Consideraciones Prácticas Acerca de La Calidad Del Semen

REDVET. Revista electrnica de Veterinaria. ISSN: 1695-7504 2009 Vol. 10, N 8

Consideraciones prcticas acerca de la calidad del semen de conejos aplicado en estudios de toxicologa de la fertilidad. http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n080809/080910.pdf

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REDVET Rev. electrn. vet. http://www.veterinaria.org/revistas/redvet - http://revista.veterinaria.org Vol. 10, N 8, Agosto/2009 http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n080809.html

Consideraciones prcticas acerca de la calidad del semen de conejos aplicado en estudios de toxicologa de la fertilidad (Practice considerations about the semen quality of rabbits for applied in fertility toxicology study).

Arencibia Arrebola Daniel Francisco: Centro Nacional de Investigaciones Cientficas (CNIC), Avenida 25 y 158, Cubanacn, Playa, Apartado Postal 6414, Ciudad de la Habana, Cuba. Email [email protected] | Rosario Fernndez Luis Alfredo: Centro de Qumica Biomolecular (CQB), Calle 200 y Avenida 21, Atabey, Playa, Apartado Postal 16042, Ciudad de la Habana, Cuba.

Resumen El conejo domstico es un descendiente del conejo salvaje que habitaba en el oeste de Europa y en el noroeste de frica. En los estudios de toxicologa experimental se destaca su uso en la determinacin de toxicidad por irritacin drmica, ocular, toxicologa de vacunas, adems de ser bsico como modelo animal para determinar compuestos teratognicos, los cuales influyen tanto en la fertilidad de la hembra como en la del macho. Los mtodos para la valoracin de la calidad del semen, tanto para la inseminacin artificial como en la investigacin, estn sufriendo un constante desarrollo para intentar estimar con mayor precisin la fertilidad de los machos. Desafortunadamente, las valoraciones de laboratorio no predicen con exactitud la fertilidad y tampoco se obtiene una repetitividad de unos anlisis a otros, debido a la subjetividad de muchas de dichas valoraciones. El objetivo de este trabajo es la confeccin de una gua terico-prctica que permita realizar estudios del semen en conejos de la raza Nueva Zelanda Blanca, aplicado a la temtica de toxicologa de la fertilidad. Trataremos los temas de induccin del celo en las hembras, condiciones y mtodo para la extraccin del semen, pruebas macroscpicas y microscpicas del semen, valoracin del peso de rganos y examen anatomopatolgico. Todas las pruebas descritas aportan datos que nos indicarn una disminucin de la calidad del semen, pero debemos realizar valoraciones que nos aporten sencillez, rapidez y que sean econmicamente viables; para ello cada investigador debe utilizar aquellas que mejor se adapten a sus condiciones de trabajo. Palabras clave: semen | fertilidad | conejo | pruebas microscpicas | toxicidad.



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Abstract The domestic rabbit is descendend from the wilds rabbits was to inhabited of western Europe and Northwestern Africa. The rabbits is very usefull in the experimental Toxicology study, in dermal irritation, ocular irritation and the vaccines Toxicology, beside is a basic animal models in teratogenicity evaluation of the pharmaceutics products, that its influence in the female and male fertility. The methods of semen quality valuation in artificial insemination and research were suffering a constant development to estimate with more precision the males fertility. Unfortunately, the laboratory valuations don't predict with accuracy the fertility and not obtained the repetitive of some analyses to other, because of the subjectivity of many valuations. The objective of this work is the making of a theoretical-practice guide that allows to carry out studies of the semen in rabbits, (New Zealand White breed), applied to the fertility toxicology thematic. We will treat the topics of the zeal induction in the females, conditions and method for the semen extraction, macroscopic and microscopic semen tests, organs weight valuation and anatomopatologic exam. All the described tests contribute data that will indicate a decrease of the semen quality, but we should carry out valuations that contribute simplicity, speed and they are economically viable; the researcher should be use the best option for his work conditions. Key words: semen| fertility | rabbit | microscopic test | toxicity.

Introduccin El conejo domstico es un descendiente del conejo salvaje que habitaba en el oeste de Europa y en el noroeste de frica. Est catalogado como uno de los mamferos de mayor utilidad en el mundo en todos los campos del saber, dado por su gran prolificidad y adaptabilidad a diferentes condiciones de manejo, salud, alimentacin y condiciones ambientales en todos los continentes.1 Se plantea que el conejo domstico se asemeja a los roedores en muchos aspectos. En los estudios de toxicologa experimental se destaca su uso en la determinacin de toxicidad drmica, ocular adems de ser bsico como modelo animal para determinar compuestos teratognicos, que influyen sobre todo en la fertilidad tanto en la hembra como en la del macho, participando en la formacin del nuevo individuo, 2 se conoce con gran precisin el tiempo en que se realiza la maduracin del ovocito, implantacin y bases sobre fertilizacin tanto en los parmetros fisiolgicos de la hembra como en el macho.3

Los mtodos para la valoracin de la calidad del semen, tanto para la inseminacin artificial como a nivel de investigacin, estn sufriendo un



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constante desarrollo para intentar estimar con mayor precisin la fertilidad de los machos reproductores. Desafortunadamente, las valoraciones de laboratorio no predicen con exactitud la fertilidad y tampoco se obtiene una repetitividad de unos anlisis a otros, debido en gran parte a la subjetividad de muchas de dichas valoraciones.4 La solucin pasara por superar esta subjetividad aumentando el nmero de experimentos. Uno de los mtodos ideales para analizar la capacidad fecundante y/o fertilidad de un macho consiste en el estudio del semen, adems de lgicamente la capacidad de producir gestaciones.5 La obtencin y valoracin espermtica ha de ser rpida y eficaz para poder conservar la calidad y capacidad fecundante del semen durante cada una de estas determinaciones.6

Para lo cual nos trazamos como objetivo de nuestro trabajo la confeccin de una gua terico-prctica que permita realizar estudios del semen en conejos, aplicados a la temtica de fertilidad, para el uso en laboratorios de toxicologa experimental siendo esta una herramienta til que ayude a la valoracin preclnica de nuevos productos y/o ingrediente activo en este campo del saber. Desarrollo Antecedentes y Justificacin del Estudio: Para introducir un producto sea un frmaco, vacuna, fertilizante, en el mercado es necesario cumplir con leyes y regulaciones, dentro de ellas se destacan los estudios de Toxicologa Experimental o como todos conocen los estudios de Toxicologa Preclnica. En el caso de productos naturales las exigencias son an mayores. Cuando este producto va a ser administrado a embarazadas, mujeres y hombres en edad frtil por un prolongado periodo de tiempo es necesario realizar estudios de Toxicologa de la reproduccin. Estos estudios estn divididos de una forma metodolgica y dinmica en tres segmentos (Fertilidad, Teratognesis y Toxicidad peri-postnatal), as como estudios multigeneracionales.7, 8 Por lo general al presentar nuestros resultados a las instituciones reguladoras la mayora de los estudios de este tipo van encaminados a determinar disfunciones en la hembra, solo tomando al macho en el apareo, midiendo la libido sexual, nmero de hembras preadas etc. En ningn caso se hace alusin a la concentracin espermtica, volumen, motilidad, morfoanomalas espermticas, las cuales de forma directa son determinantes de una gama de valoraciones a medir en estos estudios, por mencionar algunas tenemos: el ndice de fertilidad, nmero cras, viabilidad de las cras, malformaciones del esqueleto y de rganos entre otras.9

Tal es el caso del Saw-Palmetto, producto natural que inhibe la Hiperplasia Prosttica Benigna, en el cual se utilizaron algunas de las valoraciones que este trabajo propone para corroborar los resultados negativos obtenidos en



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esta rama, siendo de gran utilidad, pues les permiti tener una mayor valoracin y nivel de confiabilidad de su producto.10-12 Por su parte el Finasteride (Dutasteride), tras corroborar los problemas existentes de afeminamiento, retardo en la bajada de los testculos y de la hendidura prepucial en cras machos, as como valores ligeramente bajos de los ndices de fertilidad en ratas, se utiliz una variante de este estudio y se obtuvo como resultado que el producto disminuye el volumen del eyaculado al ser administrado a corto plazo, no se han realizado an estudios a largo plazo.13-18

En materia de experiencia, le podremos comentar que este tipo de estudio se est implementando en nuestro laboratorio a raz de obtener extensos resultados en la toxicologa de la reproduccin de un producto nuestro en desarrollo en el cual se obtuvieron resultados en funcin de la toxicidad reproductiva de la hembra y en el macho de forma indirecta, por cuanto las autoridades regulatorias nos exigan algn tipo de estudio que manifestara la no toxicidad reproductiva directa en el macho, destacar que los resultados iban o no ms haya de la integridad de los rganos sexuales (anlisis anatomopatolgico), salud, libido etc. Por ende este trabajo no se basa en la implementacin de nuevas tcnicas, sino que el investigador en el campo de la toxicologa experimental sepa que estas herramientas existen y que pueden ser utilizadas para resolver de forma inmediata un problema dado con metodologas que incluyen un bajo costo, fcil reproduccin y obtencin rpida de los resultados, las cuales no necesitan de equipos sofisticados ni de personal calificado en esta materia. Para lo cual tomamos valoraciones que incluyen un anlisis bsico como son las pruebas de rutinas que en este trabajo debatimos, pudiendo ser desarrolladas por tcnicos o especialistas en laboratorios con bajos recursos. Diseo experimental: Para determinar la influencia en la fertilidad tras la administracin en dosis repetidas de un producto mediante la valoracin o contrastacin seminal de conejos en toxicologa experimental por lo general se forman 4 grupos experimentales de 8 a 10 conejos machos/grupo (32-40 total) ,19 de 7-8 meses de edad (adultos) de 1,8-2,5 kg, para formar un grupo control de vehculo y tres niveles del producto a evaluar. Se puede incluir o no un grupo control positivo administrado con sustancias de referencia, el cual puede ser administrado por dosis y va diferente a la sustancia de ensayo. Por lo general el mtodo de extraccin de semen mas usado es la falsa monta con el uso de una coneja estrogenizada para lo cual se incluyen a razn de 1 hembra para 6-8 machos.20

Se administra la sustancia de ensayo durante 8 semanas (60 das por va oral, el cual abarca un ciclo espermtico y del siguiente, en el conejo este ciclo dura 48 das), durante los cuales debe pesar los animales



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semanalmente para determinar las dosis de producto a administrar y se observaran dos veces al da.21 Al cabo de las 8 semanas debe extraer el semen con el uso de una coneja en celo para su valoracin macroscpica y microscpica. Para tener una mayor valoracin de la toxicidad del producto a evaluar en el sistema reproductivo del macho se deben sacrificar los animales para realizar un estudio anatomopatolgico de rganos y cavidades, por ltimo se extraen los rganos sexuales (testculos, epiddimos, prstata y vesculas seminales) para su estudio histolgico y la determinacin de la relacin peso de rgano/peso corporal.22 Todas las variables analizadas se deben comparar contra el grupo control negativo. Induccin del celo en las hembras: Las Prostaglandinas induce la regresin del cuerpo lteo, iniciando una nueva ovulacin. Su uso es recomendable ya que las hembras se encontrarn receptivas a los dos das de su aplicacin, para un nuevo servicio.23

Coneja estrogenizada. Entre los tratamientos hormonales que se utilizan pre-monta se encuentra la PMSG, la cual genera un Pico de estrgeno que mejora la receptividad-fertilidad y prolificidad, las dosis deben ser pequeas de 20 UI mximo por va (subcutnea). Adems para mejorar la aceptacin se debe bioestimular con un tratamiento de 16 horas de luz durante 8 das antes de la extraccin del semen.24 La PMSG constituye una Gonadotropina Corinica extrada del suero de una yegua gestante. Ejemplo de algunos esquemas de aplicacin efectiva, utilizadas por nosotros durante evaluaciones previas a algunos de nuestros productos: 25 1.) Se aplica va intramuscular o subcutnea 12-35 UI, 48 horas antes del momento del servicio natural, la dosis de 35 suele ser ms efectiva. 2.) Se aplica va intramuscular 20 UI, 72 horas antes del momento del servicio natural. Condiciones para la extraccin del semen: Se utiliza una vagina artificial que consta de las siguientes partes:

- Tubo rgido de PVC. - Goma-espuma. - Globos comunes adaptados. - Tubo colector graduado.

El cuerpo de la vagina (tubo de pvc) est recubierto en su interior por una capa de goma-espuma. Dentro del cuerpo de la vagina se coloca el ltex formando una cmara aislada donde se coloca el agua caliente, de manera tal que el agua nunca tome contacto con el semen. En el extremo posterior del tubo rgido se coloca un tubo colector graduado para la recoleccin del semen. Como lubricante se utiliza vaselina.26



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El volumen y la calidad del semen dependen de la camisa utilizada en la vagina artificial, la cual debe estar seca y no se debe utilizar gel, adems hay que realizar un cuarto de vuelta del ltex dentro de la vagina, pues los pliegues que se forman permiten una estimulacin al macho. Se puede agregar 10-15 gramos de glicerol en el agua para mantener la temperatura de la misma en la vagina.27Adems se debe llenar con agua a temperatura de 55-58 C y completar con una inyeccin de aire para favorecer la presin. Se debe tener muy en cuenta la temperatura del agua debido a que las vaginas artificiales con temperaturas de 50 C induce la liberacin de orina y a menos de 40 C el animal no salta o se incrementa el volumen de gel y grnulos dificultando la manipulacin del eyaculado y alterando su calidad dando resultados falsos positivos.28 Una vez completa con agua y aire la vagina se deja en una estufa a 50 C hasta su uso. Antes de la extraccin se agrega a la vagina el tubo colector y se protege con un tubo aislante de la luz y del fro. Mtodo para la extraccin del semen: En el momento de la extraccin se lleva la hembra a la jaula del macho. Se ubica la hembra en posicin de servicio, cuando el macho intenta el salto se coloca la vagina artificial por debajo del vientre de la coneja, de manera tal que el pene del reproductor se introduzca en la vagina artificial. La temperatura del agua de la vagina artificial debe ser tal, que llegue al pene del macho a 40 / 42 C. Si se utiliza un ltex muy grueso, resulta ms aislante y se debe aumentar la temperatura del agua.29 La temperatura del agua es el desencadenante de la eyaculacin en el macho.30 Una vez terminado el salto, se observa en el tubo colector si el eyaculado presenta tapn mucoso o gel, procedente de la secrecin de las vesculas seminales y de la prstata, debindose retirar. El eyaculado se coloca en un tubo de centrfuga graduada dentro de un termo a 30-36 C de temperatura, procedindose luego a la valoracin del eyaculado de forma macroscpica y / microscpica. Otra forma es que al extraerlo se debe ubicar en un recipiente en bao de mara a 37 C para evitar choques trmicos. 1. Pruebas Macroscpicas: - COLOR: Blanco nacarado normal, indica buena calidad seminal. Se deben desechar los eyaculados que presenten una coloracin griscea, rojiza (con sangre, por lesiones en el pene o uretra), marrn por contaminacin con heces fecales, amarillo por presencia de pus u orina con mal olor o con sedimentos anormales.31 - ASPECTO: Se clasifica en uniforme los ms deseados y no uniforme en cuanto a la opacidad. - OLOR: Suis generis, otra variante de olor se clasifica como mala. - PH: 6,0 -7,3 es normal otros plantean de 6,8-7,5.32, 33 Por lo general a



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partir de valores de 7,2 comienza a disminuir la concentracin, motilidad y viabilidad del semen. Valores diferentes a estos, nos indican mala calidad seminal. Se realiza con el uso de un pHmetro o papel de tornasol. - VOLUMEN: Se determina mediante la graduacin de los tubos colectores, debe ser de 0,25-0,3 a 1-1,5 mL. Depende de la poca del ao los valores mas bajos de rango se obtienen en otoo y los ms altos en primavera.34 - CONSISTENCIA: La ms deseada es lquida, que no sea acuoso. Para realizar esta prueba homogenice en primera instancia la muestra de semen lentamente, luego se toman 20 L y se deja caer sobre una lmina portaobjeto gota a gota, para lo cual se dan las siguientes clasificaciones: 35

1. Gota a gota. 2. Forma de filamento. 3. Fluye como el agua.

2. Pruebas Microscpicas Fundamentales: Las pruebas microscpicas siempre se deben realizar por dos observadores independientes para luego establecer un promedio entre ambos resultados. - CONCENTRACIN: Esta valoracin es muy importante, ya que existe una variabilidad grande de unos eyaculados a otros. La concentracin se puede calcular por varios mtodos, destacando la espectrofotometra y el uso de cmaras de recuento celular (Brker, Neubauer, Thoma).36 La espectrofotometra (m=540nm) mide la densidad ptica de la muestra (turbidez), lo que permite saber la concentracin llevando la lectura que obtengamos a una tabla de conversin, donde estn relacionados diferentes niveles de tramitancia con diferentes concentraciones de espermatozoides, aunque en conejos este mtodo induce a error debido a la gran cantidad de impurezas que presenta el semen, por lo tanto no se recomienda su uso.37 El mtodo mas usado en las investigaciones y por nosotros es la valoracin de la concentracin mediante Cmara de Neubauer o en forma subjetiva se observa una gota de semen entre porta y cubreobjeto a 40-60 aumentos. La concentracin en el semen oscila entre 50-250 x 106 espermatozoides/mL. A continuacin encontrara el procedimiento general de dos tcnicas las cuales de forma rpida le ayudaran a establecer la concentracin de espermatozoides que contiene el semen a evaluar: Tcnica 1: El conteo se realiza con ayuda de la cmara de Neubauer a una dilucin 1:100 utilizando como diluente la solucin salina formolada, luego se homogeniza con movimientos lentos de inversin del tubo, y se toma con una pipeta Pasteur aproximadamente (10 L), posterior a esto se deja deslizar en la cmara. Despus de reposar dos a cinco minutos se procede al conteo espermtico.38



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Solucin salina formolada: Para preparar 1 L de volumen final de esta solucin debe mezclar, 9 g de cloruro de sodio, con 3 mL de formol al 40 % y por ultimo aadir 1 000 mL de agua destilada. Se cuenta los espermatozoides presentes en los cuatro cuadrantes, con un total de 16 cuadros. El volumen ocupado por los 4 o 5 cuadros a contar segn el tipo de cmara multiplicado por la dilucin origina un factor de multiplicacin. Ejemplo: 16 + 18 + 12 + 20 = 66. Factor de multiplicacin: 4 x 100 x 10. Concentracin = 66 x 4 000 = 264 000 espermatozoides/mm3 o 0,264106 espermatozoides/mm3. Esta tcnica tambin permite calcular los espermatozoides totales por eyaculado los cuales se obtienen con una simple multiplicacin del volumen por la concentracin. En este caso es necesario unificar la medida por lo que se debe multiplicar nuevamente por 1 000 para llevar desde milmetros cbicos de la concentracin hasta mililitros de volumen.39 Ej: Volumen de eyaculado: 1 mL. Concentracin: 264 000 /mm3. 1 x 264 000 x 1 000 = 264 000 000 = 0,264 x 109 espermatozoides totales.

Tcnica 2: En primera instancia se homogeniza la muestra con movimientos lentos de inversin del tubo, luego se toma un tubo de 12x75 mm y se agrega 100 L de semen + 900 L de solucin diluente, o simplemente a una dilucin 1:100. Posterior a esto mezcle con movimientos lentos de inversin del tubo y monte en cmara de Neubauer, dejar sedimentar por 5 minutos. Debe contar en el mm central de la cmara de Neubauer.40

Los espermatozoides contados se multiplican por 4 o 5 cuadros contados y se dividen entre 10, se informa el nmero por 106 espermatozoides por mL. Ej: 15+10+20+24= 69 x 4/10= 27,6 x 106 espermatozoides/mL. Preparacin de la solucin diluente: Tome 50 g de Bicarbonato de Sodio y luego debe diluir con agua destilada hasta completar a 100 mL. - ANOMALIAS: Para determinar el nmero y tipo de formas anormales puede colorear o no con eosina la muestra. Estos valores se cuentan en base a 100 y se expresan lo resultados como (%). Cabeza. Es ovalada, contiene cromatina altamente condensada (DNA). La dotacin cromosmica de sta es haploide, es decir, slo contiene la mitad de los cromosomas que poseen las clulas somticas del animal que son 44.41



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Acrosoma. Se encuentra en el extremo anterior de la cabeza del espermatozoide, es un saco membranoso que contiene ciertas enzimas, como la acrosina y la hialuronidasa, que se encargan de disolver la zona pelcida del ovocito para permitir la fecundacin.42 Tracto intermedio. Est delimitado en su parte anterior por el cuello y en la posterior por el anillo. Podra definirse su funcin como el motor del espermatozoide, el que produce el movimiento.43 Cola. Es aquella parte que lleva a cabo el movimiento. Las anomalas morfolgicas pueden afectar a cualquiera de las tres partes del espermatozoide: cabeza, tracto intermedio y cola, generando alteraciones que van a dificultar la fecundacin.44

Se coloca una gota en un portaobjeto y se observa sobre todo:

1. En la cabeza, estn los normales y anormales que incluye (macrocabeza, microcabeza, cabeza doble y cabeza suelta). 2. En el Cuello, anillo o porcin intermedia, estn los normales y anormales los cuales incluye (enroscado, doble, engrosado y excntrico). 3. En la Cola, estn los normales y anormales los cuales incluye (en ovillo, ltigo, dobles y flexionadas).

De colorearse la muestra se tomaran 0,1 mL de semen y se mezclara con 3 mL de cloruro de sodio al 0,9%, luego se homogenizara con movimientos lentos de inversin del tubo mecnicamente y se adicionara de 3 a 7 gotas de eosina Y al 1%, dejndose actuar por 5 minutos, luego se extiende o se coloca una gota en un portaobjeto siendo tapada con un cubreobjeto, secndose los bordes de la lmina. Se aceptan valores de 10 a 15 %, los cuales no son importantes, otros autores plantean que de un 20-30% de anomalas totales es aceptado.45 - MOTILIDAD: La motilidad es una caracterstica de la clula espermtica y se trata de uno de los parmetros ms importantes en las contrastaciones seminales, debido a que es imprescindible para que se produzca la fecundacin. Existen varias tcnicas de estudio de la motilidad, pero la ms utilizada y a la vez, la ms simple, es la valoracin visual del porcentaje de espermatozoides mviles y la calidad de su movimiento.46 Los espermatozoides pueden presentar dos tipos de movimiento, movimientos de rotacin (alrededor de su eje) y/o movimientos progresivos (desplazamiento de la clula), por lo general lo realizan de forma lineal, pero en ocasiones es circular. Para la realizacin de esta valoracin todo el material usado debe estar en condiciones de normocinesis (temperatura de 37C).47



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Motilidad Masal: Se depositan de 7 a 10 L en un portaobjeto atemperado (tanto los portaobjetos como las puntas deben estar a 37 C), y se observa a 40 aumentos, se valora la velocidad con la que se mueven los remolinos de la superficie de la gota valorndose en una escala de puntuacin de 0-5.48 - Nada (0), Temblor en el lugar (1), Inicio de ondas van y vienen, es malo an (2), Regular con ondas lentas (3), Buena con ondas rpidas (4) y por ultimo Muy buena con remolinos o tornados (5). Para que su valoracin sea buena el 60-70% de los animales examinados deben estar entre 4 y 5. Se debe estimar los resultados como porcentaje, es fundamental establecer un promedio entre el nmero de animales a utilizar por dosis. Motilidad Individual: Diluir el semen con algn diluente seminal sobre todo suero fisiolgico a 37 C (cloruro de sodio al 0.9%), para lo cual tome 100 L de semen para 900 L de esta solucin, luego se homogeniza con movimientos lentos de inversin del tubo y con una pipeta procedemos a colocar una gota en un portaobjeto, luego se coloca un cubreobjeto y se observa al microscopio ptico (todos los tiles deben estar atemperados a 37 C). En primer lugar se evala el % de espermatozoides con motilidad sin tener en cuenta su movimiento.49

Luego debe evaluar el tipo de movimiento (progresivo, rectilneo y uniforme) en una escala del 1 al 5. (5) Muy Buena (>95%), (4) Buena (80-95%), (3) Regular (70-80%), (2) Mala (60-70%), Nula o Muy Mala (< 60%).50 Todo el material debe estar en condiciones de normocinesis, a temperatura de 37 C. - VIABILIDAD: La relacin de vivos / muertos es otro parmetro importante. Un espermatozoide muerto libera enzimas entre las que se encuentran las del acrosoma, que van a producir daos en las membranas de los vivos, lo que provocar un mayor numero de espermatozoides daados y la consiguiente prdida de calidad de las dosis seminales.51 Para determinar este cociente se utiliza generalmente una serie de tinciones, entre ellas la de Eosina-Nigrosina, Yoduro de propidio o la de Tripn azul.52 Todas estas tcnicas se basan en la capacidad del espermatozoide para evitar la incorporacin de determinados colorantes a su interior, debido al efecto barrera que realiza su membrana citoplasmtica. La viabilidad en los casos de fertilidad se plantea que debe ser medida dentro de 30 minutos posterior a la extraccin, destacndose grandes prdidas posteriores al mismo.53 Para lo cual se adicionan 5 gotas de eosina Y al 1% o simplemente utilice el homogenato que quedo en la prueba de



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determinacin de anomalas mezclndola con 5 gotas de nigrosina al 1%, se plantea que todas las mediciones microscpicas del semen se deben realizar a la misma vez para que el tiempo no sea un parmetro determinante de su calidad,54 se colorea durante 5 minutos (la eosina colorea los espermatozoides muertos y la nigrosina permite que los vivos al ser incoloros o transparentes se visualicen), luego se homogeniza con movimientos lentos de inversin del tubo y se realiza el frotis de una gota, se esperan 10 minutos a secar. Posterior a esto se debe observar los muertos de color rosa y los vivos transparentes siendo visualizados por el fondo negro que forma la nigrosina.55 Ms del 70-80% es muy buena, 70% es buena, de 60- 69 es regular, valores por debajo de 60% son malos.56,57 3. Peso de rganos y examen anatomopatolgico: Para el sacrificio, a los animales debe administrarle una sobre dosis de pentobarbital sdico58-61 y luego de perder los reflejos, se sacrificarn, dejndose desangrar por la vena cava abdominal.62 Posteriormente se practica la necropsia completa examinndose el contenido de las cavidades abdominal, torcica y craneana, pesando los (testculos derecho e izquierdo, epiddimos derecho e izquierdo, prstata y vesculas seminales) y tomando muestras de estos segn el protocolo de trabajo para el estudio histopatolgico.63 Con posterioridad se debe calcular la relacin: (peso del rgano/peso corporal) x 100 para su procesamiento estadstico como ndice de toxicidad. El peso corporal referido es el que presentan el da del sacrificio. 64 Para el estudio histopatolgico, las muestras obtenidas se deben fijar en formaldehdo al 10% tamponado y los cortes se deben colorear con hematoxilina y eosina.65 Deber someterse a este estudio con prioridad todos los animales del grupo control y de la dosis mxima utilizada. Conclusiones Todas las pruebas descritas aportan datos que nos indicarn una disminucin de la calidad del semen, pero debemos realizar valoraciones que nos aporten sencillez, rapidez y que sean econmicamente viables; para ello, cada investigador debe utilizar aquellas que mejor se adapten a su forma de trabajo, sin olvidar que a mayor nmero de pruebas, ms fiables son los resultados de las mismas. El uso de estas pruebas en los laboratorios de toxicologa experimental constituye una herramienta til, la cual ayuda a una valoracin preclnica ms amplia de nuevos productos y/o ingrediente activo. Referencias Bibliogrficas

1. Amann, R. Use of animals models for detecting specific alterations in reproduction. Fundam Appl Toxicol, 2003, vol. 2, p. 13-26. 2. Moore, K.L., Persaud, T.V. Embriologa clnica. Editado por McGraw-Hill Interamericana, Mxico, 1999, pp. 80-81.



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3. Ferguson, L.R. Overlap between mutagens and teratogens. Mutat. Res, 1997, n396, p. 1-8. 4. Shepard, T.H. Catalog of Teratogenic Agents. The John Hopkins University Press, 10th edn, Baltimore and London, 2001, pp. 140-141. 5. Barrat, C.L., Tomlinson, M.J., Cooke I.D. Prognostic significance of computerized motility analysis for in vitro fertility, Fertil Steril, 2003, n60. p. 520-525. 6. Boyers, S.P., Davis, R., Katz D.F. Automated Semen Analysis. Curr Probl Obstet Gynecol Fertil, 1999, vol. 12, p. 172-200. 7. EPA. Reproduction and Fertility Effects. Health effects testguidelines oppts 870.3800. 1998, United States Environmental Protection Agency Prevention, Pesticides and Toxic Substances (7101), EPA 712C 98208, August 1998. 8. Repetto M. Toxicologa Fundamental. Patologas txicas de las gnadas y de la funcin sexual. Tercera Edicin. Editado por ENPSES-MERCIE GROUP, Espaa, 2002, pp. 224-225. 9. Giknis, M., Clifford, B. Reproductive and Behavioral Evaluations. Charles River Laboratories, 2007, p. 56-57. 10. McGuffin, M., Hobbs, C., Upton, R., Goldberg, A. American Herbal Product Association's Botanical Safety Handbook., eds. Boca Raton, FL: CRC Press, 1997. pp. 107. 11. Small, J.K., Bombardelli, E., Morazzoni. P. Serenoa repens (Bartram). Fitoterapia, 1997, vol. 68 (2). p. 99-113. 12. Marks, E. Effects of saw palmetto herbal blend in men with symptomatic benign prostatic hyperplasia. Journal of Urology, 2000, vol. 163(5).p.1451-1456. 13. Carraro, J.C., Raynaud, J.P., Koch, G., Chisholm, GD. Comparisons of phytotherapy (Permixon) with finasteride in the treatment of benign prostatic hyperplasia: a randomized international study of 1098 patients. Prostate, 1996, vol. 29, p.231- 240. 14. Barros, D.A. Avertex Finasteridecomprimidos recubiertos. LABORATORIOS BETA S.A. Centro de Asistencia Toxicolgica La Plata. Buenos Aires. E.M.A.M.S. 2007, Certificado N 43.311. 15. Boyle, P., Gould, A.L., Roehrborn C.G. Prostate volume predicts outcome of treatment of benign prostatic hyperplasia with finasteride: meta analysis of randomized clinical trials. Urology, 1996, vol. 48, p.398- 405. 16. Iguer Ouada, M., Verstegen, J.P. Effect of Finasteride (Proscar MSD) on seminal composition, prostate function and fertility in male dogs. Journal of reproduction supplement, 1997, vol. 51, p.139-149. 17. Carlin, J.R., Christofalo, P., Arison, B.H., Ellsworth, R.E., Rosegay. Disposition and metabolism of Finasteride in dogs. The American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics, 1996, vol. 25. p.100-109. 18. Johnston, S.D., Kamolpatana, K., Root-Kustritz, M.V., Johnston, GR. Prostatic disorders in the dog. Animal Reproduction Science, 2000, p. 405-415. 19. Takayama, S., Akaike, M., Kawashima, K., Takahashi, M., Kurokawa, Y. Collaborative Study in Japan on Optimal Treatment Period and Parameters for Detection of Male Fertility Disorders in Rats Induced by Medical Drugs. J. Amer. Coll. Toxicol, 2000, vol. 14, p.266-292.



13/18

20. Ulbrich, B., Palmer, A.K. Detection of Effects on Male Reproduction - A Literatura Survey. J. Amer. Coll. Toxicol, 2001, vol. 17, p. 293-327. 21. Ulbrich, B.J. Special Issue, Testicular Toxicity. Toxicol. Sci, 2000, vol. 20, p.173-374. 22. Sakai, T., Takahashi, M., Mitsumori, K., Yasuhara, K., Kawashima, K.Collaborative work to evaluate toxicity on male reproductive organs by 2-week repeated dose toxicity studies in rats. Overview of the studies. J. Toxicol. Sci, 2000, vol.25, p.1-21. 23. Salewski, E. Faerbermethode zum Makroskopischen Nachweis von Implantations Stellen am Uterus. Pharmakol. Exp. Pathol, 1980, vol. 2, p.247-250. 24. Edwards, J.A. The External Development of the Rabbit and Rat Embryo. In: Adv. Teratol. D.H.M. Woolam (edition.), Academic Press, NY, 1995, Vol III, pp. 310-312. 25. Martn, M. Reproduccin en la coneja: Anatoma y fisiologa. Cunicultura, 2002, vol. 27, n160, p. 381-390. 26. Gibson, J.P. Use of the Rabbit in Teratogenicity Studies. Toxicol. Appl. Pharmacol, 2000, vol. 9, p. 398-408. 27. Battaglini, M., Castellini, C., Lattaioli, P. Variability of the main characteristics of rabbit semen. J Appl Rabbit Res, 2003, vol.15, p. 439-446. 28. Farrell, P.B., Foote, R.H., Simkin, M.E., Clegg, E.D. Relationship of semen quality number of sperm inseminated, and fertility in rabbits. J. Androl, 2003, vol.14, p. 464-471. 29. Hammerstedt, R.H. Evaluation of sperm quality: identification of the subfertile male and courses of action. Anim Reprod Sci, 2000, vol.42,p. 77-87. 30. Marai, I.F., Habeeb, A.A., Gad, A.E. Rabbits productive, reproductive and physiological performance traits as affected by heat stress: a review. Liv Prod Sci, 2002, vol. 78, p. 71-90. 31. Roca, T. Cubricin en Cunicultura: Estudio para poder determinar el coste de la cubricin en monta natural (MN) e inseminacin artificial (IA). Publicaciones Engormix.com, 2009, vol. 3, p. 4-5. 32. Hernndez, P.J., Fernndez, R.F., Avalos, R.A., Daz, B.R. Efecto de la adicin de gelatina a semen de conejo almacenado a 12 C. Revista de Salud Animal, 2004, vol. 26, n3, p. 197-201. 33. Gonzlez, U.A. Contrastacin seminal. Cunicultura, 2002, vol.27, n 160, p. 394-399. 34. Hirai, M., Cerbito, W.A., Wijayagunawardane, M.P.The effect of viscosity of semen diluents on motility of bull spermatozoa. Theriogenology, 2002, vol. 47, p. 1463-1478. 35. Marco, L.M., Salvad, U.M. Manejo de machos en inseminacin artificial. Produccin de semen y calidad. Cunicultura, 2000, vol.147, p. 232-238. 36. Santa, M.A., Gutirrez, E., Lpez, M. J. Cooling, effect of diluent additives and fertility of Angora rabbit semen. Agro-Ciencia, 1999, vol. 5, p. 43-48. 37. Alvario, M.R. Control de la reproduccin en el conejo. Ediciones Mundi Prensa, Zaragoza, Espaa, 2000, pp. 65-88.



14/18

38. Chen, Y., Li, J.,Simkin, M.E., Yang, X. Fertility of fresh and frozen rabbit semen inseminated at different times is indicative of male differences in capacitation time. Biology of Reproduction, 1999, vol. 41, p.848-853. 39. Mathur, A.K., Srivastava, R.S., Anil, J. Effect of pH and temperature on in vitro preservability of rabbit semen. Indian Journal of Animal Sciences, 1998, vol. 62, p.144-146. 40. Templeton, G.S. Cra del conejo domstico. Ediciones. C.E.C.S.A, Mxico, 2000, pp. 103-105. 41. Nagy, S., Sinkovics, G., Kovacs, A. Viability and acrosome integrity of rabbit spermatozoa processed in a gelatin-supplemented extender. Anim.Reprod. Sci, 2002, vol. 70, p.283-286. 42. Christensen, P., Stryhn, H., Hansen, C. Discrepancies in the determination of sperm concentration using Burker-Turk, Thoma and Makler counting cham-bers and a determination of anomalous forms. Theriogenology, 2005, vol. 63, n4, p.992-1003. 43. Prez, F., Tablado, L., Yeung, C.H., Cooper, T.G. Changes in the motility pattern of spermatozoa from the rabbit epididymis. Mol Reprod Dev, 2000, vol.45, p.364-371. 44. Quintero, A., Mir, J., Rigau, T., Rodrguez, J.E. Identification of sperm subpopulations with specific motility characteristics in stallion ejaculates. Theriogenology, 2001, vol.56,p.801-815. 45. Mortimer, S.T. Practical Aspects about insemination in mammals. J Androl, 2000, vol.21,p.515-524. 46. Catellini, C., Lattaioli, P. Effect of number of motile sperm inseminated on reproductive performance of rabbits does. Anim Reprod Sci, 1999, vol.57,p.111-120. 47. Davis, R.O., Katz, D.F. Operational standards for CASA Instruments. J Androl, 2000, vol.14,p.385-394. 48. Estany ,J., Camacho, J., Baselga, M., Blasco, A. Selection response of growth rate in rabbits for Meta production. Genet Sel Evol, 1999,vol. 24,p.527-537. 49. Rigau, T., Piedrafita, J., Reverter, A., Canal, M. The rate of L-lactate production: a feasible parameter for the fresh diluted rabbits semen quality analysis. Animal Reprod Sci, 2000,vol.43,p.161-172. 50. Verstegen, J., Iguer, M., Onclin, K. Computer assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology, 2004, vol.57,p.149-179. 51. Romero, E. Cunicultura: Inseminacin Artificial. Editado por la Editorial on-line Agrobit.com, Santiago del Estero 1071 (5900), Villa Mara, Crdoba Argentina, 2007, Tomo I, pp.35-37. 52. Vicente, J.S., Castro M.P. Manejo reproductivo en el conejo, 2008 [Citado 6 Marzo 2009]. Disponible en:http://home.utad.pt/apez/APEZNorte/2000/Cunicultura/S4.htm. Sesso IV Reproduo. 53. Haggerty, G., Hall, R. Animal Models in toxicology. Toxicology. The Rabbit. Reproduction Procedures. Editado por Dekker, M INC. New York (U.S.A), 1992, pp. 457-458. 54. Carson, W., Amann, R.P. The male rabbit. Effects of ejaculation and season on testicular size and function. Journal Animals Science, 1999, vol.34,p.302-304.



15/18

55. Bamba, K. Evaluation of acrosomal integrity of rabbit and boar spermatozoa by bright field microscopy using an eosin-nigrosin stain. Theriogenology, 1998, vol. 29,p.1245-1251. 56. Lavara, R., Moc, E., Vicente, J.S. Buenas prcticas de inseminacin artificial. Boletn de Cunicultura, 2003, n128,p.14-23. 57. Brun, J.M., Thean-clment, M., Bolet, G. The relationship between rabbit semen characteristic and reproductive performance after artificial insemination. Animal Reproduction Science, 2002, vol.170,p.139-149. 58. Hatch, R.C. Euthanatizing agents. In: Veterinary Pharmacology and Therapeutics. (Booth NH, McDonald Le, editions). Ames: Iowa State University Press, 1999, 5th edn, pp. 1059-1064. 59. Logair, J., Finley, G.G., Laniel, M.A. Guidelines for euthanasia of domestic animals by firearms. Canadian Veterinary Journal, 2003, vol.32, p.724-726. 60. Blackmore, D.K .Euthanasia; not always eu. Australian Veterinary Journal, 2000, vol.70, n11, p.409-13. 61. Baumans, V., Hellebrekers, L.J., Bertens, A.P., Hartman, W. Evaluation of euthanasia agent in rabbits and dogs. 26th Scientific Meeting of the Society for Laboratory Animal Science, Basel 13-15 September. 1998.p.3-5. 62. Andrews, E.J., Taylor, B., Clark, J.D. Report of the AVMA Panel on Euthanasia. Journal of the American Veterinary Medical Association, 2000, vol.202,p.229-249. 63. Schardein, J.L. Product Safety evaluation Handbook. Reproductive Hazards. Editado por Shayne Cox Gad, Marcel Dekker, M INC. New York (U.S.A), 1999, Second Edition, pp. 330-331. 64. Chhabra, R.S., Huff, J.E., Scwetz, B.S., Selkirk, J. An overview of Prechronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Experimental study Desings and Criteria Used by the National Toxicology Program. Environmental Health Perspectives,1990, vol.86, p.313-312. 65. Lillie, G. Histopatology. Tcnicas y prcticas histolgicas. Editorial ATIKA,1995, pp. 51-52.

REDVET: 2009 Vol. 10, N 8

Recibido 22.03.09 - Ref. MAY050907 - Revisado 25.06.09 - Aceptado 08.08.09 Ref. def. 080910REDVET - Publicado 15.08.09

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