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CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYT- SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACYT-

FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT- SECCIÓN DE PATOLOGÍA. DEPARTAMENTO DE LABORATORIOS CLÍNICOS

HOSPITAL ROOSEVELT MINISTERIO DE SALUD PÚBLICA Y ASISTENCIA SOCIAL

INFORME FINAL

TIPIFICACIÓN DE NEOPLASIAS DEL TEJIDO LINFOIDE (LINFOMAS) Y LINFADENOPATÍAS A TRAVÉS DE MARCADORES INMUNOHISTOQUÍMICOS

PROYECTO FODECYT NO. 35-2008

DR. ORLANDO RODAS PERNILLO Investigador Principal

GUATEMALA, FEBRERO DE 2013.

AGRADECIMIENTOS: La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por la Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología –SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología –CONCYT-.

ACRÓNIMOS

ALC Antígeno linfocítico cutáneo ALK Kinasa de linfoma anaplásico C-LACG Linfoma anaplásico de células grandes cutáneo CAB Centro activado parecido a las células B CGB Centro germinal parecido a las células B EBER ARN codificado del virus de Epstein Barr LACG Linfoma anaplásico de células grandes LCM Linfoma de células del manto LCP Leucemia de células peludas LDCBG Linfoma difuso de células B grandes LF Linfoma folicular LH Linfoma de Hodgkin LHc Linfoma de Hodgkin clásico LHNPL Linfoma de Hodgkin tipo nodular con predominio linfocítico LLA Leucemia linfoblástica aguda LLB Linfoma linfoblástico LLC Leucemia linfocítica crónica LLP Linfoma linfocítico pequeño LP Linfocito predominante LPCT Linfoma periférico de células T LPL Linfoma linfoplasmacítico LTCBGRH Linfoma de células T/células B grandes ricas en histiocitos LZM Linfoma de la zona marginal MW Macroglobulinemia de Waldenström PM-VLEB Proteína de membrana-virus latente de Epstein Barr TdT Transferasa desoxinucleotidil terminal VEB Virus de Epstein Barr VHH Virus del Herpes humano

CONTENIDO

Página

RESUMEN ..................................................................................................................................... i

SUMMARY ................................................................................................................................... ii

PARTE I ........................................................................................................................................ 1

I.1 INTRODUCCIÓN ................................................................................................ 1 I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ........................................................... 3

I.2.1 Antecedentes en Guatemala........................................................................ 3 I.2.2 Justificación del trabajo de investigación ................................................... 5

I.3 OBJETIVOS E HIPÓTESIS ............................................................................... 6 I.3.1 Objetivos ..................................................................................................... 6

I.3.1.1General.............................................................................................. 6 I.3.1.2 Específicos .................................................................................... 6

I.3.2 Hipótesis ..................................................................................................... 6 I.4 METODOLOGÍA................................................................................................. 7

I.4.1 Localización................................................................................................ 7 I.4.2 Las Variables .............................................................................................. 7 I.4.3 Indicadores.................................................................................................. 7 I.4.4 Estrategia metodológica.............................................................................. 7 I.4.5 El Método.................................................................................................... 8 I.4.6 La Técnica Estadística .............................................................................. 17

PARTE II..................................................................................................................................... 18

MARCO TEÓRICO ....................................................................................................... 18 II.1 PANELES DE INMUNOHISTOQUÍMICA .................................................... 18 II.2 NEOPLASIAS HEMATOLINFOIDES COMUNES ...................................... 27

II.2.1 Linfomas de células B pequeñas .............................................................. 27 II.2.2 Linfoma linfoplasmacítico (LPL)............................................................. 30 II.2.3 Neoplasias de células plasmáticas ............................................................ 30 II.2.4 Linfomas de células B grandes................................................................. 32 II.2.5 Linfoma de Hodgkin................................................................................. 38 II.2.6 Linfomas de células T............................................................................... 40 II.2.7 Neoplasias histiocítica y dendríticas......................................................... 43

PARTE III ................................................................................................................................... 45

III.1 RESULTADOS ................................................................................................... 45 III.1 Discusión de resultados ...................................................................................... 58

PARTE IV ................................................................................................................................... 60

IV.1 CONCLUSIONES .............................................................................................. 60 IV.2 RECOMENDACIONES .................................................................................... 61 IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................. 62

PARTE V ..................................................................................................................................... 72

V. INFORME FINANCIERO ................................................................................ 72

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RESUMEN La tipificación apropiada de neoplasias de tejido linfoide a través de técnicas de inmunohistoquímica es importante para realizar un diagnóstico específico y diferenciar entre procesos neoplásicos y reactivos. De esta manera se proporciona al paciente el tratamiento adecuado, evitando tratamientos incompletos o innecesarios. En Guatemala, los hospitales públicos realizan este diagnóstico con base en el estudio histológico morfológico solamente, el cual no es específico, debido a que no cuentan con las técnicas de inmunohistoquímica para realizar esta tipificación. El objetivo principal del estudio fue determinar el inmunofenotipo en las neoplasias de origen linfoide y linfadenopatías de los pacientes que consultan al Hospital Roosevelt y Hospitales Departamentales de la Red Nacional o en otros centros que sean referidos al Hospital Roosevelt para su tratamiento. El estudio se realizó con un diseño no experimental, transversal descriptivo en pacientes del Hospital Roosevelt durante los años 2008-2009. Se revisaron las preparaciones histológicas para realizar la observación histológica-morfológica, y luego se realizaron los estudios de inmunohistoquímica. Los anticuerpos utilizados permitieron realizar la inmunotipificación de neoplasias linfoides de células grandes, clasificar el origen de las mismas y descartar procesos neoplásicos indiferenciados. El laboratorio realizó el control de calidad de los métodos de inmunohistoquímica utilizados corriendo muestras control que no presentaran enmascaramiento de antígenos. Los resultados mostraron que 58% de los pacientes eran del sexo masculino y 42% fueron del sexo femenino. Los grupos etáreos con el mayor porcentaje de lesiones diagnosticadas fueron de 0-10 años, 21-25 años y 36-40 años de edad. Los anticuerpos que más se utilizaron en las pruebas fueron el CD20, CD3 y CD45, que son importantes para inmunotipificar el linaje B o T de las neoplasias. Los linfomas no Hodgkin de células B fueron diagnosticados en un 37% de los casos, siendo la neoplasia diagnosticada mayormente. La enfermedad de Hodgkin fue diagnosticada en 11% de los casos. El 43% de las lesiones correspondieron a hiperplasias linfoides/procesos infecciosos (no neoplásicos). La inmunotipificación además permitió la diferenciación del diagnóstico específico de neoplasias mieloides, histiocitosis de células de Langerhans, rabdomiosarcoma alveolar, liposarcoma rediferenciado y metástasis a ganglio linfático, que anteriormente fueron diagnosticadas como neoplasias tipo linfoide. En conclusión, las técnicas de inmunohistoquímica implementadas son herramientas útiles que permitiránel diagnóstico diferenciado de las neoplasias tipo linfoide, hiperplasias linfoides (no malignos) y otro tipo de neoplasias. Las autoridades del HospitalRoosevelt pueden utilizar los resultados obtenidos en este estudio para la adquisitión de medicamentos para el tratamiento adecuado de las neoplasias encontradas con mayor frecuencia.

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SUMMARY The proper tipification of lymphoid neoplasias through immunohistochemistry is important in order to make a specific diagnostic and diferenciate between neoplasic and reactive processes. In this way, the patient receives the adequate treatment required and incomplete or unnecessary treatments are avoided. In Guatemala, national public hospitals make this diagnosis based on the histo-morphologic study only, which is not specific, due to the lack of immunohistochemistry techniques to perform the typification. The main objective of this study was to determine the immunophenotype of the lymphoid neoplasias and lymphoadenopathies in patients treated at the Roosevelt Hospital, local hospitals from the national hospital network and other centers refering patients to Roosevelt Hospital. The study had a non-experimental design, descriptive transversal and was carried out in patients treated at Roosevelt Hospital from 2008 to 2009. The histologic samples were observed to perform the histo-morfologic classification, and then, the immunohistochemistry study was carried out. The antibodies used allowed the immunotipification of large-cell lymphoid neoplasias, classification of their origin and dismiss undiferenciated neoplasic processes. The laboratory carried out the quality control for the immunohistochemistry methods running control samples not showing antigen masking. Results showed that 58% of the patients were males and 42% were females. The age groups with highest percentage of diagnosed lesions were 0-10 ys, 21-25 ys and 36-40 ys old. The CD20, CD3 and CD45 were the antibodies mostly used, which are important for immune tipification of lineage B or T neoplasias. B-cell no-Hodgkin lymphoma was diagnosed in 37% percent of the cases, and it was the neoplasia with the highest diagnostic percentage. Hodgkin disease was diagnosed in 11% of the cases. Lymphoid hyperplasias/infectious processes (no neoplasic) were diagnosed in 43% of the cases. Moreover, specific diagnosisof myeloid neoplasias, Langerhans cell hystiocitosis, alveolar rhabdomyosarcoma, re-diferenciated liposarcoma and lymph node metastasis, which were previously diagnosed aslymphoid neoplasias, were achieved through immunotipification. In conclusion, the implemented immunohistochemistry techniques are useful tools allowing of the diferencial diagnosis of lymphoid neoplasias, lymphoid hyperplasias (non malignant) and other type of neoplasias. The Roosevelt Hospital authorities may use the results obtained in this study to acquire the medications for the proper treatment of the neoplasias more frequently found.

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PARTE I I.1 INTRODUCCIÓN En la década de los 80 y principios de los 90, se introdujeron y generalizaron las técnicas de inmunohistoquímica y genética molecular para identificar y aplicar criterios diferenciales y reproducibles para la clasificación de los linfomas. También se describieron nuevas entidades, definidas con técnicas de inmunohistoquímica y de biología molecular con una correlación clínica característica, que permite la consideración de entidades anatomoclínicas, inmunofenotípicas y genéticas. La clasificación de los linfomas reconoce tres categorías principales de neoplasias linfoides basado en la morfología y el linaje celular: neoplasias de células B, neoplasiasde células T y células NK (natural killer o asesinas naturales) y linfoma de Hodgkin. Esta clasificación fue publicada en 1994 con la denominación Revised European American Classification of Lymphoid Neoplasm (Clasificación REAL). La Organización Mundial de la Salud (OMS), recientemente impulsó el desarrollo y las modificaciones de la clasificación REAL mediante la creación de comités de estudio con la participación de clínicos y patólogos. La clasificación REAL/OMS tiene hoy una aplicación generalizada y existe en relación con ella una gran aceptación intelectual y científica, consecuencia de su notable reproducibilidad cuando se utilizan las técnicas adecuadas para su estudio, ya sean tanto inmunológicas como de biología molecular. Esto posibilita identificar, conocer el estadio madurativo de la célula tumoral, la patogenia de las alteraciones que inciden en la proliferación, la diferenciación o la apoptosis del tumor, la situación inmunológica, e incluso en algunos casos, la aproximación etiológica. Muchos de los trastornos hematolinfoides se derivan de los mismos tipos de células en diferentes etapas de maduración y sus diferencias morfológicas son sutiles. Al observar las tinciones con hematoxilina y eosina, un patólogo experimentado puede realizar un diagnóstico correcto basado solamente en las mismas, sin embargo, si este tipo de especímenes no se observa con frecuencia, el diagnóstico puede ser difícil. Por consiguiente, se recomienda el uso de un panel de tinciones de inmunohistoquímica para ayudar a determinar el linaje de las células, subclasificar tumores, y tamizar las entidades morfológicas comunes que semejan a otras. Los linfomas no Hodgkin son neoplasias malignas linfoides que pueden presentar fenotipo de células B ó T; las de tipo B son más frecuentes, mientras que los linfomas de tipo T tienen peor pronóstico y por lo general son más agresivos. Con el objeto de realizar un diagnóstico específico para el tratamiento de la enfermedad, se recomienda el uso de paneles de tinciones de inmunohistoquímica, que sirvan de punto de partida para el diagnóstico diferencial, basándose en las categorías morfológicas, tales como proliferaciones foliculares, expansiones paracorticales, infiltrados difusos de células pequeñas, células grandes, e infiltrados similares al de Hodgkin. En las técnicas de inmunohistoquímica se identifican antígenos utilizando anticuerpos seleccionados en combinación con un marcador visual directamente en los tejidos (biopsias, especímenes quirúrgicos, citología, etc.). El tejido debe estar fijado correctamente en parafina. Este método permite tener diagnósticos precisos en tumores, enfermedades infecciosas y tambien como factor pronóstico en varios tipos de cáncer (por ejemplo, el carcinoma de la glándula mamaria).

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Específicamente en el caso de linfomas, existen una serie de anticuerpos básicos que se corren para realizar el tamizaje inicial. También es importante entender el patrón de tinción normal de estos marcadores en los tejidos linfoides benignos o reactivos. Las tinciones más usadas son para CD3, CD30, ciclina D1, TdT, CD43 y Ki 67. Dependiendo de los resultados obtenidos, se pueden correr otros anticuerpos que den positivos para lesiones determinadas y así realizar un diagnóstico más específico. La mayoría de las tinciones están dirigidas a las lesiones de células B, que constituyen la mayoría de los linfomas. Los linfomas no Hodgkin lo componen más de 30 diferentes linfomas y su incidencia va en aumento. En Guatemala, se considera que los linfomas no Hodgkin se encuentran entre las diez primeras causas de cáncer. Según datos internacionales, la sobrevida de estas enfermedades es de aproximadamente cinco años. Es muy importante el estudio inmunofenotípico para determinar la naturaleza de estos procesos neoplásicos y distinguir entre enfermedad de Hodgkin, linfomas no Hodgkin e infiltraciones por otros procesos linfoides para poder establecer factores pronósticos y de progresión en estos desórdenes linfoproliferativos. Desde el punto de vista del tratamiento del paciente, es importante hacer notar que otra de las ventajas de los estudios de inmunohistoquímica es la diferenciación entre los procesos reactivos y neoplásicos para no dar tratamientos innecesarios y onerosos a pacientes que no presentan neoplasia pero que morfológicamente es difícil o aún imposible diferenciar entre estas dos entidades. En los hospitales de la Red Nacional del Ministerio de Salud Pública y Asistencia Social solamente se realizaba el estudio morfológico de los tejidos de los pacientes, y no se contaba con una adecuada tipificación de las neoplasias de origen linfoide (Linfomas Hodkgin y No Hodkgin). En este estudio se implementó la inmunotipificación de lesiones y neoplasias de origen linfoide en el laboratorio de inmunohistoquímica. Con esto también se logró que el laboratorio sirviera como centro de referencia para la red nacional pública de hospitales en la tipificación de estas lesiones y neoplasias.Todo esto derivó en beneficio al paciente, ya que al tener un diagnóstico más específico, se logró dar un mejor tratamiento a los pacientes con lesiones del tejido linfoide tanto neoplásicas como reactivas o infecciosas. En el país no existen datos sobre el inmunofenotipo de las neoplasias del tejido linfoide que predominan en la población guatemalteca. Se estima que aproximadamente la mitad de la población del país acude a los servicios de salud públicos, y siendo que el Hospital Roosevelt es uno de los principales hospitales del país, donde además se reciben pacientes referidos de otros centros para su tratamiento, se considera que la realización de este estudio ha proporcionado información sobre el tipo de neoplasias que se dan con mayor frecuencia en la población. Esto servirá de base para profundizar sobre entidades específicas en futuros estudios de investigación.

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I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

I.2.1 Antecedentes en Guatemala

En el año de 2001, se aprobó el proyecto “Técnicas de Inmunohistoquímica en Patología Quirúrgica y su Aplicación en la Investigación” (Proyecto No.62 Correlativo 308, Contrato No.FA-33-2001), el cual contempló la capacitación de un Médico Patólogo de la Sección de Patología del Hospital Roosevelt en el Laboratorio de Inmunohistoquímica Hospital Universitario de la Universidad Autónoma de Nuevo León, Monterrey, México, así como la implementación del laboratorio de inmunohistoquímica con la compra de equipo por parte del FACYT, y los reactivos que serían adquiridos por el Hospital Roosevelt, Departamento de Laboratorios clínicos. La inquietud para implementar las técnicas de inmunohistoquímica nació de la necesidad de contar con las técnicas para identificar antígenos utilizando anticuerpos seleccionados en combinación con un marcador visual directamente en los tejidos (biopsias, especímenes quirúrgicos, citología, etc.). Este método permite tener diagnósticos precisos en tumores, enfermedades infecciosas y tambien como factor pronóstico en varios tipos de cáncer (por ejemplo, el carcinoma de la glándula mamaria). También esta técnica puede ser valiosa en trabajos de investigación en patología quirúrgica. En oncología es una herramienta básica para poder dar tratamiento adecuado a pacientes tanto adultos como de la población infantil, ya que si no se tipifica adecuadamente un tumor por medio de los métodos de inmunohistoquímica se podría dar un tratamiento incompleto o innecesario a los pacientes. El proyecto FACYT No.08-2002, se contempló como un seguimiento al proyecto que lo antecedió, realizándose un Curso Teórico Práctico de Inmunohistoquímica, principalmente para difundir este tipo de técnicas a los médicos patólogos en ejercicio, docentes y técnicos. Actualmente se ha implementado el Laboratorio de Inmunohistoquímica en el Hospital Roosevelt gracias a la ayuda de la línea FACYT, del CONCYT, el Hospital Roosevelt y el Patronato de Servicio Social también del Hospital Roosevelt. El proyecto FODECYT No.30-02contempló implementar los Factores Pronósticos en Carcinoma de Glándula Mamaria, este proyecto ha tenido una muy buena aceptación por parte de los médicos oncólogos del Hospital Nacional de Cancerología (INCAN), Hospital Roosevelt y algunos Hospitales Privados. Este proyecto finalizó en febrero del año 2005. Con respecto a las neoplasias malignas indiferenciadas en Guatemala no existía a nivel de los Hospitales Públicos marcadores de inmunohistoquímica que permitan conocer el tipo de tumor en estos pacientes, por lo tanto fue importante realizar el FODECYT No.01-04 Titulado “Implementación de marcadores inmunohistoquímicos en la tipificación de neoplasias malignas indiferenciadas”.

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También fue necesario contar con mayor número de anticuerpos, así como un baño de flotación, canastas de tinción y un refrigerador que no produzca escarcha. Sin embargo para que el Laboratorio Inmunohistoquímica pueda aportar toda la ayuda diagnóstica que se requiere en casos de pacientes oncológicos es necesario tener mayor cantidad de anticuerpos para tipificar neoplasias indiferenciadas, las cuales de no ser tipificadas pueden conllevar un tratamiento oncológico inadecuado. Una de las neoplasias frecuentes que se necesita sean inmunotipificadas son las de origen linfoide, ya que en Guatemala actualmente a nivel de instituciones públicas no se cuenta con la tecnología para poder tipificarlas y dar un adecuado tratamiento a los pacientes que las padecen.

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I.2.2 Justificación del trabajo de investigación La aplicación de los anticuerpos monoclonales (AcMos) al estudio y clasificación de los linfomas, logró una transformación radical en la concepción y manejo de estas enfermedades que ayudó a reconocer nuevas entidades y favoreció el surgimiento de nuevas clasificaciones. Por otra parte, el estudio inmunofenotípico de los mismos procesos linfoproliferativos permitió un importante avance en la comprensión de la heterogeneidad, comportamiento clínico y biológico de estos tumores. El estudio del inmunofenotipo en los linfomas tiene como objetivos fundamentales:

• Determinar la naturaleza hematológica del proceso neoplásico. • Definir la línea B o T del proceso linfoproliferativo. • Determinar factores pronósticos o de progresión.

Actualmente en Guatemala, la mayor parte de hospitales tanto privados como estatales carecen de la cantidad de anticuerpos necesarios para tipificar adecuadamente las neoplasias del tejido linfoide, por este motivo es sumamente necesario poder tipificar estas lesiones para conocer como se comportan las neoplasias del tejido linfoide en Guatemala y tener un parámetro de referencia así como un adecuado tratamiento a los pacientes que consultan al Hospital Roosevelt y a otros hospitales de la red nacional de Salud Pública.

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I.3 OBJETIVOS E HIPÓTESIS

I.3.1 Objetivos

I.3.1.1General

Determinar el inmunofenotipo en las neoplasias de origen linfoide y linfadenopatías de los pacientes que consulten al Hospital Roosevelt y de los casos diagnosticados previamente en Hospitales Departamentales de la Red Nacional o en otros centros que sean referidos al Hospital Roosevelt para su tratamiento.

I.3.1.2 Específicos

1. Determinar el número de neoplasias de tejido linfoide en el Hospital Roosevelt

2. Diferenciar los procesos del tejido linfoide de origen reactivo (no malignos) de

los neoplásicos mediante la utilización de marcadores inmunohistoquímicos y la morfología histológica.

3. Describir la tipificación del inmunofenotipo (B, T o nulo, Enfermedad de

Hodgkin) de los procesos neoplásicos del tejido linfoide para un adecuado tratamiento de estos pacientes.

4. Implementar las técnicas de inmunohistoquímica para tipificar las neoplasias.

I.3.2 Hipótesis

No aplica

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I.4 METODOLOGÍA

I.4.1 Localización

El estudio se realizó en el Hospital Roosevelt, ubicado en la Calzada Roosevelt, zona 7 de la Ciudad de Guatemala.El Hospital está localizado a una elevación de 1529 metros sobre el nivel del mar (m.s.n.m) en las siguientes coordenadas: 14°36´52.60" latitud norte, 90º32´34.14" longitud oeste.

I.4.2 Las Variables

Este fue un estudio Descriptivo-Retrospectivo y Prospectivo. Fue descriptivo, en la medida que se midieron las variables en el estudio. Fue retrospectivo, porque se trabajaron los casos de procesos linfoproliferativo en los cuales los tejidos aún fueron viables para realizar estudios de inmunohistoquímica. También fue prospectivo porque se estudiaron los casos nuevos que necesitaron ser inmunotipificados.

I.4.2.1 Variables dependientes

• Diagnóstico histológico de neoplasia o lesión del tejido linfoide

I.4.2.2 Variables independientes

• Inmunotipificación

− Inmunofenotipo B − Inmunofenotipo T − Otra inmunotipifación

• Diagnóstico

− Linfoma (Hodgkin/No Hodkgin) − Hiperplasia linfoide

I.4.3 Indicadores

El estudio se realizó con un diseño no experimental, transversal descriptivo. Se efectuó la revisión de preparaciones histológicas para determinar que casos necesitan inmunotipificación con dos observaciones, la primera histológica-morfológica y la segunda con los estudios de inmunohistoquímica.

I.4.4 Estrategia metodológica

Primera etapa: Se cotizaron el equipo, los anticuerpos primarios y los reactivos que se utilizaron. Durante esta etapa se realizó un entrenamiento a un técnico/a en histopatología en técnicas de inmunohistoquímica para los marcadores en neoplasias y lesiones del tejido linfoide principalmente en el manejo de diluciones.

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Segunda etapa:Se estandarizó la técnica y se buscaron y obtuvieron los casos controles para el estudio. La búsqueda se realizó entre los casos nuevos de lesiones neoplásicas y reactivas del tejido linfoide, así como también se buscaron tejidos que se utilizaron como controles. Los casos positivos para los diferentes tipos de anticuerpos, los cuales no deben ser fijados en formalina neutra (con buffer) por más de 72 horas,se corrieron para los marcadores según sea la morfología de las lesiones. Esta búsqueda se realizó no solamente en el Hospital Roosevelt sino en otros laboratorios de Patología, tanto nacionales como privados, que permitieran fijar los tejidos con formol Buffer. También se realizó el control de calidad en el laboratorio de Histopatología para obtener muestras que no presentaran enmascaramiento de antígenos.Este control de calidad consta de las siguientes aspectos:

i. Realizar formalina neutra (con buffer): Esta formalina neutra se implementó por parte del hospital Roosevelt, para no interferir con las técnicas de inmunohistoquímica.

ii. Adecuado control del procesador de tejidos, evitando sobrecalentar los tejido al desparafinar.

iii. Control del proceso de histotecnología con los pasos adecuados, según las recomendaciones del Instituto de Patología de las Fuerzas Armadas, Washington, U.S.A. Todos los reactivos utilizados para este proceso

Tercera etapa:Se dió el servicio a los pacientes con diagnóstico de neoplasias y lesiones del tejido linfoide que consultan al Hospital Roosevelt y a los pacientes que forman parte de los hospitales del sistema de referencia.

I.4.4.1 Población y Muestra

La población en la que se realizó el estudio fueron los pacientes del Hospital Roosevelt durante los años 2008-2009. La población constó de un total de 12,000 casos que se atendieron durante estos años. Del total de casos atendidos se tomó una muestra de pacientes que tuvieron diagnóstico histológico de lesiones del tejido linfoide, los cuales fueron inmunotipificados. No se utilizaron casos de años anteriores por no contarse con viabilidad del tejido.

I.4.5 El Método

• Técnica y método de trabajo Se efectuó la revisión de las preparaciones histológicas de los tejidos que se hayan informado como neoplasias o lesiones del tejido linfoide.Se seleccionaron los bloques de parafina de los tejidos a los cuales se consideró necesario realización de estudios de inmunotipificación. Se realizaron estudios de inmunohistoquímica de acuerdo al

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algoritmo utilizado en base a la morfología de las lesiones.Los datos del estudio se registraron manualmente en la Ficha de Recolección de Datos. • Realización de técnicas de inmunohistoquímica en los tejidos seleccionados.

• Técnica de inmunohistoquímica.

Procedimiento 1. Desparafinar las láminas e hidratarlas con agua destilada 2. Bloquear la actividad de la peroxidasa endógena con solución de peróxido de

hidrógeno-metanol durante 30 minutos. 3. Enjuagar con agua destilada, 2 veces, durante 1 minuto cada uno. 4. Colocar en la solución salina de fosfato estabilizadora, (PBS) durante 2 minutos 5. Opcional: Digerir las secciones con una solución de tripsina, preparada fresca, a

37°C de 3 a 10 minutos. 6. Enjuagar bien con la solución salina de fosfato estabilizadora. 7. Colocar en suero normal de la misma especie animal, en el cual el anticuerpo

puente es producido, durante 30 minutos, escurrir sin enjuagar las láminas. 8. Colocar con el anticuerpo primario durante 30 minutos. 9. Enjuagar bien con la solución salina de fosfato estabilizadora 10. Colocar con el anticuerpo secundario durante 30 minutos. 11. Enjuagar bien con la solución salina de fosfato estabilizadora 12. Colocar en la solución del complejo peroxidasa antiperoxidasa, durante 30 minutos. 13. Enjuagar bien con la solución salina de fosfato estabilizadora 14. Colocar en la solución sustrato de diaminobencidina, durante 10 minutos. 15. Enjuagar bien con la solución salina de fosfato estabilizadora, seguido de un

enjuague con agua destilada. 16. Contrastar con la solución hematoxilina de Mayer, durante 5 minutos. 17. Lavar con agua tibia o templada, durante 10 minutos. 18. Deshidratar y aclarar a través de alcohol etílico al 95%, alcohol etílico absoluto y

xileno, 2 cambios cada uno, durante 2 minutos cada uno. 19. Montar con un medio resinoso.

• PROCEDIMIENTO DE IHQ TÉCNICA DEL COMPLEJO ESTREPTO

AVIDINA-BIOTINA.1 a. Reactivos

1. Formol neutro al 10% 2. 3-Aminopropylthietoxy Silane. IHQ- Sigma A-3648. 100 ml. 3. Xilol 4. Etanol 5. Agua destilada y bidestilada 6. Fosfato de Sodio Dibásico 7. Fosfato de Sodio Monobásico

1 Realizado durante el entrenamiento y en base a las técnicas del Laboratorio de Inmunohistoquímica del Dr.Juan Pablo Flores. Universidad Autonoma de Nuevo Leon, Monterrey, México, Enero 2002.

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8. Laminillas esmeriladas 9. Acido cítrico 10. Citrato sódico 11. Tripsina (Trypsin) Code No.5 2012 12. Peróxido de Hidrógeno (reactivo) 13. Cloruro de Sodio (Reactivo) 14. Fosfato de Potasio Dibásico 15. Fosfato de Potasio Monobásico 16. Tween 20 17. Seroalbúmina bovina o leche 18. Hematoxilina 19. Acetona

b. Anticuerpos Anticuerpos según listado, con diluciones y No. De catálogo

1. Tripsina Code No. S 2012 2. Large Volume DAKO LSAB + Kit, Peroxidase K 0690 (For use with

primary antibodies from Rabbit, Mouse and Goat supplied by the user). 3. Biotinylated Swine Anti Goat, Mouse, Rabbit Inmunoglobulins. Code No. E

0453 4. Medio de montaje acuoso. DAKO –Paramount Aqueous Mounting Medium

Tem. No 002972. PL 6829 1200. 15 ml. 5. DAKO Proteín Block Sekrum-Free, Ready- To – Use. Code X0909 6. Metanol 7. Xileno

Anticuerpos Los anticuerpos primarios utilizados como marcadores en la inmunotipificación de las lesiones y neoplasias del tejido linfoide los cuales fueron revelados por técnicas de inmunohistoquímica son los siguientes:

• CD o CD3 o CD5 o CD10 o CD15 o CD20 o CD23 o CD45 o CD68 o CD79A o CD99 o CD117 o CD138

• Pax5 • Fascina

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• Antígeno de Membrana Epitelial • TdT • BCL-2 • BCL-6 • CD1a

El panel de anticuerpos que se corrieron se escogió con base en la morfología de las células (CuadroI.1) c. Equipo

1. Balanza analítica 2. Baño de María 3. Beakers y Erlenmeyers. Varias medidas 500 a 4,000 ml 4. Agitador orbital(agitador magnético con adaptador) 5. Refrigerador con control de temperatura 6. Medidor de temperatura para refrigerador. 7. Medidor de pH (pH meter) 8. Pipetas: Juego de eppendorf:

a. 1,000 microlitros b. 50-75 microlitros c. 50 microlitros (solo para esta cantidad) d. 10, 20, 25 microlitros e. de 1 a 10 microlitros.

9. Puntillas para pipetas 10. Cámaras de Humedad marca Baxter. 11. Siete recipientes de tinción 12. Bandejas 13. Piceta para agua 14. Probeta de 500 ml, 100 ml, 50 ml. 15. Pipetas desechables 16. Canastillas verticales para 24 láminas, de plástico. 17. Aire acondicionado a 16-20 grados Centígrados.

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• Procedimiento

a. Fijación. 1. Formol Neutro al 10% 2. Bouin 3. Otros fijadores (se especifican con la ténica correcta como citologías, tinciones de H

y E. 4. Incluisión: parafina. b.Preparación de laminillas 1. Corte de especímenes de 4-5 micras. 2. Montar tejido en laminillas silenizadas.(Ver proceso de silenización con 3-

Aminopropyltriethoxy Silane. IHQ Sigma A.3648 100 ml). 3. Colocar las laminillas en el horno a 60°C. Toda la noche o 2 horas previo al

procedimiento. 4. Enfriar las laminillas a temperatura ambiente.

c.Hidratación 1. Xileno-5minutos 2. Xileno-5 minutos 3. Etanol-3 minutos 4. Etanol 96%-2 minutos: (480 ml de alcohol etílico + 20 H20 destilada) 5. Etanol 80%-2 minutos: (400 ml de alcohol etílico + 100 H20 destilada) 6. Etanol 70%- 2 minutos: (350 ml de alcohol etílico + 150 H20 destilada 7. H20-2 minutos 8. H20- 2 minutos d.Recuperación de antígenos en microondas o en baño • En microondas

1. Inmersión de laminillas en solución de Buffer citrato de sodio 0.1 m pH 6 en recipiente.

2. Colocar el recipiente en H20 precalentada durante 3-5 minutos en microondas y dejarlo enfriar luego en un baño de agua a temperatura ambiente (Recipiente dentro de recipiente, evitando que se le introduzca agua al buffer. El agua debe cubrir el 90% del recipiente con el buffer).

3. Recuperar el Buffer Citrato evaporado y dejar enfriar a temperatura ambiente. 4. Volver a colocar el recipiente en H20 precalentado durante 3-5 minutos en

microondas a temperatura ambiente. 5. Recuperar el Buffer citrato evaporado y dejar enfriar a temperatura ambiente. 6. Lavar en H20 destilada.

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• En baño

1. Las laminillas inmersas en solución Buffer citrato de sodio 0.1 m pH6 colocadas en recipiente se colocan en el Baño a 95°C por 40 minutos. Dependiendo del tiempo puede variar la temperatura. A mayor temperatura menor tiempo y a menor tiempo mayor temperatura.

2. El baño debe estar lleno con agua destilada para evitar sales, cubriendo hasta la altura del 90% del nivel de las laminillas (no del recipiente).

3. Enfriar a temperatura ambiente(Recipiente en recipiente). 4. Lavar en H20 destilada para lavar el Buffer 10 veces en cada recipiente.

e.Bloqueo de fondo

1. Inmersión de laminillas en H202 – Metanol al 3% durante 15 minutos. Esta solución sólo puede usarse durante un día.

2. Lavar en H20 en dos diferentes recipientes. 3. Colocar proteína bloqueadora (1 gota de leche en cada laminilla o en un

recipiente dependiendo del volumen de láminas) durante 5 minutos. Lavar en H20 destilada.

f. Digestión enzimática. Ver protocolo específico para cada anticuerpo. Luego de realizar la digestión enzimática se procede a lavar las láminas en PBS y se quedan alli por dos pasos de 10 minutos.

g. Proceso de inmunotinción.

1. Inmersión de laminillas en PBS pH 7 por 10 minutos ( 5 minutos en cada recipiente).

2. Colocar el Anticuerpo primario por 2 horas a temperatura ambiente (ver dilución específica para cada anticuerpo). El anticuerpo primario se coloca sobre la preparación utilizando una pipeta de 50 microlitros y se le coloca cubreobjetos pequeño para que absorba mejor el anticuerpo. Estas se colocan en la cámara de humedad, cuidando que se mantenga con adecuada cantidad de agua y tenga un nivel adecuado (puede verse con un “nivel”).

3. Lavar en 2 cambios de PBS pH7. por 5 minutos cada uno. 4. Incubar el Anticuerpo Secundario (Antisuero Biotinilado) por 30 minutos a

temperatura ambiente. Se coloca una o dos gotas dependiendo del tamaño del tejido. (Large Volume DAKO LKSAB + Kit Peroxidase Link, Anti-Mouse, Anti-Rabbit and Anti-Goat Inmunoglobuline). Colocar las preparaciones en un agitador orbital para una adecuada mezcla.

5. Lavar en 2 cambios de PBS pH 7 – 5 minutos cada uno.

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6. Incubar con el complejo streptovidina/peroxidasa durante 30 minutos a temperatura ambiente. Siempre en la cámara de húmedad y en el agitador orbital.

h. Reacción del cromógeno Se puede utilizar DAB O AEC. En el AEC no se utiliza alcohol ni xilol, en el DAB se puede utilizar el alcohol y el Xilol. AEC+Substrate-Chromogen. Code No. K.3469. DAKO

1. Aplicar solución cromógena 3-10 minutos o hasta que aparezca tinción a temperatura ambiente.

2. Lavar en H20 destilada. i. Contratinción con hematoxilina de Harris

1. Inmersión en Hematoxilina de Harris por 30”, 1-3 minutos, dependiendo de la concentración de la misma.

2. Lavar en chorro de agua de la llave. j. Montaje acuoso Montar directamente de agua. Se utiliza el DAKO-Paramount Aqueous Mounting medium. Item. No. 002972 PL 6829 1200 15 ml Lote. 08166. k. Montaje permanente

Etanol – 10 pasadas Etanol – 10 pasadas Etanol – 10 pasadas Xileno – 10 pasadas Xileno – 10 pasadas Montar en resina Entellan.

• Preparación de soluciones IHQ

1. Formol Neutro al 10% para 1 litro.

a. Fosfato de Sodio Dibásico – 6.5 gramos b. Fosfato de Sodio Monobásico – 4 gramos c. Aforar a 1 litro en H20 destilada disolver calentando (no ebullición)

agitando continuamente y suavemente dejar enfriar a temperatura ambiente.

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2. Preparación de laminillas con aminopropylethoxysilane (silano). a. Para 500 laminillas b. Preparar solución con silano

i. 10 ml. de silano más 490 de acetona. ii. Inmerse las laminillas por 2 minutos en solución silano

iii. Lavar en 2 cambios de H20 destilada. iv. Secar por 12 horas a temperatura ambiente. v. Mantener las laminillas en lugar seco y obscuro.

3. Buffer Citrato de Sodio 0.1 m pH6 m Valores aceptados: pH 5.5 – 6.5

a. Solución A: Acido Cítrico 0.1 m i. Acido Cítrico – 21 gramos

ii. Agua destilada – hasta 1 litro b. Solución B: Citrato sódico 0.1 m

i. Citrato Sódico – 29.4 grs. ii. Agua destilada – hasta 1000 ml

c. Solución de Trabajo: i. Solución A: - 18 ml.

ii. Solución B: -82 ml. iii. H20 Destilada – Hasta 1 litro.

4. TRIPSINA al 0.01%

Tripsina - 0.01 mgr PBS pH 7 – 100 ml

-Mantener en congelación -Descongelar a temperatura ambiente inmediatamente antes de usarse.

5. H202 - Metanol al 6%

a. Peróxido de Hidrógeno – 6 ml. b. Metanol -94 ml.

i. Preparar inmediatamente antes de su uso ii. No volver a re-usar

6. PBS pH7.0

a. Para 2 litros b. Cloruro de Sodiio – 6.5 gr c. Fosfato de Potasio Dibásico – 2.8 gr d. Fosfato de Potasio Monobásico – 0.4 gr. e. Medir antes pH (6.5-8) f. Aforar a 2 libros con Agua Bidestilada g. Antes de agregar el Tweeen calibrar el pH, una vez agregado el Tween

20 ya no es posible calibrarlo. h. Agregar 2 ml de Tween 20. i. Mantener en refrigeración 2-5° centígrados.

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I.4.6 La Técnica Estadística

• Se elaboró una base de datos en el programa de computación “Excel”. • Se realizó el análisis descriptivo de los datos • Los datos se tabularon y graficaron • Explicación de resultados • Las técnicas descriptivas que se utilizaron se escogieron en función del tipo de dato

a medir.

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PARTE II MARCO TEÓRICO II.1 PANELES DE INMUNOHISTOQUÍMICA Los paneles de inmunohistoquímica se seleccionan con base en el examen morfológico. Por lo tanto, mientras se identifiquen características más específicas en las secciones teñidas con hematoxilina y eosina (H y E), los paneles de inmunohistoquímica seleccionados serán los que mejor se adapten y orienten según la morfología encontrada. • Tinciones generales Al realizar el diagnóstico, excluir la presencia de un linfoma podría ser más importante que determinar la etiología de una hiperplasia linfoide reactiva. En los ganglios linfáticos es útil tener en cuenta que la mayoría de los casos de hiperplasia reactiva muestran una combinación de hiperplasia folicular, paracortical, y/o del seno, aunque puede predominar uno de éstos. Cuando se observa la hiperplasia de un componente individual con exclusión de los demás, es sugerente de un proceso neoplásico. (Lu & Chang, 2011) La mayoría de las tinciones están dirigidas a las lesiones de células B, que constituyen la mayoría de los linfomas. Estas incluyen a el CD20, CD3, bcl-2 y CD43. Para el linfoma de Hodgkin (LH) también se puede agregar el CD30. Por lo tanto, es importante entender el patrón de tinción normal de estos marcadores en los tejidos linfoides benignos/reactivos. El CD20 debería destacar la localización de las células B, principalmente dentro de los folículos. Los folículos primarios expresan las bcl-2, pero carecen de CD10 y bcl-6. Los folículos secundarios contienen un centro germinal y una zona de manto. Las células del centro germinal expresan a los CD10 y a los bcl-6 pero no a los bcl-2. La zona del manto está compuesta de células similares a las del folículo primario. Las células B dispersas, incluyendo a los inmunoblastos grandes, pueden estar presentes en la región paracortical. Los inmunoblastos muestran positividad CD30 débil y variable, que característicamente varía en intensidad de célula a célula. Tanto las células B paracorticales como los inmunoblastos pueden aumentar en condiciones reactivas, pero siempre hay un mayor número de células T paracorticales. Los agregados de células difusas CD20+ fuera de los folículos es sugerente de linfoma de células B. La inmunotinción CD3 destaca la localización de las células T predominantemente en la región paracortical, sólo con células T dispersas dentro de los centros germinales. Los CD43 se deben correr siempre en paralelo con los CD3 y CD20 para evaluar la distribución de la tinción. En la mayoría de las condiciones reactivas, la tinción CD43debe ser similar a la de CD3, sin co-localización de las células CD20+. El patrón de tinción de bcl-2 también se asemeja al de CD3 con tinción adicional en los folículos primarios y las zonas del manto. El CD5 es otro marcador útil para los tumores malignos de células B y células T. Sin embargo, la mayoría de los linfomas B que expresan CD5, como la leucemia linfocítica crónica / linfoma linfocítico pequeño (LLC/LLP) y el linfoma de células del manto (LCM), también son CD43+. Por lo tanto, el CD5 no está incluido en el panel general, pero sigue siendo útil en determinadas condiciones. (Lu & Chang, 2011).

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• Patrón folicular Este patrón se refiere a una proliferación de muchos nódulos de linfocitos que se asemejan a los folículos. El principal diferencial está entre la hiperplasia folicular reactiva y el linfoma folicular (LF). Un hallazgo individual no es suficiente para distinguir entre la hiperplasia y el linfoma, sino que se necesitan múltiples características morfológicas bien descritas para realizar esta distinción. En casos ambiguos puede ser útil correr un panel de tinciones de inmunohistoquímica. La mayoría de los casos pueden ser aclarados usando el panel básico de CD20, CD3, bcl-2, CD43, y/o CD5, agregando CD10 y/o bcl 6 (Cuadro II.1). (Lu & Chang, 2011) CuadroII.1. Tinciones útiles para el patrón folicular Tinción Patrón Normal Uso

CD20 Células B, principalmente en los folículos, dispersas paracorticales

Resalta la arquitectura ganglionar. Confirma el linaje B. Evalúa para áreas difusas con células B

CD3 Células T, principalmente paracorticales, dispersas en los centros germinales

Resalta la arquitectura ganglionar. Uso en conjunto con bcl-2, CD5 y CD43 para evaluar expresión aberrante de células B

bcl-2 Células T, células B del folículo primario, células B de la zona del manto

Bcl-2 positivo en el centro germinal indica malignidad si los folículos primarios están excluídos

CD43 Células T, granulocitos, algunos histiocitos

Evalúa para la expresión aberrante de células B. Neoplasma CD43+ posiblemente colonización folicular por LZM, LLC/LLP o LCM

CD5 Células T Evalúa para la expresión aberrante de células B. Neoplasma CD5+ posiblemente colonización folicular por LLC/LLP o LCM

CD10 Centros germinales Confirma el origen de célula folicular central. Excluye los folículos primarios

bcl-6 Centros germinales Confirma el origen de célula folicular central. Excluye los folículos primarios

Ki-67 Alto en centros germinales. Bajo en la región paracortical

Bajo Ki-67 en los centros germinales sugiere LF

Kappa/ lambda

Proporción Kappa:Lambda es 2-3:1 La restricción indica malignidad

Fuente: Lu & Chang, 2011 Las inmunotinciones Kappa y lambda son útiles para una minoría de casos, la citometría de flujo tiene mayor sensibilidad para la evaluación de cadena ligera. Las células B reactivas del centro germinal se tiñen para CD10 y bcl 6, pero no para bcl-2. Los centros germinales que son positivos para bcl-2 casi siempre son linfoma. Sin embargo, existen tres precauciones a tomar en cuenta. Primero, sólo se deben evaluar los centros germinales, ya que los folículos primarios normales y las zonas del manto son bcl-2+. La co-localización de CD10+, bcl-6+ y bcl-2+ es útil ya que CD10 y bcl-6 no se expresan en los folículos primarios o las células B de la zona del manto. Segundo, las células dispersas con bcl-2 positivo dentro de los centros germinales probablemente son células T auxiliares foliculares normales y no se deben interpretar como

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neoplásicas. Esto aplica excepto cuando las células B neoplásicas dispersas bcl-2+ dentro del centro germinal se tiñen más fuerte que las células T adyacentes bcl-2+ o las células del manto. Este hallazgo sugiere LF-in-situ. (Lu & Chang, 2011). Por último, la falta de tinción de bcl-2 no excluye el diagnóstico de LF, especialmente en la población pediátrica, en el que hasta dos tercios de los casos son negativos para bcl-2. (Lorsbach et al., 2002) El bcl-2 no es específico para LF y no lo distingue de otros linfomas de células B pequeñas que puedan colonizar los folículos, tales como LCM o el menos común, linfoma de la zona marginal (LZM). El CD43+ con falta de expresión de CD10 no es característico de LF, y plantea la posibilidad de LCM o LZM. La co-expresión de CD5 en las células B sugiere LCM o LLC/LLP. El Ki-67 puede ser útil, ya que muestra un mayor índice de proliferación en los centros germinales reactivos y a menudo, el número de núcleos positivos en LF es más bajo. El CD20 es útil al establecer el linaje B y evaluar la arquitectura difusa contra la folicular. También se puede ver un patrón nodular insinuado, compuesto de nódulos más grandes y más espaciados de lo normalmente visto en LF, compuesto de una mezcla de células B y células T. Debería considerarse la posibilidad de Linfoma de Hodgkin (LH) tipo nodular con predominio linfocítico (LHNPL) y se debería realizar un cuidadoso examen histológico para predominio linfocítico (anteriormente las células L & H) y tinciones adicionales. (Lu & Chang, 2011) • Patrón de hiperplasia paracorticales

La región paracortical es el espacio entre los folículos y se compone generalmente de una mezcla de células T con células B, en un menor grado, incluyendo inmunoblastos grandes, células dendríticas, macrófagos, células plasmáticas y/o eosinófilos y células dendríticas plasmocitoides. La hiperplasia reactiva predominante de la región paracortical también es relativamente común, pero es más difícil de distinguir de la multitud de linfomas, tanto de células B como T, que la asemejan. Es importante destacar que la hiperplasia reactiva paracortical casi siempre está acompañada de hiperplasia folicular y/o sinusal. En algunos casos, tales como con la mononucleosis infecciosa aguda, la hiperplasia paracortical puede eclipsar la hiperplasia folicular, aunque los folículos reactivos todavía deberían ser evidentes. Los linfomas también pueden incluir preferentemente la región paracortical con algunos folículos reactivos residuales todavía presentes. Los tumores que semejan a la hiperplasia reactiva paracortical son generalmente aquellos con un infiltrado mixto. Las principales entidades neoplásicas a considerar incluyen los linfomas de células T/células B grandes ricas en histiocitos (LTCBGRH), linfoma de Hodgkin clásico (LHc), y LHNPL, y los linfomas de células T, incluyendo linfomas periféricos de células T, tipo no específico (LPCT, TNE) y el linfoma angioinmunoblástico de células T. (Lu & Chang, 2011) Para todas las entidades, el panel inicial de inmunotinciones es similar y debe incluir CD20, CD3, bcl-2, CD43, CD30, y Ki-67 (Cuadro II.2). En un niño, también se deben agregar las tinciones del virus de Epstein-Barr (VEB) para excluir mononucleosis infecciosa aguda. Algunos linfomas de células B pequeñas pueden afectar preferentemente a la región paracortical y no afectar los folículos; éstos se reconocen fácilmente como agregados de células B CD20+. Debido a que la región paracortical comprende predominantemente las células T mezcladas con otros tipos de células, puede ser más difícil de diagnosticar la afección de los linfomas de células T. La expansión de las áreas CD3+ desplazando las células B CD20+ a la periferia del ganglio linfático indica el desgaste de la arquitectura y es altamente sugestivo de linfoma. La pérdida de

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la expresión de bcl-2 es también sugestivo de linfoma de células T. La evaluación de la expresión de bcl-2 en las células B no es tan útil en este escenario, ya que son difíciles de separar de las células T paracorticales. Se espera que la expresión de CD43 se siga a la del CD3 y ésta generalmente no se pierde en los linfomas de células T. El Ki-67 es normalmente bajo en la región paracortical, mientras que el linfoma periférico de células T tiene una tasa de proliferación elevada, generalmente. La tinción de CD20 puede enfatizar una arquitectura vagamente nodular, que no es evidente en la tinción H y E, sugiriendo la posibilidad de LHNPL. Las células, dispersas, grandes, poco frecuentes y atípicas con expresión uniformemente fuerte de CD20 están relacionadas con LTCBGRH. (Lu & Chang, 2011). Cuadro II.2. Tinciones útiles para el patrón de hiperplasia paracortical Tinción Patrón Normal Uso

CD20 Células B, principalmente en los folículos, dispersas en la región interfolicular

Resalta la arquitectura ganglionar y la hiperplasia folicular concurrente. Los agregados difusos indican linfoma de células B. Las células B desplazadas hacia la cápsula es sugerente de linforma de células T. La arquitectura nodular vaga puede ser LHNPL.

CD3 Células T, principalmente interfoliculares, dispersas en los centros germinales

Resalta la arquitectura ganglionar. Uso en conjunto con bcl-2 y CD43 para evaluar expresión aberrante de células B

bcl-2 Células T, células B del folículo primario, células B de la zona del manto

Bcl-2 perdido en las células T es sugerente de linfoma. Expresión aberrante de células B extremadamente difícil de evaluar.


Usualmente no se pierde en el linfoma de células T. Expresión aberrante de células B extremadamente difícil de evaluar.

CD30 Inmunoblastos Tinción con intensidad variable sugiere inmunoblastos reactivos. Tinción membranosa y/o paranuclar/Golgi uniformemente fuerte en LHc.

Ki-67 Alto en centros germinales. Bajo en la región paracortical

Alto Ki-67 en la región paracortical es sugerente de linfoma

Fuente: Lu & Chang, 2011. Patrón de tinción de CD30: En las lesiones que asemejan a la hiperplasia reactiva paracortical, el CD30 se utiliza para la detección de LHc. En éste, las células de Hodgkin muestran un patrón de tinción de membrana y/o paranuclear/Golgi que es de intensidad bastante uniforme de célula a célula. La tinción citoplasmática difusa por sí sola no se debe considerar positiva. La dificultad está en que los inmunoblastos reactivos paracorticales, vistos en la hiperplasia reactiva paracortical e incluso algunos linfomas de células T, también pueden ser CD30+. En contraste a las células de Hodgkin, la tinción de CD30 en los inmunoblastos es generalmente más débil y muestra variabilidad en la intensidad de célula a célula. Los casos con hiperplasia folicular concurrente, sin mérito para Hodgkin o células de Reed Sternberg, y la tinción variable de CD30 no requieren más estudio diagnóstico intensivo para LHc. Otros pueden requerir tinciones adicionales. (Lu & Chang, 2011)

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• Patrón de Linfoma Similar a Hodgkin Clásico El linfoma de Hodgkin clásico característicamente muestra el desgaste de los ganglios linfáticos por células de Hodgkin escasas en un entorno celular compuesto de células T pequeñas, histiocitos, eosinófilos, células plasmáticas y neutrófilos. El subtipo de esclerosis nodular más común también muestra bandas fibrosas anchas que irradian de una cápsula engrosada y atrapan los nódulos del infiltrado. Ocasionalmente, el LHc puede incluir solamente a las regiones paracorticales, el llamado patrón interfolicular, y se observa con mayor frecuencia con el subtipo mixto de celularidad. Por el contrario, en algunas condiciones reactivas, especialmente mononucleosis infecciosa aguda, el número de inmunoblastos puede sufrir un incremento grande, agruparse, e incluso mostrar formas bilobadas y multinucleadas semejantes a las células de Hodgkin. Cuando se sospecha de LHc, el panel inicial de las tinciones de inmunohistoquímica debe incluir CD20, CD3, CD15, CD30 y CD45 (Cuadro II.3). (Lu & Chang, 2011). Si está disponible, es útil incluir también el PAX-5 en el panel. Además de CD30+ consistente y uniforme, las células de Hodgkin generalmente también son CD15+ (85%), PAX-5+(90%), con un subconjunto positivo para CD20 (20% a 50%), y son consistentemente negativas para CD45.(Agnarsson & Kadin,1989; Chittal, et.al., 1988; Foss, et.al., 1999; Pinkus, Thomas & Said, 1985; Schmid, Pan, Diss & Isaacson, 1991). Cuadro II.3. Tinciones útiles para el patrón de linfoma similar a Hodgkin clásico Tinción Patrón Normal Uso


Resalta la arquitectura ganglionar y la hiperplasia folicular concurrente en las proliferaciones reactivas y el desgaste en los linfomas. Positivo en las células con predominio linfocítico de LHNPL y células grandes de LTCBGRH. Positividad variable en las células de Hodgkin. Células B del fondo aumentadas puede ser LHNPL vs el LHc rico en linfocitos.


Resalta la arquitectura ganglionar. Positivo en las células B grandes de LACG a menos que haya una pérdida aberrante

CD15 Granulocitos Positivo en las células de Hodgkin en LHc. Negativo en las células grandes de todas las entidades que semejan a otra.

CD30 Inmunoblastos Tinción con intensidad variable sugerente de inmunoglastos reactivos. Tinción membranosa y/o paranuclear/Golgi uniformemente fuerte en LHc y LACG. Negativo en las células con predominio linfocítico

CD45 Casi todas las células hematolinfoides

Negativo en las células de Hodgkin de LHc. Tinción más fuerte en las células con predominio linfocítico

PAX-5 Células B Débilmente positivo en las células de Hodgkin de LHc. Tinción más fuerte en las células con predominio linfocítico de LHNPL y células grandes de LTCBGRH. Negativo en LACG.

Fuente: Lu & Chang, 2011.

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En contraste, los inmunoblastos reactivos son consistentemente negativos para CD15 y la positividad para CD20, CD45, y PAX-5 es variable. Es importante tener en cuenta que el CD15 es positivo en los granulocitos, que son pequeños y multilobados. Estos no deben confundirse con las células de Hodgkin o de Reed Sternberg. El CD15 es positivo de forma variable entre diferentes células de Hodgkin del mismo caso. El PAX-5 es una tinción nuclear y su evaluación se debe realizar bajo alta potencia, ya que muestra una positividad débil característica de los LHc. La evaluación de CD45 es generalmente difícil debido a la abundancia de células T mezcladas, que a menudo rodean a las células de Hodgkin. Para ser considerada con una tinción positiva, las células grandes deben mostrar tinción membranosa circunferencial que es igual o más fuerte que los linfocitos que las rodean. Los casos en los que el CD30 es positivo y el CD15 es negativo son los más difíciles de diagnosticar y pueden requerir de un estudio intensivo para el diagnóstico para exluir una hiperplasia reactiva paracortical, linfoma anaplásico de células grandes (LACG), otros linfomas de células T, y ciertos tipos de linfomas difusos de células B grandes (LDCBG). (Lu & Chang, 2011). • Infiltrados difusos de células pequeñas Los linfomas de células B pueden estar separados por el tamaño predominante de las células neoplásicas. Usando un histiocito o el núcleo de una célula endotelial como referencia, las células pequeñas son más pequeños que un núcleo de la célula endotelial, las células intermedias son aproximadamente del mismo tamaño, y las células grandes son más grandes. La mayoría de estas entidades se diagnostican fácilmente como malignas basándose sólo en la morfología. La proliferación monomórfica es generalmente evidente en baja potencia, con desgaste focal de la arquitectura de los ganglios linfáticos, como mínimo. Se debe tener en cuenta que la mayoría de estos tumores malignos están compuestos en realidad de una gama de células de diferentes tamaños, lo cual es más evidente en alta potencia. Sin embargo, los aglomerados de células grandes que no muestran ningún patrón generalmente indican la transformación de células grandes. Un método de diagnóstico para clasificar los linfomas de células B de bajo grado o de células pequeñas se basa en la inmunohistoquímica. (Lu & Chang, 2011) Linfomas compuestos principalmente de células pequeñas: El panel básico debe incluir CD20, CD3, CD5, CD10, CD43 y bcl-2. El ciclina-D1 (bcl-1) y CD23 también se pueden agregar al panel inicial, junto con kappa y lambda, especialmente si están presentes características plasmocitoides (Cuadro II.4). El patrón de tinción de CD20 es importante para confirmar la primera impresión morfológica de una malignidad de células B, mostrando una población de células B expandidas. La tinción del CD20 también se puede utilizar para resaltar los hallazgos arquitectónicos que pueden no ser evidentes en las secciones teñidas con H y E, tales como los nódulos en LF. El CD10+, junto con la falta de expresión de CD5 y CD43, es típico de LF. El LLC / LLP generalmente presenta CD5+, CD23+, y CD43+. LCM también es positiva para CD5 y CD43, expresión de ciclina-D1. El bcl-2+ se observa en la mayoría de los linfomas de células B pequeñas y es útil para distinguir el LZM de las proliferaciones de células B reactivas monocitoides en los ganglios linfáticos. Aunque, los linfomas de células T, mucho menos comunes, tales como el LPCT tipo no específico, también pueden incluir un infiltrado difuso de células pequeñas. Los linfomas de células T generalmente expresan CD3 y CD43, con pérdida variable de bcl-2 y CD5. (Lu & Chang, 2011).

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Cuadro II.4. Tinciones útiles para el patrón difuso de células pequeñas Tinción Patrón Normal Uso


Resalta el desgaste de la arquitectura ganglionar por los aglomerados difusos de las células B. Las células B desplazadas hacia la cápsula es sugerente de linfoma de células T. Arquitectura ganglionar vaga puede ser LHNPL.


Células T dispersas pueden todavía estar presentes en los linfomas de células B. Uso en conjunto con bcl-2, CD5 y CD43 para evaluar la expresión aberrante de células B.

bcl-2 Células T, células B de los folículos primarios, células de la zona del manto,

La expresión aberrante de células B es sugerente de linforma de células B. La pérdida de bcl-2 en las células T es sugerente de lnforma de células T.


Usualmente no están perdidos en el linforma de células T. La expresión aberrante de células B es sugerente de LLC/LLP, LCM o LZM. CD43 negativo es sugerente de LF o LZM.

CD5 Células T Evalúa la expresión aberrante en las células B. Positivo en LLC/LLP y LCM. La pérdida aberrante es sugerente de linforma de células T.

CD10 Centros germinales Positivo en LF Ciclina D1 (bcl-1)

Células endoteliales Positivo en LCM (difusivamente). Puede ser positivo en las neoplasias de células plasmáticas, LCP (en algunos subgrupos) y LLC/LLP (débil)

CD23 Red dendrítica folicular Positivo en LLC/LLP K/L Proporción K/L es 2-3:1 La restricción indica malignidad Fuente: Lu & Chang, 2011 • Infiltrados Difusos de Células Grandes Para un infiltrado compuesto por agregados de células grandes hematolinfoides que no tienen ningún patrón en particular, el LDCBG es la entidad más común y por lo general el diagnóstico es sencillo. Sin embargo, existe un amplio diagnóstico diferencial que se debe considerar, incluyendo el carcinoma, melanoma, hiperplasia reactiva paracortical, LH, y otras neoplasias hematolinfoides que no sean del tipo Hodgkin. Estas neoplasias incluyen el linfoma linfoblástico (LLB), el linfoma de Burkitt, LCM blástico, LF, leucemia mieloide aguda, los linfomas de células T, y neoplasia precursora de células dendríticas plasmocitoide. Un panel inicial de inmunohistoquímica de parafina ayuda a distinguir entre las diferentes posibilidades. La distinción entre el carcinoma y el melanoma se hace fácilmente utilizando pancitoqueratina y S100. Suponiendo que ya se haya establecido un trastorno hematolinfoide, también se puede correr un panel auxiliar que incluya CD20, CD3, CD30, ciclina D1, transferasa desoxinucleotidil terminal (TdT), CD43, y Ki-67 (Cuadro II.5). Si las características morfológicas son muy sugestivas de LDCBG, se pueden realizar las pruebas para bcl-2, bcl-6, CD10, y MUM1. El caso evidente de LDCBG será positivo para CD20, con un Ki-67 que se encuentra elevado pero es menor al 80%, y será negativo para CD3, CD30, ciclina D1, TdT, y CD43. La positividad para

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cualquiera de los marcadores anteriores no excluye LDCBG sino que actúa como un tamizaje para otras entidades en el diagnóstico diferencial y debería realizarse un estudio diagnóstico intensivo adicional (Cuadro II.6). (Lu & Chang, 2011). Cuadro II.5. Tinciones útiles para el patrón difuso de células grandes Tinción Patrón Normal Uso

CD20 Células B, principalmente en los folículos, dispersión interfolicular

Resalta el desgaste de la arquitectura ganglionar por aglomerados sin patrón de células B en LDCBG, LB, y LCM blástico. Positividad variable en Linfoma linfoblástico de células B.


Positivo en LACG y linfoma linfoblástico de células T.

CD30 Inmunoblastos Positividad fuerte y uniforme en LHc y LACG. Puede ser variablemente positivo en LDCBG

Ciclina D1 (bcl-1)

Células endoteliales Positivo en el LCM blástico

TdT Linfocitos tímicos Positivo en el linfoma linfoblástico. Puede ser positivo en la leucemia mieloide aguda y la neoplasia plasmacitoide blástica de células dendríticas


Positivo en el LB, leucemia mieloide aguda, linfoma linfoblástico y los linfomas de células T, incluyendo LACG. A menudo negativo en LDCBG

Ki-67 Alto en los centros germinales. Bajo en la región paracortical

Células 100% positivas sugerente de LB perono específico.

CD138 Células plasmáticas Positivo en neoplasia de células plasmáticas y neoplasias de células B con diferenciación plasmacitoide tales como el linfoma plasmablástico. Positivo en algunos carcinomas, sarcomas y melanomas.

K/L Proporción K:L es 2-3:1 Establece la diferenciación hematolinfoide si CD138 es el único marcador positivo.

ALK1 Negativo Positivo en LACG y ALK+ LDCBG Fuente: Lu & Chang, 2011.

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CuadroII.6. Lista de tinciones positivas que sirven para el tamizaje inicial y las posibles entidades sugestivas

Tinción Entidades sugestivas CD3 Linfomas de células T, incluyendo LACG y T-LLB CD30 LACG, LHc, hiperplasia reactiva paracortical ciclina D1 LCM blástico TdT LLB, leucemia mieloide aguda, neoplasia precursora de células

dendríticas plasmacitoides CD43 Linforma de Burkitt, linformas de células T, leucemia mieloide

aguda y LLB Ki 67-cercano al 100% Linforma de Burkitt

Fuente: Lu & Chang, 2011. Algunas consideraciones especiales que se deben tener en cuenta son (Lu & Chang, 2011): 1. En un niño con una linfoadenopatía nodular o cervical, se debe ser extremadamente

cuidadoso al diagnosticar LDCBG y siempre se deben realizar estudios de VEB para excluir mononucleosis infecciosa aguda.

2. Recordar que los linfomas de células B de bajo grado pueden haber dispersado células grandes y grupos de células grandes en los centros de proliferación. Solamente use este panel si hay presencia de células grandes en láminas sin patrón, para evitar un diagnosticar equivocadamente un caso como LDCBG, cuando es un linfoma de células B de bajo grado.

3. Los casos poco comunes pueden mostrar morfología inmunoblástica pero carecen de todos los marcadores mencionados arriba, tales como en los linfomas plasmablásticos o plasmacitoma plasmablástico.

Los linfomas primarios de efusión típicamente también carecen de marcadores de células-pan- B, pero el contexto clínico debería ayudar con este diagnóstico. Un tipo muy raro de linfoma de células grandes llamado linfoma de células B grandes, kinasa de linfoma anaplástico+ (ALK) es negativo para marcadores de células pan B y CD30. El CD138, kappa, lambda, y las inmunotinciones de ALK1 junto con la hibridación in situ del ARN codificado del Virus Epstein-Barr (EBER) pueden ser útiles en estos casos de fenotipo nulo. (Lu & Chang, 2011).

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II.2 NEOPLASIAS HEMATOLINFOIDES COMUNES

II.2.1 Linfomas de células B pequeñas

Linfoma Folicular (LF) Es un linfoma compuesto de centrocitos y centroblastos con al menos un patrón folicular focal. Los folículos son generalmente de igual tamaño y tienen escaso tejido linfoide difuso que los separa, pueden o no tener una zona del manto y carecen de polarización. Los centrocitos son generalmente células pequeñas con núcleos irregulares /hendidos cromatina condensada y nucleólos no sobresalientes.Los centroblastos son células grandes con núcleos redondos/no hendidos núcleos, cromatina vesicular, y uno o más nucléolos periféricos. El LF es positivo para todos los marcadores de células pan B, incluyendo CD20, CD79a, PAX-5, y los factores de transcripción de células B BOB.1 y OCT-2. Los marcadores del centro germinal CD10 y bcl-6 son positivos en la mayoría de los casos de LF, y la co-expresión aberrante de CD5, CD23 o CD43 es rara. El bcl-2 es positivo en la mayoría de los casos, con excepción del grado 3, que puede ser negativo para bcl-2 hasta en 25% de los casos. (Lai, Arber, Chang, Wilson& Weiss, 1998). Aunque la clasificación se basa en la morfología, la evaluación de la arquitectura difusa se realiza mejor en las secciones teñidas de inmunohistoquímica, tales como CD20. Se debe notar que el CD10 puede ser negativo en la porción interfolicular FL. (Dogan et al., 1998) Como se mencionó anteriormente, se puede encontrar LF-in-situ, que se caracteriza por células B neoplásicas bcl-2+ en el interior del centro germinal que muestran tinción más fuerte que las células T bcl-2+ o las células del manto adyacentes (CuadroII.7). (Cong et al., 2002)

Leucemia linfocítica crónica / Linfoma linfocítico pequeño

Los LLC/LLP incluyen ganglios linfáticos que muestran un aspecto nodular insinuado debido a la presencia de centros de proliferación que contienen prolinfocitos y parainmunoblastos o inmunoblastos. En sitios extraganglionares o biopsias pequeñas, la arquitectura nodular sutil puede no ser apreciada. Los LLC / LLP también expresan sus marcadores de células pan-B, aunque la reactividad para CD20 es generalmente débil. La mayoría de los casos son CD5+, CD23+, CD43+ y bcl-2+, y son negativas para CD10 y bcl-1 (ciclina D1). La positividad para CD23 y negatividad para bcl-1 es útil para distinguir los LLC / LLP de LCM. Los casos poco comunes de LLC / LLP pueden ser CD23- y bcl-1+. En los casos difíciles, la distinción se basa en la identificación morfológica de los centros de proliferación, que excluye LCM. La identificación de la translocación t (11; 14) se reportaba anteriormente en LLC/LLP, pero ahora se piensa que excluye este diagnóstico. (Weiss, 2008). CD5+ y CD23+ ayudan a hacer la distinción de LZM. Sin embargo, los casos poco comunes de LZM pueden ser positivos para CD5 e incluso CD23, por lo tanto, el examen morfológico es todavía el más importante, con casos excepcionales que requieran la citometría de flujo o citogenética. El ZAP-70 es positivo en aproximadamente la mitad de los casos y se correlaciona con peores prognosis, aunque la evaluación es difícil en las secciones de parafina. (Wiestner et al.,

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2003) Los estudios de inmunoglobulinas en las secciones de parafina son generalmente negativos a menos que las células presenten algunas características plasmacitoides. Por lo general, el Ki-67 muestra baja proliferación en las áreas difusas y alta en los centros de proliferación. El MUM1 también es positivo en los centros de proliferación y puede ser útil. (Lu & Chang, 2011).

Cuadro II.7. Diferenciación de linfomas de células B pequeñas.

Positivo Positivo/Negativo Negativo Linfoma folicular* CD10 bcl-1, CD5, Cd23, CD43 LLC/LLP* CD5, CD23, CD43 bcl-1§, CD10§ Linfoma células del manto*

bcl-1, CD5, CD43 CD10§, CD23§

Linfoma de la zona marginal*

CD43, CD138, restricción K/L

bcl-1, CD5§, Cd10§, CD23§, DBA.44§, TRAP§

Linfoma linfoplasmacítico*

CD138, restrición K/L

CD43 bcl-1, CD5§, CD10§, CD23§

Neoplasia de células plasmacíticas

CD138, restricción K/L

bcl-1, CD43, CD79a, MUM-1, CD56

CD10§, CD20§, CD45§, PAX-5§

Leucemia de células pilosas

CD20, anexina A1, DBA.44, TRAP

bcl-1 CD5, CD10, CD23, CD43

* Positivo para marcadores de células pan B CD20, CD79a, PAX-5, BOB.1 y OCT-2. § Casos raros pueden ser positivos. Fuente: Lu & Chang, 2001.

Linfoma de células del manto (LCM)

El LCM por lo general expresa el CD5 y CD43, pero, frecuentemente, ligeramente inferior a los LLC/LLP.(Dorfman& Shahsafaei,1997; Lai, Weiss, Chang & Arber, 1999) Los CD10 y CD23 son negativos generalmente, lo cual es útil en la distinción de LF y los LLC/LLP, respectivamente. La expresión de ciclina D1 (bcl-1) se ve en casi todos los casos y se asocia con la translocación t (11; 14)(q13; 32) entre los genes CCND1 (BCL-1) y la cadena pesada de la inmunoglobulina. (Cheuk,Wong,Wong& Chan, 2004). La tinción de ciclina D1 es nuclear y varía característicamente en intensidad entre las células tumorales en los linfomas. Se debe tener cuidado al reconocer la tinción nuclear positiva en las células endoteliales, que sirven como un control interno. Los casos negativos para ciclina D1 pueden sobreexpresar la ciclina D2 o D3. (Fu et al., 2005) Los casos poco comunes pueden carecer de expresión de las proteínas ciclinas y también pueden carecer de la translocación t (11; 14)(q13; q32), y el diagnóstico de LCM debe hacerse sólo si todas las demás características son clásicas. Una tinción nuclear de SOX11, ha mostrado una sensibilidad similar a la ciclina D1 en estudios pequeños de LCM. Se ha reportado

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que una ciclina D1-negativas del LCM es positiva para SOX11. (Chen,Gao,Fan& Peterson, 2010) Otras neoplasias linfoides que también pueden mostrar ciclina-D1+ incluyen neoplasias de células plasmáticas (hasta 25% de los casos), (Vasef et al., 1997) la leucemia de células pilosas (LCP; hasta el 50% de los casos, pero por lo general sólo en un subconjunto de las células), (Bosch et al., 1995; De Boer, van Krieken& Schuring, 1997) y LLC / LLP (casos raros que muestra tinción débil en los centros de proliferación)(O’Malley, Vance& Orazi, 2005). De estos, sólo los últimos muestran similitudes morfológicas. El LCM no contiene células grandes mezcladas o centros de proliferación y ésta es una característica útil para distinguirlo de los otros linfomas comunes de células pequeñas tales como el LF, LZM, y LLC/LLP. Las variantes blastoide y pleomórfica del LCM contienen células grandes, pero todas las células neoplásicas son grandes, y en la variante blastoide tienen apariencia uniforme, parecido al LLB. Ambas variantes son también positivas para ciclina D1, ayudando a hacer la distinción de otras entidades tales como LLB, el LDCBG y el linfoma de Burkitt. (Lu& Chang, 2011).

Linfoma de células B de la zona marginal (LZM)

LZM se divide en los tipos extranodal, ganglionar y esplénico y todos muestran inmunofenotipificación similares. Todos expresan el CD20 y son generalmente negativos para CD5, CD10, CD23 y ciclina D1. La expresión de CD43 está presente en un tercio de casos (Lai et al., 1999) La diferenciación plasmacítica está presente a menudo y es bastante notable, generalmente con expresión demostrable de CD138 y restricción de cadenas ligeras. La falta de CD5 y CD10 ayuda a diferenciar el LZM de los LLC / LLP, LCM y LF con relativa facilidad en la mayoría de los casos. Es más difícil distinguir entre el LZM y las proliferaciones reactivas tales como la hiperplasia reactiva monocitoide de células B en los ganglios linfáticos o la gastritis crónica severa. El hallazgo de la restricción de cadena ligera de la inmunoglobulina monotípica es diagnóstico de malignidad, pero esto es se encuentra generalmente sólo en las secciones de parafina cuando las características plasmacitoides están presentes. En los ganglios linfáticos, el bcl-2+ en una población de células B monocitoides es un diagnóstico de malignidad. El bcl-2+ en las biopsias pequeñas en las biopsias pequeñas de los sitios extranodales pueden ser muy difíciles de interpretar y no debe utilizarse como único indicador de malignidad. Los agregados de células B-bcl-2+ en una biopsia de estómago pueden representar folículos primarios o manto reactivo o células B de la zona marginal. La hiperplasia reactiva de la zona marginal del bazo, los ganglios linfáticos abdominales, o la mucosa ileal pueden expresar bcl-2 en o cerca de los folículos. (Meda et al., 2003). En los sitios extranodales tales como el estómago, el CD43+ en las células B puede ser la característica más fácil para identificar malignidad. Otro indicador de la malignidad es la presencia de agregados celulares CD20+, sin una población de células T asociadas y compartamentalizadas. Muchos casos de LZM extranodales no mostrará ninguno de los criterios inmunohistoquímicos de malignidad mencionados antes. Se debe confiar en las características morfológicas y si es necesario, en los estudios de rearreglo de los genes. (Lu & Chang, 2011).

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II.2.2 Linfoma linfoplasmacítico (LPL)

El linfoma linfoplasmacítico (LPL) se asocia generalmente con la macroglobulinemia de Waldenström (MW), definido en el año 2008 en el esquema de clasificación de la Organización Mundial de la Salud (OMS) como cualquier concentración de gammapatía de IgM monoclonal en combinación con la participación de la médula ósea de LPL. (Owen et al., 2003; World Health Organization [WHO], 2008) El LPL más comúnmente produce una paraproteína IgM, pero esto no se da siempre. El LPL se caracteriza morfológicamente por un infiltrado compuesto de linfocitos pequeños, linfocitos plasmocitoides y células plasmáticas. Se observa la expresión inmunohistoquímica de marcadores de células pan B y frecuentemente CD43 (Lai et al., 1999), generalmente sin expresión de CD5, CD10, CD23, o ciclina D1. Como con la mayoría de los linfomas con diferenciación plasmacítica, la expresión monotípica de cadenas ligeras generalmente se detecta en las secciones de parafina. Las células plasmáticas maduras son CD138+. La paraproteína de IgM no es exclusiva del LPL; las presentaciones clínicas parecidas a la WM se pueden ver en otros linfomas, incluyendo el LLC/LLP y LZM esplénico. El LPL por lo general no se tiñe para CD5 o CD10, una característica que permite distinguir de la mayoría de los otros linfomas de células B pequeñas. Sin embargo, la diferenciación del LZM puede ser difícil debido a que tienen inmunofenotipos similares y las diferencias morfológicas son sutiles, tales como la apariencia monocitoide y la compartamentalización de las células plasmáticas del LZM. Algunas veces puede ser necesario realizar el diagnóstico del linfoma de células B pequeñas con diferenciación plasmacítica según las recomendaciones de la OMS. (WHO, 2008) La presencia de un espectro de células con características linfoides y plasmocitoide, junto con la expresión de CD20, ayuda a distinguir el LPL/MW de las neoplasmas de células puras plasmáticas. (Lu & Chang, 2011).

II.2.3 Neoplasias de células plasmáticas

Este contiene una población pura de células plasmáticas que generalmente aparecen maduras, pero muestran la citología atípica o plasmablástica / inmunoblástica. Los neoplasmas de células plasmáticas consistentemente expresan el CD138, y con frecuencia expresan el CD79a, MUM-1, y CD43. La expresión aberrante de CD56 y CD117 es común en células neoplásicas, pero no en células plasmáticas reactivas. (Lin, Owens, Tricot& Wilson, 2004; Tsang, Chan, Ng & Pau, 1996). Generalmente, no hay expresión de CD45, CD20, o PAX-5. La restricción monotípica de cadena ligera es demostrable en las secciones de parafina, por lo general con expresión de IgG e IgA. La expresión de ciclina D1 se observa en aproximadamente un cuarto a un tercio de los casos y se correlaciona con la presencia de la translocación (11; 14). (Vasef et al., 1997) La expresión de la proteína de SOX11 no se ve, incluso en las neoplasias de células plasmáticas con esta translocación.(Chen et al., 2010) El diagnóstico diferencial incluye la plasmocitosis reactiva, la enfermedad de Castleman, y linfomas de células B pequeñas que contienen un infiltrado prominente de células plasmáticas tales como el LPL, LZM, y LLC / LLP. El panel inicial debe incluir el CD138, kappa, lambda, CD43, CD45, CD20

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y CD3. La restricción monotípica de cadena ligera diferencia una neoplasia de células plasmáticas de la plasmacitosis reactiva. Si las tinciones de cadenas ligeras no contribuyen, el CD56 puede ser útil. Las células plasmáticas en la enfermedad de Castleman pueden mostrar la restricción lambda (pero no Kappa); la positividad para el virus del herpes humano 8 (VHH-8) puede ser útil si existe sospecha clínica. La falta de un infiltrado CD20+/CD45+ es útil para distinguir una neoplasia de células plasmáticas de los linfomas de células B pequeños que pueden contener diferenciación plasmocitoide o infiltrados de células plasmáticas. Las neoplasias plasmablásticas de células plasmáticas no se pueden distinguir de los linfomas plasmablásticos por la morfología o la inmunohistoquímica y requiere una correlación clínica. La expresión de CD138 no es específica para las neoplasias de células plasmáticas y se puede ver en varias malignidades no hematolinfoides tales como carcinomas, sarcoma y melanoma. (O’Connell, Pinkus& Pinkus, 2004) En los casos con morfología plasmablástico y CD138+, también se debe establecer el origen hematolinfoide con un panel que puede incluir CD45, CD79a, CD43, kappa, lambda, CD20, CD3, CD30, pancitoqueratina, y S100. El CD43 es bastante específico para malignidades hematolinfoides (tanto linfoides como mieloides), y se ha reportado solamente en raras ocasiones en otros tumores. (Segal, Stoler & Tubbs, 1992) Por el contrario, el MUM-1 también se expresa en el melanoma, aunque está presente en las neoplasias de células plasmáticas y otros linfomas. (Sundram, Harvell, Rouse, & Natkunam, 2003)

Leucemia de células peludas (LCP)

La leucemia de células pilosas (LCP) es una neoplasia indolente de células B compuesta de células con núcleos ovales, citoplasma abundante, y proyecciones citoplasmáticas peludas, que tienen una apariencia de “huevos estrellados” en las secciones histológicas. La enfermedad afecta principalmente a la médula ósea y el bazo, ocasionalmente al hígado, los ganglios linfáticos, y la piel. (WHO, 2008) La participación de la médula ósea muestra un patrón característico intersticial que se distingue de otras células B neoplásicas pequeñas. Sin embargo, su aspecto histológico en los ganglios linfáticos y el bazo se superpone con el LZM. Un panel útil de inmunotinciones puede incluir a los CD20, CD3, CD43, anexina A1, DBA.44, fosfatasa ácida tartrato resistente (TRAP), bcl-1, CD5, y / o CD23. LCP es generalmente positiva para CD20, CD45, anexina A1, DBA.44, TRAP, y bcl-2. (Falini et al., 2004; Matutes, 2006) Un subconjunto de las células muestran una expresión débil de bcl-1 en algunos casos. (Cheuk et al., 2004; Miranda et al., 2000) Aunque el DBA.44 y TRAP son marcadores sensibles para la LCP, ambos pueden ser positivos en algunos casos de LZM. (Matutes, 2006) La tinción de SOX11 se correlaciona con casos bcl-1+. (Chen et al., 2010) Las células son negativas para CD5, CD23, y CD43. El bcl-1 no es un marcador muy sensible para LCP pero es consistentemente negativo en LZM. Quizás el marcador más sensible y específico es la anexina A1, que muestra tinción citoplasmática en casi todos los casos de LCP y es negativa en todos los otros linfomas de células B, incluyendo el LZM. (Falini et al., 2004)

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II.2.4 Linfomas de células B grandes

Linfoma difuso de células B grandes (LDCBG)

Este es un grupo heterogéneo de linfomas con múltiples variantes y subtipos que se han dividido con base en las características morfológicas, inmunohistoquímicas, genéticas y clínicas. (WHO, 2008) Las variantes morfológicas incluyen a las centroblástica, inmunoblástica, y anaplásica. Los subgrupos molecular e inmunohistoquímico incluyen al centro germinal parecidos a las células B (CGB) y al centro activado o no germinal parecidos a las células B (CAB). Con el uso de la terapia con rituximab, el significado clínico de estas variantes ya no está claro. (Winter et al., 2006) Todas estas variantes están combinadas en la categoría de LDCBG, tipo no específico según la actual clasificación de la OMS. Estos linfomas son CD20+, CD79a+, y PAX-5+, así como los marcadores de transcripción de células B BOB.1 y OCT-2, pero otras tinciones aparte del CD20 se necesitan generalmente sólo en casos morfológicamente difíciles. Si con base en el panel inicial se sospecha de un diagnóstico de LDCBG tipo no específico, se puede considerar agregar el bcl-2, bcl-6, CD10 y MUM1. Para los pacientes mayores de 50 años de edad, se puede agregar la proteína 1 de membrana (PML1) del VEB latente, bajo ciertas circunstancias con el propósito de excluir LDCBG-VEB-positivo de ancianos. El LDCBG tipo no específico es CD10+ en aproximadamente la mitad de los casos, bcl-6 es positivo en aproximadamente 75% de los casos; MUM-1 es positivo en aproximadamente la mitad, bcl-2 es positivo en aproximadamente la mitad, y algunos casos también pueden ser positivos para CD5, CD23, y CD43. (Berglundet al., 2005; Chang et al., 2004; Hummel et al., 2006; Muris et al., 2006; Pileri et al., 2002; Shivakumar& Armitage, 2006; Yamaguchi et al., 2002). La expresión de Ki-67 varía desde 30% a 100%. Algunos casos, especialmente en la variante anaplásica de LDCBG, también son CD30+. Estos casos son negativas para la proteína ALK y los marcadores de células T. El uso de inmunohistoquímica para dividir el LDCBG en CGB y CAB es opcional. El tipo CGB es CD10+ (> 30% de las células) y/o bcl-6+, pero es negativo para MUM-1. El tipo CAB es típicamente negativo para CD10 y bcl-6+ y MUM-1+. (Chang et al., 2004; Muris et al., 2006). La distinción entre el LDCBG y el linfoma de Burkitt puede ser muy difícil. Se sospecha del linfoma de Burkitt si se observa una apariencia monomórfica con un patrón tipo cielo estrellado, o si el Ki-67 se aproxima a 100% y las células son CD10+ y bcl-6+. También se sospecha de linfoma de Burkitt si el bcl-2 es negativo (observado en aproximadamente dos tercios de los casos de linfomas de Burkitt), y hay CD43+, observado en aproximadamente el 50% de los linfomas de Burkitt y sólo en el 10% del LDCBG. (Lai et al., 1998; Lai et al., 1999)Si la sospecha sobre linfoma de Burkitt es muy alta se recomienda realizar estudios de fluorescencia de hibridación in situ, con la salvedad que el 10% de LDCBG también contienen la translocación de c-myc, aunque por lo general en un fondo de cariotipo complejo. (Hummel et al., 2006; Yunis, Mayer&Amesen, 1989). En presencia de CD30+ en LDCBG, considerar LACG y LHc. En la mayoría de los casos

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de LDCBG, se observa fuerte expresión del CD20 en agregados de células grandes, con sólo positividad focal variable para CD30. Estos casos son comunes y pueden ser diagnosticados claramente como LDCBG sin más estudio diagnóstico. Los casos difíciles son aquellos con menos células grandes y fondo más inflamatorio y fibrosis, tales como en el caso del linfoma primario mediastínico de células grandes. Un panel útil para distinguir estos casos de LHc puede incluir CD15, CD45, CD79a, BOB.1, OCT-2, y PAX-5 (Cuadro II.8). Por lo general, no todos estos marcadores son necesarios para hacer la distinción. La positividad fuerte y consistente del CD20 de membrana de todas las células malignas es sugerente de LDCBG, mientras que la tinción de intensidad variable en un subgrupo de células es sugerente de LHc. El CD15 es un marcador muy útil, ya que es positivo en LHc y negativo en LDCBG. CD45, CD79a, BOB.1 y OCT-2 son generalmente negativos en CHL y positivo en DLBCL. La intensidad del PAX-5 (débil en LHc y fuerte LDCBG ) también puede ser útil. (Lu & Chang, 2011).

Cuadro II.8. Linfoma difuso de células B grandes (LDCBG) versus Linfoma de Hodgkin clásico (LHc) versus Linfoma de Hodgkin tipo nodular con predominio linfocítico

(LHNPL)

LDCBG LHc LHNPL CD30 Positivo/negativo

(variable) Positivo Positivo/negativo

(débil) CD15 Negativo Positivo Negativo CD45 Positivo Negativo Positivo CD20 Positivo Positivo/negativo Positivo CD79a Positivo Negativo Positivo MUM-1 Positivo Positivo Negativo BOB.1 Positivo Negativo Positivo OCT-2 Positivo Negativo Positivo PAX-5 Fuerte Débil Moderado

Fuente: Lu & Chang, 2011. La clasificación de LDCBG de la OMS 2008 se divide en 4 subtipos y 8distintas enfermedades (WHO, 2008): Subtipos del linfoma difuso de células B grandes • Linfoma de células T/células B grandes ricas en histiocitos • Linfoma difuso de células B grandes primario del sistema nervioso central • Linfoma difuso de células B grandes primario cutáneo de las extremidades inferiores • Linfoma difuso de células B grandes positivo para el virus de Epstein Barr en

ancianos

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Entidades clínicas distintas asociadas al linfoma difuso de células B grandes • Linfoma primario mediastínico (tímico) de células B grandes • Linfoma intravascular de células B grandes • Linfoma difuso de células B grandes asociado a inflamación crónica • Granulomatosis linfomatoide • Linfoma de células B grandes ALK+ • Linfoma plasmablástico • Linfoma de células grandes que surge en la enfermedad de Castleman multicéntrica

asociada al virus del Herpes humano-8

Para algunos, la distinción del LDCBG tipo no específico requiere de la morfología y la inmunohistoquímica. Estos incluyen el LTCBGRH, LDCBG VEB+ de los ancianos, y linfoma de células B grandes ALK+. (Lu & Chang, 2011).

Linfomas de células T/células B grandes ricas en histiocitos (LTCBGRH)

Este es un subtipo de LDCBG en el que las neoplasias de células B son escasas en comparación con el infiltrado inflamatorio. El requisito que las células neoplásicas sean menos del 10% se ha eliminado de la clasificación de la OMS-2008 y se ha sustituido por una definición más descriptiva con células B grandes esparcidas, individualmente dispersas que no se agregan. (World Health Organization [WHO], 2001; WHO, 2008). Como el nombre sugiere, el fondo está compuesto principalmente de células T e histiocitos. También hay células plasmáticas dispersas y eosinófilos. El perfil inmunohistoquímico de las células grandes es similar al LDCBG, tipo no específico. Las células expresan a los marcadores de células-pan-B, y son generalmente CD30- y CD15-, e invariablemente negativos para el VEB. Esto ayuda a distinguir esta entidad del LHc, la mononucleosis infecciosa aguda, y otras neoplasias asociadas al VEB como el granulomatosis linfomatoide y LDCBG-VEB+ de ancianos. La distinción con LPCT requiere del reconocimiento de atipia morfológica en las células pequeñas y grandes, con un panel confirmatorio para células T si existe sospecha. (Lu & Chang, 2011).

Linfoma difuso de células B grandes-Virus de Epstein Barr-positivo de ancianos

Este linfoma ocurre en los pacientes mayores de 50 años de edad y no tienen otras causas de inmunosupresión aparte del envejecimiento. La enfermedad inicialmente afecta a los ganglios linfáticos y por lo general afecta sitios extraganglionares tales como piel, pulmón, amígdalas y estómago. (Oyama et al., 2007) Con base en la morfología, se han descrito dos formas de este linfoma; la primera no se distingue histológicamente del LDCBG tipo no específico y el diagnóstico diferencial es similar. La otra forma es semejante al LHc, con infiltrado polimorfo y células dispersas tipo Hodgkin. El perfil de inmunohistoquímica de ambas formas es similar al de LDCBG tipo no específico, incluyendo la expresión variable de CD30, con la excepción de VEB+, que sirve para diferenciar. Sin embargo, el VEB+ no es del todo específico ya que la granulomatosis

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linfomatoide, el linfoma plasmablástico, el linfoma primario de efusión, y el LDCBG asociado con inflamación crónica son VEB+ y muestran la tinción de CD20 en las células neoplásicas grandes. La información clínica y otras inmunotinciones son útiles para distinguir entre estas entidades. Las tinciones de VEB son sugerentes de LDCBG si el paciente tiene más de 50 años de edad, hay necrosis, las células muestran pleomorfismo y/o las células semejantes a Reed Sternberg, o hay afectación extraganglionar. (Lu & Chang, 2011)

Linfoma de Células B grandes ALK-positivo

Este es un pequeño subconjunto de linfomas de células B que se asemejan morfológicamente al LDCBG inmunoblástico, con un patrón de crecimiento sinusoidal. La inmunohistoquímica muestra reactividad granular y con forma similar a un punto de la proteína citoplásmica de la ALK, que indica una translocación variante. Estos tumores son negativos para los marcadores de células pan-B tales como CD20, CD30, solamente positiva débilmente para CD45, y a menudo muestran la expresión aberrante de CD4 y CD57.Los tumores también son positivos para los marcadores asociados a las células plasmáticas CD138, el antígeno de membrana epitelial (AME), y MUM1, y a menudo muestran restricción de la cadena ligera. (Delson et al., 1997; Stachurski et al., 2007)La prueba del linaje B puede requerir de rearreglo de genes. El diagnóstico diferencial morfológico incluye LACG ALK+ y el linfoma plasmablástico. El LACG puede ser excluido fácilmente por la tinción de CD30+, que es negativo en el linfoma de células B grandes ALK+. La ALK+ excluye para el linfoma plasmablástico. (Lu & Chang, 2011)

Linfomas relacionados con células B grandes difusas, clínicamente distintas de

los linfomas de células B grandes

Estos tienen presentación característica y sitios anatómicos específicos de aparición, que por lo general apuntan a un diagnóstico. Estos incluyen el LDCBG primario del sistema nervioso central, LDCBG primario cutáneo, localizados en las extremidades inferiores, el linfoma primario mediastínico de células B grandes, el linfoma intravascular de células B grandes, el LDCBG asociado con inflamación crónica, la granulomatosis linfomatoidea, el linfoma plasmablástico, linfoma de células B grandes que surge en el VHH-8 asociado a la enfermedad de Castleman multicéntrica y el linfoma primario de efusión. La mayoría de ellos muestran inmunofenotipo similar al de LDCBG tipo no específico y se definen principalmente por la presentación clínica. A continuación se describen algunos linfomas que tienen inmunofenotipos distintos. (Lu & Chang, 2011)

LDCBG cutáneo primario localizados en las extremidades inferiores

Este es linfoma cutáneo primario de células B que afecta principalmente a las extremidades inferiores de mujeres de edad avanzada y muestra agregados monomórficos de centroblastos e inmunoblastos. Cualquier linfoma cutáneo primario de células B con esta morfología debe caer dentro de esta categoría, aunque no esté presente en las extremidades inferiores. Estos tumores expresan antígenos de células pan-B, incluyendo CD20, como también bcl-2, bcl-6, MUM-1, y FOX-P1, y generalmente son negativos

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para CD10. (Hoefnagel et al., 2003; Kodama et al., 2005) El principal diferencial está con el linfoma cutáneo primario del centro del folículo y se puede distinguir con el reconocimiento de una arquitectura folicular y el uso de un panel típico para LDCBG que contiene bcl-2, bcl-6, CD10 y MUM-1. Ambos son bcl-6+, pero el LDCBG cutáneo primario, del tipo de la pierna por lo general muestra la expresión de bcl-2, MUM-1, y FOX-P1, mientras que el linfoma cutáneo primario cutáneo del centro folicular suele ser negativo para estos marcadores. (Lu & Chang, 2011)

LDCBG asociado con inflamación crónica

Esto abarca el linfoma asociado al piotórax y el LDCBG que surge después de otra inflamación crónica de larga duración, tales como la osteomielitis crónica, implantes metálicos, o las úlceras crónicas de la piel. A diferencia del linfoma primario de efusión, el linfoma asociado al piotórax se presenta con una masa tumoral. Su fenotipo es similar al del LDCBG, con algunos casos que muestran diferenciación plasmática, y expresión de antígenos a células T aberrantes. La PM-VLEB y la hibridación in situ del VEB son generalmente positivas. (Petitjean et al., 2002)

Granulomatosis linfomatoide Este es un linfoma de células grandes impulsado por el VEB, angiocéntrico extraganglionar y angiodestructivo con células T reactivas mezcladas. Las células grandes son VEB+ y expresan CD20, mientras que la expresión de CD30 es variable y no expresan CD15. (Wilson, Kingma,Raffeld, Wittes & Jaffe, 1996). Aunque la PM-VLEB puede ser positiva, la hibridación in situ del ARN codificado del virus de Epstein-Barr es el estándar y se utiliza para la clasificación, que se basa en la cantidad de células grandes positivas para el ARN codificado del virus de Epstein-Barr en relación al fondo mixto reactivo e inflamatorio. Los agregados difusos de células grandes sin el infiltrado reactivo mixto no se consideran granulomatosis linfomatoide y deben ser clasificadas bajo otras entidades clínicopatológicas, tales como LDCBG tipo no específico o de LDCBG VEB+ de ancianos. Ésta se puede distinguir del otro linfoma principal angiodestructivo (linfoma extranodular de células asesinas naturales/células T, tipo nasal) a partir de la positividad del CD20. Puede ser necesario distinguir las lesiones de menor grado con menor número de células grandes y la positividad de CD30 del LHc utilizando una estrategia similar a la descrita antes (Cuadro II.8). (Lu & Chang, 2011)

Linfoma plasmablástico

Este se asocia con estados de inmunodeficiencia como el virus de inmunodeficiencia humana y la edad avanzada. Las células pueden parecerse a los inmunoblastos o mostrar más diferenciación plasmacítica inmadura. El inmunofenotipo es similar a las neoplasias de células plasmáticas, pero la expresión de CD56 es menos común. La PM-VLEB es generalmente negativa, pero la hibridación in situ del VEB es positiva generalmente. El VHH-8 es negativo. (Dong et al., 2005; Vega et al., 2005)

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Linfoma de Células B Grandes con origen en el VHH-8 asociado a la enfermedad de Castleman multicéntrica

Este se reconoce por los agregados de plasmablastos, los cuales desgastan la arquitectura ganglionar normal, en un contexto de enfermedad de Castleman multicéntrica. La mayoría de estos pacientes son positivos para el virus de la inmunodeficiencia humana. Estas células son positivas para el antígeno nuclear 1 del VHH-8 latente, una tinción nuclear, y muestran restricción de la cadena pesada de IgM y la cadena ligera lambda. El VEB es por lo general negativo. (Oksenhendler et al., 2002)

Linfoma primario de efusión

Este se presenta generalmente como una efusión serosa sin una masa tumoral asociada. La efusión contiene células que citológicamente se asemejan al linfoma plasmablástico. Inmuno-fenotipicamente se encuentra CD45+, CD138+ y EMA+, pero el CD20, CD79a, y PAX-5 son negativos. (Nador et al., 1996) La PM-VLEB es generalmente negativa, pero el VEB se puede mostrar por la hibridación in situ. (Cioc et al., 2004) El BOB.1 y OCT-2 son positivos, igual que en el linfoma plasmablástico y las células plasmáticas normales. El VHH-8 es siempre positivo.(Chu, Loera, Huang & Weiss,2006).

Linfoma/leucemia linfoblástico Esta es una proliferación monomorfa de células pequeñas a intermedias con citoplasma escaso, cromatina fina y nucleolos no visibles. Las leucemias linfoblásticas agudas B y T LLA/LLB tienen diferentes presentaciones clínicas pero tienen morfologías similares. Ambos son consistentemente positivas a TdT, CD43, y CD99, y frecuentemente positiva para CD34. (Lai et al., 1999; Arber& Jenkins, 1996; Soslow, Bhargava& Warnke, 1997). El CD45 está presente en la mayoría de los casos, pero no en todos. (Weiss, Arber & Chang, 1993) Ambos pueden expresar marcadores mieloides tal como el CD33, pero nunca expresan mieloperoxidasa. La citometría de flujo y la citoquímica pueden ayudar a establecer el linaje de una neoplasia blástica. Con la inmunohistoquímica de parafina, el PAX-5 es el marcador más sensible y específico para asignar el linaje B. (Torlakovic, Torlakovic, Nguyen, Brunning & Delabie,2002) La mayoría de LLA-B/LLB-B también serán positivas para CD10, CD79a, y BOB.1, mientras que los CD20 y OCT-2 son negativos generalmente. (Chu et al., 2006) No se observa la expresión de ningún antígeno de células T. Los LLA-T/LLB-T generalmente expresan CD3 (citoplasmática) y CD7, aunque sólo el CD3 se considera linaje específico. Los antígenos de las células T restantes para CD1a, CD2, CD4, CD5, y CD8 se expresan de forma variable. Se puede observar ya sea la coexpresión de CD4 y CD8 o la ausencia de ambos. (Link et al., 1983; Pittaluga, Raffeld, Lipford & Cossman, 1986; van Dongen et al., 1988) Un panel con TdT, CD43, CD3, PAX-5, CD79a, CD10, mieloperoxidasa, CD20, bcl-1, y Ki-67 es útil para asignar linaje y excluir imitadores morfológicos, tales como la leucemia mieloide aguda (mieloperoxidasa positivo), el LCM blástico (bcl-1+ y TdT-), y el linfoma de Burkitt (CD20+, TdT-, y Ki-67 cercano al 100%). Los neoplasmas TdT+ se deben teñir

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para mieloperoxidasa debido a que algunas leucemias tienen linaje mieloide, particularmente aquellas con t(8:21) pueden expresar TdT y/o PAX-5. (Valbuena et al., 2006). Algunas veces se puede observar expresión de CD79a y CD10 en las LLA-T/LLB-T. (Pilozzi et al., 1998)

Linfoma de Burkitt

Este muestra una proliferación monomorfa de células de tamaño intermedio con cantidades moderadas de citoplasma basófilo, cromatina vesicular, y uno o más nucleólos medianos. La presencia de macrófagos con cuerpos teñibles imparten una apariencia de cielo estrellado, mientras que los agregados de células reactivas inflamatorias no son frecuentes. El linfoma de Burkitt muestra expresión consistente de los marcadores de células pan-B CD20, CD79a, PAX-5, BOB.1, y OCT-2, así como CD10 y bcl-6. (Harris et al., 1994; Nasr, Rosenthal,& Syrbu, 2010). El bcl-2 es generalmente negativo, pero puede ser débilmente positivo en hasta una tercera parte de los casos. (Lai et al., 1998) La coexpresión de CD43 es común. (Lai et al., 1999) La tinción de Ki-67 muestra positividad nuclear en casi el 100% de las células. El linfoma de Burkitt no se tiñe para TdT, mieloperoxidasa, CD 117, CD34, CD5, o ciclina D1. Estos ayudan a distinguirla de la mayoría de otros infiltrados monomorfos de células medianas. (Weiss, 2008; Harris et al., 1994)

II.2.5 Linfoma de Hodgkin

Linfoma de Hodgkin clásico Es un linfoma de linaje B derivado de centros germinales de las células B. El diagnóstico se basa en la identificación de células clásicas de Reed-Sternberg y/o las llamadas células de Hodgkin, que son básicamente células Reed-Sternberg uninucleadas. Las células neoplásicas a menudo representan menos del 10% del infiltrado, el cual comprende una mezcla de células T reactivas, histiocitos, eosinófilos, neutrófilos y células plasmáticas. Las células neoplásicas son consistentemente positivas para CD30, por lo general son positivas para CD15, débilmente positivas para PAX-5, el CD20+ es variable, y son negativas para CD45 y CD3. (Agnarsson & Kadin,1989; Chittal et.al., 1988; Foss et.al., 1999; Pinkus et al., 1985; Schmid et al., 1991). Las células de Hodgkin son positivas para el MUM-1 y bcl-2, y negativas para CD79a, BOB.1, OCT-2, CD43, CD138, y los marcadores de linaje T (CuadroII.8). (Arber & Weiss, 1993; Buettner, Greiner,Avramidou, Jack & Niedobitek, 2005; Gualco, Weiss& Bacchi, 2010; Lones, Pinkus, Shintaku& Said, 1994; Stein et al., 2001). La PM-VLEB es positiva en un tercio de los casos y está fuertemente asociada con los niños y ancianos, y con celularidad mixta y subtipos de depleción de linfocitos. (Hummel et al., 1992) El bcl-6 también es positivo en un tercio de los casos. (Capello et al., 2000; Fallini et al., 1996) El infiltrado inflamatorio reactivo de fondo generalmente muestra CD3+ y CD45+ de células T, con la excepción del subtipo rico en linfocitos, que muestra abundantes células B CD20+, y el subtipo de depleción de linfocitos, en el que los linfocitos son sustituidos por histiocitos y otras células inflamatorias. (Lu & Chang, 2011).

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Cuando la morfología es clásica y el CD15 es positivo, el diagnóstico es sencillo generalmente. Las dificultades surgen debido a que el CD15 es negativo en el 15% de los LHc y casi todas las entidades dentro del diagnóstico diferencial también son CD15 negativo. (Agnarsson & Kadin,1989; Chittal et al., 1988; Foss et al., 1999; Pinkus et al., 1985; Schmid et al., 1991) En los casos en que el CD20 es también negativo, especialmente hay abundantes células de Hodgkin y forman agregados, se debe excluir el LACG, que carece de expresión de CD45 y CD3 en 33% y 60% de los casos, respectivamente. (Weiss et al., 1993; Medeiros& Elenitoba-Johnson, 2007). La mayoría de los casos se deberían aclarar agregando el PAX-5, PM-VLEB, CD43, ALK, y marcadores citotóxicos, tales como TIA-1, granzima B, y/o perforina. Los LACG son siempre negativos para el PAX-5 y el VEB, y la mayoría de los casos son positivos para CD43 y marcadores citotóxicos. (Foss et al., 1996; Nakamura et al., 1997) En los tumores CD30+/CD15- que también son CD20+, se debe considerar el diagnóstico de LTCBGRH, que es CD30+ en el 5% de los casos y universalmente CD20+. Esta entidad también es consistentemente positiva para CD45, pero la evaluación de la expresión de CD45 no siempre es fácil, dado el infiltrado difuso de células T. En estos casos es útil agregar el BOB-1 y el OCT-2. Estos factores de transcripción se expresan en casi todos los LDCBG y sólo el 10% de LHc. (Chu et al., 2006; Stein et al., 2001) La hiperplasia paracortical reactiva se distingue fácilmente del LHc, debido a la hiperplasia folicular que le acompaña. Un error común es enfocarse sólo en el aspecto de alta potencia de los inmunoblastos reactivos, que pueden parecerse a las células de Hodgkin debido a los nucleolos prominentes y la positividad variable del CD30. Ocasionalmente, el subtipo de celularidad mixta del LHc puede mostrar un patrón interfolicular. Las características combinadas de CD15 negativo, CD45+ variable, CD30+ variable puede llevar al diagnóstico de hiperplasia paracortical reactiva y no linfoma de Hodgkin interfolicular. El subtipo rico en linfocitos del LHc puede mostrar un patrón nodular de células B que rodean las células de Hodgkin, que puede parecerse mucho a LHNPL. (Lu & Chang, 2011).

Linfoma de Hodgkin con predominio de linfocitos nodulares Como su nombre lo indica el LHNPL muestra un infiltrado de células B reactivas nodulares o nodulares y difusas, algunas veces con un aumento de histiocitos epitelioides. El diagnóstico se basa en la identificación de células con predominio linfocítico, que se caracterizan por células grandes multilobadas con cromatina vesicular y uno o más nucleolos localizados periféricamente. La nodularidad no siempre es evidente en la sección teñida con H y E, pero la inmunotinción CD20 debería resaltar el patrón ganglionar característico, debido a que la mayoría de las áreas interganglionares se componen de células T. Los ganglios son más grandes y mucho más espaciados que en los casos de LF, pero todavía muestran una malla de células dendríticas foliculares CD21+/CD23+/CD35+.Las células LP son CD30-, CD15-, y consistentemente CD20+ y CD45+ (Cuadro II.7). (Mason et al., 1994) También son generalmente positivas para CD79a, PAX-5 (tinción moderada, en contraste con la tinción débil o ligera de las células Reed Sternberg del LHc), BOB.1, OCT-2, y bcl-6. (McCune, Syrbu& Vasef, 2006; Stein et al., 2001) El bcl-2 es positivo en un tercio de los casos. (Chu, Chang, Arber & Weiss,

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2000) Las células LP son negativas para MUM1, CD43, y marcadores de células T. (Gualco et al., 2010) Además de una gran número de células B, los ganglios también contienen un número aumentado de células T, que tienen un fenotipo de células foliculares tipo ayudadoras (CD57+, PD1+, y bcl-6+). (Kraus & Haley, 2000) Algunos prefieren utilizar las tinciones de los CD57 y PD1 debido a que son negativos en las células LP y resaltarán las células T al rodear las células LP de forma característica. Por lo tanto, si se sospecha LHNPL, el panel de inmunohistoquímica debe incluir CD20, CD3, CD45, CD30, CD15, CD57 y PD1. Si los nódulos todavía no son evidente en la tinción de CD20, se puede agregar el CD21, CD23 o CD35 para ayudar a revelar la nodularidad. (Lu & Chang, 2011). En la práctica, el CD30 puede ser débilmente positivo en las células LP hasta en un tercio de los casos. (Chang, Arber & Weiss, 1993). El CD15 también puede ser positivo en un porcentaje menor de casos. (Anagnostopoulos et al., 2000) En los casos ambiguos de LHc vs. LHNPL, puede ayudar agregar al panel el MUM-1, BOB.1 y OCT-2. El LHc es positivo para el MUM-1 y negativo para BOB.1 y OCT-2. El LHNPL muestra el patrón opuesto, es negativo para MUM-1 y positivo para BOB.1 y OCT-2. (Gualco et al., 2010; Stein et al., 2001) Si estas tinciones no están disponibles, el bcl-6 y PLM-VEB pueden ser útiles. Aproximadamente 40% de los LHc son PLM-VEB+ y la mayoría son bcl-6 negativos, mientras que las células LP son consistentemente negativas para PLM-VEB y bcl-6+. (Chu et al., 2000; Ambinder& Weiss, 1999) Una vez que la arquitectura ganglionar se aprecia, la hiperplasia paracortical reactiva no se considera generalmente en el diferencial, sino otro patrón reactivo, se puede considerar la transformación progresiva de los centros germinales. Esto también es una distinción bastante fácil, ya que la transformación progresiva se produce en un contexto de hiperplasia folicular, con ganglios grandes mezclados entre los folículos reactivos, mientras que el LHNPL muestra desgaste de la arquitectura ganglionar y por lo general está separado de las áreas que contienen folículos residuales reactivos. A menudo, el diagnóstico diferencial más difícil es el del LTCBGRH. Las células LP y las células neoplásicas en el LTCBGRH pueden mostrar inmunofenotipos idénticos, por lo tanto, la distinción se apoya en la identificación de los nódulos de células B y células CD57+/PD-1+ que rodea las células LP. Esto puede ser extremadamente difícil de identificar, sobre todo porque los casos de LHNPL que ya han durado algún tiempo tienden a contener áreas más difusas, más células T y menos células CD57+ que lesiones tempranas de LHNPL. (Fan, Natkunam, Bair, Tibshirani & Warnke, 2003)

II.2.6 Linfomas de células T

Linfoma Periférico de células T, tipo no especificado

Este puede mostrar una variedad de morfologías, que van desde las lesiones que se asemejan a la hiperplasia paracortical reactiva a aquellas compuestas de abundantes células atípicas grandes. Por lo general, pero no siempre, la arquitectura ganglionar se desgasta y no hay hiperplasia reactiva folicular acompañante. Los linfomas de células T, en general, son poco frecuentes y el panel de inmunohistoquímica inicial por lo general no difiere de la de los paneles de células B, con la inclusión de CD20, CD3, bcl-2, CD30,

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y CD43. La falta de características morfológicas e inmunofenotípicas de los linfomas de células B o LH aumentaría la sospecha de un linfoma de células T. Desafortunadamente, no existe un equivalente de la restricción de cadena ligera de inmunoglobulina que proporcione evidencia definitiva y directa de un clon neoplásico. En lugar de eso, el estudio depende de la evaluación de la pérdida de los marcadores de las células pan-T y/o bcl-2. (Lu & Chang, 2011) Un panel general para el linfoma de células T incluye los marcadores de las células pan-T CD2, CD3, CD5, CD7, junto con bcl-2, Ki-67, CD30, y CD20. El CD4 y CD8 se pueden agregar, pero la proporción CD4:CD8 no es similar a la proporción kappa:lambda para determinar malignidad. El LPCT-tipo no específico muestra un fenotipo de células T maduro y debería expresar por lo menos uno de los marcadores de las células pan-T y no debería expresar CD1a, TdT, o los marcadores de linaje B tales como el CD20, CD79a, PAX-5, BOB.1 u OCT-2. A menudo hay pérdida de expresión de uno o más marcadores de células pan-T, a veces con pérdida aberrante de bcl-2; cualquiera de los dos proporciona fuerte evidencia de una malignidad de células T. La mayoría de los casos se componen de células CD4+/CD8—linfocitos T ayudadores. (Weiss, Crabtree, Rouse& Warnke, 1985). El Ki-67 está generalmente elevado, un hallazgo inusual en la región paracortical de los ganglios linfáticos benignos. Se pueden observar inmunoblastos reactivos dispersos CD30+, pero éstos deben estar dispersos, con la intensidad de tinción variable. La infección por VEB es común, pero probablemente representa células B reactivas infectadas. En algunos casos, la expresión del antígeno no se pierde y se debe confiar en los estudios de reordenamiento de genes del receptor de células T para confirmar la impresión morfológica. Linfoma angioinmunoblástico de células T

Este se deriva probablemente de los linfocitos T ayudadores foliculares. Esta entidad se caracteriza por la proliferación polimorfa de linfocitos T ayudadores intrafoliculares que característicamente muestran citoplasma claro, sobre todo alrededor de vénulas prominentes del endotelio alto, y una proliferación irregular de las redes dendríticas foliculares, algunas rodeando vénulas del endotelio alto. Pueden estar presentes cantidades variables de histiocitos, eosinófilos y células plasmáticas mezcladas. A diferencia del LPCT tipo no específico, las células neoplásicas no pierden frecuentemente los antígenos de las células pan-T. (Ferry, 2002) Sin embargo, existe un perfil característico de inmunohistoquímica de los linfocitos T ayudadores intrafoliculares que es muy útil en el diagnóstico. El panel de diagnóstico debe incluir los marcadores habituales de células T CD2, CD3, CD5, CD7, y bcl-2, el CD20, los marcadores de linfocitos T ayudadores intrafoliculares bcl-6, CD10, CXCL13, y/o PD-1, y un marcador de las células dendríticas foliculares CD21, CD23, o CD35. Se debería esperar encontrar que la mayoría de las células positivas para bcl-6, CD10, CXCL13, o PD-1 y las redes dendríticas foliculares expandidas e irregulares rodean las vénulas endoteliales altas, resaltado por CD21, CD23 o CD35. (Jones, Jorgensen, Shahsafaei & Dorfman, 1998; Krenacs, Schaerli, Kis, & Bagdi, 2006) El Ki-67 por lo general no está aumentado. Casualmente, aunque no es necesario para el diagnóstico, muchos casos muestran VEB+ en las células B no neoplásicas mezcladas. (Dunleavy, Wilson & Jaffe, 2007)

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Linfoma anaplásico de células grandes (LACG)

El LACG abarca varios linfomas de células T que tienen diferentes presentaciones clínicas, pero pueden tener características morfológicas en común. Con técnicas inmunohistoquímicas, todos los LACG tienen en común la característica distintiva de la expresión fuerte difusa del CD30. Además del CD30, otros marcadores de activación de los linfocitos son consistentemente positivos, incluyendo el CD25, CD71, y el antígeno humano leucocitario-DR. (Delson et al., 1988) Además, la mayoría de los casos de LACG expresan uno o más de los marcadores de células pan-T, CD43, y al menos uno de los marcadores citotóxicos TIA-1, granzima B o perforina. (Foss et al., 1996; Medeiros et al., 2007) El CD45 es positivo en dos tercios de los casos. (Weiss et al., 1993) Algunos casos muestran un fenotipo nulo, con pérdida de todos los marcadores específicos para células T. En estos casos es útil confirmar el diagnóstico a través de la demostración de los marcadores CD43 y citotóxicos. La mayoría de los casos son CD4+. El CD15 es positivo ocasionalmente, como también el CD68, aunque el marcador más específico para histiocitos, CD163, es negativo. (Benharroch et al., 1998; Lau, Chu & Weiss, 2004)

El LACG cutáneo primario (C-LACG), además del perfil de inmunohistoquímica descrito anteriormente, expresa el antígeno linfocítico cutáneo (ALC) en la mayoría de los casos, mientras que el LACG ganglionar no expresa el ALC. Sin embargo, algunos casos de LACG ganglionar con afectación secundaria de la piel son ALC+ según algunos informes. (Magro& Dyrsen, 2008). Por lo tanto, este anticuerpo es poco probable que sea útil como correlación clínica para distinguir entre las formas primarias cutáneas y ganglionar. Además, el LACG ganglionar es ALK+ en aproximadamente el 60% a 85% de los casos, (WHO, 2001) ya sea con distribución nuclear, citoplasmática, o nuclear y citoplasmática, dependiendo del tipo de translocación. La translocación más común t(2;5) /nucleofosmina-ALK se asocia con la tinción nuclear y citoplasmática. Los casos de LACG-ALK+ son generalmente EMA+. (Benharroch et al., 1998) A diferencia de otros linfomas de células T y LDCBG, todos los cuales pueden mostrar CD30+ irregular, con intensidad variable, los LACG muestran aglomerados celulares CD30+ de intensidad fuerte. Como resultado de esto, el diagnóstico diferencial se limita a mononucleosis infecciosa aguda y LHc, especialmente la variante sincitial del subtipo esclerosis nodular, que puede formar agregados de células de Hodgkin que son CD30+. Este diferencial podría ser confuso por el hecho de que LACG puede perder la expresión de CD3, ser negativo para CD45, e incluso en ocasiones puede ser positivo para CD15. Por lo tanto, en los casos sospechosos de LHc en los que se observan agregados de células grandes, se recomienda excluir LACG utilizando un panel de tinciones que incluyen PAX-5, PM-VEBL, ALK, CD43, y los marcadores citotóxicos TIA-1, granzima B, y/o perforina. El PAX-5+ y VEB+ respaldan el diagnóstico de LHc, mientras que la expresión de las últimas tinciones no se observa en el LHc, pero favorece el diagnóstico asociado a LACG. La tinción para el VEB también es útil en pacientes jóvenes, donde se debe ser cuidadoso con las mononucleosis infecciosa aguda, que en ocasiones puede formar agregados de inmunoblastos grandes CD30+. Generalmente, estos agregados son focales, y no desgastan toda la arquitectura ganglionar. El VEB no está asociado con

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LACG a menos que esté asociado a inmunodeficiencia, tal como el desorden linfoproliferativo post-transplante. (Brougusset, 1993) Otros linfomas de células T pueden transformarse en LACG y no distinguirse por su morfología o inmunofenotipo. Para realizar el diagnóstico, es necesario correlacionar el escenario clínico y la patología previa. Por último, es prudente poner cuidadosamente atención a la presentación clínica para ayudar a excluir leucemia/linfoma de células T del adulto, que puede expresar CD30, CD25, y los marcadores de linaje T. (Lu & Chang, 2011). II.2.7 Neoplasias histiocítica y dendríticas

Este grupo de neoplasias, incluyendo el sarcoma histiocítico, la histiocitosis de las células de Langerhans, el sarcoma de interdigitación de las células dendríticas, y el sarcoma de células dendríticas foliculares, es extremadamente raro. Muchos de ellos se pueden clasificar con un panel que incluye CD163, Langerina, CD21, CD35 y S100. En resumen, CD163 es positivo en el sarcoma histiocítico y la histiocitosis de células de Langerhans; Langerina en la histiocitosis de células de Langerhans solamente; CD21 y CD35 en el sarcoma de células dendríticas foliculares solamente; y S100 sin los otros marcadores en el sarcoma de interdigitación de las células dendríticas (Cuadro II.9). (Lau et al., 2004; Lau, Chu& Weiss, 2008; Nguyen et al., 2005; Pileri et al., 2002). La Langerina es una glicoproteína crucial para la formación de gránulos de Birbeck y es un marcador altamente sensible y específico para las células de Langerhans, el CD1a es una alternativa comparable. (Lau et al., 2008) El CD163 ha demostrado ser un marcador histiocítico más específico que el CD68 o la lisozima. Si el CD163 no está disponible, se puede utilizar también una combinación de estas últimas tinciones.(Lau et al., 2004; Nguyen et al., 2005)

Cuadro II.9. Neoplasias Histiociticas y Dendríticas.

CD163 Langerina CD21/CD35 S100 Sarcoma histiocitico Positivo Negativo Negativo Positivo/negativo Histiocitosis de las células de Langerhans

Positivo/negativo Positivo Negativo Positivo

Sarcoma interdigitante de las células dendríticas

Negativo Negativo Negativo Positivo

Sarcoma folicular de las células dendríticas

Negativo Negativo Positivo Negativo/positivo

Fuente: Lu & Chang, 2011.

Neoplasia blástica plasmacitoide de células dendríticas

Esta entidad, anteriormente linfoma blástico de células asesinas naturales, es una neoplasia rara que morfológicamente se asemeja a proliferaciones blásticas monomórficas tales como el LLB, la leucemia mieloide aguda, LCM blástico, y el linfoma de Burkitt. La afectación cutánea es casi universal, y la afección de la médula ósea y los ganglios linfáticos también se observa comúnmente. (Herling & Jones, 2007;

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Petrella et al., 2005) Estos tumores expresan el marcador dendrítico plasmocitoide CD123, así como el CD4, CD43, CD45, CD56 y CD68. Generalmente, la TdT es positiva, pero la mieloperoxidasa y los antígenos de las células B y T generalmente no se expresan. Los tumores con expresión de CD43 y la TdT incluyen a la leucemia mieloide aguda y el LLB. El CD123+ confirma el diagnóstico para neoplasia blástica plasmocitoide de células dendríticas. (Lu & Chang, 2011).

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PARTE III III.1 RESULTADOS

CUADRO III.1. PACIENTES CON LINFADENOPATÍAS QUE CLÍNICAMENTE FUERON DIAGNOSTICADOS COMO PROCESOS

LINFOPROLIFERATIVOS/HIPERPLASIAS SEGÚN EDAD Y SEXO. AÑOS 2008/2009

GRUPOS SEXO SEXO

ETAREOS M % F % TOTAL % 0-5 15 8.47 5 2.82 20 11.30

6 A 10 9 5.08 15 8.47 24 13.56 11 A 15 6 3.39 6 3.39 12 6.78 16 A 20 5 2.82 5 2.82 10 5.65 21 a 25 10 5.65 3 1.69 13 7.34 26 A 30 8 4.52 3 1.69 11 6.21 31 A 35 6 3.39 5 2.82 11 6.21 36 A 40 9 5.08 3 1.69 12 6.78 41 A 45 1 0.56 4 2.26 5 2.82 46 A 50 4 2.26 5 2.82 9 5.08 51 A 55 5 2.82 7 3.95 12 6.78 56 A 60 5 2.82 3 1.69 8 4.52 61 A 65 6 3.39 2 1.13 8 4.52 66 A 70 7 3.95 6 3.39 13 7.34 71 A 75 5 2.82 1 0.56 6 3.39 76 A 80 2 1.13 1 0.56 3 1.69 TOTAL 103 58.19 74 41.81 177 100.00

FUENTE: FODECYT 35-2008

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GRÁFICA III.1. DISTRIBUCIÓN DE CASOS POR GRUPOS ETÁREOS

Fuente: FODECYT 35-2008

GRÁFICA III.2. RELACIÓN ENTRE GRUPOS ETÁREOS Y SEXO


0 5 10 15 20 25

0-‐5

11 A 15

21 a 25

31 A 35

41 A 45

51 A 55

61 A 65

71 A 75

Distribución de casos por grupos etáreos

No de casos

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CUADRO III.2. ANTICUERPOS UTILIZADOS EN PRUEBAS DE INMUNOHISTOQUÍMICA PARA TIPIFICACIÓN DE PROCESOS

LINFOPROLIFERATIVOS/METASTASIS U OTROS CON DIAGNÓSTICO PREVIO DE LINFOMA/LINFADENOPATÍAS

ANTICUERPOS

(PRUEBAS) No. % ANTICUERPOS

(PRUEBAS) No. % CD30 80 4.90 MYO D1 4 0.24

FASCINA 19 1.16 MIOGENINA 4 0.24 CD15 19 1.16 MELAN A 5 0.31 CD3 166 10.17 S100 6 0.37 CD20 166 10.17 CD1a 1 0.06 EMA 81 4.96 TTF-1 3 0.18 CD45 169 10.35 Tiroglobulina 3 0.18 Ki67 63 3.86 Calcitonina 1 0.06

PAGF 1 0.06 CK7 4 0.24 CK 7 0.43 kappa/lambda 11 0.67

HMB45 6 0.37 PAX-5 21 1.29 TdT 58 3.55 Ciclina D1 (bcl-1) 66 4.04

CD68 2 0.12 CD23 8 0.49 CD 117 2 0.12 CD138 2 0.12

bcl-2 136 8.33 ALK 59 3.61 CD43 146 8.94 CD99 1 0.06 CD10 146 8.94 VIMENTINA 5 0.31 bcl-6 138 8.45 DESMINA 4 0.24 CD5 12 0.73 SFA 1 0.06 CK20 4 0.24 RE 1 0.06

Cromogranina 1 0.06 RP 1 0.06 TOTAL 1633 100.00


48

GR

AFI

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III

. 3 A

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CU

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S PA

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ICA

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Fuen

te:

FOD

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T 35

-200

8

49

CUADRO III. 3. LOCALIZACIÓN ANATÓMICA DE LAS LESIONES DIAGNOSTICADAS CLÍNICAMENTE COMO PROCESO

LINFOPROLIFERATIVO/LINFADENOPATÍAS.

LOCALIZACION ANATOMICA No. % AXILAR 6 3.39 BAZO 5 2.82 CAVIDAD ORAL Y PALADAR 4 2.26 CEREBRO 2 1.13 COLON Y VIA BILIAR 3 1.69 CUELLO 84 47.46 ESTOMAGO 6 3.39 HUESO Y MEDULA OSEA 11 6.21 INGUINAL 18 10.17 MAMA 2 1.13 MEDIASTINO 2 1.13 MESENTERIO 3 1.69 NASAL 1 0.56 OJO 1 0.56 PIEL 6 3.39 RETROPERITONEO 2 1.13 SUBMAXILAR 2 1.13 SUPRACLAVICULAR 5 2.82 TEJIDOS BLANDOS 7 3.95 TIMO 3 1.69 TORAX 4 2.26 TOTAL 177 100.00


GRÁFICA III.4. LOCALIZACION ANATOMICA DE LESIONES LINFOIDES

50


51

CUADRO III.4.INMUNOFENOTIPO, LINAJE Y ORIGEN DE LAS LESIONES Y NEOPLASIA CLINICAMENTE DIAGNOSTICADAS CLINICAMENTE COMO

LESIONES LINFOIDES

INMONOFENOTIPO, LINAJE Y ORIGEN No. %

LINFOMA NO HODGKIN INMUNOFENOTIPO B 65 36.72

LINFOMA NO HODGKIN INMUNOFENOTIPO T 4 2.26

ENFERMEDAD DE HODGKIN 19 10.73

HIPERPLASIA LINFOIDE O PROCESO INFECCIOSO 76 42.94

NEOPLASIA MIELOIDE 2 1.13

HISTIOCITOSIS DE CELULAS DE LANGERHANS 1 0.56

RABDOMIOSARCOMA ALVEOLAR 1 0.56

LIPOSARCOMA DEDIFERENCIADO 1 0.56

METASTASIS 8 4.52

TOTAL 177 100.00


52

GRÁFICA III.5.DIAGNÓSTICOS HISTOLÓGICOS DE LESIONES CLÍNICAMENTE

DEL TEJIDO LINFOIDE


53

CUADRO III.5. DIAGNÓSTICO HISTOLÓGICO POR INMUNOFENOTIPO

INMUNOFENOTIPO DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS DEL TEJIDO LINFOIDE TOTAL % B % T %

Linfoma cutáneo de células grandes inmunofenotipo B 3 4.35 3 4.35 --- 0.00

Linfoma de células B de la zona marginal 1 1.45 1 1.45 --- 0.00

Linfoma de células del Manto 1 1.45 1 1.45 --- 0.00

Linfoma de células grandes anaplásico 4 5.80 4 5.80 --- 0.00

Linfoma de Tejido Linfoide Asociado a Mucosas MALT 1 1.45 1 1.45 --- 0.00

Linfoma difuso de células grandes B 34 49.28 34 49.28 --- 0.00

Linfoma difuso de células grandes B rico en histiocitos 1 1.45 1 1.45 --- 0.00

Linfoma difuso de células grandes inmunofenotipo T 2 2.90 1 1.45 1 1.45

Linfoma difuso de células grandes primario del Sistema Nervioso Central 1 1.45 1 1.45 --- 0.00

Linfoma folicular grado histológico 2 inmunofenotipo B 3 4.35 3 4.35 --- 0.00

Linfoma Linfoblástico 10 14.49 8 11.59 2 2.90

Linfoma linfocitico de células pequeñas 4 5.80 4 5.80 --- 0.00

Linfoma sinonasal angiocéntrico 1 1.45 --- 0.00 1 1.45

Linfoma tipo Burkitt 1 1.45 1 1.45 --- 0.00

Linfoma tipo Burkitt intestinal 2 2.90 2 2.90 --- 0.00

TOTAL 69 100.00 65 94.20 4 5.80 Fuente: FODECYT 35-2008

54

GRAFICA III. 6. DIAGNÓSTICOS HISTOLÓGICOS ASOCIADOS A

INMUNOFENOTIPO


55

CUADRO III.6. PATRONES HISTOLÓGICOS DE HIPERPLASIA

DIAGNÓSTICO DE HIPERPLASIA No. %

Hiperplasia de pulpa blanca y pulpa roja 3 3.95

Hiperplasia difusa 4 5.26

Hiperplasia difusa asociada a VIH 1 1.32

Hiperplasia difusa y sinusoidal 1 1.32

Hiperplasia folicular 22 28.95

Hiperplasia folicular con microabscesos neutrofílicos 1 1.32

Hiperplasia folicular y difusa 13 17.11

Hiperplasia folicular y sinusoidal 17 22.37

Hiperplasia sinusoidal 7 9.21

Hiperplasia tímica 3 3.95

Linfadenitis aguda con necrosis 1 1.32

Linfadenitis granulomatosa 3 3.95

TOTAL 76 100.00


56

GRÁFICA III.7. PATRONES HIPERPLÁSICOS DE HIPERPLASIA LINFOIDE


57

Con respecto a los grupos etáreos que se observaron en el cuadro III.1, se encontró que del total de 177 pacientes, 103 fueron del sexo masculino con 58.19% y 74 del sexo femenino con 41.81 %. La edad donde más frecuentemente se diagnosticaron lesiones correspondió al grupo etáreo comprendido entre 0-10 años, sin embargo hay otro pico de incremento en las enfermedades linfoides en el grupo etáreo de 21 a 25 años y de 36 a 40 años. Estos hallazgos también se aprecian en las gráficas III.1 y III.2. En el cuadro III.2 puede observarse que los anticuerpos mayormente utilizados correspondieron al CD30, CD3, CD20, EMA, CD45, Ki67,TdT, bcl-2, CD43, CD10, bcl-6, bcl-1, y ALK, ya que la mayor parte de neoplasias fueron de células grandes. Los tres anticuerpos mas utilizados en las pruebas fueron CD3 con 166 pruebas que correspondió al 10.17%, CD20 con 166 pruebas que correspondió al 10.17%, CD45 que correspondió al 10.35%. Estos resultados también se visualizaron en la gráfica III.3. Con respecto a la localizaciónanatómica de las lesiones del tejido linfoide se observó que la mayor parte de las mismas se localizaron en la región del cuello con un 47.46% de todas las lesiones, observándosetambién 18 lesiones en la región inguinal con un 10.17% y 11 lesiones en hueso y médula ósea con un 6.21 %. Las lesiones menos frecuentes fueron en región nasal y ojo. En el cuadro III.4 se ve que el inmunofenotipo de neoplasias mayormente diagnosticado fue el de linfomas no Hodgkin de células B con un 65 casos en las neoplasias, que correspondió a un 36.72%, sin embargo la mayor parte de entidades correspondieron a las hiperplasias linfoides/procesos infecciosos (no neoplásicas) con un número de 76 pacientes que corresponde al 42.94% de las lesiones estudiadas. La entidad neoplásica que también fue importante en este estudio fueron la enfermedad de Hodgkin con un total de 19 pacientes que correspondió a un 10.73% del total de los mismos. Se incluyeron también las neoplasia mieloides, la histiocitosis de células de Langerhans, un caso de rabdomiosarcoma alveolar, un caso de liposarcoma rediferenciado, y un total de ocho casos de metástasis a ganglio linfático ya que clínicamente estas lesiones fueron consideradas en su momento como neoplasias de tejido linfoide y fue necesaria su inmunotipificación para un adecuada diagnóstico. Se observó que del total de los diagnósticos de neoplasias malignas con respecto a los linfomas no Hodgkin, la mayor parte fueron los linfomas difusos de células grandes inmunofenotipo B con un total de 34 pacientes que correspondieron al 49.28%. Con respecto a los patrones histológicos de la hiperplasia se observó que el patrón predominante fue la hiperplasia folicular con 22 casos (28.95% del total de hiperplasias), este tipo de hiperplasias está relacionada con procesos infecciosos inespecíficos, tanto la linfadenitis granulomatosa como la linfadenitis aguda con necrosis puede estar asociada a microorganismos específicos, tales como bacterias u hongos. Se observaron tres casos con hiperplasia de pulpa blanca y congestión de pulpa roja que se observó en el bazo.

58

III.1 Discusión de resultados

En el cuadro III.1 que muestra los grupos etáreos pudo observarse que la mayor cantidad de lesiones se dió en niños y pacientes, jóvenes, sin embargo, este grupo etáreo se considera que fue el más numeroso debido a que la mayor parte de entidades fueron hiperplasias y procesos infecciosos, que se dan predominantemente en este grupo etáreo. Luego de este grupo etáreo se ve una distribución mas o menos homogénea en la vida adulta como en los pacientes del grupo etáreo de 66 a 70 años ya que los procesos neoplásicos tienen una distribución etárea uniforme en todas las edades. La relación entre el sexo femenino y masculino fue mayor en el sexo masculino, como ha sido descrito en la literatura para este tipo de lesiones. Se observó que los anticuerpos mayormente utilizados fueron el CD3, CD20, CD45, CD30, CD15, Ki67, Fascina. Los anticuerpos mayormente utilizados fueron aquellos que se utilizaron en el panel para neoplasias linfoide de células grandes, ya que para iniciar con la inmunotipificación es necesario partir desde el aspecto morfológicos de la neoplasia y luego realizar el panel. Varios de los anticuerpos utilizados también fueron para poder clasificar el origen de algunas de las neoplasias con respecto a si se originan en el centro folicular del ganglio linfático. Otros anticuerpos utilizados fueron para descartar procesos neoplásicos indiferenciados y clasificar las neoplasias como de origen linfoide. Tanto el anticuerpo CD20 (10.71% de las pruebas), CD3 (10.17% de la pruebas) , CD45 (10.35%) que fueron los mas utilizados son importantes para inmunotipificar si se trata de neoplasias del linaje B o T. La localizaciónanatómica mas frecuente fue a nivel de la región del cuello con el 47.46%, así como la región inguinal, tanto para los procesos neoplásicos como para las hiperplasias linfoides. Se observaron también sitios extranodales tales como cavidad oral, paladar, cerebro, estómago, área nasal, ojo, piel y región submaxilar. La mayor parte de las lesiones malignas fueron los linfomas no Hodgkin inmunofenotipo B con 65 casos que corresponden al 36.72%, la enfermedad de Hodgkin mostró una frecuencia de 19 casos con un 10.73% del total de las lesiones, siendo estas dos neoplasias las más frecuentemente observadas en las lesiones del tejido linfoide. Sin embargo la mayor parte delas lesiones correspondieron a hiperplasias linfoides o procesos infecciosos benignos, con 76 casos que representaron al (42.94%). Estos hallazgos son similares a los descritos en la literatura para linfomas no Hodgkin. Con respecto a los diagnósticoshistológicos relacionados con el inmunofenotipo de los linfomas no Hodgkin mostró que la entidad más frecuente fue el Linfoma de Células Grandes Inmunofenotipo B, el cual también se ha visto en otros estudios como la neoplasia más frecuente en este tipo de lesiones. Es sumamente importante contar con la inmunotipicación de este tipo de neoplasias para poder dar un tratamiento quimioterapéutico adecuado. Con respecto a los procesos linfoides no neoplásicos (hiperplasias) se observó que el patrón de mayor frecuencia fue la hiperplasia folicular, segunda de la mixta con patrón folicular y sinusoidal, luego la que muestra un patrón folicular y difuso, todas estos patrones son inespecíficos. Se observótambién un patrón de hiperplasia sinusoidal que también es inespecífico. Los patrones de hiperplasia figura asociado a VIH, así como la hiperplasia folicular

59

con microabscesos neutrofílicos, la linfadenitis aguda con necrosis y la linfadenitis granulomatosa tuvieron como origen la infección de bacterias y la asociado a VIH es por inmunocompromiso. Es necesario hacer notar que la única forma de realizar un diagnóstico adecuado en este tipo de lesiones es por medio de los estudios de inmunohistoquímica, ya que solo con el estudio morfológico no es posible llegar a un diagnóstico específico en este tipo de entidades.

60

PARTE IV IV.1 CONCLUSIONES 1. Se determinó el inmunofenotipo en las neoplasias de origen linfoide y linfadenopatías de los

pacientes que consultaron al Hospital Roosevelt y de los casos diagnosticados previamente en Hospitales Departamentales de la Red Nacional o en otros centros que sean referidos al Hospital Roosevelt para su tratamiento.

2. El número de lesiones del tejido linfoide en el Hospital Roosevelt fue un total de 177 casos

en el periodo correspondido entre el 1 de enero de 2008 al 31 de diciembre de 2009.

3. Se diferenciaron los procesos del tejido linfoide de origen reactivo (no malignos) que fueron un total de 76 (42.94%), casos que no mostraron malignidad por medio de la utilización de marcadores inmunohistoquímicos y la morfología histológica.

4. Con respecto al inmunofenotipo se observó que la mayor parte de las neoplasias linfoides

correspondieron al linaje de celulas B con 65 casos que correspondieron a un 36.72%, las neoplasias de celulas T fueron cuatro neoplasias que correspondieron al 2.26%, la enfermedad de Hodgkin mostro un porcentaje del 10.73%.

5. Se implementaron las técnicas de inmunohistoquímica para tipificar las neoplasias. 6. Se dió y se seguirá dando servicio gratuito a los pacientes que consulten en casos de

neoplasias malignas y/o hiperplasias del tejido linfoide al Hospital Roosevelt. 7. Se logró la cooperación con el Ministerio de Salud Pública y Asistencia Social para poder

implementar de aquí en adelante un servicio a los pacientes de la Red Nacional de Salud Pública.

61

IV.2 RECOMENDACIONES

1. Se recomienda que todos los especímenes de ganglio linfático sean fijados con formol neutro para evitar un exceso de enmascaramiento de antígenos los cuales deben ser identificados por los anticuerpos de inmunohistoquímica.

2. Es necesario que antes de la utilización de los marcadores de inmunohistoquímica

morfológicamente deben de ser clasificados como neoplasias o hiperplasias.

3. Una vez clasificados morfológicamente debe procederse a realizar los estudios de inmunohistoquímicaen base a la morfología, identificando las lesiones de células grandes, de células pequeñas, hiperplasias y enfermedad de Hodgkin, a partir de la morfología se realizan paneles de inmunohistoquímica para tipificar las lesiones.

4. Para un adecuado diagnóstico inmunohistoquímico debe haber un adecuado estudio

histológico previo por lo que se recomienda únicamente seleccionar los tejidos que no presenten artefacto de procesamiento ya que esto daría resultados inadecuados en los estudios de inmunohistoquímica.

5. Tener una adecuada correlación clínica y con otros estudios de laboratorio para lograr un

mejor diagnóstico.

6. A partir del presente estudio se determinó que la mayor parte de neoplasias del tejido linfoide son linfomas no Hodgkin inmunofenotipo B por lo que es necesario contar con los medicamentos necesarios para este tipo de neoplasias en las instituiciones públicas que atienden estos pacientes.

62

IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Agnarsson, B.A. & Kadin, M.E. (1989). The immunophenotype of Reed- Sternberg cells. A

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PARTE V

V. INFORME FINANCIERO

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