CDNICYT ralb COMISIÓN NACIONAL DE INVESTIGACIÓN CENIfACA Y TECNOLÓGICA 5

Concurso Nacional de Proyectos FONDECYT 2004GOBIERNO DECHILE

COMPROBANTE DE RECEPCION DE INFORME FINAL

NUMERO : 1040573# RESPONSABLE :GERMAN RICARDO CUNTHER SAPUNAR RUT :8128522-5 TIPO :FONDECYTREG. ETAPA :2007 DURACION : 4 Ano(s)

TITULO CARACTERIZACION FISICOQUIMICA DE MICELAS DE ESTERES DE SACAR OSA Y LIPOSOMAS MIXTOS DE CLORURO DE DIOCTADECILDIMETILN4ONI

DISCIPLINA :FISICO-QUIMICA (QUIMICA) FolvDECYT FECHA RECEPCION :14/03/2008

TIMBRE REOEPCION

Fondecyt FONDO NACIONAL DE DESARROLLO

CIENTÍFICO Y TECNOLÓGICO

INFORME FINAL GOBIERNO DE CHILE

COICVT FONDfCVT PROYECTO FONDECYT REGULAR

1040573 4 Años 2007 NÚMERO PROYECTO DURACIÓN AÑO DE EJECUCIÓN

GERMAN RICARDO GUNTHER SAPUNAR 8.128-522-5 INVESTIGADOR(A) RESPONSABLE RUT

Olivos 1007, Independencia 9782876 DIRECCION FONO

GGUNTHER@CIQ.UCHILE.CL E-mali

PERIODO QUE INFORMA 16 / marzo / 2007 1 14 / marzo / 2008 DESDE 1 HASTA

CONTENIDO (MARQUE CON UNA X EL CASILLERO QUE CORRESPONDA)

INCLUYE NO INCLUYE

Formulario de Informe Final SI Publicaciones SI Resumen de Tesis Título/Grado SI Información acerca de inventos y patentes NO Otros (especificar) NO Informe Incentivo Coop. Internacional (Si corresponde) NO

Coinvestigador 2am . Firma Invsti,gador(a)

Fecha: 12 / marzo 1 2008

CONTENIDO DEL INFORME FINAL

I. CUMPLIMIENTO DE LOS OBJETIVOS PLANTEADOS EN EL PROYECTO. Marque con una X el casillero correspondiente.

Cumplimiento Fundamentación para el cumplimiento Si Parcial No Objetivos parcial o incumplimiento

1. Síntesis estereoselectjva de Los compuestos propuestos fueron sintetizados, monoésteres de sacarosa con Ac. O O pero no en forma estereoespecifica como era la grasos con distintos largos de intención inicial. cadena hidrofóbica, derivados esterificados en la posición 6-0 de la sacarosa, de los ácidos Mirístico, Palmítico y Esteárico 2. Purificación de los monoésteres de sacarosa, cuando sea necesario, empleando técnicas de cromatografía líquida de alta eficiencia a escala semi preparativa.

3. Análisis y caracterización de los o o ésteres de sacarosa por Resonancia Magnética Nuclear 1 H y Cromatografía Gaseosa, Cromatografía Líquida, Espectrometría de Masa, Análisis Elemental, etc

4. Determinación de la r- O O concentración micelar crítica de todos los surfactantes obtenidos. Determinación del número de agregación micelar para cada uno de los surfactantes estudiados. Determinación de la micropolaridad y la microviscosidad de las micelas formadas para cada uno de los detergentes usando la variación de la razón I j /1 3 de las bandas del pireno para la micropolaridad y la anisotropía de la fluorescencia de sondas.

S. Determinación de la dependencia de la CMC, del número de 0 LI agregación, de la micropolaridad y de la microviscosidad con la presencia de aditivos como alcoholes alifáticos lineales y ramificados de largo de cadena intermedio y de colesterol.

6. Estudio de la dependencia del número de agregación con la temperatura.

7. Determinación de las constantes o El La metodología que se emplea para este de reparto de diversos aditivos tipo de experiencias resultó ser inadecuada entre la pseudofase acuosa y la para los sistemas sometidos a estudio. pseudofase micelar.

8. Estudio del efecto de la O O presencia de surfactante sobre las 1L

vesículas, en función de la concentración.

9. Determinación de la micropolaridad y la microviscosidad

de las vesículas de DODAC y DPPC, con distintas proporciones del éster de sacarosa.

10. Evaluación del efecto de la presencia del cosurfactante sobre o

las temperaturas de transición de fase y sobre la formación de dominios.

11. Evaluación de las modificaciones6d

A pesar de que la metodología empleada de las propiedades de solubilización para este tipo de experiencias presentó de vesículas de DODAC y DPPC por dificultades, se rediseñaron las la presencia del cosurfactante y experiencias, para cumplir con este sobre la velocidad de salida de objetivo. diferentes compuestos confinados al compartimiento acuoso interno de vesículas.

Otro(s) aspecto(s) que Ud. considere importante(s) en la evaluación del cumplimiento de los objetivos planteados en la propuesta original o en las modificaciones autorizadas por los Consejos.

Adicionalmente a los objetivos planteados en la propuesta de este proyecto, se desarrollaron una serie de experiencias, que permitieron cumplir objetivos que se detallan a continuación.

1) Determinación de parámetros del octil sacarosa (adición al Objetivo 4, reportado el primer año de proyecto)

II) Solubilización de Liposomas de DPPC por Esteres de Sacarosa. III) Solubilización de Vesículas de DODAC y Liposomas de DPPC por Octil Sacarosa. IV) Solubilización de Liposomas de POPC y POPC-Colesterol con Miristil Sacarosa. IV) Extracción de colesterol con ciclodextrinas y HDL desde liposomas de POPC y POPC-ester

de sacarosa. V) Extracción de colesterol con ciclodextrinas y HDL desde liposomas de DODAC y DODAC-

ester de sacarosa. VI) Solubilización eritrocitos (estudio in Vitro) con miristil sacarosa, empleando metodologías

de microscopía bifotónica.

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II. RESULTADOS OBTENIDOS

Describa brevemente los resultados obtenidos en el proyecto en un máximo de cinco páginas, tamaño carta, espacio seguido. Para cada uno de los objetivos específicos, describa o resuma los resultados. Relacione las publicaciones y/o manuscritos enviados a publicación con los objetivos específicos. Incluya en anexos, la información de apoyo que estime pertinente y necesaria para la evaluación.

* ------------Síntesis (Objetivo 1):

Para la obtención de las moléculas de estudio, se utilizaron las metodologías mencionadas en la formulación general del proyecto: 1) Transesterificación en medio básico y ji) Ataque electrofílico regioselectivo sobre un complejo azúcar-óxido de dibutilestaño. Se confirmaron las observaciones preliminares, ambos procedimientos dan origen a los tres monómeros posibles y una mezcla compleja de varios diésteres y triésteres. Es decir, todas las experiencias sintéticas efectuadas dieron origen a una mezcla compleja de ésteres de sacarosa, y en ningún caso fue posible evitar abordar el objetivo 2. Se sintetizaron los tres compuestos propuestos: miristil, palmitil y estearil éster de sacarosa, y además se prepararon el éster del ácido laurico y el del ácido octílico, con el propósito de disponer de un mayor número de compuestos en la serie de diferentes largos de cadena.

Purificación (Objetivo 2):

La purificación de los compuestos a partir de los crudos semipurificados de reacción, se realizó empleando indistintamente metodologías HPLC preparativas o cromatografía en columna de sílica a baja presión. Se utilizó una u otra metodología dependiendo de la masa de crudo obtenido. La elución, en ambos casos, se realizó empleando como solvente una mezcla cloroformo: metano¡ 3:1, las fracciones colectadas se analizaron por placa fina. Se aislaron los monoésteres 6-0 y algunos diésteres de todos los compuestos sintetizados. El monoéster derivado del ácido octílico resultó ser poco estable y se descompuso tras ser purificado, con relativa rapidez.

Análisis (Objetivo 3):

Los espectros de resonancia magnética nuclear de todos los monoésteres coincidieron con los descritos en la literatura y su pureza se estableció por HPLC y placa fina.

Caracterización de las Micelas (Año 2004, Objetivo 4):

Las concentraciones micelares críticas de los ésteres aislados se determinaron, empleando:

la razón entre las bandas 1 y 111 del pireno, parámetro directamente relacionado con la micropolaridad del ambiente sensado. Los valores de cmc evaluados para cada surfactante, y en función de la temperatura se muestran en la Tabla 1 del anexo, en este caso el comportamiento de las cmc en función de la temperatura, permitió evaluar los parámetros termodinámicos asociados al proceso de micelización, que también se incluyen en la Tabla 1. la polarización generalizada del laurdan, GP, nos muestra la rigidez de la zona que sensa la prueba, pudiendo asimilarse a la microviscosidad de dicha zona. En este caso tanto los valores de cmc como su dependencia con la temperatura son diferentes a lo obtenido con pireno como sonda. La dependencia observada no permitió realizar el estudio termodinámico con estos valores de cmc. Como se puede ver además por los resultados entregados en la Tabla 2, la adición del surfactante debe realizarse desde solución acuosa, pues en presencia de solventes como el DMSO la micela sufre alteraciones significativas. medidas de tensión superficial (realizadas con un tensiómetro de du Noy), los resultados se muestran en la Tabla 3. Se evaluaron además las tensiones límite de los cuatro surfactantes y a partir de la pendiente del gráfico de la cmc contra el logaritmo natural de la concentración el exceso superficial y el área ocupada por cada molécula de surfactante. Y finalmente los parámetros críticos de empaquetamiento.

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Con las mismas sondas empleadas para determinar la cmc, se determinaron además la polaridad y la microviscosidad, de las micelas formadas por cada uno de los surfactantes. Estas medidas nos permiten establecer el valor de la propiedad en el momento en que las micelas empiezan a formarse (a concentraciones levemente superiores a la cmc) y además establecer si a concentraciones mayores del surfactante las micelas mantienen sus propiedades o sufren alteraciones. Los datos de las tablas 4 y 5 permiten establecer que:

1) la polaridad de la zona sensada por el pireno aumenta levemente con el largo de cadena y a medida que aumenta la concentración la polaridad de las micelas se mantiene relativamente constante excepto para el MES, que muestra una reducción sostenida de la polaridad. En todos los casos la polaridad cuando recién se forman las micelas es mayor que en el plateau.

u) La microviscosidad muestra un comportamiento irregular con una disminución inicial de los valores de GP (aumento de la fluidez), seguida de un aumento (rigidización del entorno de la prueba) al alargarse la longitud de las cadenas del éster. Al alcanzar el plateau, en todos los casos la microviscosidad se mantiene relativamente constante.

Se determinaron además los números de agregación empleando metodologías estacionarias y resueltas en el tiempo, los números de agregación obtenidos muestran una importante dependencia con la prueba que se emplea para desactivar al pireno. Los valores determinados, Tabla 6, son similares a los reportados para otros surfactantes no iónicos.

Incorporación de sustratos a las micelas (Año 2004, Objetivo 5):

La incorporación de alcoholes alifáticos al medio provoca cambios en la cmc de los surfactantes estudiados. Los alcoholes alifáticos de cadena lineal (n-propanol), provocan un aumento del valor de la cmc en los cuatro casos. Con alcoholes alifáticos ramificados (¡so-propano¡) el lauril derivado muestra un aumento de la cmc, mientras que para los ésteres de cadenas más largas no hay efecto apreciable, se observa, eso sí, una leve reducción en el caso del miristil y un leve aumento en el caso del estearil. Estos resultados se muestran en la Tabla 7 del anexo.

Se analizó que cambios sufren las propiedades termodinámicas de la micela a medida que el sustrato se incorpora en ella. Al mantener la concentración de surfactante constante, el aumento de la concentración del sustrato agregado (varios alcoholes alifáticos y colesterol), provoca que la polaridad de la micela vaya disminuyendo sostenidamente, la razón 1/111 del pireno va tomando valores menores. La microviscosidad analizada en similares condiciones, usando la GP del Laurdan muestra un comportamiento más complejo, en la mayoría de los casos se observa un aumento de GP al inicio (rigidización del entorno de la sonda), para luego de alcanzar un máximo empezar a disminuir. En algunos casos se observa reducción de la microviscosidad desde el principio. Este comportamiento se ejemplifica en la figura 1 del anexo. La incorporación de colesterol a las micelas resulto ser un proceso lento por lo que se analizó en el tiempo el cambio de la polaridad y rigidez de las micelas, en las tablas 8 y 9 se muestran los cambios de la razón ¡/111 y de la polarización generalizada del Laurdan, respectivamente.

Adicionalmente a los Objetivos planteados, se desarrollaron las experiencias y resultados que se exponen a continuación.

Se desarrolló un método espectroscópico para estudiar la capacidad de este tipo de surfactantes para repartirse en vesículas pequeñas (SUVs) de DODAC y luego solubilizarlas. Las interacciones que operan durante este proceso, se analizaron empleando la polarización generalizada del Laurdan.

Se determinó Ja concentración de cada surfactante a la cual la bicapa se satura, concentración crítica de saturación, y la concentración a la que la vesícula se solubiliza, concentración crítica de solubilización. Se detectó una nueva concentración crítica por debajo de la de saturación, que asignamos a cambios estructurales del surfactante en la superficie de la vesícula. Todas las concentraciones críticas determinadas mostraron dependencia lineal con la concentración de DODAC, por lo que fue posible determinar los valores de razón molar surfactante-DODAC, R y las constantes de reparto, K, para cada una de las situaciones críticas. Se demostró que a mayor valor de la cmc (menor longitud de la de cadena hidrocarbonada), menor es la afinidad por la bicapa mientras la capacidad para saturarla y solubilizarla aumentan.

Dependencia del número de agregación con la temperatura (Año 2005, Objetivo 6):

Se evaluaron los números de agregación de los cuatro monoésteres sintetizados empleando metodologías de irradiación estacionaria (informado el año anterior) y medidas resueltas en el tiempo, en función de la concentración de micelas y en función de la temperatura. Se observa una dependencia importante de los valores medidos con el desactivante empleado. Comparando para un mismo desactivante, se observa que:

• El octil derivado muestra una importante dependencia con la concentración cambiando su valor desde 50 a cerca de 3000 unidades por micela al pasar de una solución 8mM a una 40mM.

• El launi y miristil derivados muestran un leve aumento del número de agregación al aumentar la temperatura.

• El palmitil y estearil derivados muestran poca dependencia entre el número de agregación y la temperatura.

• La presencia de n-hexanol reduce levemente el número de agregación del lauril derivado y afecta muy poco en el caso de los demás monoésteres.

Determinación de constantes de reparto (Año 2005, Objetivo 7):

Este objetivo se abordó, pero no fue posible alcanzar los resultados previstos, pues el comportamiento de los sistemas estudiados no fue el descrito para otros sistemas análogos. Como se puede ver en la información adicional entregada en el anexo, para el reparto de n-hexanol en micelas de MLS se observa una clara desviación de la linealidad, haciendo imposible la determinación de constantes de reparto. En el caso de las micelas de MPS la respuesta del sistema resultó mostrar muy poca dependencia con la concentración de miceias, haciéndose nuevamente imposible evaluar constantes de reparto. Situaciones análogas se dieron para los demás esteres estudiados.

Adicionalmente a los objetivos planteados para el segundo año, se desarrolló una serie de experiencias, cuyos resultados se detallan a continuación.

1) Determinación de parámetros del octil sacarosa (adición al Objetivo 4, reportado el primer año de proyecto) II) Solubilización de DPPC por ésteres de sacarosa. III) Solubilización de DODAC y DPPC Octil sacarosa. IV) Solubilización de liposomas de POPC y POPC-Colesterol con miristil sacarosa. V) Extracción de colesterol con ciclodextrinas y HDL desde POPC y POPC éster de sacarosa. VI) Solubilización eritrocitos (estudio in Vitro) con miristil sacarosa, empleando metodologías de microscopía.

Efecto de la presencia de surfactante sobre las vesículas. (Año 2006, Objetivo 8):

Se estudió el efecto de la presencia de los diferentes esteres de sacarosa en el proceso de solubilización de membranas de vesículas de DODAC, DPPC y POPC. Se estableció por comparación de los resultados obtenidos para el DODAC y el DPPC (y POPC) que los grupos amonio poco voluminosos del DODAC permiten la formación de una barrera de moléculas de sacarosa sobre la interfase, pero la rigidización como se muestra en la sección anexos depende del largo de la cadena hidrocarbonada del éster, cuanto más larga es la cadena mayor es el valor de GP (además en este comportamiento se observa una discontinuidad, esteres de cadena corta provocan poco cambio en el ambiente sondeado). En el caso de los liposomas de fosfatidilcolina (DPPC o POPC), el valor de GP es poco dependiente del largo de la cadena del éster. Y la presencia del mismo provoca muy poca variación entre el GP inicial (en ausencia de surfactante) y el GP de saturación, lo que indicaría que las cabezas de sacarosa están entre las cabezas zwitteriónicas y no sobre

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ellas (limitando en menor medida el acceso del agua a la región donde se ubica la sonda). Esta proposición es plenamente compatible con los resultados obtenidos en el desarrollo de otros objetivos.

Efecto de la presencia de surfactante sobre la micropolaridad y microviscosidad de vesículas. (Año 2006, Objetivo 9):

Se evaluaron las propiedades del liposoma a concentraciones sublíticas, por debajo de la concentración de saturación de la membrana. Las vesículas de DODAC ya habían sido evaluadas como trabajo adelantado. Para los Iiposomas de DPPC se evaluó la micropolaridad y microviscosidad empleando como sondas Laurdan, pireno y DHP.

Nuevamente el pireno resulta ser una sonda poco apropiada, pues es se desplaza y por esa razón se están sondeando zonas diferentes en lugar de dar cuenta del efecto que produce la presencia de éster en la micropolaridad.

Efecto de la presencia de surfactante sobre la salida de solutos desde el pool acuoso central. (Año 2006, Objetivo 11) este objetivo corresponde al cuarto año de desarrollo del proyecto, pero se inició el desarrollo de experiencias:

Se estudio el efecto de la presencia de cantidades crecientes de palmitil sacarosa sobre la salida de azul de metileno desde el compartimiento central de vesículas de DODAC. El procedimiento experimental requiere que las vesículas se carguen con una elevada concentración de azul de metileno, estos liposomas se hacen pasar por una columna de Sephadex que retiene el colorante externo y permite recoger vesículas cargadas (este proceso debe realizarse a baja temperatura para evitar o reducir la salida del colorante). La concentración local de colorante es tal que el equilibrio monómero-dímero está fuertemente desplazado hacia la especie dimérica, al salir al medio externo el colorante la menor concentración desplaza el equilibrio hacia la forma monomérica, con el consiguiente cambio en el espectro de absorción, como se muestra en la sección anexo. A partir de estos cambios espectroscópicos es posible ajustar la cinética de salida del colorante y estudiar el proceso.

Los resultados obtenidos junto al comportamiento de la columna, indican que probablemente, además de quedar retenido el azul de metileno de la pseudofase acuosa externa, está quedando retenido el éster de sacarosa (se reduce la cantidad de éster presente en la membrana y obviamente el efecto esperado por la presencia del éster se ve menoscabado).

Para verificar el problema y solucionarlo se empezaron a realizar pruebas de ultrafiltración empleando el sistema de extrusión de que disponemos y se está evaluando la posibilidad de utilizar un sephaciex de características diferentes para evitar la retención y remoción del ester) y luego realizar las experiencias cinéticas de salida del colorante.

Adicionalmente a los objetivos planteados para el tercer año, se desarrollaron otras experiencias, cuyos resultados se detallan a continuación.

VII) Estudio de la interacción de partículas rHDL con membranas con colesterol y diferentes empaquetamientos lipídicos.

En este grupo de experiencias se analizó el efecto del empaquetamiento lipídico en la capacidad de partículas de HDL, para remover colesterol desde la bicapa. Se realizaron medidas de GP del Laurdan con espectroscopia de fluorescencia convencional en cubeta (SUVs) y con microscopia bifotónica (GUVs). Se trabajó con liposomas de:

(1) POPC más 32%cholestero$, en presencia de un monoester de sacarosa para alterar la superficie y características de la membrana (MMS, miristil sacarosa)

(2) Dos mezclas tipo raft (DOPC: DPPC: FC 1:1:1 y POP: SM: FC 6: 1: 1) (3) Eritrocitos.

Los resultados se analizaron en términos de la importancia del empaquetamiento lipídico y/o separación de fases (existencia de dominios) en la capacidad de las partículas de HDL para remover colesterol desde la bicapa.

III. PRODUCTOS GENERADOS POR EL PROYECTO

En esta sección debe incluir todo documento o material cuyo contenido corresponda substancialmente a los objetivos del proyecto que se informa y en los que se indique el NO del proyecto FONDECYT. Aténgase a los formatos que se incluyen para cada tipo de producto generado. Adjunte copia de los documentos no enviados previamente a FONDECYT. Utilice las hojas adicionales que sean necesarias.

SI Ud. tiene un proyecto de Incentivo a la Cooperación Internacional, destaque con (9 las publicaciones generadas como producto del mismo a continuación de las que corresponden al Regular

1. Artículos en revistas científicas nacionales o extranjeras con Comité Editorial. Marque con una "X" Jo que corresponda. Para trabajos En Prensa! Aceptados! Enviados adjunte copia de carta de aceptación o de envío.

Título del ArtículoSolubilization of Vesicles By Sucrose Esters Monitored Employing Fluorescent Te ch niq u es

Autor(es)N. Becerra, L. R. de la Nuez, A. L. Zanocco, E. Lemp, G. Gunther

Nombre Completo de la Revista. Colloids and Surfaces

Ref. bibliográfica Año:2006 Vol. 272 N° 1-2 Pág. 2-7

Estado de la publicación a 0 Publicada/En LI Aceptada LI Enviada O En preparación la fecha.* Prensa Otras fuentes de DID Universidad de Chile, 112-212001 e INC 0214 financiamiento, si las hay

Título del Artículo

Detergent solubilization of lipid bilayers followed by 2-photon microscopy.

Autor(es)C. Toro, A. Zanocco, G. Gunther. E. Gratton, S. Sánchez

Nombre Completo de la Revista. Biophysical Journal ¡.. yLX Ref. bibliográfica Año:2006 Vol. 90 N° Pág. 276Pos

Estado de la publicación a 0 Publicada/En O Aceptada O Enviada O En preparación la fecha.* Prensa Otras fuentes de

NIH RR03 155 financiamiento, si las hay *Corresponde al abstract del trabajo presentado en el Biophysiscal Meeting 2006

Título del ArtículoInteraction of rHDL particles with membranas containing cholesterol in different lipid packing.

Autor(es)S. Sánchez, C. Toro, M. Tricerri, E. Gratton, G. Gunther

Nombre Completo de la Revista. Biophysical Journal

Ref. bibliográfica Año:2007 Vol. 92 N° Pág. 428a

y

Estado de la publicación a 0 Publicada/En O Aceptada O Enviada O En preparación la fecha.* Prensa

Otras fuentes de NIH RR03155 financiamiento, si las hay

*Corresponde al abstract del trabajo presentado en el Biophysiscal Meeting 2007

Título del ArtículoMicelles from a series of 6-0 Sucrose esters

Autor(es) N. Becerra, C. Toro, A. Zanocco, E. Lemp, G. Günther

Nombre Completo de la Revista.

Ref. bibliográfica Año: N° Pág.

Estado de la publicación a D Publicada/En O Aceptada 0 Enviada O En preparación la fecha.* Prensa Otras fuentes de financiamiento, si las hay

Este manuscrito fue enviado en septiembre del 2007, recibiéndose las correcciones solicitadas por los referees a principios de febrero del 2008, el manuscrito corregido fue reenviado el día 7 de marzo de 2008.

Título del Articulo Effect of cholesterol in the process of vesicle solubilization by myristil sucrose

Autor(es) C. Toro, S. A. Sanchez, A. Zanocco, E. Lemp, E. Gratton, G. Gunther

Nombre Completo de la Revista. Biophysical lournal

Ref. bibliográfica Año:2008 Vol. 94 N° Pág. 323-Pos

Estado de la publicación a Iii Publicada/En O Aceptada O Enviada O En preparación la fecha.* Prensa Otras fuentes de NIH RR03155 financiamiento, si las hay

*Corresponde al abstract del trabajo presentado en el Biophysiscal Meeting 2008

Título del Artículo Effect of cholesterol in the process of vesicle solubilization by myristil sucrose

Autor(es) C. Toro, S. A. Sanchez, A. Zanocco, E. Lemp, E. Gratton, G. Gunther

Nombre Completo de la Journal Lipid Research Revista.

Ref. bibliográfica Año: N° Pág.

Estado de la publicación a D Publicada/En O Aceptada O Enviada LI En preparación la fecha.* Prensa Otras fuentes de NIH RR03155 financiamiento, si las hay

*El manuscrito se encuentra en la etapa final de preparación, se incluye en los anexos

'o

2. Otras publicaciones/ productos.

Título Laurdan Generalized Polarization: from cuvette to microscope

Modern Research and Educational Topics in Microscopy, Series 3, Vol 2,

pags. 1007-1014.

Tipo de publicación o Monografía LI Seminario/Taller/Curso producto Fl Libro LI Informe Técnico

ILl Capítulo de Libro LI Software Marque con una "X- lo que fl Mapa LII Patente corresponda LI Exposición de Arte

Otro. Especificar:

Autor(es) S. A. Sanchez, M. A. Tricerri, G. Günther and E. Gratton

Editor(es) (Libros o Capítulos de Libros) A. Mendez-Vilas y J. Diaz Eds

Nombre de la Editorial! Organización Formatex

Lugar y Fecha de Publicación País:España Ciudad: Badajoz

Fecha: 2007

3. Presentaciones a Congresos Nacionales e Internacionales. Adjunte copia del resumen o texto de la ponencia y de la tapa de/libro de Resúmenes, si no la ha enviado previamente.

Título de la Ponencia Solubilización vesículas unilamelares pequeñas de DODAC por ésteres de sacarosa.

Autor(es)N. Becerra, L. R. de la Nuez, A. L. Zanocco, E. Lemp, G. Gunther

Nombre del Congreso VI Jornadas de Investigación en Ciencia y Tecnología, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas.

Lugar y Fecha País: Ciudad:

1

Fecha:

Chile Santiago 22 de Marzo de 2005

Título de la Ponencia Solubilization of Dodac Small Unilamellar Vesicles By Sucrose Esters. A Fluorescence Study

Autor(es) N. Becerra, L. R. de la Nuez, A. L. Zanocco, E. Lemp, G. Gunther.

Nombre del CongresoVIII Encuentro Latinoamericano de Fotoquimica y Fotobiologia.

Lugar Fecha País: Ciudad: Fecha:

Argentina La Plata 8-12 de Noviembre de 2004

Título de la PonenciaSolubilización de liposomas de POPC con miristil sacarosa

Autor(es)C. Toro, L. R. de la Nuez, E. Gratton, S. Sanchez, A. L. Zanocco, G. Günther

Nombre del CongresoXXVI Jornada Chilena de Química

Lugar y Fecha País: Ciudad: Fecha: Chile Concepción 10-13 de enero de 2006

Título de la Ponencia Caracterización fisicoquímica de micelas de monoesteres de sacarosa de diferente largo de cadena

Autor(es)N. Becerra, L. R. de la Nuez, A. Zanocco, G. Gunther,

Nombre del CongresoXXVI Jornada Chilena de Química

Lugar y Fecha País: Ciudad: Fecha: Chile Concepción 10-13 de enero de 2006

Título de la PonenciaDetergent solubilization of lipid bilayers followed by 2-photon microscopy

Autor(es)C. Toro, A. Zanocco, G. Gunther. E. Grattori, S. Sánchez

Nombre del Congreso50th Annual Meeting Biophysical Society

Lugar Fecha País: Ciudad: Fecha: Estados Unidos Salt Lake City 18-22 de Febrero de 2006

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Título de la Ponencia Solubilization of lipid b,layers with myristyl sucrose: in vitro and in vivo determinations

Autor(es)C. Toro, E. Gratton, S. Sánchez, A.L. Zanocco, G. Günther

Nombre del Congreso17th Inter-American Photochemical Society Winter Conference

Lugar Fecha País: Ciudad: Fecha: Brasil Salvador de Bahía 11-16 de Junio de 2006

Título de la Ponencia Interaction of rl-IDL particles with membranes containing cholesterol in different lipid packing.

Autor(es)S. Sánchez, C. Toro, M. Tricerri, E. Gratton, G. Gunther

Nombre del Congreso51th Annual Meeting Biophysical Society

Lugar y Fecha País: Ciudad: Fecha: Estados Unidos Baltimore 3-7 de Marzo de 2007

Título de la Ponencia Solubilizacion de Vesículas Unilamelares Pequeñas de DPPC por Esteres de Sacarosa.

Autor(es) E. Berríos, A. L. Zanocco, E. Lemp, G. Günther

Nombre del CongresoXXVII Jornada Chilena de Química

Lugar y Fecha País:J Ciudad: Fecha:

Chile Chillán 20-24 de Noviembre de 2007

Título de la Ponencia Effect of the cholesterol in the solubilization process by -fructofuranosyI-6-0-myristyl-a-D-glucopyranoside (MMS)

Autor(es)C. Toro, S. A. Sanchez, E. Gratton, A. Zanocco, E. Lemp, G. Gunther

Nombre del Congreso52th Annual Meeting Biophysical Society

Lugar Fecha País: Ciudad: Fecha: Estados Unidos Long Beach 2-6 de Febrero de 2008

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4. Tesis y/o Memorias en ejecución y/o terminadas en el marco del proyecto. Adjunte copia del resumen no informado anteriormente y certificación de aprobación, si corresponde.

Título de la TesisCaracterización Físico Química de Micelas de Monoesteres de Sacarosa

Nombre y Apellidos Natalia Becerra Pacheco del/de los Alumno(s) Germán Günther Sapunar Y Tutor

Título/Grado alcanzado Químico

Institución, Facultad, Universidad de Chile, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Departamento Departamento de Química Orgánica y Fisico Química.

Lugar y Fecha País:Chile Ciudad: Santiago

Fecha de Inicio: 29 marzo 2004 Fecha de Término: enero 2006

Título de la Tesis Efecto de la presencia de Monoésteres de Sacarosa sobre la salida de colesterol desde la bicapa de vesículas y liposomas

Nombre y Apellidos Claudia Toro Vergara del/de los Alumno(s) Germán Günther Sapunar Y Tutor

Título/Grado alcanzado Químico

Institución, Facultad, Universidad de Chile, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Departamento Departamento de Química Orgánica y Fisico Química.

Lugar y Fecha País:Chile Ciudad: Santiago

Fecha de Inicio: 01 marzo 2005 Fecha de Término: enero 2007

Título de la Tesis Efecto de la presencia de Monoésteres de Sacarosa sobre las propiedades físico químicas de liposomas de DPPC.

Nombre y Apellidos Eduardo Berrios Rojas del/de los Alumno(s) Germán Günther Sapunar Y Tutor

Título/Grado alcanzado Químico

Institución, Facultad, Universidad de Chile, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Departamento Departamento de Química Orgánica y Fisico Química.

Lugar y Fecha País:Chile Ciudad: Santiago

Fecha de Inicio: marzo 2007 Fecha de Término: Diciembre 2007

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Título de la Tesis Efecto de la presencia de esteres de sacarosa en la bicapa de liposomas, sobre la salida de azul de metileno desde el compartimiento acuoso central.

Nombre y Apellidos Oscar Sepúlveda Puga del/de los Alumno(s) Germán Günther Sapunar Y Tutor

Título/Grado alcanzado Químico

Institución, Facultad, Universidad de Chile, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Departamento Departamento de Química Orgánica y Físico Química.

Lugar y Fecha País:Chile Ciudad: Santiago

Fecha de Inicio: julio 2007 Fecha de Término: julio 2008

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IV. DESTAQUE OTROS LOGROS DEL PROYECTO TALES COMO: • Estadías de investigación. • Formación de recursos humanos exceptuando tesistas ya informados. • Actividades de difusión y/o extensión en la temática del proyecto. • Cualquier otro logro no contemplado en los ítem anteriores y que Ud. quiera destacar.

Durante el desarrollo del proyecto, se realizaron dos estadías de investigación, una en la Universidad de Illinois en Urbana-Champaign y la otra en la Universidad de California en Irvine, ambas en el Lavoratory for Fluorescence Dynamics, del Dr. Enrico Gratton. Además de tener acceso a equipos y metodologías no disponibles en Chile, fue posible darle una importante difusión al tema de trabajo y establecer vínculos, que por el momento se han traducido en al menos cinco presentaciones conjuntas de trabajos en congresos internacionales, en el capítulo de un libro y en un manuscrito en la etapa final de preparación. Esta colaboración ha permitido que el área de interés del proyecto se haya la expandido al campo de la biofísica, situación que no estaba contemplada inicialmente. Además, y disponemos de datos relevantes para el ámbito de la biofísica (remoción de colesterol desde bicapas lipídicas en presencia de esteres de sacarosa y solubilización de eritrocitos) como para generar una publicación adicional.

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V. RESUMEN

Describa en forma precisa y breve el tópico general del proyecto, sus metas y objetivos y los resultados alcanzados. Utilice un lenguaje apropiado para la comprensión del público no especialista en el tema. Esta información podrá ser difundida. (No debe exceder este espacio en fuente Verdaria 9)

En las últimas décadas, la industria de los surfactantes, ha orientado cada vez más su atención hacia las materias primas naturales, para reemplazar productos derivados de la actividad petroquímica. En particular ha crecido el interés en utilizar surfactantes polihidroxílicos, SPH (término que implica que la cabeza polar del surfactante tiene presentes varios grupos hidroxilo). Para estos compuestos el estado del conocimiento general acerca de su comportamiento en solución no es tan profundo como el que se tiene para otros detergentes no iónicos. Entre los SPH de interés se incluyen los ésteres de sacarosa (ES). En la actualidad y a nivel tecnológico, esta familia de surfactantes se utiliza en diversas aplicaciones tanto en la industria de los alimentos como en tecnología farmacéutica.

Nuestro interés básico se centra en en el estudio de las propiedades fisicoquímicas de soluciones acuosas de ésteres de sacarosa puros. Adicionalmente en el efecto que tiene su presencia sobre membranas Ilpídicas de origen sintético y natural, (tanto las alteraciones previas a la solubilización como la misma solubilización).

En este proyecto, se preparó una serie de ésteres de sacarosa puros (seis compuestos), regioespecíficamente sustituidos en la posición 6 del anillo de glucosa con cadenas alquílicas de diferente largo. Con ellos se determinó la dependencia de los parámetros fundamentales que dan cuenta de la estructura de las micelas que forman, en función del largo de la cadena hidrocarbonada. Entre las propiedades que caracterizan las micelas se evaluó: la concentración micelar crítica, el número de agregación, la micropolaridad y la microviscosidad. Se estudió el efecto de la incorporación de estos detergentes derivados de azúcares sobre la estructura y propiedades de la pseudofase lipídica de liposomas de cloruro de dioctadecildimetilamonio (DODAC) dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) y palmito¡¡ oleoilfosfatldllcolina (POPC), tanto en función del largo de cadena del éster como del tamaño del liposoma. Este efecto se evaluó usando propiedades macroscopicas del sistema (evaluadas por medidas de fluorescencia en estado estacionario) y observando directamente liposomas gigantes a través de metodologías de microscopía bifotónica. En este ámbito del proyecto, se realizaron estudios para determinar el rango de concentraciones de surfactante (para cada uno de los diferentes ésteres de sacarosa sintetizados), en los que se produce la incorporación, determinándose cuál es el efecto sobre propiedades tales como la temperatura de transición desde el estado de gel a líquido cristalino. Se determinó a partir de qué concentraciones de ES se inicia el proceso de solubilización. Empleando técnicas de microscopía de fluorescencia bifotónica se obtuvo información específica acerca de la formación de microdominios durante el proceso de transición de tase y observación de fenómenos o alteraciones a nivel de la interfase de la vesícula, particularmente los relacionados con el proceso de solubilización. A nivel estructural de la vesícula, se determinó cómo la presencia de las cabezas de sacarosa a nivel de la interfase afecta a propiedades tales como la micropolaridad y la microviscosidad de la fase lipídica. Adicionalmente, se evaluó el efecto de la presencia de ester de sacarosa sobre fenómenos tales como la salida de un sustrato desde el compartimiento acuoso central de los liposomas y la remoción de colesterol desde la bicapa lipídica, empleando como agentes de extracción ciclodextrinas y partículas HDL. Para ambos casos la presencia de éster provoca bloqueo. Finalmente se estudio el efecto de los ES sobre la solubilización de eritrocitos (membranas naturales) y los cambios de forma que en estos se originan (estomatocitosis).

Los resultados del presente proyecto (algunos correspondientes a objetivos no planteados inicialmente) contribuyen a lograr un conocimiento más profundo de las propiedades fisicoquímicas de las soluciones acuosas los ésteres de sacarosa, en particular a concentraciones por sobre la CMC. Por otra parte, y como consecuencia de las propiedades moleculares de los ES, su presencia en los liposomas de DODAC POPC y DPPC, en concentraciones adecuadas, provoca alteraciones significativas propiedades relevantes del microagregado, que tienen su origen en la formación de una interfase más estructurada, consecuencia de la capacidad del azúcar de interactuar con el agua a través de la formación de puentes de hidrógeno. Alterando la permeabilidad de la bicapa lipídica a la entrada y salida de sustratos y a la formación de una barrera estérica, que evitaría o reduciría eventuales interacciones intervesiculares restringiendo el fenómeno de fusión de liposomas, y aumentando la estabilidad del sistema. Es evidente que ambos factores, la mayor estabilidad y la disminución de la permeabilidad de vesículas modificadas con el ES como co-surfactante, debe estimular y favorecer el empleo de estos sistemas mixtos en aplicaciones en el área farmacéutica.

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