Conservación de Cepas de Colección

Bioq. María de los Angeles SosaInstituto de Medicina Regional – UNNEInstituto de Medicina Regional  UNNE

Resistencia ‐ Chaco

¿Qué es una¿Qué es una Colección de cultivos¿Qué es una¿Qué es una Colección de cultivos microbianos?

Son entidades en donde se realizan una serie de actividades cuyo objetivo principal es preservar , 

mantener y distribuir  cepas  con sus características originales.

••Colecciones de investigaciónColecciones de investigaciónCEREMIC, IMRCEREMIC, IMR--M, M, MalbránMalbrán

••Colecciones industriales Colecciones industriales Colección Instituto Colección Instituto FinlayFinlay (Cuba)(Cuba)••Colecciones de servicioColecciones de servicioColecciones de servicioColecciones de servicioATCC, CBSATCC, CBS

Cultivos puros  evitar las contaminacionesCultivos puros, evitar las contaminacionesSobrevida del 70 al 80% del inoculoGenéticamente establesGenéticamente estables

Conservación de cepasConservación de cepasMétodos de conservación a largo plazo:• Liofilización• Criopreservación (N2 líquido,  ‐30, ‐80º C)

Métodos de conservación alternativosMétodos de conservación  alternativos• Transferencia periódica. 

‐ Bajo capa de aceite mineral• Conservación en agua destilada Método de CastellaniConservación en agua destilada . Método de Castellani

Métodos de conservación restringidos• Desecación en papel de filtrop p• Desecación en suelo, arena, silica gel• Secado Liquido o L‐Drying

Métodos de conservación a largo plazo 

CriopreservaciónCriopreservación

• La congelación disminuye la actividad metabólica de una célula por l di i ió d di iblla disminución de agua disponible.

• Se guardan en ampollas selladas ( vidrio o plástico: crioviales) con un agente crioprotectorun agente crioprotector

• Es el mejor método de conservación a largo plazo.

• Requiere aparatos especiales, es honeroso

S i i d í NL• Suministro constante de energía o NL.

• No apto para el envío de las cepas. 

Factores que influyen en la viabilidad y b l d d d lestabilidad de las cepas

• Temperatura de almacenamiento:Temperatura de almacenamiento: Nitrógeno líquido a  –195ºC, o bien en su fase gaseosa a –140ºCgaseosa a  140 C.

Ultrafreezer de hasta –96ºC. 

Congelador –20ºC –40ºC no son aconsejablesCongelador   –20ºC , –40ºC, no son aconsejables para algunos grupos .

• Alta densidad celular:• Alta densidad celular:  Usar entre 107 ‐ 104  células/ml: Lisis de parte del inóculo. 

Edad de las célulasEdad de las células

• Que mo. se va a conservar, gran variabilidad. , gVelocidad de crecimiento promedio (18 hs, 1 semana, 20 días)

• Deben estar maduras, lo ideal es preservarla en fase log tardía o al inicio de su fasefase log tardía o al inicio de su fase estacionaria.mayor resistencia a la congelacion y descongelacion. 

• Si es una cepa que tiene un estado de esporulación hacerlo en ese momentoesporulación, hacerlo en ese momento.

Nucleación cristalinaNucleación cristalina

• Una Velocidad de Congelación de 1 a 10 º C/ming /minimiza el efecto de la concentración de los solutos durante la nucleación. 

• Congelación paulatina evita la Ruptura celular!!!

Crioprotector:Crioprotector: • Son compuestos químicos no tóxicos con facilidad

para atravesar la membrana celular y acumularse intracelularmente.

• reducen al mínimo los efectos perjudiciales del aumento de la concentración de solutos y la formación yde cristales de hielo.

• Examinar sus propiedades tóxicas (DMSO>glicerol)• Los penetrantes mejores que los no penetrantes• Los penetrantes mejores que los no penetrantes

Los mas usados:Glicerol 10%Sacarosa 7% + inositol 7%Leche descremada 10% (vol/vol)DMSO 5% (vol/vol)DMSO 5% (vol/vol)

Período de equilibrio:Período de equilibrio: se inocula en el medio liquido, se incuba hasta la fase estacionaria centrifugar se retira ella fase estacionaria, centrifugar, se retira el pellet y se resuspende en 2‐5ml caldo, añadir el crioprotectorel crioprotector.• Tiempo: 30 minutos a Tº ambiente. El agente

crioprotector puede ser tóxico para las células si el tiempo de equilibrio es demasiado largo.

• Fraccionamiento en viales

“Lote de reserva”

“Lotes de trabajo”

Freezer -80ºC Freezer -80ºCIMR UNNE RCIA CHACO

LABORATORIO CENTRAL DE CORRIENTES CORRIENTES

Suministro especialSuministro especial de energía eléctrica

Espacio físico sp c o s corefrigerado

Estabilizador, elevador de tensión

Grupo electrógeno

Reconstitución (deshielo)Reconstitución (deshielo)

• Velocidad y temperatura de descongelado:Velocidad  y temperatura de descongelado: 

D l ió á id B ñ M í 37ºC• Descongelación rápida: Baño María a 37ºC. 

• Crioviales: – Criotolerancia, tapa a rosca y o‐ring. Máxima capacidad de 

almacenamiento y facilidad de manejo. 

N ll l 0 5 1 0 l– No llenar, colocar entre 0,5 a 1,0 ml 

de la suspensión de célular. 

CRIOPERLASCRIOPERLASPerlas de cerámica  que se impregnan con la solución celular a congelar y al reconstituir b t l i b lit i id d d d l l tbasta con emplear una o varias bolitas sin necesidad de descongelar el resto.

Recuperación post congeladoRecuperación post congelado

• STREESS!! Una vez recuperadas nunca utilizar estos• STREESS!! Una vez recuperadas nunca utilizar estos microorganismos  inmediatamente en pruebas fisiológicas realizar 1 o 2 pasajes previosfisiológicas, realizar 1 o 2 pasajes previos.

• Transferir a medios adecuados (caldos o medios i d )agarizados)

• Tiempo de incubación: puede disminuir la velocidad de crecimiento.

CriopreservaciónCriopreservación

Ventajas:jViabilidad 7 a 10 añosNo se detectaron cambios genéticosApto para una gran variedad de mo.Simple, pre‐tratamiento mínimo.

Desventajas:Equipamiento y mantenimiento $$$Equipamiento y mantenimiento $$$.Criotubos, racks para criotubos, etc.Monitoreo de la Tº.

d í lé l óSuministro constante de energía eléctrica, grupo electrógeno.

Liofilización

•Combina una congelación (‐60°C)  y luego secado al vacío. (Secado por sublimación)

•Para bacterias levadurasPara bacterias, levaduras, esporulados y virus. 

•Mayor sobrevida para bacterias gram (+) que Gram (‐). 

•Viabilidad hasta 30 años. •Espacio reducido los liófilos•Espacio reducido, los liófilos pueden almacenarse a temperatura ambiente (18ºC), con lo cual su envío es muy cómodo.

LioprotectoresLioprotectores

• No utilizar glicerol, genera liófilos muy viscosos. g , g y• No DMSO porque es algo tóxico, y al concentrarse por la evaporación del agua puede dañar a las célulascélulas.

• Si:Inositol 5% la mayoría de las bacteriasInositol 5% la mayoría de las bacteriasProteosa peptona‐glicerol para bacterias,leche descremada 10‐20 % para hongos y ti i tactinomicetos 

glutámico‐glutamato para las bacterias lácticasSacarosa 7% + peptona 7%Sacarosa 7%   peptona 7%

ConsideracionesConsideraciones

• Tipo de microorganismo

• Inoculo: 108‐109 células/ml bacterias, 105‐107 hongos

• Tº durante la sublimación: lo más baja  posible, sin subir por encima de –50ºC.

• Grado de deshidratación alcanzado: humedad menor al 1% 

• Atmósfera de oxígeno en el tubo: cerrados al vacío para evitar la i d í ( hid ió id ió )presencia  de oxígeno (rehidratación, oxidación)

• Condiciones de almacenamiento: En oscuridad y la Tº debe ser constante 18ºC o refrigerarconstante, 18ºC  o refrigerar.

Reconstitución del liófiloReconstitución del liófilo

Pasos:Pasos:Se toman los viales de la parte superior, cubren congaza para evitar explosión al ingreso de aire.g p p g

Se inyectan 0.1‐0.4 ml de medio enriquecido conpipeta Pasteur o jeringa.

Se agita y se disuelve, luego transferir a el medio decultivo adecuado.

Mayor sobrevida, al mantener elevada laPresion osmótica durante la rehidratación!!

Liofilización

Ventajas:Viabilidad y longevidad elevada Promedio 20 añosNo se detectaron cambios genéticosApto para una gran variedad de mo.Fácil manipuleo y transporte de los liófilosProtección total ante posibles contaminantesProtección total ante posibles contaminantesProducción a gran escala

D t jDesventajas:Equipamiento inicial y mantenimiento $$$.Muchos mo. no resistenExisten algunos daños genéticos y/o selecciónLaboriosoRequiere personal especializado

é d d óMétodos de conservación alternativos

f i iódiMétodos de conservación

Transferencia periódica• Método común de conservacion que consiste en la q

resiembra periódica del cultivo en un medio fresco.• El intervalo de transferencia varia con el mo, debiendo 

onsiderarse el medio de lti o ade adoconsiderarse el medio de cultivo adecuado• Mantener a T amb o 4º C durante 15 días a 2 meses.• Bajo capa de aceite mineral o vaselina estéril ( Evita laBajo capa de aceite mineral o vaselina estéril ( Evita la 

desecación y ↓ metabolismo) Refrigerado, mantiene hasta 3 años.

N i i (1 ñ )Neisseria sp. (1 año)Salmonella sp (35 años)

ConsideracionesConsideraciones

Retardar el envejecimiento alargando los eta da e e ejec e to a a ga do osperiodos entre dos resiembras: 

↓Inóculo↓nutrientes del medio (Agar min,  agar cepa)inocular en profundidad y no en estría, los anaerobios facultativos crecen más rápido en presencia de O2facultativos crecen más rápido en presencia de O2 (productos tóxicos)Almacenar a 4ºC‐8ºC.

• Los  mo. muy aerobios no se pueden guardar en tubos completamente cerrados.

T f i iódiMétodos de conservación

Transferencia periódicaVentajas: 

Viabilidad: 2 ó 3 años.No requiere equipamiento especializado.No “estress” Rehabilitación + rápida.

Desventajas:Variaciones genéticas!!!Variaciones genéticas!!!Deshidratación. Contaminación. Supervisión técnica constante. Espacio físico de almacenamiento.

Método de CastellaniMétodos de conservación

Método de Castellani

• Es un método muy utilizado con altos porcentajes de viabilidad (hongos filamentosos, levaduras y algunas bacterias)

• Suspensión de bacterias, levaduras, esporas  o bloques p , , p qde agar en agua destilada estéril o agua de mar.

• Inoculo menor a 104‐105 células/ml para bacterias y levaduras.levaduras. 

• Tº amb y a 4ºC. 

Ej: Candida sp y DermatofitosEj: Candida sp y Dermatofitos.

Método de CastellaniMétodos de conservación

Método de Castellani

Ventajas:Viabilidad 5 años o más.Almacenamiento : mesada o heladera. No contaminación con ácaros.No contaminación con ácaros.Alto % de recuperación. Bajo % variaciones genéticas.

DesventajasDesventajas:Estabilidad de los caracteres es buena (?? Virulencia, poder fermentativo)P l dPersonal entrenado.Tubos con o‐ring (deshidratación).Solo cepas con buena esporulación.

Métodos de conservación RestringidosRestringidos

Secado líquidoo

Leche descremada 5%

•Bacterias y levadurasBacterias y levaduras•TRANSPORTE•Viabilidad 2 o 3 años

Desecación en Silica gelDesecación en Silica gel

M b h b i !!!Muy bueno para hongos y bacterias!!!Pasos:• Preparación del inoculo 109 – 1010 cél/mlPreparación del inoculo 10 10•Distribución de la suspensión a disecar sobre la silica gel esterilizada a 160º C 3 horas (cambio de color)horas (cambio de color)

•Colocar e en disecador 12 horas a 4ºC•Distribución de los gránulos en tubos de polipropileno.•Congelado.•Reconstitución (sacar 1 granulo)Reconstitución (sacar 1 granulo)

i d l l íMicoteca del Dpto. Micología

Instituto de Medicina Regional

Directores: Gustavo GiusianoIMR-M

Directores: Gustavo Giusiano –Magdalena Mangiaterra

Curadores: María de los Angeles Sosa

Mariana Fernández

P l Té i Lili AlPersonal Técnico: Liliana Alegre

Departamento de Micología Instituto de Medicina Regional

Repique en Medio Pruebas de Pruebas deRepique en Medio Dixon o LN

(Purificación)

Pruebas de identificación

presuntiva

Pruebas de identificación

definitiva

Registro manualRegistro Fraccionamiento y

archivo Registro manual computarizado archivo

Etiquetado

Controles Controles periódicos de periódicos de

viabilidadviabilidadControl de Control de inventarioinventarioviabilidad viabilidad

Paso 1: Repique en Medio Dixon o LN

(Purificación)

La incubación se realiza en atmosfera húmeda a Tº promedio 32ºC, 5 a 7 días.

( )Considerar la velocidad de crecimiento:

Rápida ( < 3 días)

Media (5-7 días) Lenta > 7 dias

M pachydermatis M furfur M M globosa M restricta M obtusaM.pachydermatis M furfur, M sympodialisM. slooffiae

M. globosa, M. restricta, M. obtusa,M japonica, M. dermatis, M. nanaM. yamatoensis, M. equina, M. capraeM. cuniculi (LN > 7dias y mDA ( 14 días)

Paso 2: Pruebas de identificación

presuntiva

Paso 3: Identificación

definitiva

EXTRACCION

Shock térmico

Cepa aislada

-Shock térmico

Amplificación

PCR screening

Amplificación26s ARN ribosomal

RFLP

Enzimas Cfo I y MboIf y

Corrida electroforéticaPCR RFLP 1

(CfoI)

Paso 4: RegistroPaso 4: Registro manual

A) Nombre (identificatorio del cultivo)

B) Nombre y dirección del depositante.

C) Fuente, sustrato o huésped de donde se aisló o derivó y fecha de aislamiento.de aislamiento.

D) Origen geográfico (lugar de origen.)

E) Número del material según el depositante o número de otrasE) Número del material según el depositante, o número de otras colecciones si fue depositado en otra parte.

F) Medio y condiciones de crecimiento, condiciones de almacenamientoalmacenamiento.

G) Hoja de seguridad (Información de riesgos)

Base de datosPaso 5: Registro computarizadoBase de datos

Fraccionamiento y archivo

“Lote de reserva”

“Lotes de trabajo”

Freezer -80ºC Freezer -80ºCIMR UNNE RCIA CHACO

LABORATORIO CENTRAL DE CORRIENTES CORRIENTES

Suministro especialSuministro especial de energía eléctrica

Espacio físico sp c o s corefrigerado

Estabilizador, elevador de tensión

Grupo electrógeno

Fraccionamiento y archivo

CONTROLES DE CALIDADCONTROLES DE CALIDADCONTROLES DE CALIDAD:CONTROLES DE CALIDAD:

Realizarlo ANTES Y DESPUÉS DE LA PRESERVACIÓN.

DE VIABILIDAD Y PUREZA

DE ESTABILIDAD DE CARACTERES RELEVANTES.

REQUERIMIENTOS PARA EL CRECIMIENTO.REQUERIMIENTOS PARA EL CRECIMIENTO.

MÉTODOS DE PRESERVACIÓN.

FRECUENCIA DE CONTROLES DE MANTENIMIENTO (1 control al año)

Control de viabilidad

MEDIO MEDIO LeemingLeeming NotmanNotman (14 días a 32ºC como.max)(14 días a 32ºC como.max)gg ( )( )

% de recuperación de viables = % de recuperación de viables = Colonias /INOCULO (10Colonias /INOCULO (1044) = % ) = %

Control de inventario

Información mínima requeridaInformación mínima requerida::Metodología de preservaciónMetodología de preservaciónLocalización e identificación del material almacenado Localización e identificación del material almacenado (en (en que lugar físico)que lugar físico)q g )q g )Fecha de conservación Fecha de conservación Numero de pasajes Numero de pasajes

Acrecentar el número de cepas de la colecciónAcrecentar el número de cepas de la colección.

Aplicar un 2do método de conservación: Liofilizar las cepas que puedan soportar esta metodología.

Completar la caracterización de las existentes.

Incrementar el personal técnico Incrementar el personal técnico 

Certificar las cepas

Promover la sustentabilidad 

Fomentar cambios de política en las Instituciones (Universidad, SeCyT)

Trabajar en red (FELACC).

RESUMENRESUMEN 

BacteriasBacterias

Transferencias simples: algunos mesesTransferencias simples: algunos mesesAlmacenamiento con aceite mineral: 1‐2 añosC l ió 20°C 1 3 ñCongelación a ‐20°C: 1‐3 añosSecado y freezado en silica gel: 6 añosCongelación a ‐70°C: 1‐10 añosN liq y liofilización: hasta 30 años

BibliografíaBibliografía• Beech, F.W.; and Davenport, R.R. "Isolation, purification and maintenance of yeasts". Methods in Microbiology. Vol

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Institute. CAB International (1994).•

AgradecimientosD t d Mi l íDpto de Micología 

IMR

Dr. Gustavo Giusiano

Lic. Magdalena Mangiaterra

Bioq. Florencia Rojas 

Bioq. Mariana Fernandez

Bioq Maria Emilia CattanaBioq. Maria Emilia Cattana

Bioq. Sergio Toma Vanacore

Tec. Liliana Alegre