CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -CONCYT-

SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -SENACYT-

FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -FONACYT-

INSTITUTO DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA AGRÍCOLAS -ICTA-

INFORME FINAL

AMPLIACIÓN DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA DEL AJO

(Allium sativum L.) POR MEDIO DE LA HIBRIDACIÓN SOMÁTICA

PROYECTO FODECYT 086-2007

M. Sc. AÍDA ELEONORA RAMIREZ RODAS

INVESTIGADORA PRINCIPAL

GUATEMALA, NOVIEMBRE DE 2012

AGRADECIMIENTOS

La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del

Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por la Secretaría

Nacional de Ciencia y Tecnología -SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y

Tecnología –CONCYT–.

ÍNDICE

CONTENIDO PÁGINA

RESUMEN i

ABSTRACT ii

PARTE I

I.1 INTRODUCCIÓN 1

I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 4

I.2.1 Antecedentes en Guatemala 4

I.2.2 Justificación del Trabajo de Investigación 4

I.3 OBJETIVOS E HIPÓTESIS 6

I.3.1 Objetivos 6

I.3.1.1 General 6

I.3.1.2 Específico 6

I.3.2 Hipótesis 6

I.4 METODOLOGÍA 7

I.4.1 Localización 7

I.4.2 Variables de Respuesta 7

I.4.3 Indicadores 7

I.4.4 Material Vegetal 7

I.4.5 Condiciones de Cultivo 8

I.4.6 Medio de Cultivo 8

I.4.7 Estrategia Metodológica 8

I.4.7.1 Recolección de Material Vegetal 8

I.4.7.2 Cultivo in vitro de materiales de ajo 9

I.4.7.3. Aislamiento de protoplastos a partir de callo 9

I.4.7.4 Aislamiento de protoplastos a partir de hojas de vitroplantas 10

I.4.8 Método

1.4.8.1 Fusión de los protoplastos 11

I.4.8.2 Cultivo y regeneración de protoplastos 12

I.4.8.3 Evaluación y Estudio de los Híbridos Somáticos Generados 13

I.4.8.4 Diseño experimental 15

I.4.8.5 Análisis de la información 15

PARTE II

II. MARCO TEÓRICO

II.1 ORIGEN DEL AJO 16

II.2 CARACTERISTICAS BOTÁNICAS

II.3 REPRODUCCIÓN 17

II.4 CARACTERÍSTICAS GENÉTICAS 17

II.5 VARIABILIDAD GENÉTICA 18

II.6 LA HIBRIDACIÓN SOMÁTICA 21

II.7 LA POLIPLOIDÍA 23

II.8 LOS PROTOPLASTOS 26

II.8.1 Cultivo de protoplastos 28

II.8.2 Fusión de protoplastos 30

PARTE III

III. RESULTADOS 31

III.1 DISCUSIÓN DE RESULTADOS 39

PARTE IV

IV.1 CONCLUSIONES 44

IV.2 RECOMENDACIONES 45

IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 46

IV.4 ANEXOS 50

ANEXO 1 51

ANEXO 2 51

ANEXO 3 52

ANEXO 4 53

ANEXO 5 54

ANEXO 6 55

PARTE V

V.1 INFORME FINANCIERO 56

i

AMPLIACIÓN DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA DEL AJO (Allium sativum L.)

POR MEDIO DE LA HIBRIDACIÓN SOMÁTICA

RESUMEN

La producción del Ajo en Guatemala se ve ampliamente comprometida, entre otras

razones, por el ataque de enfermedades, baja calidad del bulbo, costos de producción y

materiales genéticos de bajo potencial de rendimiento y susceptibles a enfermedades. El

ajo puede ser sujeto de tratamiento si se aprovecha la variabilidad genotípica identificada

mediante la exposición de la misma. Esto puede ser por medio de la inducción de la

variabilidad fenotípica mediante algunos procedimientos específicos, como la inducción

de variabilidad por medio de mutaciones, inducción de la poliploidía, o la hibridación

somática. El fin principal fue, contribuir con el desarrollo de un sistema tecnológico para

el mejoramiento genético del cultivo del ajo Allium sativum L. Específicamente se

estudiaron dos métodos, uno electrofísico y uno químico para inducir la hibridación

somática como una forma de ampliación de la variabilidad genética del ajo Allium

sativum L. Para alcanzar el objetivo de este trabajo se aplicó el conocimiento y técnicas

para el aislamiento, cultivo y regeneración de protoplastos. Se estableció una

metodología para el aislamiento de protoplastos de 8 materiales de ajo, 4 de tipo egipcio

(A2, A6, A8 y A14) y 4 de tipo chileno (A3, A7, A10 y A13), a partir de hojas de

vitroplantas. Los materiales que respondieron mejor al procedimiento de aislamiento de

protoplastos presentando concentraciones más altas de protoplastos por mililitro fueron

las de tipo egipcio (A6 y A8). Se adaptó una metodología para la fusión de protoplastos

de ajo mediante el uso de electroporación y también se adaptó una metodología para la

fusión de protoplastos de ajo mediante el uso de Polietilene Glicol (PEG) de peso

molecular 1300. Se logró la generación de microcallos de ajo a partir de los protoplastos

aislados y tratados con procedimientos de fusión celular. Los materiales de ajo que

respondieron a la formación de microcallos mediante el procedimiento de electroporación

y fusión química fueron, A2, A6, A7, A8 y A10. No fue posible la regeneración plantas

completas para determinar si se obtuvo los híbridos somáticos, propuestos inicialmente,

para ser utilizados en un programa de mejoramiento genético del ajo en Guatemala. Se

cuenta con información específica y material vegetal en el banco de germoplasma in vitro

del ICTA, con potencial para futuras hibridaciones o para uso inmediato en el campo de la

selección genética.

ii

ABSTRACT

Garlic production in Guatemala is seriously endangered due to diseases, low quality bulb,

production costs and genetic materials of low yield potential and susceptible to diseases.

Garlic breeding is possible by taking the advantages of identified genotypic variability. It

can be done by means of phenotypic variability induction using some specific procedures

such as mutations, polyploidy induction and somatic hybridization. The main objective of

this study was to contribute to provide a technological system for garlic breeding. Two

methods were assessed to induce variability through somatic hybridization, one electro-

physical and one chemical. To reach this aim were applied the protoplast isolation and

culture techniques. A method for the protoplast isolation of 8 garlic materials was

assessed, 4 of the Egyptian type (A2, A6, A8 y A14) and 4 of the Chilean type (A3, A7,

A10 y A13). Fresh vitroplantas leafs were used for protoplasts isolation. The garlic

materials that gave the highest yield of protoplast (per g of fresh leaves) were from the

Egyptian type (A6 y A8). A method for garlic protoplast fusion was assessed by

electroporation and by the use of PEG (MW 1300). Calli were regenerated from different

garlic materials. The materials with a better response after electroporation and PEG

treatment were A2, A6, A7, A8 y A10. It was not possible to regenerate plants from calli

of these materials to determine if the protoplast fusion was successful. Garlic material is

now preserved at the ICTA in vitro germplasm collection for future studies or for further

field evaluations.

1

PARTE I

I.1 INTRODUCCIÓN

En los últimos años se ha experimentado un descenso importante en la producción

de ajo en Guatemala. La principal razón es que se ha dejado de sembrar muchas áreas en

los municipios tradicionales de cultivo en Huehuetenango y Quiché. Se estima que

actualmente se están sembrando cerca de 1,000 hectáreas, cuando hace unos diez años se

podría encontrar cerca de 2000 hectáreas. Varias razones están asociadas a este fenómeno.

Agronómicamente los factores que han incidido en la baja de la producción están: El

ataque de enfermedades, particularmente el moho blanco (Esclerotium cepivorum), los

costos de producción, escasez de semilla sana y la inexistencia de materiales mejorados de

ajo.

En general, en buena medida los problemas de enfermedades bióticas y abióticas

pueden ser atenuados por el uso de semilla de alta calidad sanitaria y genética. Este

aspecto es abordado actualmente por el ICTA mediante un sistema de producción de

semilla básica libre de enfermedades (Cifuentes, 2007). Por otro lado, el problema de los

altos costos de producción puede ser resuelto mediante modificaciones agronómicas

importantes al sistema de producción, que permita reducir costos de producción.

En el caso de la problemática de la escasa oferta de materiales genéticos se puede

resolver mediante el desarrollo de un programa de mejoramiento genético que permita la

sustitución continua de materiales genéticos. Esta estrategia es importante por cuanto las

variedades mejoradas pueden ser una solución más integral a varios problemas a la vez,

tales como la resistencia a enfermedades, la tolerancia a la sequía, mejor adaptación a

nuevos sistemas de cultivo y de mejores características agronómicas, de almacenamiento

o de procesos agroindustriales.

Debido a que el ajo es una especie completamente apomíctica (Novak, 1982), los

procedimientos de mejoramiento genético por medios convencionales se han restringido a

la selección clonal individual (Rosales-Longo, 1999) o bien selección clonal masal. Estos

procedimientos explotan la variabilidad genética que exhibe el ajo actualmente, esta

diversidad es producto de variaciones genéticas espontáneas, a través de los cerca de

5,000 años desde que el ajo se cultiva (Herklots, 1972). Sin embargo, la variabilidad

genética que exhiben estos materiales es relativamente estrecha, particularmente aquella

que se expresa fenotípicamente (Rosales-Longo, 2006).

2

Pérez et al., (1998) indica que la variabilidad genética permite el mejoramiento de

las especies vegetales, como las hortalizas; su expresión es necesaria para diferenciar las

características deseables e indeseables. La variación genética puede ser local (natural e

inducida). La variabilidad puede ser también aumentada por introducciones desde otros

países, lo cual no se considera propiamente mejoramiento. En general, es recomendable

trabajar ambas fuentes de variabilidad para complementar un programa de mejoramiento.

Para poder realizar la selección de los mejores materiales genéticos, es necesario

ampliar la base genética que permita aumentar la posibilidad de encontrar materiales

genéticos que sean útiles.

Si bien las poblaciones de ajo son apomícticas obligadas (Novak, 1982) y

propagados a través del bulbillos (gajos o dientes), exhiben variación morfológica entre

las distintas poblaciones. El ajo, Allium sativum puede ser clasificado en dos variedades

ophyoscorodon y sativum. La variedad A. sativum var. Ophyoscorodon (Hard neck), es

reconocido por la producción de un escapo floral que produce al final una umbela estéril

en tanto que A. sativum var. sativum no produce tal escapo floral en condiciones normales

y es conocido como ajo de cuello blando (soft neck) (Engeland, citado por Al-Zahim,

1997).

En el año 2006 se concluyó un trabajo que estudió la variabilidad genética del ajo

en Guatemala (Rosales-Longo, 2006; Rosales-Longo y Molina, 2007). En este estudio se

estableció que la diversidad genotípica del ajo en Guatemala es suficientemente amplia

para utilizar esta como base para un programa de mejoramiento genético. Sin embargo, en

el mismo estudio, se determinó que la expresión fenotípica de dicha variabilidad

genotípica es muy estrecha (Rosales-Longo, 2006). Esto sugiere que al utilizar esta base

genética para un programa de mejoramiento genético del ajo, las estrategias de

mejoramiento deben estar orientadas a hacer aflorar la variabilidad genotípica en términos

fenotípicos.

En este sentido, el uso de la hibridación somática, se consideró, una excelente vía

para ampliar la base genética y a la vez inducir una mayor expresión fenotípica producto

de las recombinaciones genómicas que se realizan. Por otro lado, el aumento inducido del

cariotipo de los materiales genéticos actuales puede representar un claro mejoramiento de

la expresión fenotípica al aumentar los niveles de expresión génica en la síntesis de un

mayor número de proteínas, que a su vez se expresan en el aumento de los volúmenes y

masas de los tejidos. Estos dos procedimientos son, en teoría, dos buenas opciones para

inducir una ampliación de la base genética, la cual se empleará para realizar selección de

materiales genéticos según los problemas más urgentes para resolver en la producción de

ajo.

De acuerdo con los objetivos planteados en este proyecto, se estableció una

metodología para el aislamiento de protoplastos de 8 materiales de ajo, 4 de tipo egipcio y

4 de tipo chileno, a partir de hojas de vitroplantas. Los materiales que respondieron mejor

al procedimiento de aislamiento de protoplastos presentando concentraciones más altas de

protoplastos fueron las de tipo egipcio. Se adaptó una metodología para la fusión de

protoplastos de ajo mediante el uso de electroporación y también se adaptó una

metodología para la fusión de protoplastos de ajo mediante el uso de Polietilene Glicol

(PEG). Aunque 5 materiales respondieron positivamente a la formación de microcallos,

3

producto de la fusión de protoplastos por las vías mencionadas, no fue posible la

regeneración de plantas completas. De acuerdo con la literatura consultada, la

regeneración de plantas a partir de protoplastos de ajo es difícil, y a partir de productos de

fusión aún más. Se suma a esta dificultad, el hecho de que la presencia de una bacteria

endógena de los materiales de ajo evaluados interfirió en todos los procesos de los

experimentos realizados.

4

I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

I.2.1 ANTECEDENTES EN GUATEMALA

El ajo se considera un cultivo de gran importancia económica para varios países de

América y Europa. En Centroamérica, el único país productor de ajo es Guatemala, ya

que, cuenta con una región cuyas condiciones climáticas son específicas y apropiadas para

este cultivo (Santizo, 2005).

En los últimos años se ha experimentado un descenso importante en la producción

de ajo en Guatemala. La principal razón es que se ha dejado de sembrar muchas áreas en

los municipios tradicionales de cultivo en Huehuetenango y Quiché. Se estima que

actualmente se están sembrando cerca de 1,000 hectáreas, cuando hace unos diez años se

podría encontrar cerca de 2000 hectáreas. Varias razones están asociadas a este fenómeno.

Agronómicamente los factores que han incidido en la baja de la producción están: El

ataque de enfermedades, los costos de producción, la escasez de semilla sana y la

inexistencia de materiales mejorados de ajo. Debido a estos problemas se vislumbra una

reducción inevitable del mercado local y con mayor razón el acceso a nuevos mercados

(Cifuentes, 2007).

La variabilidad genotípica del ajo cultivado en Guatemala es en el promedio alta

(Rosales-Longo y Molina-Monterroso, 2007), sin embargo, esta variabilidad no se

expresa adecuadamente en el campo fenotípico. Esto es, ciertos caracteres morfológicos y

de expresión fenotípica como la precocidad, resistencia a enfermedades, resistencia o

tolerancia a factores abióticos (suelo, temperatura, heladas, adaptación, etcétera), no se

expresan con suficiente amplitud.

En general, los problemas de enfermedades bióticas y abióticas pueden ser

atenuados por el uso de semilla de alta calidad sanitaria y genética. Este aspecto es

abordado actualmente por el ICTA mediante un sistema de producción de semilla básica

libre de enfermedades (Cifuentes, 2007). Por otro lado, el problema de los altos costos de

producción puede ser resuelto mediante modificaciones agronómicas importantes al

sistema de producción, que permita reducir costos de producción.

I.2.2 JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN

El problema de expresión fenotípica puede ser sujeto de tratamiento si se

aprovecha la variabilidad identificada mediante la exposición de la misma. Esto puede ser

por medio de la inducción de la variabilidad fenotípica mediante algunos procedimientos

5

específicos, como la inducción por medio de mutaciones, inducción de la poliploidía, o la

hibridación somática. Por lo que se ha descrito antes, el cultivo del ajo y los materiales

genéticos con los que actualmente se cuentan, son un buen prospecto para su

mejoramiento por medio de la poliploidía inducida. En todo caso en este proyecto se

presenta la intención de ampliar la variabilidad genética actual del ajo, por medio de la

inducción de hibridación somática, con el fin de que, posteriormente, los fitomejoradores

dispongan de material suficiente para realizar selecciones de aquellos materiales genéticos

que se adapten a los sistemas de producción y que ofrezcan mejores ventajas de

productividad y características agronómicas deseables.

6

I.3 OBJETIVOS E HIPÓTESIS

I.3.1 OBJETIVOS

I.3.1.1 GENERAL

Contribuir con el desarrollo de un sistema tecnológico para el mejoramiento

genético del cultivo del ajo Allium sativum L.

I.3.1.2 ESPECÍFICO

Estudiar dos métodos, uno electrofísico y uno químico para inducir la hibridación

somática como una forma de ampliación de la variabilidad genética del ajo Allium

sativum L y modificación del cariotipo.

I.3.1.3. HIPÓTESIS

Existe variabilidad genética en las poblaciones de ajo generadas por medio de los

procedimientos para la inducción de hibridación somática.

7

I.4 METODOLOGÍA

I.4.1 LOCALIZACIÓN

El estudio se realizó en el laboratorio de Biotecnología, CIAL-ICTA, localizado en

la estación experimental “Labor Ovalle” del Instituto de Ciencia y Tecnología Agrícolas

(ICTA), ubicada en el municipio de Olintepeque, Departamento de Quetzaltenango a

203.5 km. de la ciudad Capital, a 3.5 km. del departamento de Quetzaltenango y a 2 km.

de la cabecera municipal de Olintepeque.

Se encuentra localizada en las coordenadas siguientes: Latitud Norte: 14°52´16” y

Longitud Oeste: 91°30´52”.

I.4.2 VARIABLES DE RESPUESTA

DEPENDIENTE

Frecuencias de híbridos somáticos de ajo generados

INDEPENDIENTE

Poblaciones genéticas de ajo que existen actualmente (parentales)

I.4.3 INDICADORES

Porcentaje de híbridos somáticos generados

Moda de híbridos somáticos generados

I.4.4 MATERIAL VEGETAL

Se empleó material genético de 16 materiales, representativos de los nueve grupos

genéticos identificados previamente de la colección VGA-2003 (Ver Cuadro 1) (Rosales-

Longo y Molina-Monterroso, 2007), (Rosales-Longo, 2006).

8

I.4.5 CONDICIONES DE CULTIVO

Las condiciones ambientales del cuarto de crecimiento fueron las siguientes: 24 ±2

°C, 16 horas de luz y 8 de obscuridad. Para cada experimento se especificaron las

condiciones ambientales (temperatura y fotoperiodo) que se utilizaron.

I.4.6 MEDIO DE CULTIVO

Ápices vegetativos: MS adicionado con fitohormonas (2-iP + ANA)

Regeneración de plantas: MS adicionado con fitohormonas (2-iP + ANA)

Inducción de callo a partir de raíces de vitroplantas: MS adicionado con fitohormonas

(BAP + 2,4-D)

Cultivo de células en suspensión: MS líquido adicionado con fitohormonas (BAP + 2,4-D)

I.4.7 ESTRATEGIA METODOLÓGICA

Se realizaron las siguientes actividades, previo a iniciar los experimentos

planteados en la investigación:

I.4.7.1 RECOLECCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL

Se recolectaron los 16 materiales genéticos, representativos de los nueve grupos

genéticos identificados previamente como la colección VGA-2003, en diferentes

localidades de los departamentos de Huehuetenango y El Quiché.

Cuadro 1. IDENTIFICACIÓN DE LOS MATERIALES DE AJO DE LA

COLECCIÓN VGA-2003

No. LAB. ACCESIÓN VGA TIPO

A-1 09-001 Chileno

A-2 09-002 Egipcio

A-3 09-003 Chileno

A-4 09-004 Chileno

A-5 09-005 Chileno

A-6 09-006 Egipcio

A-7 09-007 Chileno

A-8 09-008 Egipcio

A-9 09-009 Chileno

A-10 09-010 Chileno

A-11 09-011 Egipcio

A-12 09-012 Egipcio

A-13 09-013 Chileno

A-14 09-014 Egipcio

A-15 09-015 Chileno

A-16 09-016 Chileno Fuente: FODECYT 086-2007

9

I.4.7.2 CULTIVO IN VITRO DE 16 MATERIALES DE AJO

a. Cultivo in vitro de ápices vegetativos

b. Regeneración de plantas

c. Inducción de callo a partir de raíces

d. Cultivo de células en suspensión

I.4.7.3 AISLAMIENTO DE PROTOPLASTOS A PARTIR DE CALLO

(CULTIVO EN SUSPENSIÓN)

El aislamiento de los protoplastos se realizó a partir de células de callos friables de

células organogénicas, producidas a partir del cultivo de meristemos en las puntas de raíz

de vitroplantas de ajo, según lo propone Molina-Monterroso y Suchini (2007). Se presenta

un breve resumen del protocolo del cultivo in vitro de puntas de raíz propuesto por

Robledo-Paz et al. (2000). También se realizó a partir de hojas de vitroplantas de ajo de

los materiales seleccionados.

a. Se emplearon raíces de plantas cultivadas in vitro de diez materiales genéticos

conservados en un banco in vitro de germoplasma.

b. El medio de cultivo fue el N6 (Nitsch and Nitsch) (Smith, 2,000).

c. Vitaminas según los propone Smith, (2000).

d. Se suplementó con 2.2. µM Ácido 2,4-Diclorofenoxiacético (2,4-D), para propiciar

un callo embriogénico, que será la fuente de células para el cultivo en medio

líquido.

e. Medio gelificante, Agar-Agar para microbiología.

f. pH ajustado a 5.8

Las suspensiones celulares embriogénicas proveen la forma más común de

suministrar células competentes para cereales y pastos (Blackhall et al., 1994). Este fue el

medio que se empleó para el aislamiento de protoplastos de células de ajo en este trabajo.

El medio de cultivo de las suspensiones celulares embriogénicas fue el mismo propuesto

para el cultivo de puntas de raíces sin la presencia de medio gelificante. Se mantuvo en un

agitador orbital a 100 RPM, con 16 horas de luz y 8 de oscuridad (Ramírez, 2007).

Las condiciones óptimas para el tratamiento enzimático de una combinación en

particular genotipo/explante han sido determinadas empíricamente en la mayoría de los

casos. Para lilieaceas se han planteado varios métodos de aislamiento de los protoplastos

(Horita, 2003 et al.; Yamashita et al. 2002). Se usó el método de aislamiento de

protoplastos para una suspensión de células embriogénicas propuesto por Yamashita et al.

(2002) y por Blackhall et al., (1994), de la siguiente forma:

a. Temperatura de incubación: 25-28 °C.

10

b. Mezcla enzimática con el siguiente contenido: 0.33 % celulasa, 0.033% Pectolyasa

0.6 M Manitol, 20mM MES·H2O y 5 mM MgCl2·6H2O

c. Se agita por un período de seis horas en un agitador orbital á 50 rpm.

d. La Suspensión se filtrará sucesivamente en filtros de celulosa de 150 µm, 90 µm, 60

µm, 40 µm y se centrifugará por tres minutos a 600 rpm.

e. El “pellet” que se obtenga será lavado en una solución de lavado, constituida por

Manitol 0.5 M, Cl2Ca 2.5 mM, a un pH de 5.6.

I.4.7.4 AISLAMIENTO DE PROTOPLASTOS A PARTIR DE HOJAS DE

VITROPLANTAS

a. Ensayo de concentraciones y combinaciones enzimáticas

Celulasa: 0.25%, 0.50%, 0.75% de concentración

Macerozyme R-10: 0.25%, 0.50%, 1.0% de concentración

Driselasa: 0.50%, 1.0%, 1.50% de concentración

Ver Cuadro 6, Anexo 6 (Anexos).

Temperatura de incubación: 25-28°C.

b. Determinación del tiempo de incubación

Se evaluó: 5 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas

Procedimiento:

Mezcla enzimática con el siguiente contenido: 0.75 % celulasa, 0.50%

Macerozyme R-10, 1.0% Driselasa 0.6 M Manitol, 20mM MES·H2O y 5 mM

MgCl2·6H2O

Se agita por un período de cinco horas en un agitador orbital á 50 rpm.

La Suspensión se filtra sucesivamente en filtros de 150 µm, 90 µm, 60 µm, 40 µm y se

centrifuga por tres minutos a 600 rpm.

El “pellet” que se obtiene se lava en una solución de lavado, constituida por Manitol 0.5

M, Cl2Ca 2.5 mM, a un pH de 5.6.

Se vuelve a resuspender el pellet y se repite el mismo procedimiento de centrifugado, 3

veces.

Finalmente se remueve el supernadante para obtener los protoplastos de ajo.

c. Determinación de viabilidad celular con tinción de Evans al 0.5%

11

1.4.8 MÉTODO

I.4.8.1 FUSIÓN DE LOS PROTOPLASTOS

Se evaluó dos técnicas para realizar la fusión de los protoplastos. Debido a que la

evaluación no puede medirse en términos de variables discretas o continuas, la evaluación

será categórica y los resultados se estudiarán mediante dos técnicas, que se detallan en la

sección de evaluación.

a. Electrofusión

Se realiza mediante la utilización de un Electroporador. Se utilizó el Multiporator,

Eppendorf. Este equipo es capaz de inducir la fusión mediante el uso de un generador de

energía que produce un campo AC (Corriente Alterna) y una fuente DC (Corriente

Directa). Así mismo se necesita una unidad de intercambio para aplicar el campo AC o los

pulsos DC. Finalmente una cámara de fusión, que utiliza cubetas para tal efecto.

Se ensayaron diferentes duraciones de los impulsos (DC) y diferentes tensiones de los

impulsos (AC).

Los pulsos eléctricos estaban dirigidos a tres diferentes concentraciones de

suspensiones celulares, las que deberían ser evaluadas en función del número de plantas

completas regeneradas de las suspensiones sujetas a electrofusión. Las concentraciones

que se evaluaron fueron de:

2 x 105, 3 x 10

5 y 4 x 10

5 protoplastos por mililitro, las cuales fueron medidos mediante

un Hematocitómetro. Lo anterior utilizando como base la propuesta de Horita et al.

(2003) en un trabajo de hibridación de células somáticas de Lirios.

Las suspensiones celulares sujetas a electrofusión fueron suspendidas en una

solución de electrofusión consistente en 0.9 M Sorbitol 2.5 mM CaCl2·2H2O, 5mM 2-

Morpholino-ethanesulpnonic acid monohidrato (MES) (SIGMA M-5287 250 gr)

(Blackhall et al., 1994; Horita et al., 2003).

El resto del protocolo específico de fusión es descrito por Blackhall et al. 1994.

b. Fusión Química:

El Polietilene Glicol (PEG) es por mucho, el compuesto químico más utilizado para

fusión. A fin de obtener una alta frecuencia de formación de heterokariontes (más del 10

% de los protoplastos tratados) y para asegurar la viabilidad de los heterokariontes, es

esencial utilizar el PEG con un bajo contenido de carbonil, por lo que se empleó PEG de

1300 M.W. (PEG SIGMA P-7777).

12

El protocolo de trabajo es el siguiente (Blackhall et al., 1994; Spector et al., 1998):

1. Solución X % de PEG 1300 en un tampón de fusión*.

2. Solución de las suspensiones de protoplastos en partes iguales en una solución

osmótica de sales CPW, a una densidad de 5 x 105 ml

-1 a baja temperatura.

3. Se mezclan los protoplastos de los parentales.

4. Se añaden 0.5 ml del PEG preparado con anterioridad, seguido de una solución

hipotónica de manitol y suero albumina bovina. Se retornan los protoplastos al

refrigerador a 4º C por 20 min.

5. Se adhieren otros 1.5 ml de la solución hipotónica mediante movimientos

suaves.

6. Se adiciona una solución de manitol. Se incuba a 4ºC por dos horas en el

refrigerador.

7. Centrifugar los protoplastos, y se resuspenden en un medio de cultivo

específico y se busca su regeneración.

* En esta parte del trabajo se ensayaron tres concentraciones del PEG, 20%, 30% y 40%.

I.4.8.2 CULTIVO Y REGENERACIÓN DE PROTOPLASTOS

Se empleó inicialmente el medio de cultivo Caboche (1980) y posteriormente un

medio de cultivo de Murashige y Skoog (1962), con la modificación de remover los iones

amonio, ya que estos son detrimentales para la supervivencia de los protoplastos

(Blackhall et al., 1994).

Las técnicas de regeneración incluyeron, entre varios procedimientos, los siguientes:

a. Se implantan los protoplastos en una solución acuosa de agarosa. Los

protoplastos son suspendidos a la concentración requerida en el medio de cultivo

propuesto arriba, conteniendo agarosa fundida (a 40º C) (1.2% w/v). La

suspensión se distribuirá en platos petri de 3 a 5 cm de diámetro, y se permite que

enfríe y solidifique a temperatura ambiente y con baja intensidad de luz (7 µE.m-

2.s

-1).

b. El medio de cultivo para la regeneración es MS suplementado con 300 µg l-1

de

2,4-D).

c. Los protoplastos se suspenden en el medio de cultivo y a una densidad de 5.0 x

105 ml

-1 en un tubo de centrífuga. Se calienta por shock en baño de maría a 45ºC

seguido por 30 segundos en hielo.

13

d. Se lavan los protoplastos dos veces por centrifugación a 80 g, seguido por una

resuspensión en medio fresco MS.

e. Se cultivan 2 ml de la suspensión de protoplastos en platos petri de 3.5 cm de

diámetro sellados con parafilm en la oscuridad a 27ºC.

f. Después de 14 días se dividen las capas de agarosa de cada plato en cuatro

porciones y se transfiere cada porción a platos separados con 3 ml de medio MS.

Se incuba en la oscuridad a 27ºC hasta que las colonias de células han

desarrollado un diámetro de entre 0.5 a 10 mm de diámetro.

g. Para inducir la regeneración propiamente, se transfieren las colonias de

protoplastos a contenedores de 5 x 5 cm con pocillos. Los pocillos deben

contener 2 ml. De medio MSKN, que es el medio MS suplementado con 2 mg l-1

de NAA, 500 μg/lt de zeatina y 30 g l-1

de sacarosa, solidificado por la adición de

12 g l-1

de agarosa. Se incuba a 27ºC en la oscuridad.

h. De 7 a 14 días después se trasladan los brotes que se hayan regenerado así como

coléoptilos a un medio MS suplementado con 30g l-1

de sacarosa y 4 g l-1

de

agarosa tipo I de SIGMA. Se incuba a 25ºC en la luz (5 7 µE.m-2

.s-1

), 16 horas de

luz por día.

i. Se sigue el protocolo de bulbificación propuesto por Pérez, (2007).

j. Se sigue posteriormente el protocolo de regeneración de plantas a partir de

microbulbos propuesto por Cifuentes et al. (2007).

I.4.8.3 EVALUACIÓN Y ESTUDIO DE LOS HÍBRIDOS SOMÁTICOS

GENERADOS

Debido a lo complejo de los protocolos que se emplearon, se hizo prácticamente

imposible mantener condiciones apropiadas para la aplicación de un diseño experimental

que pudiera ayudar a una evaluación de las técnicas propuestas para lograr la fusión de

protoplastos.

Por lo anterior, se propuso dos técnicas para la evaluación de la efectividad de la

aplicación de los procedimientos propuestos. Estas técnicas no se utilizaron en este

proyecto, porque no se logró la regeneración de plantas, sin embargo se describen a

continuación.

a. Estudios de Polimorfismos del ADN genómico

De acuerdo con los estudios realizados previamente (Rosales-Longo, 2006;

Rosales-Longo y Molina-Monterroso, 2007) mediante el uso de la técnica AFLP™

(Amplified Fragment Lenght Polimorfism) se cuenta con información específica de los

patrones genéticos de los materiales conservados en el banco de germoplasma. Se realiza

un estudio específico de los patrones de bandas AFLP™ con los que se cuenta, a fin de

14

establecer características muy propias de cada material genético que es sujeto de estudio,

según se plantea en el apartado “Material Vegetal”.

Posteriormente se realiza comparaciones que incluyan en un solo gel de

acrilamida, tanto a los parentales como a los putativos híbridos.

Se sabe que los híbridos somáticos presentan, en un mismo carril, características

de ambos padres. Debido a que no se espera el fenómeno de recombinación, debiera ser

muy clara la presencia de los híbridos somáticos.

Se busca que los polimorfismos encontrados sean consistentes en más de un clon

de la misma accesión de ajo con el fin de asegurar que estos polimorfismos correspondan

a ADN nuclear.

b. Análisis Nuclear (GISH)

Este procedimiento se descartó desde el inicio del proyecto porque para aplicar

esta técnica se necesita un microscopio con filtros para fluorescencia con el que no se

dispone en el ICTA, y los fondos para la compra de equipo se utilizaron íntegros para la

compra del electroporador y hasta fue necesario hacer algunas transferencias de otros

renglones para completar el monto que se necesitaba para la adquisición de ese equipo.

De todas maneras a continuación se describe el procedimiento:

Se colectan puntas de raíces de los microbulbos de los híbridos somáticos

putativos cultivados in vitro y se tratan con Colchicina o hidroquinoleína a 20º C por un

espacio de 2.5 hrs. Estos serán fijados en una mezcla de ácido acético y etanol (1:3). La

composición de los cromosomas de los híbridos somáticos será estudiada por medio de

GISH (Genomic in situ Hybridization), el cual es una variante de FISH (Fluorescent In

Situ Hybridization) (Spector et al., 1998; Yamashita et al. 2002).

En términos generales el procedimiento es como sigue:

El ADN total genómico de uno de los materiales de ajo parental (para cada híbrido

somático putativo) es extraído por la metodología ya estandarizada del laboratorio de

Biología Molecular del ICTA en La Labor Ovalle, por medio de la metodología CTAB

(Rosales-Longo y Molina-Monterroso, 2007), este ADN, es marcado con Biotina 16-

dUTP, para este efecto se utiliza un Kit comercial de “Nick-Translation”, este ADN

marcado es utilizado como una sonda. El ADN aislado, del otro material de ajo parental

(para cada híbrido somático putativo) no es marcado y se utiliza, según el protocolo

GISH, como ADN de bloqueo. Las señales de hibridación de la sonda son amplificadas

con Avidina Flourosceína DN. La imagen GISH es observada en un microscopio con

filtros para fluorescencia. En un mismo núcleo se espera observar 16 pares de

cromosomas, 16 de uno de los parentales y 16 del otro.

15

I.4.8.4 DISEÑO EXPERIMENTAL

Debido a lo complejo de los protocolos que se emplearon, se hacía prácticamente

imposible mantener condiciones apropiadas para la aplicación de un diseño experimental

que pudiera ayudar a una evaluación de las técnicas propuestas para lograr la fusión de

protoplastos, por lo que, se propuso, las dos técnicas descritas anteriormente, para la

evaluación de la efectividad de la aplicación de los procedimientos planteados.

I.4.8.5 ANÁLISIS DE LA INFORMACIÓN

Con el objeto de probar la hipótesis propuesta, se planteó realizar, luego de la

identificación plena de la hibridación, mediante los procedimientos anteriores, un estudio

de frecuencias. Se propuso realizar una comparación de frecuencias entre los

procedimientos utilizados y se evaluar las diferencias mediante el uso de una prueba de ji-

cuadrado (Steel y Torrie, 1985; SAS Institute, 1989).

16

PARTE II

II. MARCO TEÓRICO

II.1 ORIGEN DEL AJO

El centro de diversidad genética principal del ajo se ubica en Asia Central, de donde

se diseminó a Egipto y el Mediterráneo. Es una de las especies vegetales más

antiguamente cultivadas, aproximadamente durante 5,000 años. Se cree que la especie

silvestre que dio origen a la especie cultivada es A. longiensis. En América fue

introducido por los españoles (Santizo, 2005).

II.2 CARACTERISTICAS BOTÁNICAS

De las cerca de 600 especies cultivadas del género Allium de la familia Alliaceae,

antes Liliaceae. A. cepa (cebolla) y A sativum (ajo) son las especies representativas más

importantes.

El ajo es una planta bianual, herbácea, monocotiledónea, de tallos aéreos, hueco y

rollizo con bulbos subterráneos compuestos por dientes que varían de tamaño y color

dependiendo de la variedad, hojas radiales, largas, alternas, comprimidas (Santizo, 2005).

De acuerdo con Cronquist, el ajo se clasifica de la siguiente manera (Santizo, 2005):

DIVISIÓN: Magnoliophyta

CLASE: Liliópsida

SUB-CLASE: Liliade

ORDEN: Liliales

FAMILIA: Liliaceae

GENERO: Allium

ESPECIE: Allium sativum L.

17

II.3 REPRODUCCIÓN

El ajo es una especie apomíctica obligada. Esto significa que en la inflorescencia se

producen yemas vegetativas o bulbillos en lugar de flores. Los bulbillos o dientes sirven

para la reproducción asexual del cultivo. No tiene ninguna posibilidad de mejoramiento

genético a través de la recombinación sexual. Varios esfuerzos se han hecho por realizar

mejoramiento del cultivo vía técnicas asexuales. Estos esfuerzos han sido orientados a la

generación de variabilidad artificial, particularmente por la vía del cultivo in vitro y la

selección clonal.

II.4 CARACTERÍSTICAS GENÉTICAS

Si bien las poblaciones de ajo son apomícticas obligadas (Novak, 1982) y

propagados a través del bulbillos (gajos o dientes), exhiben variación morfológica entre

las distintas poblaciones. El ajo, Allium sativum puede ser clasificado en dos variedades

ophioscorodon y sativum. La variedad A. sativum var. ophioscorodon (Hard neck), es

reconocido por la producción de un escapo floral que produce al final una umbela estéril

en tanto que A. sativum var. sativum no produce tal escapo floral en condiciones normales

y es conocido como ajo de cuello blando (soft neck) (Engeland, citado por Al-Zahim,

1997).

Se ha propuesto que todas las variedades de ajo, las cuales son completamente

domesticadas, han evolucionado de la especie silvestre Allium longicuspis (Moriconi et

al., 1991; Al-Zahim et al., 1997), la cual estuvo distribuida desde el sur de Turkemenia

hasta Tien Shan y ahora confinada al Asia central. Esta especie silvestre no es fácilmente

distinguible de la cultivada var. ophioscorodon, excepto por las anteras excertadas las

cuales no son comunes en los materiales cultivados (Al-Zahim et al., 1997, 1999). El ajo

tipo egipcio mayormente cultivado en Guatemala, corresponde a Allium sativum var.

ophioscorodon.

Todos los clones de ajo estudiados presentan un juego diploide de 16 cromosomas

con un número base de x=8 (2n=2x=16) (Al-Zahim et al.). Este número es constante,

excepto para un caso de 2n=18 reportado por Sharma y Bal (1958). Un gran nivel de

inestabilidad se presenta, sin embargo, en el nivel estructural de los cromosomas. Si bien

los clones europeos muestran diferencias significativas en todos los cromosomas en

cuanto a la longitud, radio de los brazos, posición de las constricciones secundarias,

etcétera, todo ellos presentan uniformidad con respecto al número de cromosomas

nucleares (con un pequeño núcleo o constricción en las cromátidas) por juego haploide

(Koul, et al., 1979)

Como ya se mencionó antes, todos los cultivares conocidos y actualmente

cultivados son completamente estériles (Al-Zahim et al., 1997, 1999). El ajo es una

especie apomíctica obligada sin ninguna posibilidad de mejoramiento genético por la vía

de la recombinación genética que brinda la reproducción sexual (Novack et al., 1982;

Muñoz et al., 1988; Moriconi et al., 1991;).

En el ajo, la sexualidad es frustrada por diferentes estados de su organogénesis,

esporogénesis y gametogénesis. Algunos clones no producen inflorescencias excertadas

18

en el tallo (Koul, et al., 1979), corresponden estos a la variedad A. sativum var. sativum

(Zahim et al., 1997). En aquellos donde se forma un escapo floral, las flores son total o

parcialmente sustituidas por un bulbillo, con el resultado de formar una estructura

completamente vegetativa o mixta. El desarrollo de flores en algunos clones sugiere que,

en el pasado el ajo ha tenido los medios de sexualidad, la producción de bulbillos

representa un cambio secundario (Koul, et al., 1979).

Algunos materiales fértiles de ajo se han desarrollado pero son de poco uso

actualmente ya que se encaran muchos problemas relacionados con el desarrollo de las

progenies (Ohsumi et al. 1993).

Los grupos varietales

En el mundo moderno se reconocen ajos de todo tipo, sin embargo la selección

natural que la especie ha sufrido, las denominaciones populares en las diferentes culturas,

los intentos de los investigadores por agruparlos y los planes de mejoramiento genético,

han complicado el panorama y su interpretación. Los ajos pueden ser agrupados por sus

características botánicas, fisiológicas o comerciales. Los intentos por hacerlo no fueron

muy exitosos, complicándose aún más la situación debido a las barreras idiomáticas. En la

práctica comercial los ajos se denominan en algunos casos según el color de los bulbos, o

el color de los “dientes” o bulbillos en otros. Este panorama es más complejo cuando de

país en país las tonalidades reciben diferentes denominaciones. En español, los mismos

tipos comerciales pueden denominarse rosa, rosado, rojo, violeta, morado o colorado. En

portugués se denominan roxo y roxao. En italiano, rosso y rosa, y en francés, rose, rosé,

rouge y violet. Los grupos ecofisiológicos de Argentina, distinto para Francia, China o

Japón, no serán motivo de este análisis, sin embargo, las mencionaremos, ya que dichas

clasificaciones guardan fuerte relación con otros tipos de agrupamientos, generando

muchas veces mayor confusión (Burba, 2009).

Variedades botánicas

A la especie Allium sativum L., denominada ajo común, ajo doméstico o ajo de

huerta, se le conocen principalmente tres subespecies (botánicamente llamadas

variedades), que son pekinense, sativum y ophioscorodon. Según algunas escuelas

populares, algunas de estas variedades estarían “especializadas” en producir bulbillos

aéreos y otras en bulbillos subterráneos, aunque en rigor de verdad, según las condiciones

ambientales de cultivo o las temperaturas del almacenamiento de la “semilla”, las

variedades pueden producir los dos tipos de propágulos, tal es el caso de ajos “blancos”,

que por lo general no emiten vara floral, pero sí lo hacen en regiones muy frías, y por

consiguiente la denominación hardneck (de cuello duro o con vara floral) o softneck (de

cuello blando o sin vara floral) es también relativa (Burba, 2009).

II.5 VARIABILIDAD GENÉTICA

La constitución genética determina una variación que es intrínseca de cada

organismo, depende de su origen y lo acompaña toda su vida. La variación ecológica que

19

corresponde a los factores externos, es independiente del origen del organismo, no es

heredable y durante la vida de un individuo puede cambiar considerablemente. Tiene

poco sentido considerar la herencia haciendo abstracción del medio ambiente, ya que no

hay dos medios ambientes iguales y que, al menos desde el punto de vista práctico,

siempre que se seleccionan plantas o se busca una variedad de plantas con mayor

producción, mejor calidad, etcétera, se tienen que considerar los medios ambientes, donde

se tome muy en cuenta la interacción del genotipo con el medio ecológico (Brauer, 1983).

Para que la selección de genotipos sea eficaz se requiere que haya variabilidad

genética dentro de la población que se selecciona. En términos generales la calidad de la

producción agrícola se fundamenta en tres grandes factores: Material genético cultivado,

Manejo agronómico y, factores bióticos y abióticos causantes enfermedades o afecciones

fisiológicas (Fehr, 1987). Pérez et al., (1998) indica que la variabilidad genética permite el

mejoramiento de las especies vegetales, como las hortalizas; su expresión es necesaria

para diferenciar las características deseables e indeseables.

La característica más notable de las plantas cultivadas es su riqueza varietal; es

difícil encontrar en especies silvestres una diversidad comparada (León, 2000). Sin

embargo, el ajo, a pesar de ser cultivado desde hace cerca de 5000 años (Herklots, 1972),

y a pesar de su importancia económica, no ha sido mejorado con la intensidad de otros

cultivos, por lo que se asume que guarda más o menos las mismas formas en la que se

inició su domesticación. De los cambios que se han suscitado y registrado, la mayoría

han ocurrido espontáneamente (Koul et al., 1979; Moriconi et al., 1991). En este sentido,

se abre un campo escasamente explotado para el mejoramiento de ajo. También, es

importante conocer qué tan amplio puede resultar el campo de la variabilidad de ajo, a fin

de encausar las estrategias más adecuadas para su mejoramiento.

La evolución de las especies vegetales cultivadas ha tomado varios caminos, sin

embargo dentro de éstos se encuentran incluidas tres categorías principales, según Allard

(1980): a) Variación Mendeliana; b) Hibridación Interespecífica y, c) poliploidía. Esta no

es una clasificación exhaustiva de los métodos por los que se han moldeado las plantas

hasta las formas útiles al hombre, sin embargo, son las principales vías por las que han

evolucionado las especies cultivadas, considerando dos períodos, pre y post-

domesticación.

Clásicamente, hay dos causas de variación genética: las mutaciones cromosómicas y

las mutaciones génicas o puntuales. Entre las primeras, también llamadas aberraciones

cromosómicas, se encuentran la duplicación, la deleción y la reordenación de segmentos

de cromosomas. Las mutaciones génicas se producen por un cambio en la información

química almacenada en el ADN, que en conjunto se denomina el genotipo de un

organismo. Tal cambio puede ser una sustitución, duplicación o deleción de nucleótidos,

que componen esta información química. Las formas alternativas de un gen, que se

producen como consecuencia de la mutación, se denominan alelos. Frecuentemente,

aunque no siempre, la variación genética da lugar al cambio de alguna característica del

organismo, denominada como su fenotipo. Una vez que forma parte de la constitución

genética de un organismo, tal variante puede extenderse por toda la población mediante

mecanismos reproductivos (Klug, 1999).

20

El concepto de vulnerabilidad genética se refiere a la posibilidad que un problema

inesperado puede causar una mayor pérdida en la producción de la mayoría de todos los

cultivares de un cultivo en particular (Fehr, 1987). La escasez de diversidad genética

puede volver vulnerables a los cultivares, en el caso de ajo esto es particularmente notorio

hoy en día con respecto a la enfermedad producida por el hongo Sclerotium cepivorum, el

cual es un problema mayor que no tiene solución por la vía de los fungicidas. La

insuficiencia de diversidad genética en los parentales usados para la formación de

poblaciones por hibridación, puede conducir a la reducción de la variabilidad genética

para caracteres cuantitativos, en consecuencia mejorar el carácter puede ser difícil o

imposible de alcanzar (Fehr, 1987).

El primer paso para el desarrollo de un cultivar es formar una población con

variabilidad genética para los caracteres de interés. Esto es alcanzado por medio de la

hibridación de parentales genéticamente diferentes o por el uso de agentes mutagénicos.

En el presente proyecto se plantea el uso de hibridación somática y poliploidización.

El mejoramiento genético del ajo (Allium sativum L.) ha sido motivo de encuentros

y desencuentros e historias curiosas. Durante mucho tiempo de la edad moderna y

contemporánea nadie creyó en la posibilidad de mejora genética del ajo bajo el argumento

que una especie agámica estricta como el ajo no tenía fuentes de variabilidad. Cuando en

la década del cincuenta un investigador ruso anunció haber encontrado en un clon la

capacidad de dar semilla botánica, otros tantos se encargaron de demostrarlo, ya que nadie

lograba que sus plantas produjeran semillas siguiendo su técnica (Burba, 2009).

Tuvieron que pasar más de 30 años para que un investigador japonés encontrara

“nuevamente” plantas con semilla que casualmente eran del mismo ecotipo ruso ya

reportado. Aún hoy no existe en el mercado un cultivar comercial obtenido por

hibridación, por lo que la técnica tradicional de selección clonal sigue siendo la principal

herramienta. La carencia de reproducción sexual en esta especie y, en consecuencia, la

falta de recombinación meiótica limitan la variabilidad natural sólo a la acumulación de

mutaciones somáticas, sin que puedan descartarse otras fuentes secundarias de

variabilidad de menor frecuencia, como pueden ser las recombinaciones mitóticas o la

presencia de transposones (Burba, 2009).

Miles de años de acumular pequeños pero significativos cambios (no muy

perceptibles por parte del agricultor), acompañados de selección negativa (se venden los

bulbos grandes y se guardan para semilla los bulbos chicos), contribuyeron para que el ajo

en el mundo llegara a mediados del siglo pasado a su piso más bajo. La selección y la

liberación de virus fueron las herramientas para superar esas barreras comerciales

trasposones (Burba, 2009).

Hoy existen cultivares con muy bajas y muy altas concentraciones de allicina y de

inulina; muy suaves y muy picantes; con y sin aptitud como saborizante de panes; con

muy altas y muy bajas concentraciones de selenio; muy precoces y muy tardíos; con y sin

fuentes de tolerancia a enfermedades causadas por hongos y virus; con pocas o muchas

propiedades antiplaquetarias en sangre; aptos para el pelado, deshidratado o elaboración

de fármacos (Burba, 2009).

21

Si bien en la actualidad algunos ecotipos de ajo son capaces de florecer y producir

semilla botánica, la selección clonal sigue siendo la herramienta más válida para

aprovechar la abundante variabilidad genética que tiene esta especie (Allium sativum) y

sus variedades botánicas (var. sativum; var. ophioscorodon y var. pekinense). Allium

sativum var. sativum son los ecotipos más comunes de ajos “rosados”, “violetas”,

“blancos” y “colorados”, mientras que A. sativum var pekinense corresponde a los ajos

“morados”, mal llamados “chinos”. A. sativum var ophioscorodon son los ajos “castaños”,

mal llamados “rusos” o “polacos” (Burba, 2009).

La falta de selección sistemática durante siglos hizo que las actuales poblaciones

clonales (en manos de los agricultores o de bancos de germoplasma) hayan acumulado

mutaciones, muchas de ellas, favorables, las cuales, pueden ser aprovechadas.

Estas variaciones y la fuerte interacción que tiene esta especie con el ambiente (por su

reñida relación con el termo–fotoperíodo) hacen que en el mundo se confundan ecotipos,

biotipos, tipos comerciales y cultivares. Por otra parte, hay confusiones en las

denominaciones populares, por lo que se requiere corregir esta situación.

Sólo para dar un ejemplo, al mismo tipo comercial de ajo en España se los llama

“morados”, en Argentina “colorados” y en Chile “rosados”. Pero los “rosados” en

Argentina son ajos subtropicales muy diferentes a los chilenos, y los “morados” de ese

país son ajos asiáticos de bajos requerimientos de frío que nada tienen que ver con los

“colorados” (Burba, 2009).

El mejoramiento genético convencional tiene como objetivos:

• El aumento del rendimiento comercial.

• La ampliación del periodo de oferta (ya sea a través de la precocidad de los materiales o

la prolongación de la vida útil pos cosecha).

• La concentración de principios órgano-azufrados (para mejorar las propiedades

nutracéuticas o las aptitudes industriales).

• El mejor maridaje con las preparaciones culinarias.

La estrategia de mejoramiento genético del ajo en los países productores apunta a

la obtención de un producto diferenciado, con sólidas bases científicas y tecnológicas en

los parámetros de diferenciación, estudiando y aprovechando la aún amplia variabilidad

natural existente (Burba, 2009).

II.6 LA HIBRIDACIÓN SOMÁTICA

Muchos estudios han sido beneficiados por la habilidad de fusionar células para

formar, ya sea heterokariontes o para la proliferación de células híbridas mononucleares

(Spector et al., 1998). La hibridación somática en plantas involucra cuatro pasos bien

definidos: El aislamiento de los protoplastos, la fusión de los protoplastos, la

regeneración de plantas de tejidos seleccionados y el análisis de las plantas regeneradas

(Blackhall et al., 1994). Como virtualmente cualquier combinación de protoplastos puede

ser inducida para lograr la fusión, la hibridación somática provee un medio para superar

las barreras sexuales en el mejoramiento genético convencional (Blackhall et al., 1994) y

22

de hecho se le reconoce como una valiosa herramienta que apoya los métodos

convencionales del mejoramiento de plantas (Pollard & Walter, 1990).

Los tratamientos para fusión celular resultan en la producción de heterokariontes y

homokariontes, mientras que algunos protoplastos se mantienen sin fusionarse. Los

heterokariontes son los productos de la fusión relevantes para la manipulación genética

vegetal. Estos contienen los núcleos de los géneros, especies, o variedades, inicialmente

en una mezcla de los citoplasmas. Al igual que las células sin fusionarse, las células de

los híbridos somáticos son totipotentes y son, en consecuencia, capaces de desarrollarse

en un organismo bien diferenciado, vía la organogénesis o embriogénesis. Las

combinaciones en el complejo núcleo-citoplasma pueden seguir a la fusión de los

protoplastos. Incompatibilidades entre los dos genomas nucleares o entre las

combinaciones núcleo-citoplasma resultan evidentes, conduciendo a la eliminación de

cromosomas o bien, en casos extremos, a la falla completa del heterokarionte para poder

mantener un crecimiento sostenido y división celular. La recombinación mitocondrial,

frecuentemente ocurre para generar “nuevos” organelos. Los cloroplastos usualmente

segregan, con aquellos de uno de los parentales convertido en dominante. Muy raramente

las recombinaciones del ADN de los cloroplastos tiene lugar (Blackhall et al., 1994)).

La fusión de protoplastos así como su cultivo han sido utilizados como una

herramienta para el análisis genético y para el mejoramiento de plantas (Horita et al.

2003). Yamashita et al., (2002) realizó estudios sobre cromosomas y ADN extranuclear

en híbridos somáticos de Cebolla y Ajo. En el caso anterior se decidió el uso de estos

híbridos para el mejoramiento de la cebolla. La irradiación de uno de los parentales antes

de la fusión puede mejorar la eliminación de los cromosomas, resultando en la fusión de

productos los cuales retienen el genoma nuclear de uno de los parentales y una mezcla de

ambos citoplasmas.

La hibridación somática fue inicialmente reportada en Tabaco por Carlson et al.

(1972) y fue desde entonces ampliamente utilizada produciendo híbridos somáticos entre

varios bien conocidos cultivos, entre ellos papa y tomate. La técnica es particularmente

útil para introducir resistencia a enfermedades de parientes silvestre o de otras especies a

la variedad cultivada (Matsumoto et al., 2002). La síntesis de la fusión de híbridos

interespecíficos es el primer paso para la transferencia de genes deseables en un cultivo

vegetal. El paso esencial siguiente es la retrocruza de la fusión interespecífica con las

plantas normales cultivadas (Gavrilenko et al. 2003). En el caso de ajo esto no será

posible debido a que no hay reproducción sexual, por lo tanto solamente se aplica la

técnica de fusión de protoplastos con el fin de ampliar la oferta genética para los procesos

de selección.

La fusión de protoplastos puede ser mediada tanto por técnicas químicas como

eléctricas. En ambos casos, la membrana celular es temporalmente desestabilizada,

resultando en la formación de poros y ligación citoplasmática entre protoplastos

adyacentes. Se cree que esta unión entre los protoplastos, inhibe la cerradura de la

membrana y a la vez permite la orientación aleatoria de las moléculas de lípidos en los

poros formados, para alinear y formar puentes entre los protoplastos adyacentes

(Blackhall et al., 1994).

23

Se puede tratar células de hojas en desarrollo de plantas para eliminar su pared

celular, dando lugar a un protoplasto. Estas células alteradas se pueden mantener en

cultivo y estimular para que se fusionen con otros protoplastos, y den lugar a híbridos

celulares somáticos (Klug, 1999).

Si se fusionan de este modo células de especies vegetales diferentes, se pueden

producir células híbridas con combinaciones cromosómicas únicas. Ya que se puede

inducir a que los protoplastos se dividan y se diferencien en tallos que dan a lugar a hojas,

en los laboratorios de investigación se dispone de potencial para producir alopoliploides.

En algunos casos, a partir de un cultivo de protoplastos se puede obtener una planta

entera. Si solo se producen tallos y hojas, aquellos se pueden injertar en el tallo de otra

planta. Si se forman flores, la fecundación puede dar lugar a semillas maduras que al

germinar darán lugar a una planta alopoliploide (Klug, 1999).

II.7 LA POLIPLOIDÍA

Aunque la mayoría de los miembros de las especies diploides tienen normalmente

dos dotaciones haploides de cromosomas, se conocen algunos casos con variaciones de

este patrón. Las modificaciones incluyen variación en el número de cromosomas

concretos así como reordenaciones del material genético dentro o entre cromosomas.

Tales cambios se denominan, en conjunto, mutaciones cromosómicas o aberraciones

cromosómicas, para distinguir tales alteraciones genéticas de las mutaciones génicas. Ya

que el cromosoma es la unidad de transmisión de acuerdo con las leyes de Mendel, las

aberraciones cromosómicas se transmiten a los descendientes de una manera predecible,

dando lugar a muchos ejemplos interesantes de variación fenotípica heredable (Klug,

1999).

La variación en el número de cromosomas va desde la adición o pérdida de uno o

más cromosomas a la adición de una o más dotaciones haploides de cromosomas. Si hay

tres o más dotaciones, se aplica el término más general de poliploidía. Aquellos que tienen

tres dotaciones son específicamente triploides (3n cromosomas), con cuatro dotaciones,

tetraploides (4n cromosomas), y así sucesivamente (Klug, 1999).

Con respecto a la poliploidía se pueden hacer varias consideraciones generales.

Esta situación es relativamente rara en muchas especies animales y es mucho más

corriente en especies vegetales. Los números impares de dotaciones cromosómicas

normalmente no se mantienen de modo seguro de generación en generación, debido a que

los organismos poliploides con un número impar de homólogos no producen gametos

equilibrados genéticamente. Por esta razón, los triploides, pentaploides y sucesivos no se

encuentran normalmente en especies que dependen exclusivamente de la reproducción

sexual para su propagación (Klug, 1999).

La poliploidía se puede originar de dos modos: Uno, la adición de una o más

dotaciones extras de cromosomas idénticas a la dotación haploide normal de la misma

especie, da lugar a la autoploploidía; y dos, puede ocurrir una combinación de dotaciones

cromosómicas de especies diferentes como consecuencia de cruzamientos interespecíficos

que dan lugar a la alopoliploidía (de la palabra griega alo, que significa otro, o diferente).

24

La distinción entre auto y alopoliploidía se basa en el origen genético de las dotaciones

extras de cromosomas (Klug, 1999).

De acuerdo con Klug (1999), se pueden utilizar los siguientes símbolos para

clarificar el origen de la dotación adicional de cromosomas. Por ejemplo, si A representa

a la dotación haploide de cromosomas de cualquier organismo, entonces

A = a1 + a2 + a3 + a4 + … + an

en donde a1, a2, etc., representa a cromosomas individuales y n al número

haploide. Utilizando esta nomenclatura, un organismo diploide estaría representado

simplemente como AA

Autopoliploidía

En la autopolipolidía, cada dotación adicional de cromosomas es idéntica a la de la

especie paterna. Por consiguiente, los triploides están representados por AAA, los

tetraploides por AAAA y así sucesivamente.

En general los autopoliploides son más grandes que sus parientes diploides. A

menudo las flores y los frutos de estas plantas tienen mayor tamaño. Este incremento

parece deberse al aumento del tamaño celular más que al aumento del número de células.

Aunque los autopoliploides no tienen informaciones nuevas o únicas, comparados con sus

parientes dilploides, tales variedades pueden tener un mayor valor comercial. Entre las

plantas triploides económicamente importantes se encuentran varias especies de papas del

género Solanum, manzanas «Winesap», bananos comerciales, sandías sin semilla y la

azucena atigrada cultivada Lilium tigrinum. Estas plantas se propagan asexualmente. Los

bananos diploides tienen semillas duras, pero la variedad comercial triploide -sin semillas-

tiene semillas comestibles. Variedades tetraploides de alfalfa, café, maní y manzana

McIntosh, tienen también valor económico por son más grandes o crecen más

vigorosamente que sus parientes diploides o triploides. La variedad comercial de fresa es

octoploide. Estas observaciones respaldan la importancia de la autopoliploidía en las

plantas cultivadas (Klug, 1999).

Alopoliploidía

La poliploidía se puede originar por hibridación de dos especies íntimamente

relacionadas. Si un óvulo haploide de una especie con dotación cromosómica AA se

fecunda por un espermatozoide haploide de otra especie con dotación cromosómica BB,

resultará un híbrido AB, en donde A = a1 + a2 + a3 + a4 + … + an y B = b1 + b2 + b3 +

b4 + … + bn. El híbrido puede ser estéril debido a su incapacidad para producir gametos

viables. Lo normal es que esto ocurra debido a que algunos o todos los cromosomas a y b

no pueden aparearse en la meiosis porque no son suficientemente similares. En

consecuencia, se produce una situación genéticamente desequilibrada. Sin embargo, si la

nueva combinación AB sufre una duplicación de los cromosomas, natural o inducida,

entonces en la meiosis se pueden producir parejas de cromosomas a y parejas b. Como

resultado, se produce un tetraploide fértil AABB. Ya que esta poliploidía tiene el

25

equivalente de cuatro genomas haploides y que el híbrido contiene una información

genética única, comparada con la de sus padres, tal organismo se denomina alotetraploide.

También se utiliza un término equivalente, el de anfidiploide, para describir la situación

en la que un organismo híbrido tiene dos genomas diploides completos. Cuando se

conocen las especies originales, se prefiere este último término. La alopoliploidía es la

forma natural más corriente de poliploidía en las plantas, debido a que la probabilidad de

formar gametos equilibrados es mucho mayor que en otros tipos de poliploidía. Ya que

hay dos homólogos de cada cromosoma dado, la meiosis se puede dar normalmente, y la

fecundación puede propagar con éxito al alotetraploide. Esta discusión supone la situación

más simple, en donde ninguno de los cromosomas del grupo A son homólogos de los del

grupo B. En híbridos entre especies muy próximas, es probable que haya algo de

homología entre los cromosomas a y b. En este caso el apareamiento en la meiosis es más

complejo. Se pueden formar multivalentes, que son más complejos que los trivalentes,

dando lugar a la formación de gametos desequilibrados. En tales casos, pueden surgir

variedades aneuploides a partir de anfidiploides (Klug, 1999).

Un ejemplo clásico de anfidiploide en vegetales es el de la especie cultivada de

algodón americano Gossypium. Esta especie tiene 26 pares de cromosomas: 13 son

grandes y los otros 13 mucho más pequeños. Cuando se descubrió que el algodón del

Viejo Mundo tenía sólo 13 pares de cromosomas grandes, se sospechó la alopoliploidía.

Cuanso se examinó el algodón silvestre americano y se vio que tenía 13 pares de

cromosomas pequeños, esta sospecha se reforzó. J. O. Beasley puedo reconstruir el origen

del algodón cultivado de modo experimental. Cruzó la variedad del Viejo Mundo con la

variedad silvestre americana y luego trató al híbrido con colchicina, para doblar el número

de sus cromosomas. El resultado de este tratamiento fue una variedad anfidiploide fértil.

Tenía 26 pares de cromosomas y características similares a la variedad cultivada (Klug,

1999).

La regla de que los núcleos somáticos contienen dos de cada uno de los

cromosomas característicos de la especie y los gametos uno solo tiene una serie de

excepciones que tienen efectos importantes en los métodos de mejora de las plantas. Se

puede realizar una clasificación arbitraria de estas excepciones: 1. La desviación consiste

en un número desusado de repeticiones de cierto cromosoma o cromosomas en el

complemento. 2. El organismo se caracteriza por un número desusado de repeticiones

de juegos completos de cromosomas (Allard, 1980).

Los efectos fisiológicos de la poliploidía varían mucho en los distintos materiales.

Sin embargo, en general la deficiencia o repetición de ciertos cromosomas produce

desequilibrios en el genotipo que hacen que aneuploides diferentes se distingan entre sí

morfológicamente y de la forma diploide. Los aneuploides son generalmente menos

vigorosos que sus genitores diploides (Allard, 1980).

La composición de los cromosomas de una especie cultivada puede influenciar los

procedimientos de mejora genética. El número y origen de los cromosomas influencia

factores como la cantidad de pérdida en el vigor ocurrida en la autopolinización, el tipo de

híbridos que exhiben la máxima heterosis, la estrategia más práctica para la retrocruza y la

factibilidad de obtener características útiles de otra especies (Fehr,1987).

26

El número somáticos de los cromosomas de una planta puede ser duplicado por

diferentes agentes, tanto físicos como químicos. La “Colchicina”, un alcaloide natural

extraído del azafrán de otoño, ha sido el químico más comúnmente utilizado. Colchicium

y la Calcemida son formas sintéticas derivadas de la Colchicina. La Colchicina se aplica

en regiones meristemáticas de la planta, donde las células están en constante mitosis

(Fehr, 1987). Los cromosomas en las células se duplican normalmente, pero el huso

cromático no se llega a formar. Los cromosomas no se alinean en el plano ecuatorial

durante la metafase y no llega a ocurrir normales, ni la anafase ni la telofase (Allard,

1980; Brauer, 1983; Fehr, 1987; Lewin, 2000). El resultado es una célula poliploide con el

doble del número de cromosomas originales.

Un efecto común de la poliploidía es el aumento del tamaño de la porciones

vegetativas de la planta, que hace que los autopoliploides sean más frondosos y más

vigorosos que sus correspondientes diploides (Allard, 1980). El caso típico es la papa

cultivada, la cual posee cuatro juegos idénticos de cromosomas (Autopoliploide).

Se deben considerar cuatro factores para utilizar la inducción de la poliploidía en

un programa de mejora genética (Dewey, citado por Allard, 1980):

El nivel de ploidía. Existen especies cultivadas que probablemente tengan un número

óptimo de cromosomas y cualquier incremento de éstos sea más bien detrimental que

beneficioso. Investigaciones indican que incrementar la ploidía más allá de un hexaploide

es de muy poca o ninguna ventaja. El ajo es una especie diploide con un número básico de

ocho. Es de suponer que el ajo se acopla bien a un proceso de inducción de la ploidía,

buscando una variedad autopoliploide.

Parte de la planta que tenga valor económico. La poliploidía inducida puede causar

irregularidades en el apareamiento de los cromosomas, lo cual resulta en la reducción de

la frecuencia de gametos viables en un juego de semillas. La inducción de la poliploidía

tienen grandes oportunidades en especies de reproducción vegetativa y cuyo principal

producto sea una parte vegetativa. Es el caso preciso del ajo.

Importancia económica del cultivo. El ajo es un cultivo altamente rentable y lo ha

demostrado por más de cien años en Guatemala. No será necesario realizar hibridaciones

ya que la especie es apomíctica obligada y por tanto no será necesario realizar trabajos

posteriores de mejora genética como las hibridaciones o retrocruzas. Además no es un

cultivo nuevo, por tanto no es necesaria su promoción.

Ciclo de selección. El cultivo de ajo tiene un ciclo de cultivo muy corto, cuatro a cinco

meses, según la variedad (Rosales-Longo, 2006) y pueden realizarse hasta dos ciclos de

selección al año, lo que puede acelerar la identificación de material en buenas

condiciones. La ploidía inducida resulta más atractiva para plantas anuales que aquellas

perennes, donde el ciclo de selección es notablemente largo.

II.8 LOS PROTOPLASTOS

Un protoplasto es la parte viva de una célula vegetal, consistente en el citoplasma

y el núcleo sin pared celular, porque ha sido removida. Los protoplastos pueden ser

aislados de órganos completos de las plantas o cultivo de tejidos. Si estos son colocados

27

en un medio nutritivo adecuado, pueden ser inducidos a formar de nuevo una pared

celular y dividirse. Un grupo pequeño de células se forma a partir de cada célula

individual y si los protoplastos fueron cultivados a una densidad relativamente baja,

pueden ser reconocidos como una colonia de callos. Las plantas pueden frecuentemente

ser regeneradas a partir de dichos callos. De ahí que, el cultivo de protoplastos se

constituya en una de las rutas por las cuales las plantas pueden ser multiplicadas, pero esta

vía no es utilizada de manera rutinaria para tal fin, aunque el número de especies en las

cuales se ha logrado la regeneración de plantas se ha incrementado constantemente

(George, 1993).

Actualmente los protoplastos son utilizados principalmente para realizar

investigación sobre infecciones de virus vegetales, y para la modificación de la

información genética de la célula mediante la inserción de fragmentos de ADN. Los

protoplastos también pueden ser fusionados entre sí para crear células vegetales híbridas.

Las células genéticamente modificadas tendrán un gran valor práctico, sólo si, a partir de

éstas, se pueden regenerar plantas completas que tengan la nueva constitución genética.

La habilidad para regenerar plantas a partir del cultivo de protoplastos es de vital

importancia para el éxito de los proyectos de la ingeniería genética vegetal (George,

1993).

Métodos para la preparación de protoplastos

Hay varios métodos por los cuales los protoplastos pueden ser aislados:

Por medios mecánicos, cortando o rompiendo la pared celular,

Por digestión de la pared celular, con enzimas,

Por una combinación de separación mecánica y enzimática.

Para un aislamiento exitoso se ha encontrado que es esencial causar la contracción del

protoplasto retirándolo de la pared celular, lo cual bajo circunstancias normales es

fuertemente comprimido. Esta contracción se logra mediante la plasmolización de las

células con soluciones de sales, tales como cloruro de potasio y sulfato de potasio, o con

azúcares o alcoholes-azúcares (particularmente manitol). La concentración osmótica

deberá ser suficiente para causar el encogimiento del protoplasma, pero no lo

suficientemente fuerte para causar daño celular (George, 1993).

Evans (1977), citado por George (1993), explica que, en el pasado, los protoplastos

eran aislados mecánicamente de piezas diseccionadas de material vegetal, pero solo un

número muy bajo de protoplastos se obtenía intacto y sin daño. Este método ha sido casi

reemplazado por técnicas de aislamiento enzimático. Las preparaciones comercialmente

disponibles usadas para el aislamiento de protoplastos son frecuentemente mezclas de

enzimas provenientes de hongos o bacterias, y contienen además pectinasa, celulasa y/o

hemicelulasa: su efectividad proviene, en parte, de su composición mixta. Los

protoplastos son usualmente aislados usando una combinación de diferentes productos

28

comerciales. La plasmólisis ayuda a proteger al protoplasto cuando ocurre la ruptura de la

pared celular durante la separación mecánica y también parece hacer a la célula más

resistente a los efectos tóxicos de las enzimas usadas para la digestión de la pared celular.

También sirve para dañar el plasmodesma que une las células adyacentes y así prevenir el

amalgamiento del protoplasma cuando la pared celular es digerida.

El tejido de una planta que va a ser utilizado para la extracción de protoplastos, debe

ser primero esterilizado superficialmente. Si se realiza una preparación posterior para

permitir la penetración de las soluciones osmóticas y las enzimas degradadoras de la

pared celular, se tiene más ventajas. Por ejemplo, cuando los protoplastos van a ser

separados del mesófilo de la hoja, la epidermis de la hoja es extraída y los segmentos del

tejido son entonces plasmolizados. El próximo paso es incubar el tejido con pectinasa y

celulsa hasta por 18 horas en la misma solución osmótica, durante este tiempo la pared

celular es degradada. La agitación del medio de incubación causa la liberación de los

protoplastos. Estos son lavados y separados in soluciones de potencial osmótico adecuado

antes de ser transferidos a un medio de cultivo (George, 1993).

Un tratamiento de digestión enzimática celular, menos severo y prolongado, es

requerido si primero se realiza una homogenización mecánica suave antes del tratamiento

con celulasa. Otra técnica es el uso secuencial de las enzimas; primero pectinasa para

separar las células y cuando la separación es completa, se usa celulasa para digerir la

pared celular. El rendimiento de protoplastos viables puede a veces ser incrementado por

el pre-tratamiento del tejido seleccionado con substancias del crecimiento, previo a la

separación. Los protoplastos son también comúnmente separados por tratamientos

enzimáticos de órganos o tejidos que han sido cultivados in vitro. Las células de cultivos

en suspensión que han sido subcultivados frecuentemente, y están dividiéndose

rápidamente, son una fuente apropiada de protoplastos (George, 1993).

Plantas madre

El aislamiento exitoso de protoplastos viables capaces de realizar división celular

y crecimiento, puede depender de la manera en la cual la planta madre fue cultivada. Por

ejemplo, Durand en 1979, encontró que el aislamiento de protoplastos de manera exitosa

y constante de plantas haploides de Nicotiana sylvestris dependía de la propagación de

lotes de plantas jóvenes in vitro. La composición del medio en el cual estas plantas fueron

cultivadas tenía un efecto notorio sobre el rendimiento de protoplastos y su habilidad para

dividirse. Un medio de cultivo con baja concentración de sales y carente de vitaminas era

particularmente desventajoso. La intensidad de luz en la cual las plantas fueron cultivada

también era crítico (George, 1993).

II.8.1 CULTIVO DE PROTOPLASTOS

Los protoplastos vegetales son muy frágiles y particularmente propensos tanto al

daño físico como químico; de ahí que, si éstos son suspendidos en un medio líquido, no

deberán ser agitados y el alto potencial osmótico en el cual el aislamiento se lleva acabo

deberá ser temporalmente mantenido. Como el crecimiento depende de una aireación

29

adecuada, los protoplastos son usualmente cultivados en contenedores profundos de

medio líquido o sólido; a densidades relativamente altas (5 x 104 a 10

5 protoplastos por

ml). Posiblemente esto es necesario porque los químicos endógenos se filtran a partir de

las células desprotegidas inhibiendo el crecimiento. Para promover el crecimiento, puede

también ser beneficioso añadir al medio, químicos suplementarios y factores de

crecimiento que normalmente no son requeridos para el cultivo de células intactas

(George, 1993).

La capacidad de los protoplastos para dividirse parece estar muy relacionada con

su habilidad para formar la pared celular. El tipo de pared que se produce inicialmente

puede ser controlado hasta cierto punto por el tipo de medio de cultivo que se utilice. Una

pared no rígida puede producirse en protoplastos de mesófilo de tabaco, por ejemplo, por

ser cultivados en un medio nutritivo que contiene una alta concentración de sales; aunque

tales células pueden dividirse 2 a 3 veces, ya no ocurre una división posterior al menos

que se forme una pared celular rígida por un cambio en el medio de cultivo. Bajo

circunstancias favorables la formación de la pared celular parece ocurrir tan pronto como

los protoplastos son removidos de las preparaciones enzimáticas hidrolizantes y los

primeros signos de la deposición de celulosa pueden ser detectados después de

aproximadamente 16 horas de permanecer en el medio de cultivo. Una vez que se inicia la

formación de la pared, la concentración osmótica es reducida para favorecer el

crecimiento celular. Esto se realiza inmediatamente en un medio líquido, pero, cuando los

protoplastos han sido colocados sobre un medio sólido será necesario transferir las células

sobre bloques de agar a otro sustrato o medio fresco.

Cuando se ha formado la pared celular, la célula regenerada generalmente

incrementa en tamaño y puede dividirse en 3 a 5 días. Si ocurren divisiones celulares

sucesivas, cada protoplasto da lugar a un pequeño grupo de células intactas y entonces a

una pequeña colonia de callo. Los cloroplastos de las células derivadas de los protoplastos

de los mesófilos de las hojas, pierden su integridad y desaparecen conforme se van

formando los callos. Los protoplastos pueden originarse de células de plantas intactas que

no tienen la misma composición genética. Si estas células se cultivan en medios líquidos,

ellas pueden permanecer juntas y formar paredes celulares comunes. Colonias de callos

mixtos dan lugar a plantas genéticamente diferentes (George, 1993).

Para evitar la agregación celular, los protoplastos deberán ser dispersados

libremente y cultivados a tan baja intensidad de luz como sea posible. Esto puede

significar que, en el cultivo de células intactas a baja densidad, deberá emplearse un

medio especialmente suplementado o acondicionado para este fin. Un método acerca de

esto fue desarrollado por Raveh en 1973. Un soporte de tejido ha sido usado para

suspender los protoplastos en un medio liquido de manera que los cambios de medio

pueden hacerse rápidamente (George, 1993).

Regeneración de plantas

Una planta completa fue regenerada por primera vez proveniente de callo

originado de protoplastos aislados en 1971, por Tabeke et al. Desde entonces se han

producido plantas a partir de protoplastos aislados de un gran número de especies, usando

30

morfogénesis directa de brotes o embriogénesis indirecta. La formación directa de

embriones somáticos a partir de protoplastos cultivados también es posible (George,

1993)

II.8.2 FUSIÓN DE PROTOPLASTOS

Aunque la fusión de protoplastos fue observada hace muchos años, llegó a tener

importancia desde que se desarrollaron los métodos para aislamientos de protoplastos y

subsecuente regeneración de plantas completas. Los protoplastos aislados no se fusionan

normalmente porque portan cargas negativas superficiales provocando que se repela unos

a otros. Se han descubierto varias técnicas para inducir la fusión de protoplastos. Dos de

las más exitosas técnicas son, uno, la adición de polyetilene glicol (PEG) en la presencia

de una concentración alta de calcio y un pH entre 8 – 10m y, dos, la aplicación de pulsos

eléctricos de corriente eléctrica directa (electro-fusión). Mediante la mezcla de

protoplastos de plantas de dos diferentes especies o géneros, se pueden realizar fusiones

exitosas, por ejemplo:

a. entre protoplastos de la misma planta, cuando ocurre la fusión de los núcleos de

dos células dando origen a homocariotes (sincariotes);

b. entre protoplastos de plantas de la misma especie (fusión intravarietal o

intraespecífica);

c. entre protoplastos de diferentes especies o géneros de plantas (fusión

interespecífica o intergenérica).

Los tipos de fusiones b y c, arriba mencionadas, pueden resultar en la formación de

híbridos genéticos los cuales podrían ser obtenidos raramente solo a través de cruzas

sexuales. Mediante la separación de la células híbridas fusionadas de las poblaciones

mixtas de los protoplastos cultivados con anterioridad, o generando un método por el cual

las células formadas a partir de las células fusionadas puedan ser reconocidas cuando

empiecen su crecimiento si ha sido posible regenerar nuevos híbridos somáticos. Algunas

plantas híbridas intergenéricas e interespecíficas han sido obtenidas por este medio.

También es posible la fusión del citoplasma de una clase de planta con el núcleo de otra.

Estas plantas cíbridas pueden ser útiles en programas de mejoramiento de plantas para la

transferencia de genes citoplasmáticos (George, 1993).

31

PARTE III

III. RESULTADOS

MATERIAL VEGETAL

Se recolectaron 16 materiales de ajo, en diferentes comunidades de los

departamentos de El Quiché y Huehuetenango. Estos materiales son representativos de los

nueve grupos genéticos identificados previamente como la colección VGA-2003.

Cuadro 2. MATERIALES GENÉTICOS RECOLECTADOS EN LOS

DEPARTAMENTOS DE EL QUICHÉ Y HUEHUETENANGO

Fuente: FODECYT 086-2007

No.

LAB.

ACCESIÓN

VGA

PRODUCTOR COMUNIDAD MUNICIPIO DEPARTAMENTO TIPO

A-1 09-001 ICTA Huehuetenango

(Río blanco)

Cantón El

Calvario

Chiantla Huehuetenango Chileno

A-2 09-002 ICTA Huehuetenango

(ICTA-Chapín)

Cantón El

Calvario

Chiantla Huehuetenango Egipcio

A-3 09-003 Hipólito Cifuentes Los Regadillos Chiantla Huehuetenango Chileno

A-4 09-004 Luis Felipe Rodríguez Los Regadillos Chiantla Huehuetenango Chileno

A-5 09-005 José Hernández Cantón El

Calvario

Chiantla Huehuetenango Chileno

A-6 09-006 Luis Enrique Figueroa Cantón El

Calvario

Chiantla Huehuetenango Egipcio

A-7 09-007 Maximiliano

Raimundo G.

Sec. 3 Rio San

Juan

Aguacatán Huehuetenango Chileno

A-8 09-008 Juan Rodríguez

Rodríguez.

Aldea La

Barranca

Aguacatán Huehuetenango Egipcio

A-9 09-009 Mario Cristóbal Aldea La

Barranca

Aguacatán Huehuetenango Chileno

A-10 09-010 Domingo Marquín

Alcón

Barrio San Juan Cunén El Quiché Chileno

A-11 09-011 Domingo Cruz Barrios Barrio San

Francisco

Cunén El Quiché Egipcio

A-12 09-012 Gaspar Mendoza Barrio San Juan Cunén El Quiché Egipcio

A-13 09-013 José Ailón Alcón Barrio San

Francisco

Cunén El Quiché Chileno

A-14 09-014 Domingo Marquín

Alcón

Barrio San Juan Cunén El Quiché Egipcio

A-15 09-015 Juan Rodríguez

Rodríguez

Aldea La

Barranca

Aguacatán Huehuetenango Chileno

A-16 09-016 Domingo Cruz Barrio San

Francisco

Cunén El Quiché Chileno

32

Fotografía 1. Gajos de ajo de diferentes materiales recolectados

Fuente: FODECYT 086-2007

CULTIVO IN VITRO DE 16 MATERIALES DE AJO

Cultivo in vitro de ápices vegetativos

Regeneración de plantas

Inducción de callo a partir de raíces

Cultivo de células en suspensión

Fotografía 2. Inducción de callo a partir de raíces de vitroplantas

Fuente: FODECYT 086-2007

AISLAMIENTO DE PROTOPLASTOS

a. A partir de callo (cultivo en suspensión)

Fotografía 3. Cultivos en suspensión

Fuente: FODECYT 086-2007

33

Los protoplastos aislados a partir de cultivos en suspensión de callos de ajo, eran muy

pequeños y frágiles, se rompían fácilmente durante el procedimiento de filtrado. Se

decidió extraer protoplastos a partir de hojas de vitroplantas, lo cual tuvo un mejor

resultado.

b. A partir de hojas de vitroplantas

Fotografía 4. Preparación de hojas de vitroplantas para la obtención de protoplastos

Fuente: FODECYT 086-2007

c. Ensayo de concentraciones y combinaciones enzimáticas

Celulasa: 0.25%, 0.50%, 0.75%

Macerozyme R-10: 0.25%, 0.50%, 1.0%

Driselasa: 0.50%, 1.0%, 1.50%

Temperatura de incubación: 25-28°C

Se determinó que la concentración y combinación enzimática más adecuada para el

aislamiento de protoplastos de ajo es:

Celulasa = 0.75% + Macerozyme R-10 =0.50% + Driselasa 1.0%

Cuadro 3. IDENTIFICACIÓN DE LOS TRATAMIENTOS ENZIMÁTICOS DE

LA GRÁFICA 1

Fuente: FODECYT 086-2007

Identificación del

tratamiento

Concentración Hormonal en %

Celulasa Macerozyme Driselasa

ca2 0.25 0.25 1.00

cb2 0.50 0.25 1.00

cc2 0.75 0.25 1.00

cd2 0.25 0.50 1.00

ce2 0.50 0.50 1.00

cf2 0.75 0.50 1.00

cg2 0.25 1.00 1.00

ch2 0.50 1.00 1.00

ci2 0.75 1.00 1.00

34

Gráfica 1. COMBINACIONES ENZIMÁTICAS PARA EL AISLAMIENTO DE

PROTOPLASTOS DE OCHO MATERIALES DE AJO

Fuente: FODECYT 086-2007

d. Determinación del tiempo de incubación

Se evaluó: 5 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas

Se determinó que el período de incubación más adecuado es:

5 horas de incubación

25 grados centígrados

Obscuridad

En agitación, a 50 RPM

pH = 5.6

Procedimiento:

Mezcla enzimática con el siguiente contenido: 0.75 % celulasa, 0.50% Macerozyme R-10,

1.0% Driselasa 0.6 M Manitol, 20mM MES·H2O y 5 mM MgCl2·6H2O

Se agita por un período de cinco horas en un agitador orbital á 50 rpm.

La Suspensión se filtra sucesivamente en filtros de 150 µm, 90 µm, 60 µm, 40 µm y se

centrifuga por tres minutos a 600 rpm.

El “pellet” que se obtiene se lava en una solución de lavado, constituida por Manitol 0.5

M, Cl2Ca 2.5 mM, a un pH de 5.6.

Se vuelve a resuspender el pellet y se repite el mismo procedimiento de centrifugado, 3

veces.

Finalmente se remueve el supernadante para obtener los protoplastos de ajo.

Determinación de viabilidad celular con tinción de Evans al 0.5%

35

Gráfica 2. VIABILIDAD DE LOS PROTOPLASTOS DE LOS MATERIALES DE

AJO EN DIFERENTES PERÍODOS DE INCUBACIÓN

Fuente: FODECYT 086-2007

Se estableció una metodología para el aislamiento de protoplastos de 8 materiales

de ajo, 4 de tipo egipcio (A2, A6, A8 y A14) y 4 de tipo chileno (A3, A7, A10 y A13), a

partir de hojas de vitroplantas.

Los materiales que respondieron mejor al procedimiento de aislamiento de

protoplastos presentando concentraciones más altas de protoplastos (60 x 100,000 y 70 x

100,000/ g de hojas frescas) fueron las de tipo egipcio (A6 y A8).

Se comprobó la viabilidad de los protoplastos de ajo aislados mediante la tinción

de Evans al 0.5%.

FUSIÓN DE PROTOPLASTOS

Electroporación: Electroporador

Fusión química: Polietilene Glicol (PEG)

36

ELECTROPORACIÓN

Se utilizó el electroporador Multiporator, Eppendorf. Se adaptó una metodología

para la fusión de protoplastos de ajo mediante el uso de electroporación con los siguientes

parámetros, impulsos de 1.5 V con una duración de 25 s, seguido de 2 ciclos de 170 V

durante 25 µs, y otro impulso de 7.5 V durante 40 s.

FUSIÓN QUÍMICA (PEG)

Se adaptó una metodología para la fusión de protoplastos de ajo mediante el uso

de Polietilene Glicol (PEG) de peso molecular 1300, en una concentración del 20%.

CULTIVO DE PROTOPLASTOS

Se logró la generación de microcallos de ajo a partir de los protoplastos aislados y

tratados con procedimientos de fusión celular.

Se empleó inicialmente el medio de cultivo Caboche (1980) y posteriormente un

medio de cultivo de Murashige y Skoog (1962), con la modificación de remover los iones

amonio, ya que estos son detrimentales para la supervivencia de los protoplastos

(Blackhall et al., 1994).

Medio de cultivo: Caboche (1980)

Medio Líquido

Medio semi-sólido

Medio MS modificado

FORMACIÓN DE MICROCALLOS

Se logró la generación de microcallos de ajo a partir de los protoplastos aislados y

tratados con procedimientos de fusión celular. Los materiales de ajo que respondieron a la

formación de microcallos mediante el procedimiento de electroporación fueron, A6, A7 y

A8, con las fusiones A6 x A7, A6 x A8 y A7 x A8. Los materiales de ajo que

respondieron a la formación de microcallos mediante el procedimiento de fusión química

fueron, A2, A6, A7, A8 y A10, con las fusiones A2 x A6, A2 x A8 y A6 x A8.

37

Cuadro 4. FORMACIÓN DE CALLO EN MATERIALES SUJETOS AL

TRATAMIENTO CON ELECTROPORACIÓN

Fusiones de

materiales ajo

Formación de callo % Formación de

callo

A2 x A6 + 20

A2 x A7 + 10

A6 x A7 ++ 25

A6 x A8 ++ 30

A6 x A10 + 15

A7 x A8 ++ 40

A8 x A10 + 20

A8 x A13 + 10

A13 x A14 - -

Fuente: FODECYT 086-2007

Cuadro 5. FORMACIÓN DE CALLO EN MATERIALES SUJETOS AL

TRATAMIENTO CON PEG (FUSIÓN QUÍMICA)

Combinaciones de

materiales ajo

Formación de callo % Formación de

callo

A2 x A6 +++ 30

A2 x A7 ++ 35

A2 x A8 +++ 25

A6 x A7 + 30

A6 x A8 +++ 40

A6 x A10 ++ 35

A7 x A8 ++ 25

A8 x A13 + 5

A13 x A14 - -

Fuente: FODECYT 086-2007

Contaminación: Se encontró una bacteria endógena en los materiales de ajo evaluados

que interfirió en todos los procesos de los experimentos realizados.

38

CONSERVACIÓN IN VITRO DE MATERIALES DE AJO

Se tiene en conservación in vitro, los 16 materiales de ajo seleccionados en este

estudio.

Fotografía 5. Conservación in vitro de 16 materiales de ajo

Fuente: FODECYT 086-2007

39

III.1 DISCUSIÓN DE RESULTADOS

El término protoplasto se refiere a componentes vivos de las células vegetales que

están rodeados sólo por la membrana plasmática; en realidad, constituyen células

desnudas de una planta. Muchos protoplastos pueden re-sintetizar la pared celular,

dividirse, formar colonias e incluso regenerar plantas. De acuerdo con la literatura, debido

a la ausencia de pared celular, los protoplastos son adecuados para diversas y diferentes

manipulaciones genéticas que no serían posibles con plantas o células intactas (Szabados

L., 1993).

La hibridación somática en plantas involucra cuatro pasos bien definidos: El

aislamiento de los protoplastos, la fusión de los protoplastos, la regeneración de plantas de

tejidos seleccionados y el análisis de las plantas regeneradas (Blackhall et al., 1994).

Como virtualmente cualquier combinación de protoplastos puede ser inducida para

lograr la fusión, la hibridación somática provee un medio para superar las barreras

sexuales en el mejoramiento genético convencional (Blackhall et al., 1994) y de hecho se

le reconoce como una valiosa herramienta que apoya los métodos convencionales del

mejoramiento de plantas (Pollard & Walter, 1990).

De acuerdo con Karamian (2010), el cultivo y regeneración de protoplastos son

pasos importantes en la hibridación somática y en la manipulación genética de materiales

vegetales de valor económico. Sin embargo para una exitosa aplicación de estas técnicas,

es indispensable disponer de procedimientos muy eficientes para aislamiento, cultivo y

regeneración de plantas. Gran parte de las actividades desarrolladas en este proyecto

trataron precisamente sobre estos aspectos, disponer de procedimientos y metodologías

para el desarrollo de una nueva línea de investigación en el campo del mejoramiento

genético no convencional, que puede ser aplicada tanto en ajo como en otras especies.

Los tratamientos para fusión celular resultan en la producción de heterokariontes y

homokariontes, mientras que algunos protoplastos se mantienen sin fusionarse. Los

heterokariontes son los productos de la fusión relevantes para la manipulación genética

vegetal. Estos contienen los núcleos de los géneros, especies, o variedades, inicialmente

en una mezcla de los citoplasmas. Al igual que las células sin fusionarse, las células de

los híbridos somáticos son totipotentes y son, en consecuencia, capaces de desarrollarse

en un organismo bien diferenciado, vía la organogénesis o embriogénesis. Las

combinaciones en el complejo núcleo-citoplasma pueden seguir a la fusión de los

protoplastos. (Blackhall et al., 1994)

De acuerdo con Smith, R., 2000, las células que se utilizan para el aislamiento de

protoplastos pueden venir de varias fuentes, tal como callos, cultivos en suspensión y

cultivo de tejidos. En este estudio se decidió usar hojas de vitroplantas ya que los

40

protoplastos eran más abundantes y de mayor tamaño en estos tejidos en comparación con

los protoplastos provenientes de los cultivos en suspensión, que además eran más frágiles.

Si se usan plantas provenientes del cultivo de tejidos, las hojas jóvenes son una fuente

excelente de células. Cuando se usan hojas, se remueve la capa de células debajo de la

epidermis si es posible exponiendo el mesófilo a la solución enzimática que permite la

digestión de la pared celular, si la capa epidermal no puede ser fácilmente removida, las

hojas pueden ser cortadas en trozos pequeños, exponiendo la capa del mesófilo (Smith,

R., 2000). Para el aislamiento de protoplastos el método enzimático es actualmente la

forma más importante y efectiva para ese propósito (Szabados L., 1993). Las paredes

celulares son removidas usualmente por digestión enzimática. Una enzima macerante

como la pectinasa es utilizada para separar el tejido en células individuales. Las celulasas

o las hemicelulasas se utilizan para digerir las paredes celulares, dejando los protoplastos.

En esta investigación se determinó que la Celulasa y la Driselasa, en combinación con

Macerozyme R-10 (0.75 % celulasa + 1.0% Driselasa + 0.50% Macerozyme R-10),

fueron efectivas en la remoción de la pared celular con un mayor número de protoplastos

viables, para la mayoría de los materiales de ajo en estudio.

Cuando se usa la digestión enzimática, es importante mantener el potencial

osmótico de la solución enzimática en condiciones ideales para prevenir la ruptura o

desecamiento de los protoplastos. Esto se logra mezclando las enzimas en una solución de

sales nutritivas y vitaminas, y ajustando el potencial osmótico con manitol, sorbitol, o una

combinación de los dos. El pH del medio enzimático debe también ser ajustado para una

actividad enzimática adecuada y un óptimo crecimiento celular. El aislamiento de

protoplastos depende en gran medida del tipo y concentración de los enzimas utilizados.

Los dos enzimas esenciales son la celulasa y la pectinasa, que degradan específicamente

los componentes celulósico y pectínico de la pared celular. Algunos tejidos también

requieren hemicelulasas adicionales para una correcta digestión de la pared. Otros

preparados enzimáticos como la driselasa desarrollan un conjunto de actividades lísicas:

celulasas, laminarinasas, xilanasas, pectinasas. Todos los preparados enzimáticos incluyen

impurezas, como nucleasas y proteasas, que pueden tener un efecto negativo sobre la

viabilidad celular (Smith, 2000).

El crecimiento del material inicial puede tener lugar in vivo o in vitro. El material

cultivado in vitro tiene la ventaja de que no precisa esterilización, como en el caso del

material cultivado in vivo. El tejido que se utiliza generalmente es el mesófilo (Pierik, R.,

1990). La mejor fuente para el aislamiento de protoplastos son las hojas en estado juvenil

y con un crecimiento activo (Hurtado, D., 1994). La utilización de callos y cultivos en

suspensión tiene la desventaja de que son genéticamente inestables, y, por lo tanto existe

un elevado grado de variación. En el caso de material cultivado en invernadero o en

cámaras de crecimiento, de deben mantener condiciones óptimas para el cultivo. Binding

y otros investigadores, indicaron su preferencia por los ápices del vástago, para la

obtención de protoplastos, mientras que otros autores prefieren plántulas, cotiledones o

hipocotilos (Pierik, R., 1990).

La elección del genotipo puede determinar el éxito en todo el proceso, desde los

protoplastos, hasta la regeneración de la planta. Por ejemplo, en el caso del tomate,

41

solamente un genotipo de cada 14 produce una planta completa, después del aislamiento

de los protoplastos (Pierik, R., 1990).

Una de las características que hace importante el cultivo de protoplastos es que,

por estar aislado del conjunto de células, cada protoplasto puede ser usado como un

sistema celular individual, lo que permite manejarlo igual que a un microorganismo,

hecho que permite efectuar estudios para el manejo, manejo y aislamiento de líneas

celulares híbridas o mutantes entre otras cosas (Hurtado, d., 1994).

En la presente investigación, el procedimiento de cortar en piezas pequeñas las

hojas de las vitroplantas de ajo, fue bastante efectiva para mejorar la acción de las

enzimas en la descomposición de la pared celular y obtener así la mayor cantidad de

protoplastos. De acuerdo con Loyola-Vargas, en Echinacea purpurea fue muy efectivo

cortar las hojas de las plántulas en tiras, siempre y cuando fueran colocadas rápidamente

en la solución enzimática digestiva, obteniendo así una mayor cantidad de protoplastos

viables.

Durante la purificación de los protoplastos aislados, el tiempo y la velocidad de

centrifugación son determinantes para la obtención de una mayor cantidad de protoplastos

viables (Loyola-Vargas, V., 2006). En experimentos con Brasicaceas, solo se utilizaron

tejidos de hojas para la obtención de protoplastos, en este caso se utilizaron solo hojas

bien desarrolladas de plantas en crecimiento activo, para asegurar un buen rendimiento de

protoplastos viables (Loyola-Vargas, V., 2006).

Un problema serio de los cultivos in vitro es la contaminación crónica causada por

microorganismos Fellner (1995). Respecto a este problema de las contaminaciones

latentes o crónicas, George (1993), señala que, conforme la experiencia con la

micropropagación ha progresado, ha llegado a ser evidente que las plantas pueden abrigar

algunas clases de problemas de contaminación con bacterias en los espacios intersticiales

de las células o dentro del sistema vascular. Algunas bacterias de esta clase son patógenas

mientras organismos encontrados dentro de las plantas pueden ser patógenos no

conocidos y pueden estar presentes sin causar síntomas obvios de enfermedad, o sin

aparente impedimento en el crecimiento del cultivo, estos organismos se llaman endófitos.

Una bacteria Pseudomona persistente interfería con la sobrevivencia in vitro ápices de

Carica papaya durante los meses de invierno, pero no ocurría así durante el verano

cuando los cultivos contaminados aparentaban no tener efectos adversos hasta el sub-

cultivo número trece. Entonces los cultivos comenzaban a declinar y la bacteria

gradualmente llegaba a ser dominante. No se sabe si la contaminación fue determinante en

causar la declinación del cultivo in vitro.

Contaminantes endógenos de cultivos in vitro de ajo han sido reportados en la

literatura científica tanto como la contaminación crónica causada por virus del ajo.

Fellner (1995), reportó que los callos derivados de hojas basales de Allium longicuspis

Regell se encontraban contaminados con microorganismos latentes.

Esto ha llevado a la interrogante, de si estas infecciones conducen a la esterilidad

de las plantas cultivadas en forma natural y a las características fisiológicas recalcitrantes

42

que muestran las plantas cultivadas in vitro. La ausencia de reproducción sexual reduce la

variabilidad genética del ajo. Por esta razón la regeneración de ajo a partir de protoplastos

es un objetivo actual constituyéndose en un prerrequisito para superar los problemas

relacionados con la reproducción sexual de Allium, utilizando hibridación somática,

gameto-somática o transformación directa de protoplastos. Al parecer los cultivos de ajo

in vitro tienen una contaminación crónica producida por microorganismos no

identificados, probablemente en estado latente. Se ha comprobado que los protoplastos

derivados de cultivos in vitro contaminados con microorganismos endógenos, no logran

dividirse pronto y mueren. En el presente estudio, se observó la presencia de una bacteria

que por sus características parece ser endógena. Ésta interfirió, tanto en el proceso de

fusión de protoplastos por el método de electroporación, así como, en la regeneración de

plantas a partir de los microcallos que lograron formarse de los materiales de ajo

sometidos a los procedimientos de fusión de protoplastos, impidiendo el desarrollo

posterior de los callos y la regeneración de plantas completas.

La naturaleza de la contaminación, sea crónica o endógena, es incierta, pero

preliminarmente algunas pruebas han mostrado la presencia de algunas bacterias gram-

positivas y gram-negativas y/o bacterias del género Bacillus. En otras pruebas realizadas

fueron identificadas colonias de Bacillus circulans y Staphylococcus xylosus fueron

identificados en callos de Allium longicuspis y Allium sativum, visiblemente

contaminados. Estos contaminantes endógenos no modificaron las características

fisiológicas de los callos (cultivados in vitro) y de plantas intactas (Fellner, 1995).

Existen varios reportes afines que indican la presencia de microorganismos

contaminantes en plantas completas de ajo y en cultivos in vitro. De acuerdo con Fellner

(1995), si se trata de aislar protoplastos de cultivos visiblemente contaminados también

los cultivos de protoplastos mostraran visiblemente la presencia de los microorganismos.

En la presente investigación fue posible observar la presencia de bacterias, mediante el

uso de microscopio, durante el proceso de aislamiento de los protoplastos de los

materiales de ajo de interés para el proyecto. La mezcla enzimática que se utiliza para

degradar la pared celular no mata los microorganismos contaminantes, ni siquiera los

daña. Los cultivos de protoplastos derivados de cultivos que no muestran contaminación

visible podrían también contener microorganismos que aun no son evidentes debido a su

baja concentración. En este estudio no se hizo evidente la presencia de microorganismos

endógenos, porque probablemente se hallaban en concentraciones muy bajas, hasta que se

realizó el aislamiento de protoplastos y posterior cultivo de los mismos, para la formación

de callos, mismos que, fueron inhibidos en su crecimiento por la competencia con las

bacterias endógenas.

Cuando se aplica antibióticos a los medios de cultivo, que contienen callos que no

muestran contaminación, éstos no suprimen los microorganismos ya que se hacen visibles

días o semanas más tarde. Existen reportes de que el uso de antibióticos en los medios de

cultivo, para inhibir las bacterias endógenas de Allium, pueden en ciertas concentraciones,

ser inhibitorias de la formación de la pared celular cuando se trata del cultivo de

protoplastos, además en concentraciones más bajas solo reducen la población de las

bacterias, manteniéndose dentro de los tejidos como bacterias endógenas. Se sabe que la

actividad de los antibióticos es afectada por el pH, por ejemplo ciprofloxacin tiene una

43

actividad óptima a un pH entre 7.0 y 8.0, pero estos valores pueden ser letales para las

células vegetales. Esto puede explicar el efecto no-tóxico de ciprofloxacin sobre las

bacterias, incluso a concentraciones relativamente altas (20 – 100 mg/l) que se han usado

en experimentos para eliminar contaminantes endógenos de cultivos in vitro de Allium.

De acuerdo con la hipótesis planteada, no fue posible la regeneración de híbridos

somáticos de ajo mediante el ensayo del método electrofísico ni mediante el método

químico para fusión de protoplastos. De acuerdo con Karamian (2010), el aislamiento

directo de protoplastos de monocotiledóneas es muy difícil y los protoplastos derivados

directamente de suspensiones celulares, frecuentemente fallan en la regeneración de

plantas completas. De acuerdo con la literatura consultada, en este estudio, tanto la

contaminación endógena de los cultivos in vitro, así como las condiciones intrínsecas de

la especie afectaron la regeneración de plantas completas de los materiales de ajo sujetos a

estudio.

44

PARTE IV

IV.1 CONCLUSIONES

1. No fue posible la regeneración de híbridos somáticos de ajo mediante el ensayo

del método electro físico para fusión de protoplastos.

2. No fue posible la regeneración de híbridos somáticos de ajo mediante el ensayo

del método químico para fusión de protoplastos.

3. Se estableció una metodología para el aislamiento de protoplastos de 8 materiales

de ajo, 4 de tipo egipcio (A2, A6, A8 y A14) y 4 de tipo chileno (A3, A7, A10 y

A13), a partir de hojas de vitroplantas.

4. Los materiales que respondieron mejor al procedimiento de aislamiento de

protoplastos presentando concentraciones más altas de protoplastos (60 x 100,000

y 70 x 100,000/ g de hojas frescas) fueron las de tipo egipcio (A6 y A8).

5. Se adaptó una metodología para la fusión de protoplastos de ajo mediante el uso

de electroporación con los siguientes parámetros, impulsos de 1.5 V con una

duración de 25 s, seguido de 2 ciclos de 170 V durante 25 µs, y otro impulso de

7.5 V durante 40 s.

6. Se adaptó una metodología para la fusión de protoplastos de ajo mediante el uso

de Polietilene Glicol (PEG) de peso molecular 1300, en una concentración del

20%.

7. Se logró la generación de microcallos de ajo a partir de los protoplastos aislados y

tratados con procedimientos de fusión celular.

8. Los materiales de ajo que respondieron a la formación de microcallos mediante el

procedimiento de electroporación fueron, A6, A7 y A8.

9. Los materiales de ajo que respondieron a la formación de microcallos mediante el

procedimiento de fusión química fueron, A2, A6, A7, A8 y A10.

10. Se tiene en conservación in vitro, los 16 materiales de ajo seleccionados en este

estudio.

11. Se desarrolló una nueva línea de investigación en el campo del mejoramiento

genético no convencional, que puede ser aplicada tanto en ajo como en otras

especies.

45

IV.2 RECOMENDACIONES

1. Introducir modificaciones a los métodos estudiados, generando nuevos

procedimientos, para lograr la regeneración de híbridos somáticos mediante la

fusión de protoplastos de los materiales de ajo de interés para el proyecto.

2. Identificar los organismos endógenos que se encuentran en los tejidos de los

materiales de ajo objeto de este estudio y determinar un método efectivo para su

control.

3. Solicitar a las autoridades del ICTA, la asignación de fondos para la continuidad

de este proyecto, ya que se avanzó en un gran porcentaje con las actividades

propuestas.

46

IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Allard, R. (1980). Principios de la mejora genética de las plantas. Barcelona.

Omega.

2. Al-Zahim, M.; Newbury, H.J.; Lloy-Ford, B.V. (1997). Classification of genetic

variation in garlic (Allium sativum L.) revealed by RAPD. Hortscience.

32(6): 1102-1104.

3. Brauer, O. (1983). Fitogenética Aplicada. Editorial Limusa, México. 518 p.

4. Burba, J.L. (2009). Mejoramiento genético y producción de “semilla” de ajo

(Allium sativum L.). Posibilidades de adaptación a diferentes ambientes.

Revista colombiana de ciencias hortícolas. Vol. 3 No. 1. pp 28-44

5. Carlson, P.S.; Smith, H.H.; Dearing, R.D. (1972). Parasexual interespecific

plant hybridization. Proceedings of National Academy of Sciences USA.

69:2292-2294.

6. Cifuentes, O. (2007). Evaluación de procedimientos hortícolas para la producción

en condiciones protegidas de semilla de ajo. ICTA. Guatemala. Informe

técnico de resultados 2006.

7. Fehr, W. (1987). Principles of cultivar development. McMillian Plublishing

company. New York. 536 p.

8. Fellner, M. (1995). Influence of the antibiotic Ciprofloxacin on culture of Allium

longicuspis callus derived protoplasts. Annals of Botany 76: 219-223.

9. Gavrilenko, T.; Thieme, R.; Himbach, U.; Thieme, T. (2003). Fertile somatic

hybrids of Solanum etuberosum (+) dihaploid Solanum tuberosum and their

backcrossing progenies: relationships of genome doage with tuber

development and resistance to patato virus Y. Euphytica 131:323-332.

10. George, E. F. (1993). Plant Propagation by tissue culture Part 1 & Part 2.

Exegetics Limited. England.

11. Herklots, G.A. (1972). Vegetables in south-east Asia. Hong Kong. South China

Morning Post Ltd. 525 p.

12. Horita, M.; Morohashi, H.; Komai, F. (2003). Production of fertile somatic

hybrid plants between oriental hybrid lily and Lilium x formolongi. Planta

217:597-601.

47

13. Hurtado, D.V. & Merino M.E. (1994). Cultivo de Tejidos Vegetales. Editorial

Trillas. México. 232 p.

14. Karamian, R. & Ranjbar, M. (2010). Somatic embryogenesis and plant

regeneration from protoplast culture of Muscari Neglectum Guss. African

Journal of Biotechnology. Vol. 10(22), pp 4602-4607.

15. Klug, W.S. & Cummings, M.R. (1999). Conceptos de Genética. Madrid. 840 p.

16. Koul, A.K.; Gohil, R.N.; Langer, A. (1979). Prospects of breeding improved

garlic in the light of its genetic and breeding systems. Euphytica. 28: 457-

464.

17. León, J. (2000). Botánica de los cultivos tropicales. San José, C.R. IICA. 522 p.

18. Lewin, B. (2000). Genes VII. Oxford University Press. New York. 990 p.

19. Loyola-Vargas, V.M. & Vásquez-Flota, F. (2006). Plant Cell Culture Protocols.

Humana Press. New Jersey. 393 p.

20. Matsumoto, K.; Duarte, A.; Oka, S. (2002). Somatic hybridization by

electrofusion of banana protoplasts. Euphytica 125:317-324.

21. Molina-Monterroso, L.; Suchini A.E. (2007). Cultivo in vitro de puntas de raíz

para la micropropagación de ajo. ICTA. Guatemala. Informe Técnico de

Resultados 2006.

22. Moriconi, D.; Burba, J.; Izquierdo, J. (1991). Manual de intercambio y

propagación de germoplasma de ajo a través de microbulbillo. Santiago de

Chile. Red de Cooperación Técnica en Producción de Cultivos

Alimenticios de la Oficina Regional de la FAO Para América Latina y El

Caribe. 45 p.

23. Muñoz, S.; Escaff, M.; Izquierdo, J. (1988). Manual de intercambio y manejo de

germoplasma in vitro de ajo Allium sativum L. Santiago de Chile. Red de

Cooperación Técnica en Producción de Cultivos Alimenticios de la

Oficina Regional de la FAO Para América Latina y El Caribe. 48 p.

24. Murashige, T; Skoog F. (1962). A revised medium for rapid growth and bio

assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15: 473-497.

25. Novak, F.; Havel, L.; Dolezel, J. (1982). In vitro breeding system of Allium.

Plant Tissue Culture. In Proceedings 5th International Congress Plant

Cell Tissue & Cell Culture. Japón. P. 767-768.

48

26. Ohsumi, C.; Kojima, A.; Hinata, K.; Etoh, T.; Hayashi, T. (1993).

Interespecific hybrid between Allium cepa and Allium sativum. Theoretical

and Applied Genetics. 85:969-975.

27. Pérez, M.; Marquez, F.; Peña, A. (1998). Mejoramiento genético de hortalizas.

Texcoco, México. Mundi-Prensa. 380 p.

28. Pérez, M.; Márquez, F.; Peña, A. (1998). Mejoramiento genético de hortalizas.

Texcoco, México. Mundi-Prensa. 380 p.

29. Pérez-García, G. (2007). Bulbificación in vitro de ajo con fines de producción de

semilla. ICTA. Guatemala. Informe técnico de resultados 2006.

30. Pierik, R.L.M. (1990). Cultivo In vitro de las Plantas Superiores. Martinus

Nijhoff Publishers. España. 326 p.

31. Pollard, J.W. & Walker, J.M. (1990). Plant cell and tissue culture. New Jersey,

USA. Humana Press. 597 p.

32. Ramírez, E. (2007). Micropropagación por embriogénesis somática de especies

Abies guatemalensis. ICTA. Guatemala. Informe técnico de resultados

2006.

33. Robledo-Paz, A.; Villalobos-Arámbula, V.M.; Jofre-Garfias, A.E. (2000).

Efficient plant regenaration of garlic (Allium sativum L.) by root-tip culture.

In vitro Cell Development Biology. 36:416-419.

34. Rosales-Longo F.U., Molina-Monterroso, L.G. (2007). Diversidad genética de

las poblaciones de ajo (Allium sativum L.) cultivadas en Guatemala,

definida por marcadores de ADN. Agronomía Mesoamericana 18(1): 75-84.

35. Rosales-Longo, FU. (1999). Mejoramiento por selección clonal de ajo egipcio. In

Informe técnico de resultados, 1999. Huehuetenango, Guatemala. Instituto

de Ciencia y Tecnología Agrícolas. p 75-80.

36. Rosales-Longo, FU. (2006). Estudio de la variabilidad genética de las

poblaciones de ajo (Allium sativum l.) cultivadas en Guatemala y formación

de un banco de germoplasma representativo, con fines de mejoramiento

genético. Instituto De Ciencia y Tecnología Agrícolas ICTA. AGROCYT.

Quetzaltenango, Guatemala. 77 p.

37. Santizo, M.Y. (2005). Estudio del efecto de tres retardadores de crecimiento sobre

la regeneración in vitro de tres genotipos de ajo (Allium sativum L.). Tesis

Ingeniero Agrónomo. Universidad de san Carlos de Guatemala, Centro

Universitario de Occidente. Quetzaltenango, Guatemala. 66 p.

49

38. SAS Institute Inc. (1989). SAS/STAT User’s guide, Release 6.03 Edition. SAS

Institute Inc. Cary, NC, USA. 1028 p.

39. Smith, R.H. (2,000). Plant tissue culture: techniques and experiments. Academic

Press. San Diego California, USA. 231p.

40. Spector, D.L.; Goldman, R.D.; Leinwand, L.A. (1998). Cells: a laboratory

manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. EUA. 3 v.

41. Steel, R.G.D.; Torrie, J.H. (1985). Bioestadística: Principios y procedimientos.

Mcgraw-Hill. México. 622 p.

42. Szabados, L. (1993). Cultivo de Tejidos en la Agricultura. Capítulo 10.

Protoplastos: Aislamiento, cultivo y regeneración de plantas. Unidad de

Investigación en Biotecnología. Centro Internacional de Agricultura

Tropical –CIAT- Cali, Colombia.

43. Universidad de la República. (1999). Protoplastos: Cultivo y Aplicaciones.

Departamento de Biología Vegetal. Facultad de Agronomía. Uruguay. 20 p.

44. Yamashita, K.; Hisatsune, Y.; Sakamoto, T.; Ishizuka, K.; Tashiro, Y. (2002).

Chromosome and cytoplasm analices of somatic hybrids between onion

(Allium cepa, L) and garlic (A. sativum L.). Euphytica 125:163-167.

50

ANEXOS

51

ANEXO 1

AISLAMIENTO DE PROTOPLASTOS A PARTIR DE CALLO

Fotografía 6. Protoplastos aislados a partir de cultivos en suspensión

Fuente: FODECYT 086-2007

ANEXO 2

AISLAMIENTO DE PROTOPLASTOS A PARTIR DE HOJAS DE

VITROPLANTAS

Fotografía 7. Secuencia de pasos para la obtención de protoplastos

Fuente: FODECYT 086-2007

52

ANEXO 3

DETERMINACIÓN DE VIABILIDAD CELULAR CON TINCIÓN DE EVANS AL 0.5%

Fotografía 8. Tinción de Evans y conteo de protoplastos con cámara de Neubauer

Fuente: FODECYT 086-2007

OBTENCIÓN DE PROTOPLASTOS A PARTIR DE LOS MATERIALES DE AJO

SELECCIONADOS

Fotografía 9. Protoplastos obtenidos de los materiales de ajo en estudio

Fuente: FODECYT 086-2007

53

ANEXO 4

Fotografía 10. Electroporación

Fuente: FODECYT 086-2007

Fotografía 11. Fusión química

Fuente: FODECYT 086-2007

54

ANEXO 5

Fotografía 12. Cultivo de protoplastos

Fuente: FODECYT 086-2007

Fotografía 13. Microcallos

Fuente: FODECYT 086-2007

Fotografía 14. Contaminación bacterial

Fuente: FODECYT 086-2007

55

ANEXO 6

Cuadro 6. COMBINACIONES HORMONALES EVALUADAS

Identificación del

tratamiento

Concentración Hormonal en %

Celulasa Macerozyme Driselasa

ca1 0.25 0.25 0.50

ca2 0.25 0.25 1.00

ca3 0.25 0.25 1.50

cb1 0.50 0.25 0.50

cb2 0.50 0.25 1.00

cb3 0.50 0.25 1.50

cc1 0.75 0.25 0.50

cc2 0.75 0.25 1.00

cc3 0.75 0.25 1.50

cd1 0.25 0.5 0.50

cd2 0.25 0.5 1.00

cd3 0.25 0.5 1.50

ce1 0.50 0.50 0.50

ce2 0.50 0.50 1.00

ce3 0.50 0.50 1.50

cf1 0.75 0.50 0.50

cf2 0.75 0.50 1.00

cf3 0.75 0.50 1.50

cg1 0.25 1.00 0.50

cg2 0.25 1.00 1.00

cg3 0.25 1.00 1.50

ch1 0.50 1.00 0.50

ch2 0.50 1.00 1.00

ch3 0.50 1.00 1.50

ci1 0.75 1.00 0.50

ci2 0.75 1.00 1.00

ci3 0.75 1.00 1.50

Fuente: FODECYT 086-2007

56

PARTE V

V.I INFORME FINANCIERO

Nombre del Proyecto:

Numero del Proyecto: 086-2007

Investigador Principal y/o Responsable del Proyecto: INGA. AÍDA ELEONORA RAMÍREZ

Monto Autorizado: Q391,930.00

Plazo de Ejecución en meses 24 MESES

Fecha de Inicio y Finalización: 02/02/2009 al 31/01/2011

Menos (-) Mas (+)

0 Servicios Personales

31 Jornales Q 30,000.00 Q 30,000.00 Q -

35 Retribuciones a destajo Q 30,000.00 Q 29,997.12 Q 2.88

1 Servicios No Personales

114 Correos y telégrafos 1,500.00Q 872.00Q 628.00Q

121 Divulgación e Información 1,500.00Q 1,500.00Q

122 Impresión, encuadernación y reproducción 2,000.00Q 2,000.00Q

131 Viáticos en el exterior 9,000.00Q 9,000.00Q

133 Viáticos en el interior 10,000.00Q 9,000.00Q 938.00Q 62.00Q

141 Transporte de personas 10,000.00Q Q175.00 10,000.00Q

181

Estudios,investigacionesy proyectos de

factibilidad 40,000.00Q 40,000.00Q -Q

181

Estudios,investigacionesy proyectos de

factibilidad (Evaluación Externa de Impacto) 8,000.00Q 8,000.00Q

185 Servicios de capacitación 10,000.00Q 10,000.00Q

2 Materiales y Suministros

241 Papel de escritorio 500.00Q 310.80Q 189.20Q

243 Productos de papel o cartón 1,000.00Q 672.05Q 327.95Q

245 Libros, revistas y periódicos 5,000.00Q 3,325.00Q 1,675.00Q

261 Elementos y compuestos químicos 58,000.00Q 56,130.39Q 1,869.61Q

262 Combustibles y Lubricantes 4,000.00Q 1,962.90Q 2,037.10Q

263 Abonos y fertilizantes 500.00Q 325.00Q 175.00Q

264 Insecticidas, fumigantes y similares 500.00Q 0.05Q 500.05Q -Q

267 Tintes, pinturas y colorantes 500.00Q 480.00Q 20.00Q

268 Productos plásticos nylon, vinil y pvc 10,000.00Q 7,000.00Q 1,248.56Q 1,751.44Q

269 Otros productos químicos y conexos 1,500.00Q 1,500.00Q

272 Productos de vidrio 8,300.00Q 4,834.28Q 3,465.72Q

282 Productos metálicos no férricos 500.00Q 500.00Q

286 Herramientas menores 1,500.00Q 619.39Q 155.00Q 725.61Q

291 Útiles de oficina 500.00Q 271.75Q 771.75Q -Q

292 Útiles de limpieza y productos sanitarios 2,000.00Q 167.60Q 2,167.60Q -Q

295

Útiles menores, médico-quirúrgicos y de

laboratorio 3,000.00Q 7,000.00Q 9,325.18Q 674.82Q

297 Útiles, accesorios y materiales eléctricos 1,000.00Q 946.42Q 53.58Q

298 Accesorios y repuestos en general 10,000.00Q 5,000.00Q 3,100.00Q 1,900.00Q

3 Propiedad, planta y equipo

323 Equipo médico-quirúrgico y de laboratorio 125,000.00Q 10,000.00Q 134,350.00Q 650.00Q

329 Otras maquinarias y equipos 179.99Q 179.99Q -Q

351

Libros, revistaas y otros elementos

coleccionables 3,325.00Q 3,325.00Q -Q

381 Activos intangibles 10,000.00Q 5,000.00Q 5,000.00Q

9 Asignaciones Globales

(-) Gastos Administrativos (10%) 35,630.00Q 35,630.00Q -Q

TOTAL 391,930.00Q Q59,944.39 Q59,944.39 328,397.09Q 63,707.91Q

Monto Autorizado 391,930.00Q Disponibilidad: 63,532.26Q

( -) Ejecutado 326,897.74Q

Ejecutado Pendiente de

Ejecutar

"AMPLIACIÓN DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA DEL AJO POR MEDIO DE LA

HIBRIDACIÓN SOMÁTICA"

PRÓRROGA AL 31/07/2011

Grupo Renglon Nombre del Gasto Asignacion

Presupuestaria

TRANSFERENCIA En Ejecuciòn