico — — —
PNM-9 RKHC-26 Bacteria con ácido
micólico — — —
PNM-9 IBUN-5.1 Bacterias género
Streptomyces — — —
PNM-161a RKHC-26 Bacteria con ácido
micólico — + —
PNM-161a IBUN-5.1 Bacterias género
Streptomyces — — —
RKHC-9 RKHC-26 Criterio ecológico No se evidencia el
crecimiento de RKHC-26
— —
RKHC-9 RKHC-28 Criterio ecológico No se evidencia el
crecimiento de RKHC-28
— —
RKHC-9 RKHC-62b Criterio ecológico — — —
RKHC-26 RKHC-28 Criterio ecológico — — —
RKHC-26 RKHC-62b Criterio ecológico — — —
RKHC-26 IBUN-5.1 Bacteria con ácido
micólico
No se evidencia el crecimiento de
IBUN-5.1 — —
RKHC-28 RKHC-62b Criterio ecológico — — —
Para cada co-cultivo, se destaca en negrita aquellos aislamientos que sobrevivieron hasta el final del tiempo de fermentación. (+): Se observó un cambio en comparación a los monocultivos correspondientes, (-): No se observó ningún cambio en comparación a los monocultivos correspondientes.
Figura 3-8: Comparación de espectros RMN 1H para los extractos orgánicos de: (a) medio de cultivo sin inocular LB, (b) monocultivo de Streptomyces sp. PNM-161a, (c) monocultivo de Rhodococcus sp. RKHC-26 y (d) co-cultivo de estos dos aislamientos.
3.3.2 Co-cultivos bacteria-hongo
Teniendo en cuenta que en la literatura la mayoría de reportes exitosos involucran al menos
un hongo en el co-cultivo, se seleccionó al aislamiento Purpureocillium sp. PNM-67 para
establecer co-cultivos binarios entre éste hongo y las bacterias seleccionadas previamente.
El hongo Purpureocillium sp. PNM-67 había sido estudiado previamente en el grupo de
investigación por su capacidad controladora de patógenos del arroz del género Burkholderia
sp. En la tesis de maestría de Romero31, a partir del cultivo en medio PDB de este hongo, se
aislaron e identificaron 4 compuestos estructuralmente relacionados con la leucinostatina A a
los que se denominaron lilacininas A-D. Las lilacininas A y C presentaron una actividad
antimicrobiana moderada contra la bacteria Burkholderia gladioli.
En este marco, se realizaron emparejamientos entre el hongo PNM-67 (Purpureocillium sp.) y
las 14 bacterias seleccionadas. Como criterio de emparejamiento sólo se tuvo en cuenta que
los dos microorganismos crecieran adecuadamente en el medio de cultivo seleccionado, pues
en la literatura los pocos criterios de selección existentes se enfocan en interacciones bacteria-
bacteria.
Ensayos previos mostraron que cuando el hongo era evaluado por contacto en medio líquido
con las bacterias, en la mayoría de los casos la bacteria no sobrevivía al período de
fermentación. Por esta razón, inicialmente se evaluaron todos los co-cultivos en un ensayo a
distancia en medio sólido, y aquellas parejas que presentaban un cambio fenotípico cuando los
dos microorganismos entraban en contacto, fueron también evaluadas en un ensayo por
contacto. A continuación, se resumen los resultados de ambas aproximaciones.
Los ensayos a distancia se realizaron en 4 medios de cultivo diferentes; sin embargo, no todas
las parejas posibles fueron evaluadas en los cuatro medios, pues algunas bacterias no crecían
en todos los medios o lo hacían muy lento. Entre los medios de cultivo se encuentran algunos
que favorecen el crecimiento del hongo como el PDA; y otros que favorecen el crecimiento de
las bacterias como el ISP2. En total se hicieron 45 ensayos, en la Figura 3-9 se muestra un
ejemplo de este ensayo.
Capítulo 3 77
Figura 3-9: Ensayo de interacción a distancia bacteria-hongo. (a) Monocultivo de Purpureocillium sp. PNM-67, (b) Monocultivo de Rhodococcus sp. RKHC-26 y (c) Co-cultivo entre Purpureocillium sp. PNM-67 y Rhodococcus sp. RKHC-26.
Se observaron cambios fenotípicos en 13 casos de los 45 ensayos evaluados. El cambio
fenotípico predominante fue la inhibición de crecimiento del hongo en respuesta a su
interacción con varias de las bacterias. Lo cual es interesante pues muestra un
comportamiento contrario a lo observado en los ensayos en medio líquido previamente
realizados, donde en general la bacteria no sobrevivía tras ser co-cultivada con el hongo. Así
mismo evidencia que el comportamiento de una interacción puede variar significativamente
según las condiciones de fermentación. Si bien en la literatura se ha reportado ampliamente
como la producción metabólica de un microorganismo es altamente dependiente de las
condiciones de fermentación32,33; en el caso de co-cultivos, existen reportes que sugieren un
comportamiento muy similar entre medio sólido y líquido34–37, sin embargo, este
comportamiento no fue el observado en los ensayos realizados en este trabajo.
Para la obtención de los extractos orgánicos de estos ensayos, se delimitaron 3 zonas, una
donde se inoculó el hongo, una donde se inoculó la bacteria y una tercera zona, que se
denominará de “interacción” pues se encontraba espacialmente entre los inóculos (Figura
3-4). La división en estas tres zonas permite sugerir el origen de los compuestos debido a su
gradiente de difusión. Con el fin de mejorar la cantidad de extracto recuperada, se reunieron
las zonas análogas de 3 cajas para su análisis por HPLC-DAD y RMN 1H.
Por HPLC-DAD se observaron cambios metabólicos asociados al co-cultivo en 8 de los 45 casos
evaluados (1 caso en PDA, 3 en ISP2 y 4 en ISP3). Es interesante observar que las bacterias
involucradas en estos co-cultivos pertenecen a los géneros Streptomyces sp. (PNM-9 e IBUN-
78 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
5.1.), Paenibacillus sp. (PNM-115, PNM-123 y PNM-210) y Brevibacillus sp. (PNM-157). Al ser
analizados estos 8 casos por RMN 1H se encontraron cambios en 5 casos que se describen a
continuación. Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla 3-2.
En el primer co-cultivo, entre el hongo Purpureocillium sp. PNM-67 y la bacteria Paenibacillus
sp. PNM-123 en medio PDA se observaron cambios fenotípicos, en HPLC-DAD y RMN 1H. En el
análisis por HPLC-DAD de la zona de interacción se observaron dos picos (con máximos de
absorbancia en 320nm) que no se presentan en los monocultivos respectivos. Estos picos
también se observan en la zona de la bacteria en la caja del co-cultivo por lo que el gradiente
de difusión de estos compuestos indica que éstos posiblemente son producidos por la bacteria
en respuesta a su interacción con el hongo. Este co-cultivo fue también analizado por RMN 1H
donde se encontraron señales entre 7.6 y 7.8ppm exclusivas a los extractos del co-cultivo en
las zonas de la bacteria y de la interacción. Los cambios inducidos por el co-cultivo pueden
observarse en la Figura 3-10. Ambas técnicas analíticas sugieren que los compuestos
inducidos por el co-cultivo son de naturaleza aromática.
Tabla 3-2: Resultados del ensayo de co-cultivo binarios entre bacterias y el hongo Purpureocillium sp. PNM-67 en el ensayo a distancia usando diferentes medios de cultivo.
PDA LBG ISP2 ISP3
Bacteria en co-cultivo
con el hongo PNM
67
Cambio Cambio Cambio Cambio
Fenotípico HPLC-DAD
RMN 1H
Fenotípico HPLC-DAD
RMN 1H
Fenotípico HPLC-DAD
RMN 1H
Fenotípico HPLC-DAD
RMN 1H
PNM-9 — — ○ — — ○ + + — + — — PNM-25 — — ○ — — ○ — — ○ — — ○
PNM-115 — — ○ — — ○ + — — + + + PNM-123 + + + — — ○ + — — + + + PNM-157 NE — — ○ + + — — — ○
PNM-161a — — ○ — — ○ — — ○ — — ○ PNM-210 — — ○ + — ○ + + — + + + PNM-216 — — ○ — — ○ — — ○ — — ○ RKCH-9 NE — — ○ NE — — ○
RKHC-26 — — ○ — — ○ — — ○ — — ○ RKHC-28 NE — — ○ NE — — ○
RKHC-59b NE — — ○ NE — — ○ RKHC-62b NE — — ○ NE NE IBUN-5.1 — — ○ + — ○ NE + + +
NE: Interacción no evaluada, (—): No se observó ningún cambio en comparación a los monocultivos correspondientes, (+): Se observó un cambio en
comparación a los monocultivos correspondientes, (○): No se realizó el análisis por RMN 1H.
Figura 3-10: Comparación de cromatogramas de HPLC-DAD (320nm) a la izquierda y comparación de espectros RMN 1H a la derecha para los extractos orgánicos de: (a) medio de cultivo PDA, (b) monocultivo de Purpureocillium sp. PNM-67, (c) monocultivo de Paenibacillus sp. PNM-123 y las tres zonas de la caja del co-cultivo (d) zona del hongo, (e) zona de la interacción y (f) zona de la bacteria.
Los co-cultivos del hongo PNM-67 con las bacterias Paenibacillus sp. PNM-115, Paenibacillus
sp. PNM-123, Paenibacillus sp. PNM-210 y Streptomyces sp. IBUN-5.1. en medio ISP3
mostraron por HPLC-DAD un pico igual en todos los casos (tanto en tiempo de retención como
en espectro UV) que puede ser asociado al co-cultivo, al estar presente en la zona de
interacción del co-cultivo y ausente en los extractos de los monocultivos correspondientes.
Estos mismos cuatro extractos de la zona de la interacción de las 4 bacterias y el hongo, fueron
analizados por RMN 1H, donde se pudo observar la presencia de señales iguales en los cuatro
extractos, pero en diferente proporción (Figura 3-11).
Figura 3-11: Comparación de cromatogramas de HPLC-DAD (320nm) a la izquierda y espectros de RMN 1H (ampliación 6-8ppm) a la derecha para los extractos orgánicos de las zonas de interacción de los co-cultivos entre Purpureocillium sp. PNM-67 y: (a) Paenibacillus sp. PNM-123, (b) Paenibacillus sp. PNM-115, (c) Streptomyces sp. IBUN-5.1 y (d) Paenibacillus sp. PNM-210. En (e) monocultivo del hongo Purpureocillium sp. PNM-67.
Teniendo en cuenta que las señales de interés tanto en HPLC-DAD como en RMN 1H se
encuentran tanto en las zonas de interacción como en la zona del hongo de los 4 co-cultivos
mencionados, es posible afirmar que los cuatro emparejamientos inducen la producción por
parte del hongo, a juzgar por el gradiente de difusión, de compuestos iguales o similares pero
en concentraciones diferentes. Es interesante notar que por evaluación visual se observó que
en estos 4 co-cultivos había inhibición de crecimiento de hongo; entonces, estos compuestos
inducidos podrían ser un mecanismo de defensa del hongo frente a las bacterias mencionadas.
Empleando el experimento bidimensional COSY, se encontró que las señales observadas en
7.28 y 6.37 ppm acoplaban entre sí, lo que indica que hacen parte del mismo compuesto.
82 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
En los ensayos a distancia en PDA se observaron dos emparejamientos en los que al entrar en
contacto el hongo con cada una de las bacterias (Gordonia sp. PNM-25 y Rhodococcus sp. RKHC-
26) se producía una pigmentación rojiza. Es interesante notar que estas dos bacterias se
incluyeron inicialmente en el panel de microorganismos pues se caracterizan por tener ácido
micólico en su pared celular. En el caso de los co-cultivos bacteria-bacteria, se ha demostrado
que las bacterias que contienen ácido micólico son capaces de inducir la producción de
metabolitos especializados en bacterias del género Streptomyces38. Estudios recientes han
mostrado que el efecto que tienen las bacterias con ácido micólico también se extiende a otras
Actinobacterias39; sin embargo, no existen reportes que muestren que tengan también efecto
en hongos40. De este modo, estos dos co-cultivos podrían ser de gran interés, pues constituirían
el primer ejemplo del efecto de las bacterias con ácido micólico sobre hongos.
Al realizarse los análisis por HPLC-DAD y por RMN 1H de la zona de interacción de los dos co-
cultivos no se encontraron picos ni señales que fueran exclusivos al co-cultivo. Buscando
aumentar la producción de este pigmento rojo, estos dos co-cultivos se evaluaron en un ensayo
por contacto.
En el caso del co-cultivo de PNM-67 con PNM-25, esta última no sobrevivió a la fermentación
posiblemente porque su tasa de crecimiento es inferior a la del hongo; así mismo, los análisis
por HPLC-DAD no permitieron observar ningún cambio en la producción metabólica. En el
caso del co-cultivo entre PNM-67 y RKHC-26 se pudo observar el pigmento rojo en toda la caja,
y se observaron cambios en la producción metabólica que se detallan a continuación.
En la Figura 3-12 se puede observar la aparición del pigmento rojo en la caja del co-cultivo.
Tanto la producción del pigmento rojo como sus implicaciones harían a este co-cultivo
interesante para su estudio químico. Primero, a los pigmentos microbianos se les han atribuido
diferentes funciones en la naturaleza que van desde su actividad protectora en contra de
radiación ultravioleta, oxidantes o compuestos antimicrobianos producidos por otros
microorganismos, hasta su actividad antimicrobiana en contra de otros microorganismos41.
Además, la producción de este pigmento rojo puede ser un indicador del cambio en la
producción de otros metabolitos24,38,42.
Capítulo 3 83
Figura 3-12: Ensayo de interacción por contacto bacteria-hongo. (a) Monocultivo de Rhodococcus sp. RKHC-26, (b) Monocultivo de Purpureocillium sp. PNM-67y (c) Co-cultivo entre Purpureocillium sp. PNM-67 y Rhodococcus sp. RKHC-26.
Los análisis por HPLC-DAD no evidenciaron ningún pico único para el co-cultivo mientras que
los análisis por RMN 1H mostraron señales en δH 0.84-0.87, 4.54 (td, J=11.05; 4.2 Hz), y 7.85-
7.88 exclusivas para el extracto orgánico del co-cultivo, como se observa en la Figura 3-13.
Por esta razón, este co-cultivo fue también seleccionado para la evaluación de su producción
metabólica.
La información más relevante de los 7 co-cultivos seleccionados para su posterior estudio
químico se resume en la Tabla 3-3.
Figura 3-13: Comparación de espectros de RMN 1H para los extractos orgánicos de a) medio de cultivo sin inocular LB, (b) monocultivo de Streptomyces sp. PNM-161a, (c) monocultivo de Rhodococcus sp. RKHC-26 y (d) co-cultivo de estos dos aislamientos en las zonas de (1) 0-2ppm, (2) 4-6ppm y (3) 6-8ppm.
Tabla 3-3: Co-cultivos binarios seleccionados para su posterior estudio químico.
Co-cultivo binario Tipo de ensayo
Cambio
Aislamiento Aislamiento RMN 1H
(δH ppm) HPLC-DAD Probable productor
Streptomyces sp. PNM-161a
Rhodococcus sp. RKHC-26
Contacto
1.5-1.7 2.35-2.50
2.95 (bt, J=7.5Hz) 7.15 (m)
No se observa ¿?
Purpureocillium sp. PNM-67
Paenibacillus sp. PNM-123
Distancia 7.6-7.8
2 picos
(λmax =320nm)
Paenibacillus sp. PNM-123
Purpureocillium sp. PNM-67
Paenibacillus sp. PNM-115,
Paenibacillus sp. PNM-123,
Paenibacillus sp. PNM-210
Streptomyces sp. IBUN-5.1.
Distancia
7.28 (d, J=2.1Hz) 6.70 (d, J=2.6Hz) 6.61 (d, J=2.6Hz) 6.37 (d, J=2.1Hz)
1 pico
(λmax=256, 287, 337 y 298nm)
Purpureocillium sp. PNM-67
Purpureocillium sp. PNM-67
Rhodococcus sp. RKHC-26
Contacto
0.84-0.87 4.54 (td, J=11.0; 4.2 Hz)
7.85-7.88 No se observa ¿?
3.4 Conclusiones
A partir de un set de 15 microorganismos (14 bacterias y 1 hongo) se evaluaron co-cultivos
bacteria-bacteria y bacteria-hongo, por medio de 151 ensayos evaluando interacciones a
distancia y por contacto en medio sólido. Los extractos orgánicos de estos co-cultivos fueron
analizados empleando HPLC-DAD y RMN 1H, técnicas que permitieron detectar los
emparejamientos con picos y/o señales inducidas por el co-cultivo. Así mismo, el uso de
cultivos a distancia, y su extracción por zonas, permitió sugerir cuál es productor de los
compuestos inducidos
En el caso de los co-cultivos bacteria-bacteria, en las interacciones a distancia se empleó una
metodología basada en la detección de cambios fenotípicos asociados a la interacción como
estrategia de priorización. A los 27 co-cultivos que presentaron cambios fenotípicos se les
evaluó su producción metabólica empleando HPLC-DAD y RMN, sin embargo, no se lograron
observar cambios inducidos por el co-cultivo con estas técnicas. En el caso de las interacciones
por distancia, se priorizaron 13 co-cultivos teniendo en cuenta los criterios de emparejamiento
reportados en la literatura. A estas 13 parejas se les evaluó su producción metabólica por
HPLC-DAD y RMN 1H, permitiendo ésta última observar cambios debidos al co-cultivo en una
de las parejas evaluadas (Streptomyces sp. PNM-161a y Rhodococcus sp. RKHC-26).
En el caso de los co-cultivos bacteria-hongo a distancia se evaluaron todas las posibles
interacciones entre el hongo Purpureocillium sp. PNM-67 con las 14 bacterias seleccionadas,
en 4 medios de cultivo diferentes. La producción metabólica de los ensayos a distancia se
evaluó en 3 zonas: dos correspondientes a los inóculos de los microorganismos, y una tercera
zona correspondiente a la interacción. Esta estrategia permitió observar los gradientes de
difusión y sugerir el productor del compuesto inducido. De los 45 ensayos evaluados, se
encontró que para 5 casos se observaban cambios inducidos por el co-cultivo, tanto por HPLC-
DAD como por RMN. En cuatro de estos casos, que consistían en los co-cultivos entre el hongo
con las bacterias Paenibacillus sp. PNM-115, Paenibacillus sp. PNM-123, Paenibacillus sp. PNM-
210 y Streptomyces sp. IBUN-5.1, es posible afirmar que el co-cultivo induce la producción por
parte del hongo, a juzgar por el gradiente de difusión, de compuestos iguales o similares pero
en concentraciones diferentes. Estos ensayos también permitieron observar que cuando el
hongo Purpureocillium sp. PNM-67 interactúa por contacto con las bacterias Gordonia sp. PNM-
25 y Rhodococcus sp. RKHC-26, se genera una pigmentación rojiza que está probablemente
Capítulo 3 87
asociada con un cambio en la producción metabólica del mismo. Este constituiría el primer
reporte de un co-cultivo exitoso entre un hongo y una bacteria con ácido micólico.
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4. Capítulo 4: Análisis de la producción metabólica de dos interacciones por contacto con la bacteria con ácido micólico Rhodococcus sp. RKHC-26
Resumen
La tasa de redescubrimiento de compuestos a partir de microorganismos ha aumentado
significativamente con el pasar de los años. Así mismo, se ha demostrado que bajo condiciones
estándar de laboratorio los microorganismos no producen todos los metabolitos que
potencialmente podrían producir. Teniendo en cuenta esto, se han desarrollado estrategias
con el fin de aprovechar el potencial biosintético de estos organismos.
Previamente se realizó un screening de interacciones binarias en medio sólido empleando un
set de 15 microorganismos. Este screening permitió priorizar 7 parejas que tenían la capacidad
de inducir cambios en la producción metabólica. Este capítulo se enfoca en el análisis de los
cambios en la producción metabólica de 2 de estos 7 co-cultivos, que se caracterizaron por ser
interacciones mediadas por contacto célula-célula. Además, los dos incluyen al aislamiento
Rhodococcus sp. RKHC-26, bacteria con ácido micólico; en la literatura, se ha reportado que
estas bacterias inducen cambios en la producción metabólica de actinobacterias.
El co-cultivo entre la bacteria Streptomyces sp. PNM-161a y la bacteria con ácido micólico
Rhodococcus sp. RKHC-26 en medio LB fue realizado por contacto. Se evaluaron los cambios en
la producción metabólica empleando LC-MS/MS, donde se encontró que en efecto la
interacción induce la producción de metabolitos no observados en los monocultivos. La
derreplicación de los datos sugiere la producción de compuestos con actividad antibiótica del
tipo macrólido y péptido. El estudio del cultivo en mayor volumen (380 cajas) fue seguido por
RMN, y permitió evidenciar algunos cambios menores, pero no permitió el aislamiento de
92 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
compuestos inducidos por el co-cultivo. Adicionalmente, se observó una baja reproducibilidad
en los co-cultivos.
El segundo co-cultivo estudiado fue el obtenido entre el hongo Purpureocillium sp. PNM-67 y
la bacteria con ácido micólico Rhodococcus sp. RKHC-26 en medio PDA por triplicado. El
seguimiento de éste se hizo empleando LC-MS/MS. Para evaluar los cambios en la producción
metabólica se emplearon técnicas de análisis multivariado y construcción de redes
moleculares. Como efecto de esta interacción se observó la producción de 6 leucinostatinas ya
reportadas. Este co-cultivo constituye el primer reporte de un co-cultivo exitoso entre un
hongo y una bacteria con ácido micólico.
Se observó en general que es necesario el mejoramiento de las condiciones experimentales
para el establecimiento de los co-cultivos por contacto con el fin de mejorar la reproducibilidad
de los experimentos.
4.1 Introducción
El co-cultivo es una de las técnicas que ha sido desarrollada con el fin de aprovechar de mejor
manera el potencial biosintético de los microorganismos. Ya encontrada la combinación o
pareja ideal para la producción de metabolitos especializados, el co-cultivo es superior a otras
aproximaciones en término de costos y simplicidad, pues no requiere reactivos costosos ni
técnicas de manipulación genética. Sin embargo, el co-cultivo requiere por lo general un
screening a gran escala para encontrar la combinación ideal de microorganismos y es difícil
generalizar cada resultado a otras bacterias u hongos.1
Pocos criterios se han establecido para facilitar este tipo de screenings. En el caso de los co-
cultivos bacteria-bacteria, se ha demostrado que las bacterias que contienen ácido micólico
son capaces de inducir la producción de metabolitos especializados en Actinobacterias2. En un
primer estudio reportado en 20113 se encontró que cuando se realizaban co-cultivos de cepas
de Streptomyces con Tsukamurella pulmonis, Rhodococcus erythropolis y Corynebacterium
glutamicum se alteraba la producción metabólica en 88%, 87% y 90% de las parejas evaluadas
respectivamente. Esto permitió a los autores concluir que las bacterias que contienen ácido
micólico pueden influenciar en altas frecuencias la biosíntesis de productos naturales en
Streptomyces spp.3
Capítulo 4 93
Estudios recientes han mostrado que el efecto que tienen las bacterias con ácido micólico
también se extiende a otras Actinobacterias4. Empleando este precepto se han aislado una gran
variedad de compuestos nuevos como las alquivemicinas A y B5, la arcyriaflavina E6, las
chojalactonas A-C7, las niizalactamas A-C8, las 5-alquil-1,2,3,4-tetrahidroquinolinas9, los
streptoaminales10, las dracolactamas A y B4, las mirilactamas C-E11, las umezawamidas A y B12,
las catenulobactinas A y B13 y el ácido gordónico14.
Se han realizado estudios para comprender el mecanismo de esta interacción, y aunque
todavía no se tiene total claridad al respecto, se ha observado que es necesario que las células
de la bacteria con ácido micólico estén vivas, pues ensayos con ácido micólico o con células
muertas no causan cambios en la producción metabólica15,16. A diferencia de estos estudios,
Adnani y colaboradores reportaron un caso en el que la inducción de un nuevo metabolito
estaba mediada por los compuestos difusibles producidos por la bacteria con ácido micólico,
sin la necesidad del contacto físico célula-célula17.
Cuando se realizan experimentos de co-cultivo, uno de los desafíos es detectar aquellos
metabolitos producidos de novo o aquellos que son afectados por la interacción. Una simple
comparación de cromatogramas o espectros puede ser suficiente para observar los cambios
más evidentes. Sin embargo, cuando se emplea espectrometría de masas, se pueden observar
tanto cambios grandes como pequeños debido a la sensibilidad de la técnica, lo que lleva a
utilizar herramientas quimiométricas que permiten un mejor análisis de los datos18.
Un primer paso exploratorio es el uso de un enfoque no supervisado como es el PCA (Principal
Component Analysis). El PCA muestras las relaciones que existen entre las muestras mediante
la visualización de agrupamientos, tendencias y muestras atípicas19. En experimentos de co-
cultivo, se esperaría observar tres clústers bien diferenciados, que confirmen las diferencias
en la producción metabólica de las dos cepas puras y el co-cultivo. Un segundo paso consistiría
en la construcción de un modelo OPLS-DA que permitan la comparación del co-cultivo con las
cepas puras. De esta manera, se podrían seleccionar aquellos picos que han sido modificado en
los co-cultivos.20
La identificación de los picos de interés basada únicamente en la información de
espectrometría de masas sigue siendo muy desafiante pues se basa esencialmente en el uso de
bases de datos21, por lo que las identificaciones que se realizan típicamente son de carácter
putativo basadas en la fórmula molecular o en criterios quimiotaxonómicos. Como un enfoque
94 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
complementario, se ha empleado la construcción de redes moleculares en la plataforma del
GNPS a partir de espectrometría de masas en tándem.22
El GNPS (Global Natural Products Social Molecular Networking) es una plataforma de acceso
libre para el almacenamiento y análisis de espectros MS/MS. El GNPS permite analizar un
grupo de datos y compararlos con datos disponibles públicamente.22 Para el año 2016, el GNPS
albergaba 221083 espectros MS/MS correspondientes a 18163 compuestos. Estos espectros
provienen de 3 fuentes, librerías espectrales creadas por el GNPS (GNPS-Collections),
espectros compartidos por la comunidad científica (GNPS-Community) y librerías externas
como MassBank, ReSpect y NIST.22
La plataforma del GNPS permite la construcción de redes moleculares, que consiste en una
estrategia computacional que permite la visualización e interpretación del espacio químico
presente en los experimentos de MS.23 Espectros con el mismo ion precursor y que tienen un
espectro MS/MS similar son unidos en un único espectro consenso. Estos espectros consenso
son simplificados como vectores los cuales son utilizados para calcular un valor de coseno
entre cada posible pareja de espectros consenso, lo que permite la determinación del grado de
similaridad espectral entre ellos. El valor de coseno puede variar entre 0 (no existe similitud)
hasta 1 (espectros idénticos).24,25 El resultado de este proceso puede ser visualizado como una
gráfica dónde cada nodo es un espectro MS/MS consenso y las cuñas entre los nodos indican
el grado de similitud entre los espectros consenso.26
De este modo, las redes moleculares permiten la visualización organizada de moléculas
relacionadas estructuralmente, lo que unido a la derreplicación basada en la búsqueda en las
librerías espectrales contenidas en el GNPS, hacen a este método una herramienta muy útil
para el análisis de resultados de espectrometría de masas en tándem.
Sin embargo, como se ha reportado recientemente27 la construcción de redes moleculares
sufre de algunas limitaciones que pueden afectar la interpretación de los resultados. Primero,
la cuantificación de los iones padre en las diferentes muestras analizadas no se aprecia
correctamente, pues la plataforma del GNPS basa su cuantificación en el número de escaneos
MS/MS detectados en cada muestra, y esto es altamente dependiente de la configuración del
análisis en la plataforma. Segundo, compuestos isobáricos pueden unirse incorrectamente en
un mismo nodo. Finalmente, la limpieza de los datos es crucial para evitar la presencia de picos
Capítulo 4 95
poco informativos tales como los presentes en el medio de cultivo y artefactos de los
instrumentos de espectrometría de masas.
Recientemente, en el GNPS se han incluido nuevas estrategias mejoradas que pretenden
superar algunas de estas desventajas. Uno de ellos es el Feature-based Molecular Networking28.
En esta estrategia, previo a la construcción de redes moleculares, los datos son procesados en
MZMine29, donde es generada una lista de picos alineada que posteriormente es subida a la
plataforma del GNPS para la construcción de redes. Entre las ventajas que incluye esta
metodología se encuentra la inclusión de información cuantitativa, la discriminación de
isómeros por tiempo de retención y la reducción de moléculas redundantes.
En el caso de co-cultivos, la construcción de redes moleculares ha sido utilizada recientemente
para evaluar simultáneamente los cambios en la producción metabólica de múltiples
interacciones. De esta manera, el uso de redes moleculares ha permitido identificar familias
moleculares exclusivas al co-cultivo30 e identificar los compuestos asociados a la interacción y
proponer las razones de su inducción31. Otros autores han complementado la derreplicación
del GNPS con dereplicación manual empleando bases de datos como el Diccionario de
Productos Naturales, MarinLit, Reaxys y SciFinder; y con derreplicación a partir de una base
de datos de fragmentación MS/MS in silico como la ISDB-UNPD32.
En este capítulo se buscó evaluar la producción metabólica de dos de los siete co-cultivos
promisorios seleccionados en el Capítulo 3. Estos 2 co-cultivos consistían en interacciones por
contacto entre la bacteria con ácido micólico Rhodococcus sp. RKHC-26 con la bacteria
Streptomyces sp. PNM-161a y el hongo Purpureocillium sp. PNM-67.
4.2 Materiales y métodos
4.2.1 General
Para los medios de cultivo se empleó agar bacteriológico (Scharlau), triptosa (Scharlau),
cloruro de sodio R.A. (Merck), extracto de levadura (Oxoid) y agar papa dextrosa (Scharlau).
Para las extracciones se empleó acetato de etilo grado analítico (PanReac AppliChem).
Para el fraccionamiento se emplearon cartuchos Hypersep C18 (Thermo Scientific) de 1000mg
de 1000mg. Como soporte cromatográfico para columna abierta se empleó resina Sephadex
96 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
LH-20 (Pharmacia Biotech). Para estas separaciones se emplearon como solventes metanol
grado HPLC (LiChrosolv) y agua destilada.
Los análisis de resonancia magnética nuclear se realizaron en un Bruker Avance 400. Se
emplearon como solventes CDCl3 con grado de deuteración 99.8 % (Merck, Alemania) y
metanol-d4 con grado de deuteración 99.8% (Merck, Alemania).
Para la determinación de la rotación óptica se utilizó un polarímetro ADP440+ (Bellingham
Stanley).
4.2.2 Cultivos
Todos los cultivos se realizaron en cajas de Petri de 90 mm*15 mm. En el caso de las bacterias
el inóculo era de 105 UFC por caja, y en el caso del hongo era de 105 conidios por caja.
Co-cultivo Streptomyces sp. PNM-161a vs. Rhodococcus sp. RKHC-26: Se realizó en medio
sólido empleando como medio de cultivo LB (composición por litro: triptosa 10g, NaCl 10g,
extracto de levadura 5g y agar 14g). El volumen de medio por caja fue de 25mL. Se realizaron
380 cajas del co-cultivo mezclando alícuotas de cada uno de los microorganismos, y esta
mezcla fue inoculada de forma masiva en la superficie del agar, previa homogenización en
vórtex por 1 minuto. Se realizaron 150 cajas de cada uno de los monocultivos. Las cajas fueron
incubadas a 30ºC por 5 días.
Co-cultivo Purpureocillium sp. PNM-67 vs. Rhodococcus sp. RKHC-26: Se realizó en medio
sólido empleando como medio PDA. El volumen de medio por caja fue de 30mL. Se realizaron
3 cajas del co-cultivo mezclando alícuotas de cada uno de los microorganismos, y esta mezcla
fue inoculada de forma masiva en la superficie del agar, previa homogenización en vórtex por
1 minuto. Se realizaron 3 cajas de cada uno de los monocultivos. Las cajas fueron incubadas a
30ºC por 10 días.
4.2.3 Extracción
Después de transcurrido el tiempo de fermentación, el agar fue cortado en cubos empleando
una cuchilla estéril. Cada muestra fue liofilizada empleando un liofilizador LABCONCO
(FreeZone 4.5). El material seco fue extraído dos veces con acetato de etilo. Las extracciones
Capítulo 4 97
fueron realizadas empleando un baño de ultrasonido Cole-Parmer a temperatura ambiente por
20 minutos. Las muestras fueron filtradas y secadas a presión reducida.
4.2.4 Fraccionamiento y aislamiento
Co-cultivo Streptomyces sp. PNM-161a vs. Rhodococcus sp. RKHC-26:: Los extractos
obtenidos del blanco de medio LB (1041.7 mg), del monocultivo de Streptomyces sp. PNM-161a
(1130.1 mg), del monocultivo de Rhodococcus sp. RKHC-26 (1083.2 mg) y del co-cultivo
(1878.3 mg) fueron fraccionados empleando cartuchos RP18. Se emplearon mezclas
MeOH/H2O 1:9, 3:7, 1:1, 7:3 y 1:0 para obtener 5 fracciones para cada uno de los extractos. La
fracción CC1.1 fue sometida a una separación por exclusión de tamaño empleando Sephadex
LH-20. A partir de esta separación se obtuvieron 14 fracciones. Se obtuvieron los compuestos
4.1 (20.7 mg) y 4.2 (5.2 mg) en las fracciones CC1.2.11 y CC1.2.12 respectivamente. Los detalles
más relevantes de este proceso de separación se pueden observar en la Figura 4-1.
Figura 4-1: Esquema de separación entre el hongo Streptomyces sp. PNM-161a y la bacteria Rhodococcus sp. RKHC-26
4.2.5 Análisis por LC/MS-MS
Se analizaron por LC/MS-MS los extractos de los co-cultivos entre Streptomyces sp. PNM-161a
y Rhodococcus sp. RKHC-26 y, entre Purpureocillium sp. PNM-67 y Rhodococcus sp. RKHC-26.
Así mismo, se analizaron los monocultivos correspondientes, los medios de cultivo (LB y PDA)
y blancos de solvente.
Los análisis se llevaron a cabo en un equipo UHPLC Thermo Dionex Ultimate 3000 acoplado a
un espectrómetro de masas Bruker Impact II UHR-Q-TOF. Los análisis fueron medidos en
modo positivo. El escaneo de masas se realizó en un rango de m/z 50 a m/z 1200. Se emplearon
los siguientes parámetros en el espectrómetro: voltaje del capilar 4.5kV, flujo de gas 8L/min,
temperatura 200ªC, presión del nebulizador 2.0bar, energía de colisión 5eV.
Los extractos fueron disueltos en metanol para una concentración final de 0.5mg/mL y fueron
inyectados en una columna Acclaim RSLC 120 ThermoScientific C18 2.2µm (3*75mm). Los
solventes usados en la elución fueron: agua con ácido fórmico 0.1% (fase A) y acetonitrilo con
ácido fórmico 0.1% (fase B). El análisis cromatográfico inició con 10% de la fase B por 4
minutos, se incrementó linealmente a 100% de la fase B en 18 minutos, se mantuvo ahí por 4
minutos, se retornó a 10% de la fase B en 3 minutos dónde se mantuvo otros 3 minutos más.
El flujo fue de 0.4mL/min.
4.2.6 Pre-procesamiento de los datos por LC/MS-MS en MZmine
Tras la adquisición de los datos, estos fueron convertidos al formato .mzXML en el programa
Data Analysis de Bruker con el fin de ser analizados en el programa de acceso libre MZmine
2.37 que permite el procesamiento de datos de espectrometría de masas de alta resolución
acoplados con métodos de separación.29
Para el procesamiento de los datos obtenidos se emplearon los parámetros que se muestran
en la Tabla 4-1 en cada uno de los módulos de análisis de MZmine:
100 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
Tabla 4-1: Valores de los parámetros de análisis en cada uno de los módulos de MZmine para las muestras de cada uno de los co-cultivos y sus correspondientes monocultivos.
PARÁMETRO Co-cultivo
Streptomyces sp. PNM-161a vs. Rhodococcus sp. RKHC-26
Co-cultivo Purpureocillium sp. PNM-67 vs.
Rhodococcus sp. RKHC-26 Mass detection (Centroid mass detector)
Noise level MS1 2.0 × 104 1.0 × 103 Noise level MS2 1.0 × 101 1.0 × 101
Chromatogram builder Min time span (min) 0.2 0.2
Min height 6.0 × 104 3.0 × 103 m/z tolerance 0.05 0.05
Chromatogram deconvolution (Baseline cut-off) Min peak height 6.0 × 104 3.0 × 103
Peak duration range (min)
0.2-4.0 0.2-4.0
Baseline level 2.0 × 104 1.0 × 103 m/z range for MS2 scan pairing (Da)
0.05 0.05
RT range for MS2 scan pairing (min)
0.2 0.2
Isotopic peaks grouper m/z tolerance 0.05 0.05 Retention time tolerance (min)
0.2 0.2
Maximum charge 3 3 Alignment (Join aligner)
m/z tolerance 0.1 0.1 RT tolerance 0.5 0.5 Weight m/z 75 75
Weight for RT 25 25
Finalmente en la opción de filtrado de picos MS/MS se seleccionó la opción Keep only peaks
with MS2 scan. En las dos matrices obtenidas se eliminaron todos los picos presentes en el
blanco de medio y en el blanco de solvente. Finalmente cada matriz fue exportada empleando
la función Export for/Submit for GNPS que generó dos archivos: Quantification table (formato
.csv) y MS2 file (formato .mgf).
4.2.7 Análisis multivariado
Los datos obtenidos fueron exportados a software SIMCA versión 14.1 (Umetrics) donde
fueron analizados empleando PCA y OPLS-DA con escalado Pareto. Empleando el mismo
Capítulo 4 101
programa se realizó un test de permutaciones para evaluar la validez del modelo OPLS-DA y
se generó un S-plot para evaluar los resultados del mismo.
4.2.8 Construcción de redes moleculares
Se siguió el mismo procedimiento para el análisis de cada uno de los dos co-cultivos
estudiados. En la plataforma del GNPS fueron cargados tres archivos: quantification table, MS2
file y metadata table. Se empleó el workflow en la plataforma del GNPS empleando los
siguientes parámetros: Precursor ion mass tolerance 0.3 Da, Fragment ion mass tolerance 0.1
Da, Minimum cosine score 0.70, Maximum number of neighbor nodes for one single node 10,
Minimum matched fragment ions 6, Maximum size of nodes allowed in a single connected
network 100, Maximum shift between precursors 500 Da, Library search min matched peaks 6,
Score threshold 0.7
El análisis realizado en la plataforma del GNPS para el co-cultivo entre Streptomyces sp. PNM-
161a y Rhodococcus sp. RKHC-26 se puede visualizar en el link:
https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/status.jsp?task=0232da24db0d4d70b9baf906838a3945.
El análisis realizado en la plataforma del GNPS para el co-cultivo entre Purpureocillium sp.
PNM-161a y Rhodococcus sp. RKHC-26 se puede visualizar en el link:
https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/status.jsp?task=be7a15f5b86d4f788dc75a8c179c29c4.
Las redes moleculares obtenidas en el paso anterior fueron visualizadas en el programa de
acceso libre Cytoscape en su versión 3.7.1.33
4.2.9 Derreplicación
Se realizó la identificación putativa de aquellos picos que no fueron identificados por el GNPS,
empleando el Diccionario de Productos Naturales (DNP)34. La búsqueda se basó en la masa
exacta de cada ion, y se limitó teniendo en cuenta los géneros a los que pertenecían los
aislamientos que hacían parte de las interacciones, así como géneros filogenéticamente
relacionados. Para la búsqueda se aceptó un error máximo de 15ppm.
102 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
4.3 Resultados y discusión
4.3.1 Co-cultivo entre la bacteria Streptomyces sp. PNM-161a y la bacteria con ácido micólico Rhodococcus sp. RKHC-26
Este co-cultivo fue seleccionado a partir del screening realizado en medio sólido presentado en
el capítulo 3. Esta selección se basó en el perfilado empleando HPLC-DAD y RMN 1H. las
diferencias más visibles se dieron el espectro de RMN 1H; sin embargo, estas diferencias eran
en zonas complejas del espectro. Con el fin de evaluar los cambios empleando una técnica más
sensible, el extracto orgánico de este co-cultivo y sus correspondientes monocultivos fue
analizado por LC-MS/MS. En el caso de los datos obtenidos por esta técnica, una simple
superposición de cromatogramas no es suficiente para realizar la comparación de los cultivos
como se hizo en el caso de HPLC-DAD. Con el fin de facilitar el análisis, los datos de LC-MS
fueron procesados por MZmine con el fin de obtener una matriz alineada de features, que fue
exportada a la plataforma del GNPS. En esta matriz se eliminaron todos las features asociadas
al blanco de medio de cultivo LB y al blanco de solvente. Se construyeron redes moleculares
empleando el Feature-based molecular networking. Las redes obtenidas se pueden observar en
la Figura 4-2.
En esta figura se visualizan de color naranja los nodos producidos por Streptomyces sp. PNM-
161a y de color morado los producidos por Rhodococcus sp. RKHC-26. Si el nodo es circular
indica que es producido tanto en monocultivo como en co-cultivo, mientras que, si es
rectangular, es exclusivo al monocultivo. De color verde se visualizan los nodos exclusivos al
co-cultivo.
De manera general se puede observar que el metabolismo de las dos bacterias cambió
drásticamente, en el caso de Streptomyces sp. PNM-161a 58 features son exclusivas al
monocultivo, mientras que en el caso de Rhodococcus sp. RKHC-26 115 features son exclusivas
al monocultivo. Además, existen 100 features asociadas exclusivamente al co-cultivo, que
muestran lo promisoria que es esta interacción para ser evaluada en mayor volumen. La
distribución de las features se puede observar en la Figura 4-3.
Capítulo 4 103
Figura 4-2. Redes moleculares para el co-cultivo entre Streptomyces sp. PNM-161a y Rhodococcus sp. RKHC-26 y sus respectivos monocultivos. Para los monocultivos, nodos circulares hacen referencia a features producidas en mono y co-cultivo, mientras que nodos cuadrados representan features exclusivas de los monocultivos.
104 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
Figura 4-3. Diagrama de Venn que muestra la distribución de los picos detectados por LC-MS/MS.
Se pueden observar redes moleculares formadas únicamente por nodos exclusivos al co-
cultivo (MN1), redes formadas por nodos exclusivos a cada uno de los monocultivos (por
ejemplo, MN6 y MN15) y redes integradas por nodos producidos en mono y co-cultivos (por
ejemplo, MN2). El primer tipo de redes es el más interesante para este tipo de estudios pues
demuestra que la interacción es capaz de inducir la formación de una “familia molecular”, es
decir un grupo de moléculas estructuralmente relacionadas35.
Existen nodos que no forman redes y se les denomina self-loops. El hecho de que no formen
agrupaciones significa que no existe similitud estructural con los demás nodos que hacen parte
de set de datos. Esto puede ser interesante en un estudio de co-cultivo pues indica que estas
moléculas podrían ser novedosas, o al menos significativamente diferentes a las demás
moléculas producidas en la interacción. En este grupo de datos hay 107 self-loops de los cuales,
18 corresponden a nodos producidos únicamente en el co-cultivo.
Es interesante notar que el co-cultivo indujo la formación de una familia molecular35 (MN1).
En esta red se encuentran 56 features de las 100 exclusivas al co-cultivo. Ninguno de estos
nodos pudo ser derreplicado empleando las librerías del GNPS. Por tal razón, se realizó una
búsqueda en el Dictionary of Natural Products empleando la masa exacta de cada ión y criterios
quimiotaxonómicos. Se identificaron putativamente 12 features, cómo se puede observar en la
Figura 4-4, y que se caracterizan por ser compuestos tipo macrólido y péptido. Las
identificaciones putativas basadas en esta búsqueda se resumen en la Tabla 4-2.
Figura 4-4. Familia molecular MN1, se destacan aquellos nodos que se identificaron putativamente a partir de la búsqueda realizada en el Dictionary of Natural Products-
Tabla 4-2. Identificaciones putativas de la MN1 (nodos producidos exclusivamente en el co-cultivo) basadas en la búsqueda en el DNP por masa exacta con un margen de error de 15 ppm.
m/z observado Aducto Compuesto Fuente biológica Fórmula molecular Error (ppm)
700.4249 M+H Tumescenamida A Streptomyces tumescens36
C37H57N5O8 4 Tumescenamida C Streptomyces sp. 37
744.4510 M+H 23-demicinosiltilosin D Streptomyces fradiae38 C38H65NO13 3
804.4883 M+H Antibiótico iso-FK-506 Streptomyces tsukubaensis39
C44H69NO12 1 Fujimicina Streptomyces tsukubaensis40 Antibiótico X14667A Streptomyces cinnamonensis41
628.3833 M+H Antibiótico SF 1902A2 Streptomyces hygroscopicus42 C30H53N5O9 13
611.3569 M+H Antibiótico S 541
(5-cetona) Streptomyces thermoarchaensis43 C36H50O8 2
523.3045 M+H Milbemicina α31 Streptomyces bingchenggensis44 C32H42O6 2
759.4460 M+H Streptotricina D Streptomyces sp. 45 C31H58N12O10
2
Isostreptotricina D Streptomyces qinlingensis46 655.3832 M+H Antibiótico UK 80695 Streptomyces hygroscopicus47 C38H54O9 1 787.4618 M+H NEAU 1069-3B Streptomyces avermitilis48 C44H66O12 1 919.5405 M+H Avermectina B2d Streptomyces avermitilis49 C50H78O15 1 504.3005 M+2H 11, 12-didehidroelaiophilina Streptomyces sp. 50 C54H86O17 0
460.2742 M+H Demetoxiisomigrastatina Streptomyces platensis51
C26H37NO6 10 8,9-Dihidrolactimidomicina Streptomyces amphibiosporus52 Lankaciclinol A Streptomyces rochei53
La MN2 también es una red interesante, pues incluye 17 nodos exclusivos al co-cultivo así
como 6 nodos producidos por Streptomyces sp. PNM-161a. Al encontrarse en la misma red, los
nodos exclusivos al co-cultivo podrían ser modificaciones estructurales de moléculas
producidas por la bacteria Streptomyces sp. PNM-161a. Por medio de las librerías del GNPS se
identificaron putativamente a las features de m/z 685.5091 y 641.4828 como los compuestos
undecaetilenglicoltridecil éter y decaetilenglicoltridecil éter con índice de similitud de 0.79 y
0.84, y errores de 2.7 y 6.6 ppm respectivamente. Los demás nodos fueron derreplicados
empleando el Diccionario de Productos Naturales y criterios quimiotaxonómicos y no se
encontraron coincidencias para ninguno de ellos.
Teniendo en cuenta todo esto el co-cultivo fue realizado en mayor volumen (380 cajas de 9cm
de diámetro). Se decidió mantener la escala de los cultivos con el fin de garantizar la
reproducibilidad, por esta razón, se incrementó el número de cajas más no la dimensión de las
mismas. El extracto orgánico del co-cultivo fue analizado por RMN 1H buscando las señales
exclusivas al co-cultivo encontradas en el screening inicial, sin embargo, éstas no se
encontraron. Todos los extractos (mono y co-cultivos, además del blanco de medio) fueron
sometidos a un fraccionamiento empleando un cartucho RP-18. A partir de cada extracto se
obtuvieron 5 fracciones, cada una de estas fracciones fue comparada con la correspondiente
para cada extracto. Se encontraron pequeños cambios por RMN en el co-cultivo en las
fracciones CC1.2 (30% MeOH) y CC1.5 (100% MeOH), señales adicionales en el co-cultivo que
no estaban en las otras fracciones. Las dos fracciones de interés se sometieron a una
separación por exclusión de tamaño empleando la resina Sephadex LH-20. A partir de este
fraccionamiento se obtuvieron los compuestos 4.1 y 4.2, ambos a partir de CC1.2, de los que
se resume su elucidación a continuación.
El compuesto 4.1 (5.2 mg) fue aislado como un sólido blanco. Al ser analizado por
espectrometría de masas se observó un ión de 327.1337 [M+H]+ que corresponde a la fórmula
molecular C18H18O4N2 (error 2.4 ppm). Se observaron los fragmentos 210.1 [M+H-C8H7N]+ y
190.1 [M+H-C7H6O3]+. Tiene máximos de absorbancia en UV en 220, 285 y 340nm. Su rotación
óptica fue de [α]D=-8.5 (c=0.14, MeOH).
El espectro de RMN 1H (Figura 4-5) mostró 8 protones aromáticos y 4 protones
correspondientes a una cadena alifática, dos de ellos son carbinólicos y diasterotópicos (δH
3.44 y 3.59), otro está unido a un carbono que soporta a un nitrógeno (δH 4.36), y el restante
es de protón bencílico desplazado a campo bajo (δH 4.20). Los espectros HSQC y HMBC (Figura
108 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
4-6 y Figura 4-7) mostraron 14 carbonos aromáticos de los cuales 7 son metinos y los demás
son cuaternarios, incluyendo uno de fenol (δC 150.83). También se observaron 3 carbonos
alifáticos, 2 de ellos unidos a heteroátomo en δC 66.35 (CH2-O) y δC 75.81 (CH-N), y un carbono
de ácido carboxílico (δC 171.35). Estas características concuerdan con una molécula que
contiene un anillo indólico, un anillo benceno y una cadena alifática de tres carbonos.
Moléculas similares ya han sido descritas para microorganismos54.
Figura 4-5: Espectro RMN 1H para el compuesto 4.1.
Capítulo 4 109
Figura 4-6: Espectro HSQC para el compuesto 4.1.
Figura 4-7: Espectro HMBC para el compuesto 4.1.
110 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
Figura 4-8: Espectro COSY para el compuesto 4.1.
El anillo indólico fue caracterizado mediante las correlaciones en COSY (Figura 4-8) de los
protones en δH 7.45 (d, J=7.95)/ δC 119.88 con δH 6.93 (td, J=7.5, 1.0)/ δC 119.56, que a su vez
acopla con δH 7.04 (td, J=7.5, 1.0)/ δC 122.32, que acopla con el doblete en δH 7.30 (d, J=7.5)/
δC 112.13. La señal singlete en δH 7.23 (s)/123.10 correlaciona en HMBC con los carbonos
aromáticos en δC 128.29 y 137.98, que a su vez muestran crosspeaks con los protones
aromáticos antes descritos. Todos estos datos permitieron sugerir la presencia de una
subunidad indol monosustituida.
Por otro lado, en COSY se observó un sistema de espín con los siguientes desplazamientos δH
6.66 (d, J=8.5)/ δC 117.89 y δH 7.33 (dd, J=8.5, 2.1)/ δC 136.22, mostrando una disposición orto
entre ellos; el último acopla con δH 7.93 (d, J=2.1)/ δC 132.91, cuya disposición es meta a juzgar
por el valor de J. Lo anterior sugiere la presencia de un benceno trisustituido. El protón aislado
en δH 7.93 correlaciona por HMBC con un carbono de ácido carboxílico δC 171.35 y un carbono
oxigenado de fenol δC 150.83 sugiriendo la presencia de un ácido en orto y un hidroxilo en meta
con respecto a este protón.
Así mismo, la molécula tiene una cadena alifática evidenciada por la presencia de cuatro
protones (dos de ellos diasterotópicos). El protón bencílico δH 4.20 (bd, J=7.7)/ δC 45.97
correlaciona en COSY al protón unido a carbono que soporta un nitrógeno δH 4.36 (ddd, J = 7.7,
Capítulo 4 111
6.9, 3.9)/ δC 75.81 que a su vez acopla con los protones carbinólicos diasterotópicos δH 3.44
(dd, J=11.1, 6.9)/ δC 66.35 y δH 3.59 (dd, J=11.1, 3.9)/ δC 66.35.
Para unir estos tres sistemas se usaron las correlaciones en HMBC del protón bencílico en δH
4.20 con los carbonos del indol en δC 117.79, 123.10, y 128.29; con los carbonos aromáticos
del anillo de benceno en δC 131.15, 132.91, y 136.22; y también con los carbonos alifáticos en
δC 66.35, y 75.81.
Las correlaciones en HMBC y COSY se pueden observar en la Figura 4-9. Todo lo anterior
permitió identificar a 4.1 como el ácido 5-(2-amino-3-hidroxi-1-(1H-indol-3-il)propil)-2-
hidroxibenzoico. A juzgar por la búsqueda en SciFinder, este compuesto no ha sido reportado
previamente, y en esta tesis se reporta por primera vez. Los datos de RMN están asignados
para el compuesto 4.1. en la Tabla 4-3.
Figura 4-9: Correlaciones observadas para el Compuesto 4.1 en los experimentos bidimensionales. El COSY se visualiza con enlaces con negrita y el HMBC con flechas azules.
112 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
Tabla 4-3: Datos de RMN 1H (400MHz) y RMN 13C (100MHz) del compuesto 4.1 medidos en metanol-d4
Posición 𝛿𝐶 (ppm) 𝛿𝐻 (ppm) (m., J en
Hz) HMBC
COOH 171.35 (C) - - 1 (C) - - 2 150.83 (C) - -
3 117.89 (CH) 6.66
(d, J= 8.5) 5
4 136.22 (CH) 7.33
(dd, J=8.5, 2.1) 2, 6, 1’
5 131.15 (C) - -
6 132.91 (CH) 7.93
(d, J=2.1) 2, 4, 1’, COOH
1´ 45.97 (CH) 4.20
(bd, J=7,7) 4, 5, 6, 2’, 3’, 2’’, 3’’, 3a’’
2´ 75.81 (CH) 4.36
(ddd, J = 7.7, 6.9, 3.9)
1’, 3’
3´ 66.35 (CH2)
3.44 (dd, J=11.1, 6.9)
1’, 2’
3.59 (dd, J=11.1, 3.9)
1’
2´´ 123.10 (CH) 7.23 (s) 1’ 3’’ 3a’’, 7a'’ 3´´ 117.79 (C) - -
3a´´ 128.29 (C) - -
4´´ 119.88 (CH) 7.45
(d, J=7.5) 3’’, 3a’’, 6’’, 7a’’
5´´ 119.56 (CH) 6.93
(td, J=7.5, 1.0) 3a’’, 7’’
6´´ 122.32 (CH) 7.04
(td, J=7.5, 1.0) 5’’, 7a'’
7´´ 112.13 (CH) 7.30
(bd, J=7.5) 3a’’
7a´´ 137.98 (C) - -
Capítulo 4 113
Figura 4-10: Compuesto 4.1, con su numeración de acuerdo al nombre sistemático
La estructura del compuesto 4.1, contiene dos carbonos asimétricos (1’y 2’). El carbono C-1’
está enlazado a dos sistemas aromáticos que dan lugar a efectos Cotton, por lo que se midió el
espectro de dicroísmo circular que se muestra la Figura 4-11.
Figura 4-11. Espectro de dicroísmo circular del compuesto 4.1.
Para determinar la estereoquímica de estos centros se recomienda aplicar el método
desarrollado por Riguera y colaboradores para 1,2 aminoalcoholes55, que usa como agente
quiral la Boc-fenilglicina (BPG). Para el centro quiral C-1’ se podría usar el método Exciton
Chirality56, que es bastante empleado en la determinación de la configuración absoluta de
productos naturales. El fundamento de este método consiste en la interacción a través del
espacio de los momentos de transición eléctrica entre dos cromóforos de un sistema quiral.
114 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
Esta interacción provoca una división de los estados excitados cuyo resultado se observa en el
espectro de UV-Vis y de CD57.
Se han aislado numerosos compuestos con una unidad indol en su estructura a partir de
microorganismos recuperados de ambientes marinos58. El compuesto de estructura más
similar al compuesto 4.1 fue reportado por Chen y colaboradores54 a partir de una cepa de
Escherichia coli, que era un clon metagenómico de una muestra de sedimento marino. El
compuesto reportado por estos autores presentó actividad analgésica54.
El compuesto 4.2 (20.7mg) fue aislado como un sólido amarillo. Al ser analizado por
espectrometría de masas de impacto electrónico fue observado un ión de 137.1 congruente
con una fórmula C7H8N2O2. Se observaron los fragmentos m/z 119.1 [M-NH2]+, 92.0 y 65
característicos del ácido antranílico59. En el espectro de RMN 1H se observan protones para
anillo aromático con los desplazamientos en 𝛿𝐻 7.80 (dd; J=8.0, 1.5; H-6), 7.22 (ddd; J= 8.5, 7.2,
1.5; H-4), 6.72 (dd; J=8.5, 1.0; H-3), y 6.56 (ddd; J= 8.0, 7.2, 1.0; H-5). Estos datos concuerdan
con los reportados previamente en la literatura para el ácido antranílico (Figura 4-12) 59.
Figura 4-12. Estructura compuesto 4.2
La producción de ácido antranílico y derivados del mismo ha sido reportado en varias cepas
del género Streptomyces sp. 59–61. Se han aislado derivados del ácido antranílico a partir de co-
cultivos entre hongos y bacterias. 62,63 El orto-aminobenzoato (antranilato) junto a los
isómeros meta y para del aminobenzoato son bloques de construcción para una gran cantidad
de compuestos microbianos64. El antranilato se deriva del metabolito central de la ruta del
shikimato, el corismato y participa en la biosíntesis de múltiples heterociclos, principalmente
con su rol en la formación del indol en la biosíntesis del triptófano. El antranilato también
puede convertirse a benzodiazepinonas, fumiquinazolinas, quinoxalinas, fenoxazinas,
Capítulo 4 115
quinolonas y fenazinas. Los tres isómeros pueden ser usados como unidades iniciadoras de
cadena en la formación de péptidos no ribosomales e híbridos de péptidos no ribosomales y
policétidos. En muchos casos, el grupo amino puede actuar como un nucleófilo interno para
generar lactamas cíclimas64.
Se hizo la búsqueda de las señales en RMN 1H de estos dos compuestos en las fracciones de
cada uno de los monocultivos y del medio de cultivo. Se determinó que el compuesto 4.2. era
también producido en el monocultivo de Streptomyces sp. PNM-161a pero en el caso del
compuesto 4.1 la complejidad de las fracciones no permitió saberlo. Por esta razón, se
evaluaron por LC-MS las fracciones eluídas en el cartucho RP-18 con 30% MeOH para el blanco
de medio, los monocultivos de cada una de las bacterias y el co-cultivo. De esta manera, se
determinó que los compuestos 4.1 y 4.2 son producidos por Streptomyces sp. PNM-161a en
monocultivo. Al evaluar el área de los picos por análisis de HPLC-DAD no se observó una
variación significativa de las mismas, lo que indicaría que el co-cultivo no tuvo incidencia en la
producción de los mismos.
Como se puede observar, las señales asociadas al co-cultivo que se detectaron en el screening
inicial no pudieron aislarse cuando el co-cultivo fue cultivado en mayor volumen. Al comparar
los espectros RMN1H de los extractos orgánicos del co-cultivo obtenidos en el Capítulo 3 con el
obtenido en este Capítulo se pudo observar que eran significativamente diferentes, lo que
indicaría la baja reproducibilidad del cultivo. Además, cuando se hizo la búsqueda de los
valores m/z de los compuestos aislados en las redes moleculares construidas a partir de los
extractos obtenidos en el Capítulo 3, solo se encontró la del Compuesto 4.1 en un self-loop, que
solo está asociado al monocultivo de Streptomyces sp. PNM-161a sugiriendo que en el co-
cultivo inicial no era producido este compuesto. Además, el hecho de que haga parte de un self-
loop sugiere que no hay análogos de esta molécula nueva.
4.3.2 Co-cultivo entre el hongo Purpureocillium sp. PNM-67 y la bacteria con ácido micólico Rhodococcus sp. RKHC-26
Este co-cultivo fue seleccionado por los cambios en RMN 1H de su extracto orgánico sumado a
un cambio fenotípico (pigmentación rojiza) debido a la interacción. Esta pareja es muy
interesante porque no hay antecedentes de un co-cultivo que involucre un hongo con una
bacteria con ácido micólico. Como se ha mencionado anteriormente el efecto de estas bacterias
solo se ha reportado sobre Actinobacterias1.
116 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
Si bien los ensayos preliminares mostraron diferencias claras por RMN (Capítulo 3) entre el
co-cultivo y los monocultivos, también en el apartado anterior se evidenció la poca
reproducibilidad de los co-cultivos por contacto. Por esto se decidió hacer un análisis inicial
por LC-MS para evaluar los cambios en la producción metabólica debidos a la interacción.
El co-cultivo, los monocultivos y el blanco de medio (PDA) fueron realizados por triplicado y
sus extractos orgánicos fueron obtenidos de manera independiente y evaluados por LC-MS.
Los resultados obtenidos fueron procesados por MZmine lo que permitió obtener una matriz
de features donde se eliminaron aquellas presentes en el blanco de medio.
Como primer paso se generó un PCA utilizando el software SIMCA con el fin observar la
distribución de las muestras. Este PCA se puede visualizar en la Figura 4-13.
Figura 4-13: Análisis PCA del perfilado en LC-MS del co-cultivo entre Purpureocillium sp. PNM-67 y Rhodococcus sp. RKHC-26.
Este PCA permite observar tres agrupaciones correspondientes a los dos monocultivos y al co-
cultivo. En efecto, el co-cultivo se separa de los monocultivos, lo que muestra diferenciación en
la producción metabólica que es lo que se busca con esta estrategia. Las réplicas de cada uno
de los monocultivos muestran poca dispersión lo que indica que la producción metabólica es
reproducible. Por otro lado, las réplicas del co-cultivo presentan una alta dispersión lo que
sugiere una baja reproducibilidad en la producción metabólica, a pesar de que las tres réplicas
Capítulo 4 117
fueron cultivadas y procesadas del mismo modo manteniendo parámetros como el tamaño del
inóculo, la temperatura, condiciones de luz y tiempo de fermentación iguales.
Con el fin de determinar aquellas features que diferencian al co-cultivo de los monocultivos se
realizó un OPLS-DA (R2=0.737, Q2=0.883) que se muestra en la Figura 4-14.
Figura 4-14: Co-cultivo entre Purpureocillium sp. PNM-67 y Rhodococcus sp. RKHC-26: a) OPLS-DA, b) S-plot, resaltadas las VIPs
El modelo fue validado por un test de permutaciones, donde el intercepto en Y del Q2 es una
medida del sobreajuste (overfitting). Este intercepto debe tener un valor menor a 0 para que
el modelo sea válido.65 En este estudio el valor del Q2Y fue de -0.21.
Para visualizar aquellos picos que inciden en la separación entre monocultivos y co-cultivo en
el OPLS-DA se generó un S-plot. Esta gráfica permite visualizar aquellas features que están
altamente correlacionados con la separación entre co-cultivo y monocultivos. Estas features
se destacan por medio de un óvalo naranja en la Figura 4-14. La identificación putativa así
como información sobre su producción se consigna en la Tabla 4-4.
118 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
Es importante notar que al analizar las variables importantes en la proyección (VIPs), 4 de
estas 5 se encuentran presentes tanto en el monocultivo del hongo como en el co-cultivo. La
razón de que hayan sido destacados en el análisis multivariado se debe al aumento en su
concentración en el co-cultivo. Al revisar el promedio de las áreas de los features obtenidas por
el procesamiento listado en la Tabla 4-1 se encontró que en el caso de los iones identificados
putativamente como la Leucinostatina A y la Leucinostatina B, en el co-cultivo su
concentración es aproximadamente 37 veces la encontrada en el monocultivo del hongo
Purpureocillium sp.
Con el fin de complementar la información obtenida con el análisis multivariado, se realizó la
construcción de las redes empleando el análisis “Feature-based molecular networking”. Para
la construcción de estas redes se emplearon solo aquellas features que se encontraban en al
menos dos de las tres réplicas para cada uno de los cultivos, puesto que se evidenció que una
de las réplicas del co-cultivo presentaba una serie de features exclusivas para ella,
evidenciando una vez más la falta de reproducibilidad de estos co-cultivos por contacto.
Las redes obtenidas se pueden visualizar en la Figura 4-15. Todos los nodos de color morado
hacen referencia a features producidas por el hongo Purpureocillium sp. PNM-67, mientras que
los nodos de color fucsia hacen referencia a los producidos por la bacteria Rhodococcus sp.
RKHC-26. Nodos circulares hacen referencia a features producidas tanto en monocultivo como
en co-cultivo, mientras que nodos en forma rectangular hacen referencia a features producidas
exclusivamente en los monocultivos. Los nodos de color blanco hacen referencia a un origen
microbiano no específico, es decir, todos aquellas features que se encuentran en los dos
monocultivos, y que también pueden encontrarse en el co-cultivo. De color verde se visualizan
las features producidas exclusivamente en el co-cultivo.
De manera general se observan 2 tipos de redes. Unas que involucran nodos de los
monocultivos y de los co-cultivos (por ejemplo, MN1 y MN2) y otras con nodos producidos en
los monocultivos. De los 184 nodos que se observan en la figura: 91 corresponden a features
producidas por el hongo Purpureocillium sp. PNM-67 (10 exclusivos al monocultivo), 6
corresponden a features producidas por la bacteria Rhodococcus sp. RKHC-26 (todos
exclusivos al monocultivo) y 81 corresponden a features exclusivas al co-cultivo. Estos últimos
evidencian los cambios en la producción metabólica de los microorganismos debidos a la
Capítulo 4 119
interacción. Adicionalmente, y como se deduce de la Tabla 4-4 solamente la VIP del OPLS-DA
con m/z 386.367 y tR 20.320 es una de las 81 features exclusivas al co-cultivo.
Mientras que gran parte de los metabolitos producidos por el hongo Purpureocillium sp. PNM-
67 en monocultivo son también producidos en co-cultivo (nodos circulares morados), en el
caso de la bacteria Rhodococcus sp. RKHC-26 la mayor parte de los metabolitos producidos en
monocultivo dejan de producirse en la interacción (nodos fucsia rectangulares).
120 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
Figura 4-15: Redes moleculares de los monocultivos del hongo Purpureocillium sp. PNM-67 y la bacteria Rhodococcus sp. RKHC-26 y su co-cultivo.
Capítulo 4 121
Las redes de mayor interés son la MN1 y la MN2 pues incluyen nodos asociados al monocultivo
del hongo (morado) y nodos exclusivos del co-cultivo, lo que puede indicar que estos últimos
son modificaciones estructurales sobre los primeros.
Con el ánimo de conocer su identidad se realizó la derreplicación empleando las librerías del
GNPS, y complementando con el Dictionary of Natural Products. De esta manera, se pudo
identificar a la red MN2 como la familia molecular de las leucinostatinas. Si bien a partir de la
derreplicación en la plataforma del GNPS sólo se identificaron las leucinostatinas A y B,
mediante derreplicación basada en el m/z observado se pudieron identificar putativamente
algunas otras leucinostatinas (A2, B2, L y K), como se puede observar en la Figura 4-16. Tres
features no pudieron ser atribuidas a ninguna de las leucinostatinas reportadas previamente
en la literatura, pero deben mantener una similitud estructural por hacer parte de la misma
red, por lo que se sugiere que son análogos de ellas.
Las leucinostatinas son péptidos lineales previamente descritos en Purpureocillium
lilacinum66, para la leucinostatina A y B se ha determinado que poseen actividad
antimicrobiana y citotóxica67,68. En estudios previos realizados en el grupo de investigación, el
hongo Purpureocillium sp. PNM-67 fue cultivado en caldo de papa, y por análisis por LC-MS/MS
se identificaron a las leucinostatinas A, B, H, K y D69. Así mismo, en ese trabajo se aislaron las
lilacininas A a D, moléculas estructuralmente relacionadas con las leucinostatinas. En las redes
construidas en este capítulo no se encontraron ninguno de estos 4 compuestos.
Para los demás features se realizó una búsqueda en el Dictionary of Natural Products versión
27.2, a partir de la búsqueda de la masa exacta con un rango de error máximo de 15ppm. Esta
búsqueda se filtró teniendo en cuenta los géneros a los que pertenecían los aislamientos y
géneros filogenéticamente relacionados. Las coincidencias encontradas a partir de esta
búsqueda se encuentran también en la Tabla 4-4.
Figura 4-16. Leucinostatinas identificadas en MN2.
Tabla 4-4: Iones relevantes en las redes moleculares. La identificación integró librerías del GNPS y el DNP. En negrita se observan los iones identificados como VIPs del OPLS-DA. Para los compuestos identificados por el GNPS, en paréntesis se observa el valor de similitud en las fragmentaciones MS/MS. Se incluye fuente biológica donde se describe los microorganismos de donde han sido aislados los compuestos identificados putativamente.
m/z observado (Aducto)
MN (Origen) Identificación putativa Fuente biológica Fórmula
molecular Error (ppm)
368.3561 [M+H]+
MN1 (Monocultivo de
Purpureocillium sp. PNM-67 y co-cultivo)
No identificado - - -
386.3669 [M+H]+
MN1 (Co-cultivo)
No identificado - - -
476.399 [M+H]+
MN1 (Monocultivo de
Purpureocillium sp. PNM-67 y co-cultivo)
No identificado - - -
602.923 [M+2H]2+
MN2 (Monocultivo de
Purpureocillium sp. PNM-67 y co-cultivo)
Leucinostatina B (GNPS, 0.73)
Purpureocillium lilacinum66
C61H109N11O13 9
609.931 [M+2H]2+
MN2 (Monocultivo de
Purpureocillium sp. PNM-67 y co-cultivo)
Leucinostatina A (GNPS, 0.73)
Purpureocillium lilacinum66
C62H111N11O13 9
318.303 [M+H]+
MN3 (Monocultivo de
Purpureocillium sp. PNM-67 y co-cultivo)
Fitoesfingosina (GNPS, 0.84)
Producido en múltiples hongos
C18H39NO3 11
617.9289 [M+2H]2+
MN2 (Co-cultivo)
Leucinostatina K Purpureocillium
lilacinum66 C62H111N11O14 10
595.9152 [M+2H]2+
MN2 (Co-cultivo)
Leucinostatina L Purpureocillium
lilacinum66 C60H107N11O13 9
124 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
m/z observado (Aducto)
MN (Origen) Identificación putativa Fuente biológica Fórmula
molecular Error (ppm)
600.9259 [M+2H]2+
MN2 (Co-cultivo)
Leucinostatina A2 Purpureocillium
lilacinum66 C62H109N11O12 10
593.9181 [M+2H]2+
MN2 (Co-cultivo)
Leucinostatina B2 Purpureocillium
lilacinum66 C61H107N11O12 10
593.9181 [M+2H]2+
MN2 (Co-cultivo)
Leucinostatina o similar - - -
616.9386 [M+2H]2+
MN2 (Co-cultivo)
Leucinostatina o similar - - -
631.9444 [M+2H]2+
MN2 (Co-cultivo)
Leucinostatina o similar - - -
237.1127 [M+H]+
Self-loop (Co-cultivo)
Communol E Penicillium commune70
C13H16O4 0
Redoxcitrinina Penicillium citrinum71
C13H16O4 0
239.1282 [M+H]+
Self-loop (Co-cultivo)
Paecilopirona A Purpureocillium
lilacinum72 C13H18O4 1
6-hidroxi-1,8-dimetoxi-3,5-dimetilisocromano
Penicillium expansum73
C13H18O4 1
255.1232 [M+H]+
Self-loop (Co-cultivo)
Striatisporina A Penicillium
striatisporum74 C13H18O5 0
314.3449 [M+H]+
Self-loop (Co-cultivo)
Paecilaminol Paecilomyces sp.75 C20H43NO 8
317.1391 [M+H]+
Self-loop (Monocultivo de
Purpureocillium sp. PNM-67 y co-cultivo)
Chermesinona B Penicillium
chermesinum76 C18H20O5 1
393.3189 [M+H]+
MN1 (Monocultivo de
Purpureocillium sp. PNM-67 y co-cultivo)
Citreoantrasteroide B Penicillium citreo-
viride77 C28H40O 8
Capítulo 4 125
m/z observado (Aducto)
MN (Origen) Identificación putativa Fuente biológica Fórmula
molecular Error (ppm)
409.3138 [M+H]+
MN1 (Co-cultivo)
Citreoantrasteroide A Penicillium citreo-
viride77 C28H40O2 8
427.3245 [M+H]+
Self-loop (Monocultivo de
Purpureocillium sp. PNM-67 y co-cultivo)
Secocitreoantrasteroide Penicillium citreo-
viride77 C28H42O3 8
443.3194 [M+H]+
Self-loop (Monocultivo de
Purpureocillium sp. PNM-67) Paxisterol Penicillium sp.78 C28H42O4 8
459.3149 [M+H]+
Self-loop (Monocultivo de
Purpureocillium sp. PNM-67) Chaxina B Penicillium sp.79 C28H42O5 8
519.1935 [M+H]+
Self-loop (Co-cultivo)
Rubratoxina B Penicillium rubrum80 C26H30O11 13
Triptoquialanina A Penicillium digitatum81
C27H26N4O7 11
754.5896 [M+H]+
Self-loop (Monocultivo de
Purpureocillium sp. PNM-67 y co-cultivo)
Asperamida B Penicillium commune82
C43H79NO9 8
Chrysogesido D Penicillium
chrysogenum83 C43H79NO9 8
Cerebrósido C Penicillium
funiculosum84 C43H79NO9 8
Este co-cultivo muestra resultados promisorios que sugieren su evaluación en mayor volumen.
Esto se evidencia en su análisis tanto por RMN (Capítulo 3) como por LC-MS como se observa
en este capítulo. Además, este es el primer estudio químico que involucra un hongo y una
bacteria con ácido micólico.
Para su evaluación en mayor volumen sería necesario primero mejorar los parámetros de
fermentación que incrementen la reproducibilidad del cultivo. Si bien para la realización de
co-cultivos por contacto se estableció una metodología que pretendía evitar este problema, los
resultados para los dos co-cultivos mencionados en este capítulo evidencian que la
reproducibilidad de esta metodología es baja.
Teniendo en cuenta que en ambos co-cultivos en medio sólido los dos microorganismos son
capaces de coexistir estando en contacto desde el comienzo del proceso de fermentación, se
sugiere evaluar estas dos interacciones en medio líquido. En este caso la agitación garantizaría
una distribución más homogénea de los microorganismos en comparación con lo que ocurre
en los ensayos en medio sólido. Este co-cultivo fue evaluado en medio líquido en 15mL en el
Capítulo 2, pero no se observaron cambios en la producción metabólica, esto pudo deberse a
que fue crecido en un medio de cultivo diferente (LB suplementado con glucosa) dónde la
interacción puede ser totalmente diferente, y a que la producción metabólica solo fue seguida
por HPLC-DAD, técnica que en el co-cultivo crecido en medio PDA sólido no permitió observar
los cambios debidos al co-cultivo.
4.4 Conclusiones
Se evaluaron los cambios en la producción metabólica empleando LC-MS/MS para el co-cultivo
entre la bacteria Streptomyces sp. PNM-161a y la bacteria con ácido micólico Rhodococcus sp.
RKHC-26, donde se encontró que en efecto la interacción induce la producción de metabolitos
no observados en los monocultivos. Se construyeron redes moleculares que evidenciaron que
gran parte de las features inducidas se encuentran en la misma red molecular, se realizó la
derreplicación de estos nodos empleando el Diccionario de Productos Naturales y se pudieron
identificar putativamente 12 features, en su mayoría compuestos con actividad antibiótica de
tipo macrólido y péptido. Este co-cultivo fue realizado en mayor volumen, a partir del cual
fueron aislados el ácido 5-(2-amino-3-hidroxi-1-(1H-indol-3-il)propil)-2-hidroxibenzoico
(4.1) y el ácido antranílico (4.2.). Estos compuestos son producidos por Streptomyces sp. PNM-
161a en monocultivo por lo que su producción no es exclusiva del co-cultivo. El primer
Capítulo 4 127
compuesto no ha sido reportado previamente, mientras el segundo es un bloque de
construcción ampliamente difundido en biosíntesis de microorganismos.
El co-cultivo entre el hongo Purpureocillium sp. PNM-67 y la bacteria con ácido micólico
Rhodococcus sp. RKHC-26 en medio PDA fue analizado empleando LC-MS/MS. Para evaluar los
cambios en la producción metabólica se emplearon técnicas de análisis multivariado y
construcción de redes moleculares. Estas últimas permitieron identificar la red de las
leucinostatinas, y mostraron que el co-cultivo incrementó la producción de Leucinostatina A y
Leucinostatina B, e indujo la producción de las leucinostatinas K, L, A2 y B2. A partir del
Diccionario de Productos Naturales se identificaron putativamente otras 12 features, del tipo
esteroide, derivado de quinazolina, esfingolípido, cerebrósido, fenólicos, entre otros. Este co-
cultivo constituye el primer reporte de un co-cultivo exitoso entre un hongo y una bacteria con
ácido micólico.
Se observó en general que es necesario el mejoramiento de las condiciones experimentales
para el establecimiento de los co-cultivos por contacto con el fin de mejorar la reproducibilidad
de los experimentos.
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5. Capítulo 5: Análisis de la producción metabólica de interacciones a distancia entre el hongo Purpureocillium sp. PNM.67 y bacterias del género Streptomyces y Paenibacillus
Resumen
El co-cultivo de microorganismos ha demostrado ser en los últimos años una estrategia
promisoria para la inducción de metabolitos especializados. Se han evaluado interacciones
bacteria-bacteria, hongo-hongo y bacteria-hongo, siendo este último sistema uno de los que ha
generado mayor cantidad de resultados exitosos.
En el capítulo 3 se hizo un screening de interacciones binarias en medio sólido empleando un
set de 15 microorganismos. Este screening permitió priorizar 7 parejas que tenían la capacidad
de inducir cambios en la producción metabólica. En este capítulo se realizó el análisis de los
cambios en la producción metabólica de 5 de estos 7 co-cultivos, que se caracterizaban por ser
interacciones bacteria-hongo mediadas por compuestos difusibles.
Se estudió el co-cultivo entre el hongo Purpureocillium sp. PNM-67 y la bacteria Paenibacillus
sp. PNM-123 utilizando como medio de cultivo PDA. Se cultivaron 450 cajas de Petri
empleando la estrategia a distancia. A partir del extracto orgánico del co-cultivo se aislaron los
compuestos tipo alcaloide withasomnina de nombres 5,6-dihidro-2-(sec-butil)-4H-
pirrolo[1,2b]pirazol (5.1) y 5,6-dihidro-2-isopropil-4H- pirrolo[1,2b]pirazol (5.2), siendo el
primero por primera vez reportado en esta tesis. Estos compuestos son inducidos por el co-
cultivo y probablemente producidos por la bacteria Paenibacillus sp. PNM-123 teniendo en
cuenta el gradiente de difusión de los mismos.
136 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
También se estudió el co-cultivo entre el hongo Purpureocillium sp. PNM-67 y la bacteria
Streptomyces sp. IBUN-5.1. usando como medio de cultivo ISP3. El co-cultivo de estos dos
microorganismos se hizo con la estrategia a distancia en 500 cajas de Petri. A partir del
extracto orgánico del co-cultivo se aisló el compuesto alternariol (5.3), una reconocida
micotoxina. Este compuesto es producido por el hongo tanto en esta interacción como en sus
interacciones con las bacterias Paenibacillus sp. PNM-115, Paenibacillus sp. PNM-123 y
Paenibacillus sp. PNM-210. Los extractos orgánicos de la zona de la interacción para estos 4
co-cultivos fueron analizados por LC/MS-MS. A partir de estos resultados se construyeron
redes moleculares en la plataforma del Global Natural Products Social Molecular Networking
(GNPS). Según estos análisis el co-cultivo del hongo con la bacteria Paenibacillus sp. PNM-115
es el más prometedor para su evaluación en mayor volumen pues es el que genera una mayor
cantidad de compuestos asociados exclusivamente a su co-cultivo. Integrando la base de datos
del GNPS y el Dictionary of Natural Products se realizó la derreplicación de los resultados
obtenidos, identificándose de manera putativa 18 compuestos del tipo derivados de ácidos
grasos, leucinostatinas, esteroides y péptidos.
Estos resultados demuestran la capacidad del co-cultivo de inducir compuestos de manera
diferencial a los producidos en los monocultivos de los microorganismos estudiados.
5.1 Introducción
Si bien, los microorganismos siguen siendo una fuente importante de compuestos con
actividad biológica, la tasa de redescubrimiento de los mismos es cada vez mayor.1 Estudios de
secuenciación de bacterias y hongos han demostrado que el potencial biosintético de estos
organismos está muy lejos de ser totalmente aprovechado.2 Por ejemplo, en Aspergillus niger
menos del 30% de los clústers de genes totales son transcritos en las condiciones estándar de
crecimiento en laboratorio.3
Teniendo en cuenta este escenario, se han desarrollado diferentes métodos para inducir,
activar y regular clústers de genes crípticos y silenciados.4 Uno de estos métodos es el co-
cultivo de microorganismos, que consiste en el cultivo de dos o más microorganismos en un
mismo ambiente confinado.5 Uno de los primeros ejemplos exitosos del uso de este método fue
reportado por Cueto y colaboradores en el 20016 y condujo al aislamiento de la pestalona, una
Capítulo 5 137
benzofenona con actividad antibiótica, a partir de la interacción entre el hongo Pestalotia sp. y
la bacteria Thalassospira sp..
Actualmente, existen múltiples trabajos sobre co-cultivo empleando sistemas bacteria-
bacteria7, hongo-hongo8 y bacteria-hongo9. Sistemas bacteria-bacteria han sido menos
estudiados que los sistemas bacteria-hongo y hongo-hongo. En parte, esto puede ser atribuido
a los desafíos que se han observado a través del tiempo como la baja sensibilidad de los
métodos para detectar metabolitos, la falta de reproducibilidad y la dificultad para escalar el
proceso.10 Los avances tecnológicos han solucionado parcialmente estos problemas; así,
resultados recientes obtenidos por técnicas como la espectrometría de masas han ayudado en
la comprensión de este tipo de interacciones.11
El grado de contacto entre los microorganismos que hacen parte del co-cultivo es relevante
pues los efectos pueden ser el resultado ya sea de una interacción debida a compuestos
difusibles o a una interacción debida a contacto célula-célula.12 En cuanto al medio de cultivo,
se pueden emplear medios sólidos o líquidos. El medio sólido ha sido empleado pues a
diferencia del medio líquido permite visualizar con facilidad patrones de interacción entre los
microorganismos; así mismo, facilita la ubicación espacial de los metabolitos13, lo que puede
permitir la identificación del organismo responsable de la producción de los compuestos
inducidos por la interacción.
Para el seguimiento de la inducción de metabolitos en los co-cultivos se ha empleado CCD14,
HPLC-UV15; RMN16; GC-MS17 y HPLC-MS18, así mismo, el uso de MS/MS permite generar mayor
información de los metabolitos presentes.5 Las técnicas acopladas a espectrometría de masas
han sido empleadas con frecuencia por su sensibilidad, poder de resolución y su capacidad de
proveer información estructural de los metabolitos inducidos.19 LC-MS tiene la ventaja de
permitir analizar un rango muy amplio de metabolitos secundarios, a diferencia de GC-MS que
requiere que los compuestos sean volátiles, por lo que su uso puede implicar pasos adicionales
de derivatización.19
El GNPS (Global Natural Products Social Molecular Networking) es una plataforma de acceso
libre para el almacenamiento y análisis de espectros MS/MS. El GNPS permite la construcción
de redes moleculares, que consiste en una estrategia computacional que permite la
visualización e interpretación del espacio químico presente en los experimentos de MS.20
Espectros con el mismo ion precursor y que tienen un espectro MS/MS similar son unidos en
138 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
un único espectro consenso. Estos espectros consenso son simplificados como vectores los
cuales son utilizados para calcular un valor de coseno entre cada posible pareja de espectros
consenso, lo que permite la determinación del grado de similitud espectral entre ellos21,22. El
resultado de este proceso puede ser visualizado como una gráfica dónde cada nodo es un
espectro MS/MS consenso y las cuñas entre los nodos indican el grado de similitud entre los
espectros consenso.23
De este modo, las redes moleculares permiten la visualización organizada de moléculas
relacionadas estructuralmente, lo que unido a la derreplicación basada en la búsqueda en las
librerías espectrales contenidas en el GNPS, hacen a este método una herramienta muy útil
para el análisis de resultados de espectrometría de masas en tándem.
Recientemente, en el GNPS se han incluido nuevas estrategias mejoradas que pretenden
superar algunas de las limitaciones de la construcción de redes moleculares. Una de ellas es el
Feature-based Molecular Networking24. En esta estrategia, previo a la construcción de redes
moleculares, los datos son procesados en MZMine25, donde es generada una lista de features
alineada que posteriormente es subida a la plataforma del GNPS para la construcción de redes.
Entre las ventajas que incluye esta metodología se encuentra la inclusión de información
cuantitativa, la discriminación de isómeros por tiempo de retención y la reducción de
moléculas redundantes.
En este capítulo se buscó evaluar la producción metabólica de cinco de los siete co-cultivos
promisorios seleccionados en el Capítulo 3. Estos 5 co-cultivos consistían en interacciones a
distancia entre el hongo Purpureocillium sp. PNM-67 y 5 bacterias (dos del género
Streptomyces sp. y tres del género Paenibacillus). Dos parejas fueron realizadas en mayor
volumen y empleando RMN y HPLC-DAD se aislaron compuestos inducidos por el co-cultivo.
Para las otras parejas se realizó un análisis por LC/MS-MS que permitió la construcción de
redes moleculares y la derreplicación empleando diferentes bases de datos.
5.2 Materiales y métodos
5.2.1 General
Para los medios de cultivo se empleó agar bacteriológico (Scharlau), agar papa dextrosa
(Scharlau), sulfato de hierro heptahidratado (Loba Chemie), cloruro de manganeso
Capítulo 5 139
tetrahidratado (Loba Chemie), sulfato de zinc heptahidratado (Loba Chemie) y avena
comercial (Don Pancho). La solución de trazas se preparó con la siguiente composición por
litro: sulfato de hierro heptahidratado 0,1g, cloruro de manganeso tetrahidratado 0,1g y
sulfato de zinc heptahidratado 0,1g.
Para las extracciones se empleó acetato de etilo grado analítico (PanReac AppliChem). Para las
separaciones se emplearon como solventes metanol grado HPLC (LiChrosolv), acetato de etilo
grado analítico (PanReac AppliChem), grado analítico (PanReac AppliChem) y agua destilada.
Para el fraccionamiento se emplearon cartuchos Hypersep C18 (Thermo Scientific) de 1000mg
y cartuchos Hypersep Diol (Thermo Scientific) de 1000mg. Como soporte cromatográfico para
columna abierta se empleó resina Sephadex LH-20 (Pharmacia Biotech).
Para cromatografía líquida en escala preparativa se empleó un equipo HPLC Thermo Dionex
Ultimate 3000 (Germering) con detector DAD. Se emplearon como solventes acetonitrilo grado
HPLC (Honeywell), metanol grado HPLC (LiChrosolv) y agua desionizada previamente filtrada
en un equipo de filtración Millipore Simplicity y luego filtrada nuevamente a través de una
membrana de nylon de tamaño de poro de 0.22 μm (CNW Technologies).
Los análisis de resonancia magnética nuclear se realizaron en un Bruker Avance 400. Se
emplearon como solventes CDCl3 con grado de deuteración 99.8 % (Merck, Alemania) y
metanol-d4 con grado de deuteración 99.8% (Merck, Alemania).
Para la determinación de la rotación óptica se utilizó un polarímetro ADP440+ (Bellingham
Stanley).
5.2.2 Cultivos en mayor volumen
Todos los cultivos se realizaron en cajas de Petri de 90 mm*15 mm. En el caso de las bacterias
el inóculo era de 105 UFC por caja, y en el caso del hongo era de 105 conidios por caja.
Co-cultivo Purpureocillium sp. PNM-67 vs. Paenibacillus sp. PNM-123: Se realizó en medio
sólido empleando como medio de cultivo PDA (composición por litro: peptona de papa 4g,
glucosa 20g, y agar 15g). El volumen de medio por caja fue de 30mL. Se realizaron 450 cajas
del co-cultivo donde la bacteria fue inoculada en el centro de la caja en una franja de 1 cm de
ancho, mientras el hongo fue inoculado en los extremos opuestos de la caja (Figura 3.3a,
140 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
Capítulo 3). Adicionalmente, se realizaron 150 cajas de cada uno de los monocultivos y 90 cajas
del blanco de medio PDA. Las cajas fueron incubadas a 30ºC por 10 días.
Co-cultivo Purpureocillium sp. PNM-67 vs. Streptomyces sp. IBUN-5.1.: Este co-cultivo se
realizó en medio sólido empleando como medio de cultivo ISP3 (composición por litro: avena
20g, agar 18g, y solución de trazas 1mL). El volumen de medio por caja fue de 30mL. Se
realizaron 500 cajas del co-cultivo donde la bacteria fue inoculada en el centro de la caja en
una franja de 1 cm de ancho, mientras el hongo fue inoculado en los extremos opuestos de la
caja (Figura 3-3a, Capítulo 3). Se realizaron 100 cajas de cada uno de los monocultivos y 90 de
blanco de medio. Las cajas fueron incubadas a 30ºC por 10 días.
5.2.3 Extracción
Para cada uno de los co-cultivos se delimitaron tres zonas diferentes: una para la zona dónde
crece cada microorganismo y la tercera para la zona de interacción, y luego cada zona se cortó
en trozos por aparte. Cada muestra fue liofilizada empleando un liofilizador LABCONCO
(FreeZone 4.5). En el caso de los monocultivos y del blanco de medio, los cultivos se cortaron
en cubos y fueron liofilizados independientemente. El material seco fue extraído dos veces con
acetato de etilo. Las extracciones fueron realizadas empleando un baño de ultrasonido Cole-
Parmer a temperatura ambiente por 20 minutos. Las muestras fueron filtradas y secadas a
presión reducida.
5.2.4 Fraccionamiento y aislamiento
Co-cultivo Purpureocillium sp. PNM-67 vs. Paenibacillus sp. PNM-123: Los extractos
obtenidos del blanco de medio PDA (149.7 mg), del monocultivo de Purpureocillium sp. PNM-
67 (938.5 mg), del monocultivo de Paenibacillus sp. PNM-123 (1055.5 mg); y, del co-cultivo en
la zona del hongo (CC2.H, 935.4 mg), la zona de la interacción (CC2.I, 962.1 mg), y la zona de la
bacteria (CC2.B, 455.6 mg) fueron fraccionados empleando cartuchos RP18. Se emplearon
mezclas MeOH/H2O 1:9, 3:7, 1:1, 7:3 y 1:0 para obtener 5 fracciones para cada uno de los
extractos. Todas las fracciones fueron analizadas por HPLC-DAD (200-600nm).
Las fracciones CC2.I.3 (50.8 mg) y CC2.B.3 (33.5 mg) se unieron (84.3 mg) y se sometieron a
una separación por exclusión de tamaño empleando Sephadex LH-20 (30 cm * 3cm). A partir
de esta separación se obtuvieron 11 fracciones (CC2.IB.1.1 a CC2.IB.1.11). La fracción
Capítulo 5 141
CC2.IB.1.6 (13.6 mg) fue separada por cromatografía líquida empleando una columna Waters
XTerra RP18 5µm (4.6*250mm) y un gradiente que iba de 10% MeOH a 100%MeOH,
obteniendo los compuestos 5.1 (0.6 mg) y 5.2 (0.4 mg). Se realizaron 14 inyecciones de 40µL
(1mg/40 µL). Los detalles más relevantes de este proceso de separación se pueden observar
en la Figura 5-1.
Co-cultivo Purpureocillium sp. PNM-67 vs. Streptomyces sp. IBUN-5.1.: Los extractos
obtenidos del blanco de medio ISP3 (1044.1 mg), del monocultivo de Purpureocillium sp. PNM-
67 (2525.1 mg), del monocultivo de Streptomyces sp. IBUN-5.1. (1602.3 mg); y, del co-cultivo
en la zona del hongo (CC3.H, 1810 mg), la zona de la interacción (CC3.I, 3723.7 mg), y la zona
de la bacteria (CC3.B, 1485.7 mg) fueron fraccionados empleando cartuchos diol. Se emplearon
mezclas Hex/AcOEt 9:1, 7:3, 1:1, 1:9, 0:1 y 100% MeOH para obtener 6 fracciones para cada
uno de los extractos.
Las fracciones de la zona del hongo en co-cultivo CC3.H.5 (102.6 mg) y CC3.H.6 (370 mg) y se
sometieron a una separación cromatográfica empleando Sephadex LH-20 (30cm*3cm). A
partir de esta separación se obtuvieron 14 fracciones (CC3.H.56.1.1 a CC3.H.56.1.14). Las
fracciones CC3.H.56.1.13 y CC3.H.56.1.14 se unieron (12.2mg) y se separaron por
cromatografía líquida empleando una columna Waters XTerra RP18 5µm (4.6*250mm)
obteniendo el compuesto 5.3. Los detalles más relevantes de este proceso de separación se
pueden observar en la Figura 5-2.
Figura 5-1: Esquema de separación del co-cultivo entre Purpureocillium sp. PNM-67 y la bacteria Paenibacillus sp. PNM-123
Figura 5-2: Esquema de separación del co-cultivo entre Purpureocillium sp. PNM-67 y la bacteria Streptomyces sp. IBUN-5.1.
5.2.5 Análisis por LC/MS
Se analizaron por LC/MS-MS los extractos correspondientes a las zonas de interacción de los
co-cultivos entre el hongo Purpureocillium sp. PNM-67 y las bacterias Streptomyces sp. PNM-9,
Paenibacillus sp. PNM-115, Paenibacillus sp. PNM-123, Paenibacillus sp. PNM-210 y
Streptomyces sp. IBUN-5.1. Así mismo, se analizaron los monocultivos correspondientes, el
medio del cultivo (ISP3) y un blanco de metanol. La obtención de estos extractos se describe
con detalle en el Capítulo 3.
Los análisis se llevaron a cabo en un equipo UHPLC Thermo Dionex Ultimate 3000 acoplado a
un espectrómetro de masas Bruker Impact II UHR-Q-TOF. Los análisis fueron medidos en
modo positivo. El escaneo de masas se realizó en un rango de m/z 50 a m/z 1200. Se emplearon
los siguientes parámetros en el espectrómetro: voltaje del capilar 4.5kV, flujo de gas 8L/min,
temperatura 200ªC, presión del nebulizador 2.0bar, energía de colisión 5eV.
Los extractos fueron disueltos en metanol para una concentración final de 0.5mg/mL y fueron
inyectados en una columna Acclaim RSLC 120 ThermoScientific C18 2.2µm (3*75mm). Los
solventes usados en la elución fueron: agua con ácido fórmico 0.1% (fase A) y acetonitrilo con
ácido fórmico 0,1% (fase B). El análisis cromatográfico inició con 10% de la fase B por 3
minutos, se incrementó linealmente a 40% de la fase B en 3 minutos, luego se incrementó
linealmente a 70% de la fase B en 11 minutos, luego se incrementó linealmente a 100% de la
fase B en 4 minutos y se mantuvo ahí por 2 minutos, y se retornó a 10% de la fase B en 2
minutos dónde se mantuvo otros 2 minutos más. El flujo fue de 0.4mL/min.
5.2.6 Pre-procesamiento de los datos de LC-MS por MZmine
Tras la adquisición de los datos, estos fueron convertidos al formato .mzXML en el programa
Data Analysis de Bruker con el fin de ser analizados en el programa de acceso libre MZmine
2.37 que permite el procesamiento de datos de espectrometría de masas de alta resolución
acoplados con métodos de separación.25
Para el procesamiento de los datos obtenidos se siguieron los siguientes pasos:
Detección de masas (Mass detection)
Se empleó el algoritmo Centroid mass detector, estableciendo un nivel de ruido (Noise level) de
1.0 × 103 para el MS1, y de 1. 0 × 101 para el MS2.
Capítulo 5 145
Construcción de cromatogramas (Chromatogram builder)
Se utilizaron los siguientes parámetros: Min time span 0.2 min, Min height 3.0 × 103 y m/z
tolerance 0.05.
Deconvolución de cromatogramas (Chromatogram deconvolution)
Se empleó el algoritmo Baseline cut-off con los siguientes parámetros: Min peak height 3.0 ×
103 , Peak duration range 0.2-4.0 min, Baseline level 1.0 × 103 , m/z range for MS2 scan pairing
0.05 Da y RT range for MS2 scan pairing 0.2 min.
Agrupamiento de isótopos (Isotopic peaks grouper)
Se utilizaron los siguientes parámetros: m/z tolerance 0.05, Retention time tolerance 0.2 min,
Maximum charge 3.
Alineamiento (Alignment)
Se empleó el método Join aligner con los siguientes parámetros: m/z tolerance 0.1, RT tolerance
0.5 min, Weight m/z 75 y Weight for RT 25.
Filtrado de picos MS/MS (Peak list row filter)
Se seleccionó la opción Keep only peaks with MS2 scan.
Limpieza de los datos
Se eliminaron todos los picos presentes en el blanco de medio y en el blanco de solvente.
Exportación de datos
La lista de picos alineada y filtrada fue exportada empleando la función Export for/Submit for
GNPS que generó dos archivos: Quantification table (formato .csv) y MS2 file (formato .mgf).
5.2.7 Construcción de redes moleculares
En la plataforma del GNPS fueron cargados tres archivos: quantification table, MS2 file y
metadata table. Este último archivo es creado por el usuario e incluye la descripción de las
muestras analizadas en función de atributos o características que facilitaran la visualización
de las redes. Se empleó el workflow Feature Based Molecular Networking en la plataforma del
GNPS empleando los siguientes parámetros: Precursor ion mass tolerance 0.1 Da, Fragment ion
mass tolerance 0.1 Da, Minimum cosine score 0.70, Maximum number of neighbor nodes for one
single node 10, Minimum matched fragment ions 6, Maximum size of nodes allowed in a single
connected network 100, Maximum shift between precursors 500 Da, Library search min matched
peaks 6, Score threshold 0.7
146 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
El análisis realizado en la plataforma del GNPS se puede visualizar en el link:
https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/status.jsp?task=9957cf04ac5547bfa7c9014b4b2ec357.
Las redes moleculares obtenidas en el paso anterior fueron visualizadas en el programa de
acceso libre Cytoscape en su versión 3.7.1.26
5.2.8 Derreplicación
Se realizó la identificación putativa de aquellos picos que no fueron identificados por el GNPS,
empleando el Diccionario de Productos Naturales (DNP)27. La búsqueda se basó en la masa
exacta de cada ion, y se limitó teniendo en cuenta los géneros a los que pertenecían los
aislamientos que hacían parte de las interacciones, así como géneros filogenéticamente
relacionados. Para la búsqueda se aceptó un error máximo de 15ppm.
5.3 Resultados y discusión
El hongo Purpureocillium sp. PNM-67 fue recuperado a partir de la esponja Niphates digitalis y
fue estudiado previamente en el grupo de investigación por Romero28 dada su capacidad
controladora de patógenos del arroz del género Burkholderia sp. Al realizar la secuenciación
del gen ITSs, se encontró un 99% de similitud con Purpureocillium lilacinum. El estudio
químico de éste, cultivado en PDB, permitió el aislamiento e identificación de 4 compuestos
relacionados estructuralmente con las leucinostatinas a los que se denominaron lilacininas A-
D. Las lilacininas A y C presentaron una actividad antimicrobiana moderada contra la bacteria
Burkholderia gladioli28.
Los aislamientos de Purpureocillium lilacinum se han destacado por ser productores de
leucinostatinas29. Estos compuestos típicamente contienen una secuencia lineal de 9 residuos
de α-aminoácidos que incluyen aminoácidos inusuales como cis-4-metil-L-prolina,
hidroxileucina y ácido α-aminoisobutírico, así como residuos de ácidos grasos de 7 átomos de
carbono en el N-terminal.30,31 De este hongo también se han aislado α-pironas32,
ciclohexenonas32, xantonas33, esteroles34, cerebrósidos34, alcaloides35 y proteínas36.
Este hongo, ha sido estudiado en condiciones de co-cultivo. Así, Teles y colaboradores37
realizaron el co-cultivo entre este hongo y la bacteria Salmonella typhimurium bajo diferentes
condiciones de fermentación encontrando que para la mayoría de casos, el co-cultivo inducía
Capítulo 5 147
cambios en la producción metabólica y en la actividad biológica frente a Staphylococcus aureus,
Candida albicans y Listeria monocytogenes.
5.3.1 Estudio químico del co-cultivo entre Purpureocillium sp. PNM.67 y Paenibacillus sp. PNM.123 en medio PDA
El co-cultivo entre el hongo Purpureocillium sp. PNM-67 y la bacteria Paenibacillus sp. PNM-
123 fue seleccionado a partir de un screening realizado en medio sólido que integró cambios a
nivel fenotípico, en HPLC-DAD y en RMN 1H para seleccionar aquellos aislamientos que
demostraban un cambio en la producción metabólica inducido por el co-cultivo (Capítulo 3).
Los cambios se evidenciaron por picos en HPLC-DAD a 320nm, por lo cual se empleó esta
técnica para el seguimiento del fraccionamiento de los extractos orgánicos. Con el objetivo de
obtener una mayor cantidad de extracto orgánico se realizaron 450 cajas para el co-cultivo que
se extrajeron por zonas como se hizo en el Capítulo 3. Se realizaron 150 cajas de cada uno de
los monocultivos, y sus extractos orgánicos se fraccionaron y se emplearon como controles.
Todos los extractos orgánicos de las 3 zonas correspondientes a las cajas del co-cultivo fueron
fraccionados empleando extracción en fase sólida con RP18 como fase estacionaria, así como
los extractos orgánicos de los dos monocultivos y el blanco de medio. Todas las fracciones se
analizaron por HPLC-DAD con el fin de evaluar en qué fracciones se encontraban los picos de
interés.
Los análisis por HPLC-DAD mostraron que los dos picos de interés se encontraban en las
fracciones eluídas con MeOH/H2O 1:1 de los extractos orgánicos de la zona de la interacción y
y también de la zona de la bacteria, lo que sugiere que ella es la productora en co-cultivo de
estos compuestos. Estas dos fracciones se unieron y se sometieron a una separación por
exclusión de tamaño empleando una resina Sephadex LH-20. Se recolectaron 180 fracciones
que fueron agrupadas según su perfil en cromatografía en capa delgada en 11 fracciones. Estas
11 fracciones fueron analizadas por HPLC-DAD, identificando los dos picos de interés en la
sexta fracción. Esta fracción fue separada por HPLC, dónde se obtuvieron 6 fracciones en
función del seguimiento a 320nm. En las fracciones 5 y 6 se encontraban los compuestos 5.2 y
5.1 respectivamente y que correspondían a los picos de interés.
148 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
El Compuesto 5.1 (0.6 mg) fue aislado como un sólido amarillo. Su rotación óptica fue de
[α]D=+172.3 (c=0.013, MeOH). El espectro UV mostró una longitud de onda de máxima
absorción en 320nm.
El análisis del espectro de RMN 1H (Figura 5-3)permitió observar múltiples señales en la
región alifática (δH 0.5-3.5), así como una señal en δH 4.13 (t, J=7.40) que indica la presencia de
un metileno unido a heteroátomo, y otra en δH 7.37 (s) que sugiere la presencia de protón
aromático aislado. Los espectros HSQC y HMBC (Figura 5-4 y Figura 5-5) permitieron
evidenciar señales para 2 carbonos cuaternarios sp2; 2 metinos, uno sp3 y otro sp2; 5 metilenos
y 2 metilos.
Figura 5-3: Espectro de RMN 1H para el compuesto 5.1.
Capítulo 5 149
Figura 5-4: Espectro HSQC del compuesto 5.1
Figura 5-5: Espectro HMBC del compuesto 5.1
150 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
Figura 5-6: Espectro COSY del compuesto 5.1
Las correlaciones observadas por COSY y HMBC se observan en la Figura 5-7. La señal de
metileno unido a heteroátomo en H 4.13 (t, J=7.40) /C 50.21 correlaciona en COSY (Figura
5-6) con el metileno en H 2.24 (quint, J=7.60)/C 22.03, que a su vez correlaciona con los
protones de metileno unido a anillo aromático en H 3.15 (t, J=7.70)/C 30.00, mostrando la
presencia de un anillo de cinco miembros fusionado con un anillo aromático. De otro lado la
señal singlete de protón aromático en H 7.37 (s)/ C 19.70 correlaciona en HMBC con el
carbono cuaternario aromáticos unido a heteroátomo en C 160.26 y con el carbono aromático
en C 143.20, este último tiene crosspeak con el metileno en H 3.15. Todo lo anterior concuerda
con un alcaloide pirazólico tipo withasomnina38. Por COSY, los protones del metino unido a
anillo aromático de H 3.23 (q, J=6.9)/ C 37.55 correlacionan con los protones diasterotópicos
del metileno en H 1.51 y 1.78/C 28.59 y con el metilo doblete H 1.17 (d, J=7.20) /C 18.19. Los
protones diasterotópicos a su vez correlacionan por COSY con los protones del metilo en H
0.86 (t, J=7.20)/ C 12.04. Teniendo en cuenta esto se deduce la presencia de un sec-butilo, que
se une al carbono aromático en C 160.26 por el crosspeak observado en HMBC con el metilo
H 1.17 (d, J=7.20) /C 18.19. Los datos de RMN asignados para el compuesto 5.1 se encuentran
en la Tabla 5-1, que fue nombrado como 5,6-dihidro-2-sec-butil-4H-pirrolo[1,2b]pirazol (5.1)
Capítulo 5 151
. La búsqueda realizada en SciFinder mostró que 5.1 no ha sido reportado previamente, y por
tanto es nuevo en la naturaleza y en esta tesis es la primera vez que se reporta.
Figura 5-7: Correlaciones observadas para el Compuesto 5.1 en los experimentos bidimensionales. El COSY se visualiza con enlaces con negrita y el HMBC con flechas azules.
El Compuesto 5.2 (0.4 mg) fue aislado como un sólido amarillo. El espectro UV mostró una
longitud de onda de máxima absorción en 320nm. Todos estos datos son muy similares a los
del compuesto 5.1, lo que se sugiere que debe ser un compuesto muy relacionado con él. El
análisis de los espectros de HSQC y HMBC permitió observar 2 carbonos cuaternarios, 2
metinos, 3 metilenos y 2 metilos, confirmando que tiene un carbono menos que 5.1. El espectro
de RMN 1H muestra que el núcleo del compuesto 5.2 es igual al de 5.1, y que la diferencia se
da en la cadena lateral, que para el caso de 5.2 corresponde a un isopropilo (δH 3.40, 1H, m; y
1.20, 6H, d, J=6.87). Todos estos espectros, junto al de COSY, permitieron proponer la
estructura del compuesto 5.2, conocido como 5,6-dihidro-2-isopropil-4H-pirrolo[1,2b]pirazol
(5.2). Las correlaciones en HMBC y COSY para este compuesto se observan en la Figura 5-8.
Los datos de RMN asignados para el compuesto 5.2 se encuentran en la Tabla 5-1 Este
compuesto fue previamente reportado por Na y colaboradores38, y había sido aislado a partir
de la cepa Streptomyces sp. 5B, que fue recuperada de la raíz de la planta Trewia nudiflora. Esta
planta se encuentra distribuida principalmente en la India, Malasia y China39 y ha sido
estudiada desde hace muchos años por la producción de metabolitos con actividades
biológicas relevantes como es el caso de los maytansinoides40,41, compuestos con actividad
antitumoral. Sin embargo, no se ha podido demostrar que estos compuestos sean realmente
producidos por la planta, por lo que los estudios se han enfocado en los microorganismos
endófitos de la planta42,43.
Los datos de RMN obtenidos en este trabajo para el compuesto 5.2 coinciden con los
reportados en la literatura38.
152 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
Figura 5-8: Correlaciones observadas para el Compuesto 5.2 en los experimentos bidimensionales. El COSY se visualiza con enlaces con negrita y el HMBC con flechas azules.
Tabla 5-1: Datos de RMN 1H (400MHz) y RMN 13C (100MHz) de los compuestos 5.1 y 5.2 medidos en metanol-d4
Posición
Compuesto 5.1 Compuesto 5.2
𝜹𝑪 (ppm)
𝜹𝑯 (ppm) (m., J en Hz)
HMBC 𝜹𝑪
(ppm)
𝜹𝑯 (ppm) (m., J en
Hz) HMBC
2 160.26
(C) - -
160.75 (C)
- -
3 119.70
(CH) 7.37 (s)
2,3a
120.05 (CH)
7.38 (s)
-
3a 143.20
(C) - -
143.42 (C)
- -
4 30.00 (CH2)
3.15 (t, J=7.70)
3a, 5, 6 30.28 (CH2)
3.16 (t, J=7.30)
3a, 5
5 22.03 (CH2)
2.24 (quint, J=7.60 )
3a, 4, 6 22.19 (CH2)
2.25 (m) 4
6 50.24 (CH2)
4.13 (t, J=7.40)
3a, 4, 5
50.21 (CH2)
4.13 (t, J=7.20)
3a, 4, 5
1’ 37.55 (CH)
3.23 (q, J=6.9)
2, 2’, 1’’
30.83 (CH)
3.40 (m) 2’, 1’’
2’a 28.59 (CH2)
1.53 (m) 2, 1’, 3’, 1’’
20.69 (CH3)
1.20 (d, J=6.87)
2, 1’, 1’’
2’b 28.59 (CH2)
1.77 (m) 2, 1’, 3’, 1’’
3’ 12.04 (CH3)
0.86 (t, J=7.20)
1’, 2’
1’’ 18.19 (CH3)
1.17 (d, J=7.20)
2, 1’, 2’
20.69 (CH3)
1.20 (d, J=6.87)
2, 1’, 2’
Capítulo 5 153
Figura 5-9: Compuestos 5.1 y 5.2 aislados a partir del co-cultivo entre Purpureocillium sp. PNM-67 y Paaenibacillus sp. PNM-123.
Las fracciones correspondientes a los monocultivos de Purpureocillium sp. PNM-67 y
Paenibacillus sp. PNM-123 fueron analizadas por RMN 1H y HPLC-DAD y no se encontraron las
señales ni los picos atribuidos a los compuestos 5.1 y 5.2, lo que confirma a juzgar por estas
técnicas que estos dos compuestos son exclusivos al co-cultivo. Como se mencionó
anteriormente, el gradiente de difusión de los compuestos sugiere que éstos son producidos
por la bacteria en respuesta a los compuestos difusibles producidos por el hongo que no fueron
caracterizados en este trabajo.
La similitud estructural entre los dos compuestos identificados como inducidos por el co-
cultivo concuerda con lo reportado en la literatura, donde se ha encontrado que en muchos
casos como resultado de la interacción se obtienen análogos que comparten el mismo núcleo.5
Estos compuestos 5.1 y 5.2 están estructuralmente relacionados con las withasomninas44,
compuestos reconocidos por su actividad biológica. La withasomnina fue aislada en 1966 a
partir de las raíces de Withania somnífera Dun., una planta empleada en la medicina tradicional
india,45y ha demostrado actividad depresora del sistema nervioso central y del sistema
circulatorio, actividad analgésica moderada, narcosis en altas dosis e inhibición de la
ciclooxigenasa 1 y 2 (COX-1 y COX-2) y del metabolismo del leucotrieno B4 (LTB4).46,47 Debido
a sus actividades biológicas, la withasomnina y derivados estructurales han sido sintetizados
empleando diversas rutas.48
Los estudios de la biosíntesis de las withasomninas han sugerido que se obtienen de una
ornitina y una fenilalanina49,50, el resultado de esta reacción hace que la cadena lateral se
ubique en la posición tres del núcleo. En el caso de los compuestos 5.1 y 5.2 la cadena lateral
se ubica en C-2, lo que sugiere que la biosíntesis de ellos no se da de la misma manera que la
de las withasomninas.
154 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
5.3.2 Estudio químico del co-cultivo entre el hongo Purpureocillium sp. PNM.67 y la bacteria Streptomyces sp. IBUN-5.1. en medio ISP3 sólido
El co-cultivo entre el hongo Purpureocillium sp. PNM-67 fue seleccionado a partir de un
screening en medio sólido (Capítulo 3). De este modo se observó que la interacción causaba un
cambio fenotípico (inhibición del hongo) y cambios en los perfiles de HPLC-DAD y RMN 1H.
Con el objetivo de obtener una mayor cantidad de extracto orgánico se realizaron 500 cajas
para el co-cultivo que se extrajeron por zonas. Se realizaron 100 cajas de cada uno de los
monocultivos, y sus extractos orgánicos se fraccionaron y se emplearon como controles.
Todos los extractos orgánicos de las 3 zonas correspondientes a las cajas del co-cultivo fueron
fraccionados empleando cartuchos diol. Se realizó el seguimiento por RMN 1H para evaluar en
qué fracciones se encontraban las señales de interés, es decir, aquellas que se encontraban
únicamente en el co-cultivo.
Las señales características del co-cultivo se encontraron en las fracciones eluídas con 100%
AcOEt y 100% MeOH en la zona del hongo y en la zona de la interacción. Esto sugiere que el
hongo es el productor de estas señales (compuestos). Las fracciones de la zona del hongo se
reunieron sin incluir las de la zona de la interacción, esto se hizo por dos razones: primero, que
las señales de interés son producidas por el hongo, por lo que podrían encontrarse en mayor
cantidad en la zona dónde fue inoculado el hongo y segundo, la masa de las dos fracciones en
mención es cercana a los 480 mg, cantidad de extracto suficiente para continuar con el proceso
de separación.
La mezcla de estas dos fracciones se sometió a una separación por exclusión de tamaño
empleando resina Sephadex LH-20. Se recolectaron 130 fracciones que fueron agrupadas
empleando cromatografía en capa delgada para obtener 14 fracciones. En la fracción 13 y 14
se encontraron las señales de interés, a juzgar por el espectro de RMN 1H y el pico de interés
por HPLC-DAD. Estas dos fracciones fueron reunidas y purificadas por HPLC para obtener el
compuesto 5.3.
El Compuesto 5.3 (2.1 mg) fue aislado como un sólido color crema. Al ser analizado por
espectrometría de masas se observó un ión de m/z 259,0591 que corresponde a la fórmula
molecular C14H1005 (error 3.9ppm). El espectro UV mostró longitudes de onda de máxima
absorción en 256, 287, 337 y 298 nm, que sugieren la presencia de una xantona51.
Capítulo 5 155
Al analizar el espectro de RMN 1H se observaron 4 dobletes en la zona de aromáticos (δH 6.37,
d, J=2.0; 7.27, d, J=2.0; 6.61, d, J=2.40; y 6.70, d, J=2.40) con constante de acoplamiento meta lo
que sugería la presencia de dos anillos aromáticos tetrasustituidos. Adicionalmente, se
observa la presencia de un metilo bencílico en δH 2.76 (s). Por COSY se observaron dos sistemas
de espín que fueron unidos mediante correlaciones en HMBC (Figura 5-10), y permitieron
proponer la estructura del compuesto 5.3, que corresponde al alternariol, una micotoxina. Los
datos de RMN y espectrometría de masas obtenidos coinciden con los reportados en la
literatura52. Los datos de RMN asignados para el Compuesto 5.3 se encuentran en la Tabla 5-2.
Figura 5-10: Correlaciones observadas para el Compuesto 5.3 en los experimentos bidimensionales. El COSY se visualiza con enlaces con negrita y el HMBC con flechas azules.
156 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
Tabla 5-2: Datos de RMN 1H (400MHz) y RMN 13C (100MHz) del compuesto 5.3 medidos en metanol-d4
Posición 𝛿𝐶 (ppm) 𝛿𝐻 (ppm) (m., J en Hz) HMBC 1 139.51 (C) - - 2 98.43 (C) - - 3 166.26 (C) - - 4 101.43 (CH) 6.37 (d, J=2.0) 2, 3, 6 5 166.43 (C) - - 6 105.28 (CH) 7.27 (d, J=2.0) 2, 4, 5, 1’ 7 ND (C) - - 1’ 110.50 (C) - - 2’ 154.24 (C) - - 3’ 102.36 (CH) 6.61 (d, J=2.40) 1’, 2’, 4’ 4’ 159.47 (C) - - 5’ 118.52 (CH) 6.70 (d, J=2.40) 1’, 3’, 6’-CH3 6’ 139.20 (C) - -
3-OH - 6’-CH3 25.37 (CH3) 2.76 (s)
ND: No detectado, valores de los carbonos determinados a través del HMBC
Figura 5-11: Compuesto 5.3. aislado a partir del co-cultivo entre Purpureocillium sp. PNM-67 y Streptomyces sp. IBUN-5.1.
Las fracciones correspondientes a los monocultivos del hongo Purpureocillium sp. PNM-67 y
Streptomyces sp. IBUN-5.1 fueron analizadas por HPLC-DAD y RMN 1H y no se encontraron las
señales ni el pico atribuido al compuesto 5.3., lo que confirma a juzgar por estas técnicas que
este compuesto es exclusivo al co-cultivo. Como se mencionó anteriormente, el gradiente de
difusión del compuesto sugiere que éste es producido por el hongo en respuesta a los
compuestos difusibles producidos por la bacteria que no fueron caracterizados en este trabajo.
Capítulo 5 157
El alternariol (Figura 5-11) fue aislado por primera vez a partir del hongo Alternaria tenuis en
195353. Posteriormente, ha sido aislado a partir de diferentes especies del género Alternaria y
del género Penicillium sp.54,55 El alternariol es una micotoxina encontrada comúmente como
contaminante en cultivos de frutas y cereales. Varios estudios han demostrado que el
alternariol tiene actividad citotóxica, genotóxica, mutágenica y carcinogénica56. Estudios in
vitro sugieren que puede actuar como un disruptor endocrino, alterando la expresión génica
de receptores de hormonas y enzimas,57 lo anterior por su similaridad estructural con el
estrógeno.
Se han realizado pocos estudios sobre la biosíntesis de este compuesto58. Thomas59 demostró
que el compuesto es un policétido no reducido formado a partir de la condensación de
unidades de acetato. Staunton y colaboradores realizaron experimentos que confirmaron la
enolización del intermediario antes de la formación del anillo60. Stinson y colaboradores61
sugirieron que la norlichexantona es la molécula precursora del alternariol pero esta hipótesis
fue refutada por Simpson y colaboradores62 basados en experimentos de marcaje isotópico.
En la literatura, se reportan varios casos de producción de alternariol en co-cultivos.15,63 Por
ejemplo, Wang y colaboradores en 2014 reportaron la producción de este compuesto y otros
4 policétidos fenólicos a partir de co-cultivos entre el hongo derivado de mar Penicillium sp.
WC-29-5 y la bacteria Streptomyces fradiae 007.64
En reportes de co-cultivos que involucran hongos, se ha encontrado la inducción de otras
micotoxinas como lo son el ácido fusárico65 y las enniatinas66,67. La inducción de este tipo de
compuestos podría constituir un mecanismo de defensa frente a los hongos o bacterias con los
que han sido enfrentados.68
En el caso de este estudio, como se observó en el capítulo 3, la inducción de las señales
correspondientes al alternariol se observaron en los co-cultivos entre Purpureocillium sp.
PNM-67 con las bacterias Paenibacillus sp. PNM-115, Paenibacillus sp. PNM-123, Paenibacillus
sp. PNM-210, Streptomyces sp. IBUN-5.1; todos caracterizados por la inhibición del
crecimiento del hongo. Esto indica que el hongo produce alternariol en estos 4 co-cultivos
como respuesta a los compuestos difusibles producidos por las 4 bacterias mencionadas. En
este punto, es importante mencionar que cepas de Purpureocillium lilacinum69,70 han venido
siendo usadas como biocontroladores, por lo que su seguridad debe ser verificada ya que al
parecer este hongo es capaz de producir micotoxinas en presencia de otros microorganismos.
158 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
5.3.3 Redes moleculares
Con el ánimo de profundizar en las interacciones entre el hongo y las 5 bacterias que causaban
la inhibición de su crecimiento en medio ISP3 (cambios fenotípicos observados en el Capítulo
3), se realizaron análisis por LC-MS que brindan una mayor sensibilidad.
Se analizaron por LC-MS/MS los extractos orgánicos correspondientes a las zonas de
interacción de los co-cultivos entre el hongo Purpureocillium sp. PNM-67 y las bacterias
Streptomyces sp. PNM-9, Paenibacillus sp. PNM-115, Paenibacillus sp. PNM-123, Paenibacillus
sp. PNM-210 y Streptomyces sp. IBUN-5.1; así como los monocultivos correspondientes y el
blanco de medio. Estos datos se procesaron empleando MZmine para obtener así una matriz
alineada de features (integran tiempo de retención y espectro de masas) que fue exportada a
la plataforma del GNPS donde se construyeron redes moleculares empleando el análisis
“Feature-based molecular networking”. Este tipo de análisis ofrece varias ventajas en
comparación al Molecular Networking tradicional, siendo una de ellas la reducción en tamaño
de las redes debido a una disminución en nodos redundantes. Esto ocurre pues los datos se
someten a un pre-procesamiento en MZmine que genera una matriz alineada de features. Así
mismo, la obtención de esta matriz permitió eliminar aquellas features presentes en las
muestras del blanco de medio de cultivo y del solvente, para así realizar la construcción de las
redes moleculares únicamente a partir de las features de interés.
Las redes permiten visualizar e interpretar el espacio químico para muestras analizadas por
espectrometría de masas. El resultado final consiste en un conjunto de agrupaciones de nodos
(donde cada nodo es una feature) con similitud en su fragmentación. La similitud en la
fragmentación es determinada por un valor de coseno que entre más cercano sea a 1 indicará
un mayor grado de similitud. Para este estudio, se empleó 0.7 como valor de coseno mínimo
para la formación de agrupaciones. Las redes moleculares construidas pueden visualizarse
haciendo uso del programa Cytoscape, que permite cambiar los colores y las formas y de los
nodos con el fin de facilitar su interpretación.
De este modo, la red obtenida se visualizó de dos maneras diferentes empleando diferentes
colores y formas del nodo, que es lo que se muestra en la Figura 5-12 y Figura 5-13. En la
primera, todos los nodos exclusivos al co-cultivo están de color verde mientras que los nodos
producidos en los monocultivos se visualizan de diferentes colores según la bacteria. En la
segunda, todos los nodos producidos en los monocultivos están de color verde, mientras que
Capítulo 5 159
los nodos correspondientes a los co-cultivos se visualizan como diagramas circulares según la
contribución de cada co-cultivo.
Con el objetivo de visualizar aquellas features (compuestos) que eran producidas por cada uno
de los microorganismos en monocultivo, y la variación de las mismas en función de su
interacción en co-cultivo, se asignaron diferentes colores y formas en la presentación de los
nodos. En la Figura 5-12, en color verde se visualizan los nodos exclusivos a los co-cultivos
evaluados. Los nodos de color blanco hacen referencia a un origen microbiano no específico,
es decir, todas aquellas features que se encuentran en más de un monocultivo, y que también
pueden encontrarse en más de un co-cultivo, es decir, podrían corresponder a metabolismo
primario o a compuestos ubicuos. En colores diferentes se representan los features para cada
uno de los microorganismos, siendo los nodos circulares los que muestran features producidas
tanto en monocultivos como en los co-cultivos correspondientes, mientras que nodos en forma
rectangular hacen referencia a features producidas exclusivamente en los monocultivos. Estos
nodos exclusivos a los monocultivos muestran varios compuestos que dejaron de ser
producidos en co-cultivo y demuestran que hay cambio en la producción metabólica de cada
uno de los 6 microorganismos empleados
La Figura 5-12 permite observar 51 nodos asociados a Purpureocillium sp. PNM-67, donde 20
de ellos se producen exclusivamente en el monocultivo de este aislamiento (rectángulos
morados), mientras que los 31 restantes se producen tanto en monocultivo como en co-cultivo
(círculos morados). En el caso de las 5 bacterias evaluadas, también se pudieron observar
nodos exclusivos a los monocultivos de cada una de ellas, siendo el caso de Paenibacillus sp.
PNM-115 el que muestra mayor cantidad de ellos (5 nodos).
160 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
Figura 5-12: Redes moleculares de las zonas de interacción de los co-cultivos entre el hongo Purpureocillium sp. PNM-67 y las bacterias Streptomyces sp. PNM-9, Paenibacillus sp. PNM-115, Paenibacillus sp. PNM-123, Paenibacillus sp. PNM-210, Streptomyces sp. IBUN-5.1.
Capítulo 5 161
Con el objetivo de visualizar aquellas features (compuestos) exclusivas al co-cultivo y
discriminar su producción según el co-cultivo donde fueron inducidas, se emplearon
diagramas circulares con diferentes colores. Así, en la Figura 5-13, se visualizan todos los
nodos asociados a monocultivos de color verde y los nodos exclusivos a los co-cultivos se
visualizan como diagramas circulares según la presencia de la feature en cuestión en uno o más
de los 5 co-cultivos evaluados. De manera complementaria, en la Figura 5-14, se visualiza la
distribución de aquellas features presentes en los co-cultivos entre Purpureocillium sp. PNM-
67 con las bacterias Paenibacillus sp. PNM-115, Paenibacillus sp. PNM-123, Paenibacillus sp.
PNM-210, Streptomyces sp. IBUN-5.1, mediante un diagrama de Venn.
De manera general, se pueden observar redes moleculares en las que se ubican nodos
asociados a monocultivos y a co-cultivos (por ejemplo, MN1), mientras que se observan otras
redes compuestas exclusivamente por nodos asociados al co-cultivo (por ejemplo, MN5). En el
primer caso, los nodos del co-cultivo serían moléculas análogas a las producidas en
monocultivo, es decir, moléculas con modificaciones estructurales pequeñas respecto a los
compuestos producidos en monocultivo. En el segundo caso estos nodos serían compuestos
estructuralmente diferentes a los presentes en el monocultivo, por lo que serían los más
interesantes de estudiar. Sin embargo, es importante tener en cuenta que estos compuestos de
interés pueden no encontrarse en cantidades suficientes para ser aislados, pues la
espectrometría de masas es una técnica dependiente de la capacidad de ionizar de un
compuesto más no de su concentración71. Por tal razón, sería necesario monitorear su
presencia empleando esta misma técnica a lo largo del proceso de purificación.
El Compuesto 5.3, del cual se describe su aislamiento y elucidación en el apartado 5.3.2., se
puede visualizar en un nodo con forma de cuadrado (m/z 259.06) en la MN13, que evidencia
que este compuesto fue producido en las interacciones del hongo con las bacterias
Paenibacillus sp. PNM-115, Paenibacillus sp. PNM-123, Paenibacillus sp. PNM-210 y
Streptomyces sp. IBUN-5.1., como habían evidenciado previamente el uso de HPLC-DAD y RMN
1H. Así mismo se observa la presencia de otros dos compuestos estructuralmente similares, y
que son producidos en el co-cultivo entre el hongo y la bacteria Streptomyces IBUN-5.1
exclusivamente.
De los 199 nodos que componen las redes moleculares, 95 nodos son exclusivamente
producidos en los co-cultivos. Al analizar estos nodos, se observa que 66 de ellos están
162 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
presentes en el co-cultivo con la bacteria Paenibacillus sp. PNM-115 (azules). Además, 41 de
esos 66 nodos son exclusivos a este co-cultivo. A esto se suma que, al observar las redes
formadas, existe una red de 6 nodos (MN5) donde todos ellos corresponden a features
exclusivas de este co-cultivo. Esto significa que, en éste, debido a la interacción, se producen
un grupo de compuestos estructuralmente relacionados (a juzgar por sus patrones de
fragmentación), es decir una “familia molecular”72, asociada únicamente a este co-cultivo.
Algunas features pueden no compartir similitud en su fragmentación con los demás espectros
presentes en la red, y por ello se denominan “self-loops”.73 En el caso de los co-cultivos, las
moléculas asociadas a estos nodos pueden ser de gran interés por ser estructuralmente no
relacionadas con los otros nodos que hacen parte de la red, esto podría significar que son
compuestos nuevos o que son compuestos previamente reportados pero no similares a los
demás compuestos presentes en la red. En este análisis, se encontraron 54 self-loops, de los
cuales 21 correspondían a nodos producidos exclusivamente en co-cultivos. Es importante
destacar que 12 de estos self-loops están asociados únicamente al co-cultivo entre el hongo
Purpureocillium sp. PNM-67 y la bacteria Paenibacillus sp. PNM-115. Todo lo anterior, sugiere
que esta interacción es la más interesante para ser evaluada en mayor volumen.
Capítulo 5 163
Figura 5-13: Redes moleculares de las zonas de interacción de los co-cultivos entre el hongo Purpureocillium sp. PNM-67 y las bacterias Streptomyces sp. PNM-9, Paenibacillus sp. PNM-115, Paenibacillus sp. PNM-123, Paenibacillus sp. PNM-210, Streptomyces sp. IBUN-5.1. En un cuadrado se encuentra el nodo correspondiente al alternariol (Compuesto 5.3).
164 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
Figura 5-14. Diagrama de Venn de distribución de features para los co-cultivos entre el hongo Purpureocillium sp. PNM-67 y las bacterias: Streptomyces sp. IBUN-5.1., Paenibacillus sp. PNM-115, Paenibacillus sp. PNM-123 y Paenibacillus sp. PNM-210.
También es interesante notar que 19 nodos están asociados a features únicamente presentes
en los co-cultivos con las bacterias Paenibacillus sp. PNM-115 (azul) y Paenibacillus sp. PNM-
210 (amarillo). Esto podría indicar que la producción metabólica en estas interacciones está
sufriendo variaciones similares, y podría deberse a que las dos bacterias pertenecen al mismo
género.
Si bien el aislamiento PNM-123 es también del género Paenibacillus, la producción metabólica
del co-cultivo que lo involucra no se asemeja a la de los co-cultivos que involucran a PNM-115
y PNM-210. Con el fin de evaluar la cercanía taxonómica de estos tres aislamientos, se contruyó
un árbol filogénetico que se puede observar en la Figura 5-15. Éste evidencia que mientras
PNM-115 y PNM-210 son cercanamente relacionadas a Paenibacillus elgii, PNM-123 se
relaciona cercanamente con Paenibacillus ehimensis, lo que podría explicar la diferenciación
entre la producción metabólica de estos tres co-cultivos.
Capítulo 5 165
Figura 5-15. Árbol filogénetico de los aislamientos Paenibacillus sp. PNM-123, Paenibacillus sp. PNM-210 y Paenibacillus sp. PNM-115 construido a partir del programa MEGA versión 7.0 empleando el método Neighbor-Joining.
Por último, como ejemplo de nodos que comparten features del mono-cultivo y del cocultivo,
se puede destacar la red MN1, que contiene la mayoría de nodos exclusivos al co-cultivo entre
Purpureocillium sp. PNM-67 y Streptomyces sp. IBUN-5.1. (13 nodos). En esta red también se
encuentran nodos producidos por el hongo, lo que indica que son estructuralmente similares.
Todo lo anterior muestra el impacto del co-cultivo en la producción metabólica de estos
microorganismos, lo que reafirma al co-cultivo como una técnica capaz de inducir
modificaciones estructurales en compuestos producidos en monocultivo, así como producir
compuestos estructuralmente diferentes a los del monocultivo.
Aparte de una visualización de la diversidad química, el análisis realizado en el GNPS, permite
realizar la derreplicación de los espectros MS/MS con la base de datos experimentales de
espectrometría de masas en tándem que alberga la plataforma. Es importante tener en cuenta
que todas las identificaciones que se mencionaran de aquí en adelante son putativas pues solo
se basan en las similitudes en el ion padre y/o en la fragmentación MS/MS, mientras que una
identificación definitiva implicaría la comparación de dos o más propiedades con un estándar
evaluado bajo las mismas condiciones analíticas.74
Todas las identificaciones realizadas por medio de la plataforma del GNPS se resumen en la
Tabla 5-3.
166 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
Se identificó una red correspondiente a las leucinostatinas (MN16). Estos compuestos se
caracterizan por ser péptidos lineales, previamente descritos en Purpureocillium lilacinum75.
En estudios previos realizados en el grupo de investigación, el hongo Purpureocillium sp. PNM-
67 fue cultivado en caldo de papa y por análisis por LC-MS/MS se identificaron a las
leucinostatinas B2, D, F, H, K, y N28. En este estudio se encontró que tanto en monocultivo como
en co-cultivo (sólo con Paenibacillus sp. PNM-115) se producen la Leucinostatina A y la
Leucinostatina B.
También se identificó al compuesto undecilprodiginina. Este compuesto es producido por
Streptomyces sp. IBUN-5.1. tanto en monocultivo como en co-cultivo. Las prodigininas son una
familia de compuestos de coloración rojiza que se caracterizan por un sistema de tres anillos
pirrólicos conjugados que son producidos por bacterias gram positivas y gram negativas.76 Las
prodigininas han sido aisladas de Serratia spp., Streptomyces coelicolor y otras
actinobacterias.77 En diferentes estudios la undecilprodiginina ha demostrado actividad
antimicrobiana, citotóxica e inmunosupresora78,79.
Se identificó al compuesto 5α,8α-epidioxiergosta-6,22-dien-3β-ol. Este compuesto es
producido por el hongo Purpureocillium sp. PNM-67 tanto en monocultivo como en co-cultivo.
Este compuesto fue aislado a partir del hongo Daedaleopsis confragosa var. tricolor.80 Se cree
que este ergosterol peróxido es un artefacto.81
La octadecanamida se ha identificado en diferentes extractos de plantas82,83 y algunos de sus
derivados se han aislado de esponjas y corales84,85. El 1-hexadecanoil-sn-glicerol ha sido
identificado previamente en plantas86. La N-(2-Hidroxietil)octadec-9-enamida ha sido muy
estudiada por su capacidad de controlar el apetito, por lo que es un agente farmacéutico en el
tratamiento de la obesidad87. El ácido 9,10-epoxi-12-octadecanoico y compuestos
relacionados han sido identificados principalmente en extractos de plantas.86
Capítulo 5 167
Tabla 5-3: Identificaciones putativas obtenidas a partir de la plataforma del GNPS.
Compuesto m/z
observado Aducto Similitud
Error (ppm)
Octadecanamida 567.581 2M+H 0.98 0 N-(2-Hidroxietil)octadec-9-enamida 326.305 M+H 0.86 4
Undecilprodiginina 394.28 M+H 0.77 6 1-hexadecanoil-sn-glicerol 331.284 M+H 0.75 3
5α,8α-epidioxiergosta-6,22-dien-3β-ol 411.325 M-
H2O+H 0.75 3
Leucinostatina A 609.929 M+2H 0.74 10 Leucinostatina B 602.917 M+2H 0.72 3
Ácido 9,10-epoxi-12- octadecanoico 279.231 M+H-H2O
0.71 1
La derreplicación a partir de la plataforma del GNPS permitió muy pocas identificaciones, lo
cual es consecuente con que el desarrollo de esta estrategia es relativamente reciente.
Teniendo en cuenta esto, se decidió complementar la búsqueda empleando otras bases de
datos.
Se realizó una búsqueda en el Dictionary of Natural Products versión 27.2, a partir de la
búsqueda de la masa exacta con un rango de error máximo de 15ppm. Esta búsqueda se filtró
teniendo en cuenta los géneros a los que pertenecían los aislamientos y géneros
filogenéticamente relacionados. Las coincidencias encontradas a partir de esta búsqueda se
resumen en la Tabla 5-4.
Tabla 5-4: Identificaciones putativas obtenidas a partir de la búsqueda de la masa exacta en el DNP con un margen de error de 15ppm.
m/z observado
Aducto MN (Origen) Compuesto Fuente biológica Fórmula
molecular Error (ppm)
301.1057 M+H
MN13 (Co-cultivo
Purpureocillium sp PNM-67 y Streptomyces sp.
IBUN-5.1)
7,8-dihidro-3,6-dihidroxi-1,7,7,8-tetrametil-5H-furo
[2',3':5,6] nafto [1,8-bc] furan-5-ona
Penicillium herquei88
C17H1605 3 1,6,10-trihidroxi-2-
(hidroximetil)-8,10-dimetil-9(10H)-antracenona
Streptomyces sp.89
331.1160 M+H
MN13 (Co-cultivo
Purpureocillium sp PNM-67 y Streptomyces sp.
IBUN-5.1)
Auranthina Penicillium
aurantiogriseum90 C19H14N4O2 7
Penifenona C Penicillium
dipodomyiocola91
C18H18O6 3
1’’,2’’-dihidro vermistatina Penicillium rubrum,
Penicillium simplicissimum92
2,3-dihidro-2-hidroxi-5-[(6-hidroxi-4-oxo-4H-piran-2-
il)metil]-2-propil-4H-benzopiran-4-ona
Streptomyces sundarbansensis93
Deoxifrenolicina Streptomyces roseofulvus,
Streptomyces fradiae94
Phaeocromicina B
Streptomyces phaeochromogenes,
Streptomyces sundarbansensis95
393.3132 M+H
MN4 (Monocultivo
Purpureocillium sp PNM-67 y co-cultivo con
Citreoantrasteroide B Penicillium citreo-
viride96 C28H40O 4
Capítulo 5 169
m/z observado
Aducto MN (Origen) Compuesto Fuente biológica Fórmula
molecular Error (ppm)
Paenibacillus sp. PNM-115)
409.3080 M+H
MN4 (Co-cultivo
Purpureocillium sp PNM-67 y Paenibacillus sp.
PNM-115)
Citreoantrasteroide A Penicillium citreo-
viride96 C28H40O2 4
471.1661 M+H
Self-loop (Co-cultivo
Purpureocillium sp PNM-67 y Paenibacillus sp.
PNM-115)
Penilactona A Penicillium crustosum97 C25H26O9 4
485.2876 M+H
Self-loop (Monocultivo
Purpureocillium sp PNM-67 y co-cultivo con
Paenibacillus sp. PNM-115)
Prugoseno B2 Penicillium rugulosum98 C29H40O6 4
Communesina H Penicillium rivulum99 C30H36N4O2 6
301.1395 M+H
Self-loop (Monocultivo
Streptomyces IBUN-5.1 y co-cultivo con
Purpureocillium sp PNM-67)
Actinobolina Streptomyces
griseoviridis100 C13H20N2O6 2
841.5380 M+H
Self-loop (Co-cultivo
Purpureocillium sp PNM-67 y Streptomyces sp.
IBUN-5.1)
30-demetil-lydicamicina Streptomyces platensis101 C46H72N4O10 8
603.3871 M+H Self-loop 6,8a-seco-6,8a-
deoxiavermectina A2a aglicona Streptomyces avermitilis102
C35H54O8 3
170 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
m/z observado
Aducto MN (Origen) Compuesto Fuente biológica Fórmula
molecular Error (ppm)
(Co-cultivo Purpureocillium sp PNM-
67 y Streptomyces sp. IBUN-5.1)
605.4024 M+H
Self-loop (Co-cultivo
Purpureocillium sp PNM-67 y Streptomyces sp.
IBUN-5.1)
Bafilomicina D Streptomyces griseus,
Streptomyces hygroscopicus103
C35H56O8
3
Lasalocido B Streptomyces lasaliensis104
Lasalocido C Streptomyces lasaliensis104
Lasalocido D Streptomyces lasaliensis104
Lasalocido E Streptomyces lasaliensis104
En la Tabla 5-4 se resume la información para cada uno de los nodos derreplicados empleando
el DNP. Así, para cada valor de m/z se observa la red (MN) en la que se encuentra, el “origen”
que hace referencia a los monocultivos o co-cultivos donde se encuentra ese valor de m/z, el
nombre de los compuestos y la fuente biológica de dónde fue aislado, la fórmula molecular, y
el error en ppm. Se observan iones que solo tuvieron una coincidencia (hit) y otros donde hay
varias coincidencias.
Para el primer caso, se identificaron putativamente los 6 compuestos que se describen a
continuación: el citreoantrasteroide A y el citreoantrasteroide B, que fueron aislados de
Penicillium citreoviride y biosintéticamente son derivados del ergosterol96. La penilactona A
fue aislada de una cepa de Penicillium crustosum97, y no presentó actividad en ensayos de
citotoxicidad. La actinobolina fue aislada de una cepa de Streptomyces griseoviridis100, y se
caracteriza por ser un antibiótico de amplio espectro. La 30-demetil-lydicamicina fue aislada
de una cepa de Streptomyces platensis101, y se caracteriza por su actividad antimicrobiana
contra Staphylococcus aureus. La 6,8a-seco-6,8a-deoxiavermectina A2a aglicona fue aislada de
una cepa de Streptomyces avermitilis102, y pertenece al conjunto de compuestos denominados
avermectinas que se caracterizan por una potente actividad insecticida.
Los nodos de m/z 301.1057 y 331.1160 hacen parte de la red molecular donde se encuentra el
alternariol (MN13). Estos dos features son producidos únicamente en el co-cultivo entre el
hongo Purpureocillium sp. PNM-67 y Streptomyces sp. IBUN-5.1 a diferencia del alternariol, que
es producido en 4 co-cultivos como se mencionó anteriormente. Teniendo en cuenta que en la
búsqueda en el DNP se generaron varias coincidencias para estos dos picos, se empleó el
servidor web CFM-ID74 para realizar la simulación del espectro MS/MS de los compuestos
encontrados en la base de datos, y así evaluar su similitud con el espectro MS/MS experimental
de cada uno de estos features.
En el caso del pico de 301.1057 se encontró que el compuesto 7,8-dihidro-3,6-dihidroxi-
1,7,7,8-tetrametil-5H-furo [2',3':5,6] nafto [1,8-bc] furan-5-ona presentaba el mayor índice de
similitud (0.6) con su espectro MS/MS. Este compuesto ha sido previamente reportado a partir
del cultivo de Penicillium herquei88. En el caso del pico de 331.1160 se encontró que la
aurantina presentaba el mayor índice de similitud (0.638) con su espectro MS/MS. Este
compuesto ha sido aislado previamente a partir de Penicillium aurantiogriseum, y es
considerado una micotoxina y un agente nefrotóxico105.
172 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
En el caso del ión 485.2876 se encontraron dos coincidencias, la communesina H presentaba
el mayor índice de similitud entre los candidatos (0.018), sin embargo, este valor es muy bajo
para indicar que la identificación putativa es válida. En el caso del ión con m/z 605.4024 se
tuvieron 4 coincidencias, y la bafilomicina D presentaba el mayor índice de similitud entre los
candidatos (0.091), sin embargo, este valor es muy bajo para indicar que esta sea la identidad
del ión.
5.4 Conclusiones
A partir del co-cultivo entre el hongo Purpureocillium sp. PNM-67 y la bacteria Paenibacillus
sp. PNM-123 en medio PDA, se aislaron los compuestos 5,6-dihidro-2-(sec-butil)-4H-
pirrolo[1,2b]pirazol (5.1), y 5,6-dihidro-2-isopropil-4H- pirrolo[1,2b]pirazol (5.2). A juzgar
por las técnicas empleadas en el seguimiento de este co-cultivo (HPLC-DAD y RMN 1H), estos
dos compuestos no son producidos por ninguno de los aislamientos en sus monocultivos.
Además, se sugiere que son producidos por la bacteria teniendo en cuenta el gradiente de
difusión de los mismos. El compuesto 5.1 es reportado por primera vez, y se diferencia del
compuesto previamente reportado 5.2 en la cadena lateral. La producción de 5.2 había sido
previamente reportada a partir de un aislamiento Streptomyces sp. Estos compuestos tienen
similitud estructural con las withasomninas, compuestos aislados de plantas que presentan
actividades biológicas relevantes.
A partir del co-cultivo entre el hongo Purpureocillium sp. PNM-67 y la bacteria Streptomyces
sp. IBUN-5.1 en medio ISP3, se aisló al compuesto conocido como alternariol (5.3). Teniendo
en cuenta HPLC-DAD, RMN 1H y LC-MS, este compuesto no es producido por ninguno de los
aislamientos en sus respectivos monocultivos, y a juzgar por gradiente de difusión es
producido por el hongo. La inducción de este compuesto también ocurre en los
emparejamientos del hongo con las bacterias Paenibacillus sp. PNM-115, Paenibacillus sp.
PNM-123 y Paenibacillus sp. PNM-210. El alternariol es una micotoxina previamente reportada
particularmente en hongos del género Alternaria, y que ha sido ampliamente estudiada a lo
largo de los años por su toxicidad y su presencia en diversos cultivos de alimentos.
Se evaluaron las zonas de interacción correspondientes a los co-cultivos entre el hongo
Purpureocillium sp. PNM-67 y las bacterias Streptomyces sp. PNM-9, Paenibacillus sp. PNM-
115, Paenibacillus sp. PNM-123, Paenibacillus sp. PNM-210 y Streptomyces sp. IBUN-5.1. por
Capítulo 5 173
LC-MS/MS. Se seleccionaron estas 5 parejas teniendo en cuenta que en el screening realizado
previamente en medio sólido, estas interacciones mostraban cambios fenotípicos asociados a
la interacción. Para facilitar la visualización y el análisis de los datos de espectrometría de
masas se construyeron redes moleculares en la plataforma de acceso libre GNPS. Este análisis
permitió comparar los cambios en la producción metabólica entre las interacciones
establecidas. De esta manera se identificó al co-cultivo entre el hongo Purpureocillium sp. PNM-
67 y la bacteria Paenibacillus sp. PNM-115 como el de más promisorio, pues esta interacción
indujo la producción de 66 features que no se encontraban en los monocultivos
correspondientes. Además, 41 eran exclusivas a este co-cultivo, y parte de ellas tenían perfiles
de fragmentación MS/MS similares entre ellas, pero diferentes a las demás moléculas
producidas en los co-cultivos y monocultivos analizados (producción de familias moleculares).
La derreplicación haciendo uso de los datos de MS/MS a partir de las librerías del GNPS, y del
Diccionario de Productos Naturales, permitió anotar putativamente 18 features presentes en
las muestras evaluadas. Se encontraron coincidencias con compuestos de tipo leucinostatina,
ácido graso, esteroide, alcaloide pirrolidínico, benzodiazepinona, fenólico y péptido.
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105. Kalinina, S. A. et al. Auranthine, a Benzodiazepinone from Penicillium aurantiogriseum :
Refined Structure, Absolute Configuration, and Cytotoxicity. J. Nat. Prod. 81, 2177–2186
(2018).
6. Conclusiones y recomendaciones
A partir de una colección de más de 200 microorganismos se seleccionaron 15
microorganismos (14 bacterias y 1 hongo) empleando al menos uno de los criterios
identificados en la literatura para el establecimiento de co-cultivos binarios: conocimiento
previo de los aislamientos, bacteria con ácido micólico en su pared celular, criterio ecológico y
bacterias pertenecientes al género Streptomyces sp. Estos criterios se derivaron de una
revisión de la literatura; sin embargo, es importante tener en cuenta que, en la mayoría de
artículos revisados, los co-cultivos se derivan de screenings hechos a partir de las posibles
combinaciones de los aislamientos de un cepario, o el autor no reporta cómo se hizo la
selección.
En primera instancia se evaluaron todos los posibles co-cultivos binarios en medio líquido en
escala de 15mL (105 experimentos). A partir de este screening se seleccionaron 5 parejas
promisorias que fueron evaluadas en 100mL. Sin embargo, se encontró que el comportamiento
de los co-cultivos seleccionados en 100mL era diferente a los realizados en 15mL, y más
importante aún, estas condiciones no garantizaban la coexistencia de los dos microorganismos
que hacían parte de la interacción. Que las condiciones aquí manejadas no hayan garantizado
coexistencia de los microorganismos no implica que el medio líquido no sea una opción válida
para el establecimiento de co-cultivos, sino que es necesario explorar otras condiciones de
fermentación para estos microorganismos, por ejemplo el uso de membranas que permitan
que los microorganismos interactúen únicamente por medio de sus compuestos difusibles, así
como la exploración de otros parámetros de fermentación no evaluados en este trabajo (por
ejemplo, diferentes medios de cultivo, pH). En cuanto al tiempo de fermentación total se
recomienda ensayar tiempos más cortos que los empleados en este trabajo.
Con el objetivo de solucionar el problema de coexistencia, en esta tesis se realizó un screening
en medio sólido en el que se podía regular de manera más sencilla el contacto entre los dos
microorganismos, lo que podría estar relacionado con la supervivencia de los mismos. Así
184 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
mismo el medio sólido permite valorar visualmente cambios fenotípicos asociados a la
interacción que podrían facilitar el proceso de priorización de parejas de co-cultivo.
Teniendo en cuenta esto, se realizaron 151 ensayos en medio sólido involucrando
interacciones a distancia e interacciones por contacto. En el caso de los co-cultivos bacteria-
bacteria los cambios fenotípicos no se tradujeron en cambios en la producción metabólica a
juzgar por las técnicas empleadas (HPLC-DAD y RMN), mientras que en el caso de los co-
cultivos bacteria-hongo la mayoría de cambios fenotípicos sí se tradujeron en cambios en la
producción metabólica visibles por HPLC-DAD y RMN. Es importante tener en cuenta que, si
bien en algunos casos no fue posible ver cambios metabólicos asociados a los fenotípicos, esto
no implica que no existiesen, sino que tal vez no fueron detectados analíticamente, y que
requieren de una técnica más sensible como la espectrometría de masas, que se ha empleado
ampliamente en este tipo de estudios. No obstante, el seguimiento de los co-cultivos por LC-
MS no garantiza que el (los) compuesto(s) detectados sean aislables, pues se pueden detectar
compuestos en baja cantidad; por otro lado, el seguimiento del co-cultivo por RMN debería
conducir con mayor probabilidad al aislamiento de los compuestos por que solamente se
detectarán compuestos presentes en alta concentración.
A partir del screening en medio sólido se seleccionaron 7 interacciones promisorias, 2 por
contacto y 5 a distancia. La gran ventaja de las interacciones a distancia es que permiten
regular tiempos de inoculación entre microorganismos, lo que se traduce en mejor crecimiento
para cada uno de ellos, y, por lo tanto, garantiza en gran medida la coexistencia de los
microorganismos. Además, los resultados de esta metodología en esta tesis mostraron un
mayor grado de reproducibilidad en comparación a las interacciones por contacto. Por lo
anterior se sugiere que, en la realización de un screening en medio sólido, se emplee en primera
instancia una estrategia a distancia.
A partir del co-cultivo a distancia entre el hongo Purpureocillium sp. PNM-67 y la bacteria
Paenibacillus sp. PNM-123 en medio PDA se aislaron los compuestos 5,6-dihidro-2-(sec-butil)-
4H-pirrolo[1,2b]pirazol (5.1) y 5,6-dihidro-2-isopropil-4H- pirrolo[1,2b]pirazol (5.2). El
compuesto 5.1. no había sido previamente reportado en la literatura, mientras que el 5.2 se
había obtenido a partir de un Streptomyces sp. Estos dos compuestos, a juzgar por el gradiente
de difusión, son producidos por la bacteria, y solo fueron detectados en el co-cultivo. Otros
compuestos similares no han sido reportados en microorganismos, lo que sugiere lo
Conclusiones 185
interesante que sería profundizar en las actividades biológicas y la ruta biosintética de estos
dos compuestos.
Las otras cuatro interacciones a distancia que mostraron producir compuestos inducidos por
el co-cultivo fueron entre el hongo Purpureocillium sp. con las bacterias Paenibacillus sp. PNM-
115, Paenibacillus sp. PNM-123, Paenibacillus sp. PNM-210 y Streptomyces sp. IBUN-5.1, todas
ellas en medio ISP3. El co-cultivo entre el hongo y la bacteria Streptomyces sp. IBUN-5.1. fue
realizado en mayor volumen, y permitió el aislamiento del compuesto conocido como
alternariol (5.3), una reconocida micotoxina. La inducción de este compuesto también ocurre
en los emparejamientos con las otras 3 bacterias previamente mencionadas, y no es producido
por ninguno de los aislamientos en sus respectivos monocultivos. El análisis por LC-MS/MS,
visualizado y analizado mediante la construcción de redes moleculares, permitió identificar al
co-cultivo entre el hongo Purpureocillium sp. PNM-67 y a la bacteria Paenibacillus sp. PNM-115
como el más promisorio para un posterior estudio químico por producir 66 features que no se
encontraban en los monocultivos correspondientes.
Por otro lado, las dos interacciones por contacto mostraron cambios en la producción
metabólica al ser analizados por LC-MS/MS, por ejemplo, la inducción en el hongo de
leucinostatinas y compuestos análogos en su co-cultivo con Rhodococcus sp. RKHC-26. Sin
embargo, es necesario evaluar otras condiciones de fermentación de manera que se garantice
una mayor reproducibilidad y en un estudio químico futuro se garantice el aislamiento de
compuestos asociados a la interacción. Las dos interacciones aquí estudiadas son de gran
interés pues ambas incluyen a la bacteria con ácido micólico Rhodococcus sp. RKHC-26
demostrando que estas bacterias tienen la capacidad de inducir cambios en la producción
metabólica como previamente se había reportado. Además, mientras que uno de los co-
cultivos es una interacción Streptomyces sp. vs Bacteria con ácido micólico, de la que ya existen
varios reportes; la otra es hongo vs. bacteria con ácido micólico, una pareja de interacción no
reportada anteriormente. Que estos dos co-cultivos evidencien cambios en la producción
metabólica solo cuando son realizados por una metodología por contacto está de acuerdo con
la información que existe en literatura que indica que para que la bacteria con ácido micólico
ejerza su efecto, debe estar viva y en contacto directo con el otro microorganismo.
Es importante tener en cuenta que, si bien la selección de microorganismos a partir de criterios
reportados en la literatura que se hizo al comienzo de este trabajo, permitió finalmente
186 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción diferencial de metabolitos especializados
obtener parejas prometedoras para los estudios químicos realizados, los estudios que evalúan
una gran cantidad de interacciones sin restricción previa en la selección pueden brindar a
futuro nuevos criterios que faciliten a otros investigadores el establecimiento de co-cultivos.
Además, como se observó en este trabajo, factores como el medio de cultivo, el tiempo de
fermentación y el tipo de interacción inciden dramáticamente en el éxito del co-cultivo, y
teniendo en cuenta que estos factores son altamente dependientes de cada microorganismo,
no se pueden realizar generalizaciones metodológicas a la ligera. Estudios que pretendan
evaluar múltiples interacciones en diferentes condiciones simultáneamente pueden ser una de
las estrategias que brinden información que se traduzca en criterios de selección y estudio de
co-cultivos más acertados.
Finalmente, a partir de los experimentos desarrollados en esta tesis, se realizan varias
sugerencias para estudios futuros. Primero, en el caso de utilizar criterios de emparejamiento,
se sugiere utilizar el de bacteria con ácido micólico vs. bacteria u hongo, pues fue el que
mejores resultados brindó en esta tesis. Teniendo en cuenta que es necesario el desarrollo de
otros criterios de emparejamiento efectivos, se sugiere emplear un set de microorganismos
más numeroso y evaluar todas las posibles interacciones entre ellos de manera que se puedan
detectar tendencias en las interacciones observadas. En el caso del esquema de trabajo a
emplear, se sugiere evaluar en primera instancia interacciones a distancia en medio sólido, por
las ventajas antes mencionadas. Todas aquellas parejas que presenten un cambio fenotípico
apreciable cuando entran en contacto, pueden ser evaluadas en un ensayo de interacción por
contacto. Este tipo de ensayo debe ser mejorado con el fin de garantizar reproducibilidad, ya
sea en medio sólido o líquido. Se recomienda el uso de varios medios de cultivo, su selección
dependerá de los aislamientos involucrados en las interacciones.
Si bien en este trabajo se les dio prioridad a las técnicas de HPLC-DAD y RMN como estrategia
para el monitoreo de la producción metabólica buscando el aislamiento de compuestos, el uso
de LC-MS/MS unido al uso de redes moleculares y estrategias de derreplicación también
demostró ser una técnica valiosa para evaluar la relación entre los metabolitos producidos en
varias interacciones. En estudios químicos futuros, se sugiere la integración de estas 3 técnicas
tanto en el perfilado metabólico de los extractos orgánicos, como en el fraccionamiento y
aislamiento de compuestos, teniendo siempre en mente las ventajas de cada una en cuanto a
sensibilidad, información química otorgada y costo.
Producción académica
Martínez-Buitrago, P., Ramos, F., Castellanos, L. “Binary co-culture selection from marine-
derived microorganisms for differential production of specialized metabolites”, Quim.
Nova, Vol. 42, No. 7, 713-719, 2019.
Bogotá Microbial Meeting 2017, Agosto 18-19 de 2017. Póster: “Microorganismos del caribe
colombiano como fuente de compuestos para el control de fitopatógenos: explorando la
diversidad química en mono y co-cultivos”.
XXVI Italo Latin American Congress of Ethnomedicine SILAE and the IX Colombian
Congress of Chromatography, Septiembre 25-29 de 2017. Póster: “Microorganisms from the
Colombian Caribbean Sea as a source of compounds for phytopathogen control: Exploring
chemical diversity in mono-cultures and co-cultures”.
Bogotá Microbial Meeting 2018, Agosto 9-10 de 2018. Póster: “Co-cultivo de
microorganismos de origen marino como estrategia para la producción de metabolitos
especializados”.
A. Anexo: Información suplementaria Capítulo 4
Figura A-1. Espectro de RMN 1H para el compuesto 4.2
190 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción de metabolitos especializados
B. Anexo: Información suplementaria Capítulo 5
Figura B.1. Espectro RMN 1H para el compuesto 5.2
Anexos 191
Figura B.2. Espectro COSY para el compuesto 5.2
192 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción de metabolitos especializados
Figura B.3. Espectro HMBC para el compuesto 5.2
Anexos 193
Figura B.4. Espectro RMN 1H para el compuesto 5.3
194 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción de metabolitos especializados
Figura B.5. Espectro COSY para el compuesto 5.3
Anexos 195
Figura B.5. Espectro HSQC para el compuesto 5.3
196 Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la
producción de metabolitos especializados
Figura B.6. Espectro HMBC para el compuesto 5.3