Comparacion de Dos Metodos Cromatograficos de Lactoferrina
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Comparación de dos procesos cromatográficos para la purificación de lactoferrina a partir de suero de queso Martínez-García M. J., Guzmán-Partida, A. M., Vázquez-Moreno, L y Ramos-Clamont M.
G*.
Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo A.C. Carretera a la Victoria Km 0.6
Hermosillo, Sonora. Coordinación de Ciencia de los Alimentos. Tel/fax 662 280 00 58. e-
mail [email protected]
Resumen El suero lácteo subproducto de la elaboración de queso cuya Demanda Bioquímica de
Oxígeno (DBQ) es de 50,000 ppm se descarga contaminado las aguas y suelos
mexicanos. La recuperación de sus nutrientes, entre ellos, las proteínas, disminuye la
DBQ hasta en un 95%. Las proteínas del suero pueden utilizarse en las industrias
alimentaria y farmacéutica, como la Lactoferrina (Lf), proteína con funciones
antibacterianas, antioxidantes e inmunomodulatorias. Se compararon dos procesos para
la purificación de Lf, las cromatografías de intercambio iónico (IEC) y de afinidad por
metales inmovilizados (IMAC). En la IEC se utilizó Sulfopropil-Sefarosa, la adsorción de
proteínas se promovió con solución de fosfatos (PBS), pH 6.7 y la elución aplicando un
gradiente de NaCl (0.1 a 1 M). La matriz aceptó hasta 800 mg de proteína de suero
obteniéndose 3.29 ±1.4 mg de Lf. Para IMAC se utilizó Sefarosa-IDA-Cu++, la adsorción
de las proteínas se promovió con Tris-Ac. Acético 0.05M, NaCl 0.5M, pH 5 y la elución
con la misma solución a pH de 4 y 3. La matriz aceptó hasta 80 mg de proteína de suero
obteniéndose 0.08 mg de Lf contaminada con inmunoglobulinas. En conclusión IEC fue
más efectiva que IMAC para la purificación de lactoferrina.
Abstract Whey is a byproduct of the cheese making process with a biological oxygen demand
(BOD) of 50, 000 ppm. Whey represents an environmental problem for Mexico because is
disposed in water and lands. However the nutrient recovery of whey can reduce DOD in
95%. Whey proteins have potential applications in food and clinical industries. One of
them, Lactoferrin (Lf) is know to act as antibacterial, antioxidant and immunomodulator
factor. A comparison of two chromatography process for lactoferrin purification was done.
For LF purification with Ion Exchange Chromatography (AEC) a Sulphopropyl-Sepharose
matrix was used. Protein adsorption was promoted with PBS buffer, pH 6.7 while elution
2
was complete using a NaCl gradient (0.1 a 1 M). Matrix accepted up to 800 mg of whey
proteins and eluted 3.29 ±1.4 mg of Lf. Purification of Lf by Immobilized metal ion affinity
chromatography (IMAC) was done using a Sepharose-IDA-Cu++ matrix. Protein adsorption
was promoted with 0.05M Tris-Acetic acid, 0.5M NaCl, pH 5 while elution was complete
using the same solution at pH of 4 y 3 respectively. Sepharose-IDA-Cu++ matrix accepted
up to 80 mg of whey protein and eluted 0.08 mg of lactoferrin and immunoglobulins. In
conclusion AEC was more effective for Lf purification than IMAC.
Introducción
La producción de queso en México es una actividad rentable que aumenta año
con año. Sin embargo, durante el proceso de elaboración, se genera una gran cantidad
(relación 9:1 con respecto al queso) de suero lácteo el cual generalmente se elimina
como efluente, constituyendo un problema potencial de contaminación. La Demanda
Bioquímica de Oxígeno (DBO) del suero es de 50,000 ppm, un programa de recuperación
de nutrientes del suero podría reducir hasta en un 95% el valor de la DBO de las aguas
residuales de la industria láctea. Esto también aumentaría la rentabilidad de la empresa
(CONAMA, 1998).
Entre las proteínas del suero que pueden recuperarse se encuentra la lactoferrina
(Lf). Esta glicoproteína de 80 kDa tiene la capacidad de unir y transportar el hierro a
través de la sangre. Además, presenta otras funciones como su actividad bactericida,
antioxidante e inmunomodulatoria, que pueden aprovecharse tanto en la industria
alimentaria como en la farmacéutica. Las principales fuentes comerciales de Lf son el
suero de queso y la leche descremada, ambas de origen bovino (Tomita et al., 2002).
Para el 2003, se estimó una producción mundial de 73 toneladas de Lf; Nueva Zelanda
es el principal productor, mientras que Asia y Europa la consumen como suplemento
alimenticio o como antimicrobiano en cosméticos y pastas de dietes. Recientemente la
FDA aprobó el uso de lactoferrina en canales de carne para el control del crecimiento
microbiano (Wakabayashi et al., 2006).
El aislamiento y purificación de proteínas se basa en estrategias que exploten
propiedades físicas químicas y biológicas de la molécula tales como su carga, su
tamaño, su solubilidad, o sus propiedades de unión específica a otras moléculas. En base
a lo anterior, las proteínas pueden separarse por diversos métodos entre los que
destacan la precipitación por salado o con solventes y los métodos cromatográficos.
Estos últimos presentan la ventaja de ser más específicos y flexibles en lo que al
establecimiento de condiciones se refiere, lo que permite preservar más fácilmente la
estabilidad y la actividad biológica de la proteína purificada (Burnouf, 1995). En este
3
trabajo se comparan dos tipos de cromatografías IEC e IMAC para la purificación de
lactoferrina a partir de suero de queso.
Materiales y Métodos Materiales
Los ensayos de inmunodetección se realizaron con anti-Lf bovina producida en
cabra y anti IgG de cabra ligada a peroxidasa producida en conejo de los Laboratorios
Bethyl Labs (Montgomery, TX, EUA). La matriz cromatográfica Sulfopropil-Sefarosa se
adquirió en GE Healthcare (Upsala, Suecia). La matriz cromatográfica Sefarosa-IDA se
sintetizó en la Universidad de Arizona según Porath y Olin (1995). El resto de los
reactivos utilizados se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). El suero se
obtuvo de la elaboración de queso fresco por el método tradicional.
Purificación de lactoferrina
La purificación se llevó a cabo en un equipo ÄKTA Purifier (GE Healthcare,
Suecia). Para la IEC se utilizó una matriz de Sulfopropil-Sefarosa empacada en una
columna XK16 a un volumen de cama (VC) de 10 mL. La matriz se equilibró con 5 VC de
pBS 10 mM, pH 6.7 (Solución A). El suero (200-1600 mg de proteína total), se aplicó a la
columna y se promovió la adsorción de sus proteínas en presencia de la solución A,
misma que se utilizó como fase móvil y solución de lavado. Las proteínas débilmente
unidas se eliminaron con solución A con NaCl 0.1 M. La elución se promovió
desarrollando un gradiente de 0.1–1 M de NaCl. La columna se regeneró con 5 VC de
NaCl 1 M, 2 VC de NaOH 1 M y 10 VC de agua Milli Q.
Para la purificación de Lf por IMAC se utilizaron 10 mL de VC de Sefarosa-IDA-
Cu++. La matriz se equilibró con 5 VC de Tris-Ac. Acético 0.05M, NaCl 0.5M, pH 5
(Solución B). Las proteínas del suero (20-80 mg) se aplicaron a la columna, se promovió
la adsorción con solución B y la elución fue con la misma solución a distinto pH (4 y 3). La
matriz se regeneró con 5 VC de Guanidina 4M, 5 VC de EDTA 10 mM y 10 VC de agua
MilliQ. En ambos casos la proteína se estimó por el método de Bradford (1970) utilizando
una curva estándar de albúmina de suero bovino (BSA). La caracterización de las
fracciones cromatográficas de IEC e IMAC se realizo por electroforesis SDS-PAGE en
geles de poliacrilamida al 10% tiñendo con plata (Laemmli, 1970) y por inmunodetección
con anti-lactoferrina bovina con Western Blot con el sistema avidina-peroxidasa (Towbin
et al., 1979).
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Resultados y Discusión En la figura 1 se muestra el cromatograma típico de la purificación de lactoferrina por
cromatografía de intercambio iónico. El pico 1 muestra la fracción de lavado obtenida con
16 VC, los picos restantes son las eluciones de las proteínas adsorbidas. Las proteínas
que no se adsorbieron específicamente (pico 2), fueron retiradas de la matriz con 7 VC de
la solución A conteniendo NaCl 0.1 M. Posteriormente se realizó un gradiente de NaCl de
0.1-1 M en solución A y se obtuvieron otros dos picos de elución (picos 3 y 4). El pico 3
eluyó con 12 VC a una concentración entre 0.1-0-5 M de NaCl a mientras que el pico
cuatro se obtuvo entre 0.5-1.0 M de NaCl con 12 VC. Las alturas máximas de los picos 3
y 4 se obtuvieron a 0.24 M y 0.75 M de NaCl, respectivamente. Se cargaron desde 200
hasta 1600 mg de proteínas de suero a la matriz cromatográfica, pudiéndose trabajar a
un flujo de fase móvil de 5 mL/min. Los balances de materia mostraron que la columna se
satura al aplicar 800 mg de proteínas de suero y que la capacidad de la matriz es de 0.33
mg de lactoferrina /mL de matriz cromatográfica. Sin embargo, la lactoferrina más pura
(1.60 ± 0.12 mg) se obtiene aplicando 400 mg de proteína a la matriz. La cantidad
obtenida corresponde al contenido reportado en la literatura. La duración del proceso fue
de 4 h.
Figura 1. Cromatograma típico de la purificación de lactoferrina por intercambio iónico. La
adsorción de proteínas se promovió en presencia de PBS pH 6.7 (pico 1). Las proteínas
que no se unieron de manera específica fueron desprendidas con NaCl 0.1 M (pico 2).
Posteriormente se eluyó con un gradiente de 0.1-1 M de NaCl (picos 3 y 4). En el extremo
izquierdo se muestra la electroforesis del pico 4 en el que se obtuvo la Lf (carril 2) y la
5
confirmación por inmunodetección con anti-lactoferrina (carril 3).
En el extremo derecho de la figura 1 se muestra la migración electroforética del pico
4 (carril 2) al aplicar 400 mg de proteína de suero de queso. Se observa una banda de
80 kDa correspondiente a la masa molecular de la Lf bovina (Levay y Viljoen, 1995). No
se observa contaminación con alguna otra proteína. La inmunodetección con anti-
lactoferrina bovina (carril 3), confirmo la presencia de la proteína.
La figura 2 presenta el cromatograma típico y la electroforesis de las fracciones
obtenidas por IMAC para la purificación de Lf. En el cromatograma se observan 3 picos
correspondientes al lavado (Solución B, pH 5) y a las eluciones con solución B a pH 4 y 3,
respectivamente. La matriz aceptó desde 20 a 50 mg de proteínas de suero saturándose
con 40mg. La velocidad máxima de la fase móvil fue de 1 mL/min. La capacidad de la
matriz fue de 0.1 mg de proteína /mL de matriz, obteniéndose un máximo de 0.08 mg de
proteína en un proceso de 4 h. Sin embargo, la Lf no pudo obtenerse pura en este tipo de
cromatografía como indica el carril 4 de la figura 2B en el que se observa una banda de
80 kDa correspondiente a la Lf y otras bandas de 66, 55 y 25 kDa correspondientes a la
albúmina sérica y a las cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas,
respectivamente. Debido a esta contaminación, fue necesario acoplar una columna de
Sefarosa-Heparina a IMAC, con el fin de aplicarle la elución a pH 4 y obtener la Lf pura
añadiendo 4 h más al proceso (Datos no mostrados).
En el Cuadro 1 se resumen los aspectos más relevantes de la comparación de
ambos procesos cromatográficos. Como puede observarse la cromatografía de
intercambio iónico requiere de la mitad del tiempo de proceso (4 h) para obtener de 18 a
20 veces más lactoferrina que la cromatografía de afinidad por metales inmovilizados. En
este último proceso debe además, acoplarse una cromatografía de afinidad por heparina
para obtener la lactoferrina pura, ya que, como se observó en los patrones
electroforéticos de la figura 2, la Lactoferrina obtenida por IMAC se encuentra
contaminada con albúmina e inmunoglobulinas. Otro aspecto importante es que, debido a
que la matriz de intercambio iónico acepta mayores flujos de la fase móvil sin
comprimirse (5 mL/min) y acepta una mayor cantidad de proteínas sin saturarse, tiene
capacidad de escalamiento del proceso
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Figura 2. Purificación de lactoferrina de suero de queso por IMAC. A) Cromatograma
típico. La adsorción se promovió en presencia de solución Tris Ac. Acético, pH 5 (pico 1.
La elución de las proteínas adsorbidas se realizó con la misma solución pero a pH 4 y 3
(picos 2 y 3), respectivamente. B SDS-PAGE al 10% de las fracciones cromatográficas.
Carril 1 estándares de masa molecular, carril 2 suero de queso, carril 3 fracción de lavado
(pico1), carril 4 fracción de elución a pH 4 (pico 2), carril 5 fracción de elución a pH 3.
La tabla 1 resume los aspectos más relevantes en la comparación de los dos procesos de
purificación.
Cuadro 1. Comparación de los dos procesos cromatográficos para purificación de
lactoferrina de suero de queso
Tipo de cromatografía
Intercambio Iónico Afinidad por Metales Inmovilizados
Matriz cromatográfica Sulfopropil-Sefarosa Sefarosa-IDA-Cu++ Cantidad de proteína que acepta la matriz
400-800 mg 35-40 mg
Velocidad de flujo 5-10 mL/min 0.5-1 mL/min Capacidad de la
matriz 0.33 mg de Lf/ml de matriz 0.1 mg proteína/mL de matriz
Lactoferrina obtenida Pura Contaminada, se requiere acoplamiento con cromatografía en
Sefarosa-Heparina Lactoferrina/corrida 1.60 a 3.29 mg
0.08 a 0.14 mg
7
Referencias Bibliográficas
• Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye-binding. Anal. Biochem. 72:248-254.
• Burnouf, T. 1995. Chromatography in plasma fraction: benefits and future trends. J. Chromatogr. B. 664:3-15.
• CONAMA. 1992. Guía para el control y la prevención de la contaminación industrial. Productos Lácteos. Comisión Nacional del Medio Ambiente. Chile
• Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4. Nature. 227:680-685.
• Levay, P.F., and Viljoen, M. 1995. Lactoferrin: a general review. Acta Haematol. 80:252-267
• Towbin, H., Staehelin, T., and Gordon, J. 1979. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. 76:4350-4354.
• Tomita, M., Wakabayashi, H., Yamauchi, K., Teraguchi, S., and Hayasawa, H. 2002. Bovine lactoferrin and lactoferricin derived from milk: production and applications. Biochem. Cell Biol. 80:109-112.