Cromatografía. sobre papel de aminoácidos en biológicos ...
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LABORATORIO DE BIOQUlMICA DE LA ESCUELA DE MEDICINA DEL ESTUDIO GENERAL DE NAVARRA
Cromatografía. sobre papel de aminoácidos en
biológicos. Interferencia de proteinas, dectrolitos y ,
azucares
José M.ª Macarulla y Félix Alvarez de la Vega
RESUMEN
Se construye un mapa de la distribución de los aminoácidos en cromatografía sobre papel, utilizando como disolventes n-Butanol-Ac. Acético-Agua y Fenal 80°0 , con objeto de facilitar Ja rápida interpretación de los cromatogramas de estas sustancias en líquidos biológicos. Se estudia la interferencia teórica y práctica que originan las proteínas, electrólito3 y azúcares y se revisan los métodos recomendados para su eliminación. Finalmente se detallan los métodos seguidos en nuestro laboratorio y se discuten Jo; resultados obtenidos con cada uno de ellos. presenl'mdo algunos cromatogramas típicos de los líquidos investigados.
Bases teóricas del proceso.--Los trabajos de investigación en el campo de los aminoácidos, desde el fuerte impulso dado por Emil Fischer habían sufrido un notable dec'.:limiento hasta que en 1944 aparece el primer estudio cualitativo de dichas sustancias en cromatografía sobre papel.
Consden, Gordon y Martín 2, al sustituir la complicada columna de gel de sílice por una simple hoja de papel de filtro, abrieron horizontes más amplios para el conocimiento y determinación de aminoácidos en variados medios biológicos y en una amplia gama de condiciones.
En efecto; estas sustancia;, como todo grupo homólogo, tienen propiedades químicas y físicas análogas y resultaban difíciles de aislar por procedimientos químicos sencillos, ya que suelen presentarse en mezclas muy complejas y siempre varios componentes respon-
den de forma similar frente a un agente precipitante , extractor, etc.
La cromatografía sobre papel se considera como una serie de procesos de distribución entre fases por Jo que. como en toda operación fraccionada, las pequeñas diferencias entre las propiedades de los componentes quedan notablemente multiplicadas. siendo posible su separación de la mezcla.
Los estudios teóricos. verificados fundame1h talmente por Martin y Gordon 14. 2, indican que el mecanismo de la cromatografía sobre papel es en esencia un caso particular de la cromatografía de partición entre dos fases líquidas. La fase estaciona ria suele ser a cuma y utiliza como soporte la celulosa de las fibras de papel de filtro. Sobre ella se desliza la fase orgánica móvil constituída por un disolvente parcial o totalmente miscible con el agua.
Aplicando al papel los cálculos teóricos deducidos para la cromatografía de partición sobre columna. y verificando las sustituciones necesarias se llega a la siguiente fórmula:
•)lit... .:::..vv
AL (X=---
As Rf -1) (1)
donde rx es el coeficiente de reparto de cada sustancia entre el agua y el disolvente orgá-
Cs nico (rx = --), As es Ja sección de Ja zona
CL
acuosa, AL la sección de la zona orgánica y Rf el cociente entre el desplazamiento de Ja sustancia y el del frente del disolvente.
La zona acuosa se supone fija sobre el papel debido a los eplaces' de puente de H entre las moléculas de celulosa y las de agua, retenidas por aquéllá,, al menos en su parte más próxima al papel. La zona orgánica se desliza por gravedad y capilaridad y como lleva una proporción notable de agua va fijando ésta en Ja parte del papel seco avanzando toda la capa. Los solutos a cromatografiar (aminoácidos, azúcares, etc.), son, por lo menos, solubles en agua y algo en la fase orgánica (fenol, butano!, propano!, colidina, etc., acuosos).
Si discutimos la fórmula (1), es fácil advertir que si rx crece - siendo rx tanto mayor cuanto crezca la razón de solubilidades a favor del agua - el valor del Rf decrecerá y la substancia se desplazará poco sobre el papel. Inversamente si el soluto es muy soluble en la fase orgánica y poco en agua (a pequeño) el valor del Rf será muy alto.
La fórmula puede aplicarse a los dos casos extremos: !.º) la sustancia es insoluble en la fase orgánica y soluble en agua.
Cs 1 rx = -- = x y enton:es x ; luego
O Rf
Rf = O; la sustancia no se desplaza del origen. 2. 0
) la sustancia es insoluble en agua y soluble en el disolvente orgánico.
o Cl = -- =O;
CL
l ----1=0;
Rf Rf =
La sustancia se desplaza hasta el frente. El cociente AL/As es difícil de medir expe
rimentalmente, pero se puede deducir, supuesto constante, de Ja fórmula anterior conociendo el coeficiente de reparto de una sustancia y su Rf.
La concordancia de los coeficientes de reparto calculados según la fórmula y Jos medidos por England en 1935 es bastante buenaaunq ue el proceso real no parece ser tan fácil JO.
En las condiciones ideales cada sustancia se desplaza independientemente de las demás de modo que su Rf es constante y esto ocurre cuando las concentraciones de todas son pequeñas y no reaccionan químicamente entre sí. De esta manera al cromatografiar mezclas
fl o!. !
de aminoácidos puros el valor del Rf de cualquiera de ellos es influído muy poco por la presencia de los demás.
Cuando están presentes otras sustancias, en la mezcla que vamos a aplicar sobre el papel, pueden producirse interferencias si afectan de alguna manera a Ja validez de Ja fór-
AL mula rx = -
As
1 ( -- - l ) o a la constan
Rf
cía de algún término de ella.
1.---Alteración de rx . Puede modificarse Ja solubilidad del aminoácido en agua y en el medio orgánico cambiando notablemente su Rf (las sales tienen este efecto entre otros más importantes: Aumentan Ja solubilidad de los aminoácidos en agua 17). (La temperatura influye también so brc el valor de rx).
2.-Alteración en el volumen y proporción entre las fases (AL/ As). Los so lutos hidrófilos pueden provocar Ja condensación de agua en una zona húmeda próxima al origen que por su gran volumen puede llegar a disolver la totalidad de los aminoácidos de Rf bajo (glicocola) o deformar notablemente la mancha y el Rf de otros más altos (valina).
3.-Alteración de la mecánica del proceso y por tanto de la aplicabilidad de la fórmula. Los coloides hidrófilos pueden deslizarse sobre el papel rodeados de una película acuosa alterando las propiedades del agua que los imbide y la difusión del disolvente sobre ella de modo que los aminoácidos dan manchas desplazadas y difusas.
4.---C:omplejarniento del aminoácido. Las sales de Cu++, Co++, etc., dan manchas alargadas y pardas con los aminoácidos debido a formar complejos tipo quelato modificando totalmente la estructura y propiedades de la molécula original sencilla.
En el cuarto caso, o sea cuando la mezcla tenga sales de metales pesados, deberá procederse siempre a su eliminación (precipitándolos con SH0 o añadiendo 9-hidroxiquinoleina al disolvente cuando se corre el cromatograma. En los otros casos, cantidades pequeñas de sales, azúcares (solutos hidrófilos) o proteínas (coloides hidrófilos) no alteran tan considerablemente el cromatograma que impidan su interpretación. Por lo tanto se puede prescindir de ellos y permitirles acompañar la disolución de aminoácidos. No obstante si las cantidades son notables la interferencia puede ser seria y debe procederse a su eliminación. Para ello los caminos son muy variados y después de una revisión sucinta de los más frecuentes pasaré a anotar los seguidos en nuestro laboratorio hasta el momento.
Las propiedades que debe reunir toda eli-
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minación son las siguientes: 1. 0 Grado alcanzado. No es preciso que sea completa. Basta que se suprima la interferencia que la motivó. 2. 0 Alteración de la muestra. Los aminocícidos no deben ser alterados, las pérdidas han de ser mínimas y se ha de evitar las hidrolisis ch: otros péptidos o proteínas si no entraban en el estudio. 3. 0 El método debe ser, en tanto se pueda, breve, fácil y reproducible.
Métodos de eliminación de y péptidos de peso molecular elevado.y a hemos citado brevemente las interferencias que provocan los coloides hidrófilos en los cromatogramas de aminoácidos. Las proteínas encajan plenamente en este grupo. Se ha visto que el fenol arrastra las proteínas en los cromatogramas unidimensionales depositándolas a lo largo de todo el camino dando con la ninhidrina una mancha difusa violácea que enmascara casi todos los aminoácidos. Estos quedan identificados solamente por intensificaciones locales de la coloración.
Si se actúa con butanol-acético-agua las manchas de las proteínas plasmáticas, por ejemplo, son más concretas y múltiples. Se pueden llegar a confundir con aminoácidos aunque viajan más lentamente y su coloración es más intensa.
Por lo tanto en la cromatografía bidimensional las manchas de proteínas serán alargadas en el sentido del fenol y separadas en el del butanol.
Así en los cromatogramas de sangre y orina no tratados según el método habitual aparece una serie de manchas alargadas que se distinguen de las de aminoácidos por su mayor longitud en la dirección del fenol.
Vista la interferencia de las proteínas en la cromatografía debido a su tamaño coloidal y sus propiedades hidrófilas, veamos los métodos más comunes de eliminación. En resumen, se trata de separar coloides y cristaloides lo cual se conseguirá: a) precipitando aquéllos en la mezcla; b) extrayendo a éstos del producto previamente desecado, o c) simplemente dializando. Son numerosos los
estudios realizados sobre aminoácidos libres en plasma, orina, músculo, células animales, vegetales, zumos de frutas, etc., y entonces interesa evitar cuidadosamente cualquier hidrolisis de péptidos durante el trabajo para no obtener resultados por exceso. al dar como libres, aminoácidos que estaban combinados.
Algo semejante nos ocurrió en unos estudios sobre líquido céfalorraquídeo. Se daba en la literatura una cantidad notable de ácido glutámico libre (superior en ccncentración a cualquier otro aminoácido). En nuestro laboratorio hicimos la extracción de los aminoácidos con acetona clorhídrica (como detallaremos) evitando todo calentamiento, y observamos que en la zona correspondiente al glutámico sólo había trazas de este aminoácido mientras que aparecía una mancha enormemente grande en la zona de la glutamina. Verificada la hidrolisis (hirviendo la muestra original con ClH 4N) y cromatografiando de nuevo desaparecía por completo la glutamina y aparecía una gran mancha en la zona del glutámico. Esto comprobó las suposiciones de que el trabajo poco cuidadoso era la causa de recoger como glutámico libre lo que en el organismc era glutamina.
l. Precipitación de las proteínas con disolventes orgánicos.
a) Con etanol-cloroformo. - La adición de alcohol a la disolución acuosa de coloides tiene un efecto floculante por deshidratación de las partículas del soluto hidrófilo. Normalmente a este efecto se une la deshidratación producida por el calor de modo que se consigue una precipitación irreversible.
Partridge 1' consigue por este procedimiento precipitar la mayor parte de las proteínas de la sangre fetal de cordero. Los aminoácidos y azúcares que puedan interesar para el análisis como están en concentraciones pequeñas seguirán disueltos en el volumen final.
b) Con etanol numero-
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sas referencias en la literatura del tra -tamiento de muestras (plasma, orina, zumos de frutas, etc.), con la cantidad de alcohol absoluto o de 96%, necesaria para que la disolución final quede del 75-90%. Las proteínas precipit:in entonces, o al evaporar para reducir el volumen. La separación suele hacerse centrifueando el precipitado o extrayendo los aminoácidos del residuo sólido ccn agm destilada.
Entre otros trabajos es muy representativo el de Walker, Telles y Pastore en líquido ceralorraquídeo 19
. Análogamente Hassall verifica unas extracciones de semillas vegetales 12 a fin de localizar unos componentes tóxicos en ellas, que se identifican con los polipéptidos: Hipoglicina A y B.
2. Precipitación con ácidos orgánicos. Suelen emplearse como agentes precipitantes el ác;do tricloroacético y d sulfosalicílico.
a) Con tricloroacético.-Henriques y colaboradores 1
' ( 1955) emplean disolu-ciones de ácido tricloroacético al 10% ,para separar aminoácidos, glutatión y péptidos de las proteínas que son precipita bles.
b) Son sulfosalicílico. - Bh1ttacharya 1 (1955) hace una separación similar de proteínas y aminoácidos de la sangre precipitando las primerns con disoluciones de ácido sulfosalicílico al 3 % (peso/ vol.).
Entre los trabajos que siguen este camino de extracción de aminoácidos citaré el de Gordon y Nardi 8 por haber servido de base a uno de los métodos seguidos en nuestro laboratorio.
3. Separación de las proteínas por ultrafiltración. - Ya que las proteínas en concentración apreciable dificultan el desarrollo normal del cromatograma, Dent pensó en separarlas de los electrolitos y aminoácidos introduciendo las modificaciones mínimas o sea no añadiendo reactivos precipitantes o extractivos que pudieran alterar las concen-
Vol!
traciones y estructurns de algunos aminoácidos. Para ello hace una separación de coloides y crist2Io:des sin precipitar aquéllos' por simple diálisis a presión r,_
Eliminación de efoctrofüo!!. - Al cromatografiar con fenol y colidina-lutidina no es imprescindible la eliminación de electrolitos. En presencia de éstos sólo aparecen seriamente ddormadas las manchas de los aminoácidos aspártico y glutámico, aunque en general cantidades notables de estas substancias suelen interferir por crearse zonas húmedas sobre el papel con el consiguiente desplazamiento y deformación de algunos aminoác~dos.
1. Precipitación con reactivo adecuado.-Si les iones presentes son de un solo tipo fácilmente precipitable se tratarán con la disolución del ion que forme una sal de un producto de solubilidad mínimo. Así, por ejemplo, de un hidrolizado de proteínas o polisacáridos con SO,H,, puede separarse el ion SO,= del ácido neutralizando con Ba(OH), hasta viraje del rojo de metilo. La disolución está suficientemente libre de iones para cromatografiar azúcares\ pero las trazas de so,= pueden perturbar algo si se trata de aminoácidos.
2. Separación por electrodiálisis. -La disolución conteniendo aminoácidos y electrolitos salinos puede someterse a una diálisis selectiva aprovechando la carga positiva o negativa de los iones salinos y la carga resultante nula de los aminoácidos por su carácter de iones híbridos.
Puesta la disolución en un campo eléctrico fuerte ( 100-200 voltios) entre electrodos situados a 2-3 cm., se consigue separar en un tiempo corto los iones salinos que emigran a sus polos qued1ndo las otras sustancias en disolución. El aparato de desalado («de-salting apparatus>i) fue descrito primeramente por Gordon 9 y posteriormente modificado por Den t.
195/ CHOll ·ITOCH -IFÍ 1 SOBRE PHEL DE ·\ llL\().\UJJOo 209
3. Extracción de los aminoácidos con acetona clorhídrica. - Si se escoge la acetona con un mínimo de agua, 1,6 ce. de ClH 6N por 100 ce. de disolución, tiene 1a acidez suficiente (prácticamente O, 1 N) para formar hidrocloruros con los aminoácidos, permitiendo su disolución en ella, y es suficientemente orgánica para dejar insolubles los demás electrolitos.
Así obtenemos los aminoácidos acompañados de un solo electrolito fuerte: el ácido clorhídrico. Este se elimina al evaporar la muestra a sequecl3.d con corriente de aire caliente gracias a su volatilidad. De todas formas, antes de cromatcgrafiar los am¡noácidos convendrá neutralizar la muestra con vapores de
4. Fijación de los aminoácidos sobre resinas con elución posterior. La separación completa de sa.les y azúcares se consigue perfectamente gracias a las resinas de interc1mbio iónico n
Las propiedades de los aminoácidos concuerdan con las de los azúcares en la insolub;lidad en éter, tetracloruro de carbono, etc .. en su solubilida.d en agua y su ligera solubilidad en piridina por lo que no había métodos sencillos de aislamiento de los aminoácidos en presencia de est'.ls sustancias hasta que se aplicaron las resinas cambiadoras de iones. E~tas poseen la capacidad de fijación sdectiva del aminoácido precisamente pcr su carácter anfótero. propiedad que no tienen las sales fuertes ni los azúcares.
Por este método se consiguen recoger todos los aminoácidos salvo los de carácter básico (arginina. ornítina. lisina, histid;na ... ). que s~ separan junto con los cationes K ... ). Con las resinas riueden emplearse disoluciones hidroalcohólicas si les aminoácidos venían disueltos en este medio.
Eliminación de azúcares. - En general, no se aplican métodos especiales pa-
ra su eliminación ya que ésta suele hacerse junto con los electrolitos. Caso de no atenderse a los electrolitos, la eliminación de interferencias debidas a los azúcares se haría por los siguientes métodos.
l. Extracción de los aminoácidos con acetona clorhídrica. Esta disuelve muy pequeña cantidad de azúcares de tal forma que si se repite la extracción la cantidad arrastrada es inocua para el cromatograma. Léi magnitud de la disoluc~ón crece si no se llega a evaporar a sequedad. fenómeno que ocurre al operar con concentraciones grandes de azúcar. Se llega a un jarabe del que hay que extraer con acetona los aminoácidos ocluí dos.
2. Oxidación de los azúcares. Cuando la cantidad de éstos es grande pueden eliminarse por oxidación tratándolos durante varias horas con Cu(OH)2 en medio alcalino (preparado de S01Cu y
18 ). Este método es más engorroso y menos práctico que otros posteriores.
3. Fijación de los aminoácidos en resinas. El método de fijación de los aminoácidos en resinas de intercambio iónico es el mejor para separar azúcares, ya que se verifica simultáneamente la separación de las sales inorgánicas. Solamente la glucosamina es retenida en forma catiónica con los aminoácidos.
4) Selección de determinados disolventes que eviten su interferencia en el cromatograma. Cuando la concentración de azúcares no es muy elevada se puede hacer cromatogramas sin eliminarlos, con pequefias distorsiones de los aminoácidos siempre que se escoja la pareja de disolvente adecuada. El Propano! 80 por 100 es muy útil porque la glucosa corre en él más que los propios aminoácidos.
MkroDO Y HESULTADOS
Comtmcción del mapa de aminoáci-
dos. -- En un solo cromatograma bidimensional ascendente hemos separar 16-20 aminoácidos. dando manchas bastante definidas. empleando cantidades del orden 4-20. l 0-8 moles de cada uno.
En nuestro laboratorio se han realizado gran número de cromatogramas de este tipo empleando corno primer disolvente la mezcla butanol-acético-agua ( 4: l: 1 en volumen) y como segundo fenol-agua ( 4: l peso/volumen con 4 gotas de NH1 en el ambiente).
Los resultados son concordantes. y standarizando las condiciones de trabajo hemos construído el siguiente mapa de aminoácidos (fig. l) para la posterior identificación de estas sustancias en plasma. orina, líquido céfalorraquídeo, etc.
La disposición de los aminoácidos concuerda en líneas generales con la que se publica en la literatura con disolventes similares (butanol-fórmico-agua) panol-agua) (butanol secundario-acéticoagua), etc., frente a fenol saturado, fenol 80% o fenol-amoníaco 3 .~. El cromatograma está trazado a escala, siendo las dimensiones reales adoptadas para las hojas las siguientes: 34 cm. para la l.ª (butanol-acético-agua) y 28,5 para la 2.ª (fenol 80%). El desarrollo cromatográfico se da por terminado cuando el disolvente llega a 1-2 cm. del borde.
Los procesos de partición tienen lugar en escala microanalítica, ya que las cantidades de cada aminoácido puestas en la mancha de origen eran de 3 a 15 microlitros de disolución 0,01 M o sea del orden de 1 o-~ Moles. En la cromatografía descendente las cantidades son ligeramente mayores y el poder separador de la operación también lo es, ya que crece el camino recorrido por el disolvente.
a la variedad de líquidos estudiados son distintas las sustancias de máxima interferencia. Así en el plasma son las proteínas, en el líquido cefalorraquídeo las
V o/. 1
sales y en los vinos y zumos los azúcares,
1. Cromatogramas de aminoácidos libres en sanguíneo. - La investigación de aminoácidos libres en la sangre tiene interés para el estudio de los procesos digestivos y la relación entre la presencia y cantidad de estos aminoácidos y determinadas enfermedades.
Para la investigación de aminoácidos se han de eliminar algunos elementos que interferir en el cromatograma. Entre las diversas técnicas existentes hemos escogido y adaptado a nuestro trabajo dos fundamentales:
a) Cromatograma directo de plasma dializado,
Seguimos aproximadamente el método de Dent 6 con algunas variaciones en la diálisis y en los disolventes del cromatograma, La marcha elegida es la si-
l-Se toman 5 ce. de sangre en con heparina para evitar su Se transfiere a un tubo de
centrífuga de 10 ce., centrifugando lue-go a pequeña velocidad (600 revoluciones/minuto). Con ello se consigue en diez minutos una buena sedimentación de los glóbulos. Si la velocidad es muy elevada la centrifugación dura menos, pero se rompen los glóbulos difundiendo la hemoglobina al plasma (hemolisis). 2-Se toman con una pipeta 2 ce. de plasma sobrenadante, transparente y amarillento cuidando no tomar glóbulos y se pasan al saco de colodión preparado. La preparación del saco de colodión
hacerse unos días o unas horas antes de su empleo. La técnica utilizada es muy sencilla. Se toma un tubo de unos 1 O ce. limpio y seco y se le vierte unos 5 ce. de disolución de colodión al 8% en alcohol-éter (1:1). Se procura, haciendo rodar el tubo, que moje uniformemente las paredes y se va vertiendo al frasco el líquido excedente poniendo el tubo horizontal y sin dejar de rodarlo. Se agrega otra vez 3 ce. aproximadamente y se va rodando con una inclina-
CRO\L\TOGl\AFL\ :iOIJRE PHEL m: \ \!J:\O \Cll>OS
l- A.e. cisteico 2- Ac. raspártico 3- Cisteina 4- Ac. glutámico 5- Serina. IS- Glicocola 7- As parragina ll- TreonJ.na
itg~~"" 11- Al1mina U- Htdroxiprolin.a 13= ~irosina
14- Jl -Alru>i:OO 15- Lisi= 16- TriptÓf~.l1o 17- Citru.lillr>. 18- Ac. T -:uúoobutfrico 19- Ac. "' -em:!nol>ut:írieo :?O- Jhstidim 21- V alinr:l 22- Arginil'llll 23- llorvalina 24- !.oU<:inas 2$- !detionina 26- ll!etionina sulf6xido
:Manchas complementarias para. interpretar otros cromatogramas
AlljÚC:eres Peptido Colorantes Sal.e e
:rn
r
Fig. 1.- Mapa de aminoácidos en cromatografía bidimensional ascendente. ---Se utiliza como primer disolvente la mezcla butanol-acético-agua (4: l 1) y como segundo fenol 80 °,1 con unas pocas gotas de amoníaco. Casi todos los aminoácidos quedan por debajo de Ja diagonal que va de la mancha de origen al extremo opuesto de papel. Sólo los ácidos aspártico
y glutámico tienen un Rf mayor en la mezcla ácida de butano] que en fcnol.
:212 Jos1:: \l. \J \C-IIWU.-1 y F1::1X\ \J.\"\HE/. llE J..\ n:r:1 Vol. J
ción de 30 grados. El excedente se va vertiendo al frasco prccurando que se forme un refuerzo de colodión en la boca del tubo. Se ha de evitar cuidadosamente la formación de burbujas de aire en el cclodión ya que pondrían en peligro la efectividad de la pared del saco. Cuando está vacío se coloca vertical invertido y se deja secar al aire. Al cabo de una hora se lava con agua varias veces y, estando lleno de ella, se empieza a despegar de la boca del tubo; con el chorro de un frasco lavador se echa agua entre el tubo y el saco que empieza a despegarse, consiguiéndose con suma facilidad la separación completa. 3-El saco se ata a un tubo de vidrio gracias a un engrosamiento producido en éste y se intrcduce en un tubo de ensayo grande acortado, perfectamente limpio, al que se puede hacer succión. 4-Una vez puestos los 2 ce. de plasma en el saco de colodión, se conect'i el tubo que lo contiene a una pequeña succión continu1, con la trompa durante ocho horas o más (toda la noche). 5-Pasa por ultrafiltración aproximadamente 1 ce. de pbsma conteniendo aminoácidos, péptidos, azúcares, sales ... pero libre de proteínas y péptidos elevados. Se toma la cantidad que se quiera cromatografiar (200 1d.) y se evapcra en vidrio de reloj con corriente de aire seco a 30-40º C. El resto de dializado se queda en nevera. 6-Se añade agua al residuo seco, se agita y pasa al papel de cromatografía Whatman n.º 1 en varias porciones. Se lava el vidrio de reloj con nueva agua y se agrega al cromatograma secando continuamente la mancha de origen con aire caliente. 7-Se desarrolla el cromatograma con fenol 80% como primer disolvente y butanolacético-agua como segundo, o viceversa.
El cromatograma tiene la disposición siguiente después de revelado con disolución de ninhidrina en butanol-acético 2N (19:1) (fig. 2).
En este método se eliminan los glóbulos y las proteínas, pero permanecen
Fig. 2.- Cromatograma de plasma dializado.· -Aparecen los aminoácidos frecuentes, algunos en concentración muy grande, además de una cierta cantidad de sales. azúcares y péptidos.
La numeración de las manchas, en todos los cromatogramas que publicamos, concuerda con la tabla del Mapa general (Fig. 1) complementadas en la misma pan sales, azúcares. péptidos, etc. La intensidad relativa de coloración la hemos traducido convencionalmente bordeando la mancha con los siguientes tipos de tra-
zos distintos.
····· ·····.Solo visible por transparencia .. - · · - •• Justamente visible por reflexiór. '••1!1111!11ee111111,Perfectrunente visible ~~~-De color rojo relativamente intenso
color rojo intenso --~-lle inte~idad especialmente fuerte - - - -De otros. colores y aspectos (sales l
azúcares. colorantes, yrolina, etc
los azúcares (glucosa) y sales (Cl Na) que producen deformaciones en las manchas de aminoácidos y los péptidos que dan color a J'i ninhidrina en posiciones distintas a las de las habituales a los aminoácidos.
b) Crom':ltograma de aminoácidos extrnídos con acetona clorhídrica. - En líneas generales seguimos el método de Gordon y Nardi 8 cuando interesa eliminar la mayor parte de proteínas. sales y azúcares.
Se¡J!bre .• liJ.57 CI\0\1 H'OGH u·¡\ SOBl\E l' \PEL IJE ·\ \l!NO \CllJO~
El tratamiento de la sangre adoptado en el laboratorio es el siguiente: l --Se toman 5 ce. en un tubo de centrífuga de l O ce. Se centrifug2 como se ha descrito anteriormente. 2-Se toma l mi. de plasma sobrenadante y se pasa a un tubo de centrífuga pequeño. 3-Se le añaden 4 ce. de acetona clorhídrica (98,4 acetona 1,64 CI H 6N) y se agita consiguiendo coagular las proteínas v permaneciendo los aminoácidos en disolución. 4-Se centrifuga y decanta la disolución de aminoácidos a otro tubo de centrífuga, se agrega al precipitado 1,5 ce. de acetona clorhídrica, se 2gita para repetir la extracción, se centrifuga y decanta de nuevo. Se repite la operación con 1 ce. de acetona clorhídrica y se reúnen los líquidos recogidos. 5-Se evapora a sequedad la mezcla obtenida para insolubilizar las sales y azúcares que habrán permanecido en disolución gracias al agua del plasma. Esta evaporación conviene hacerla sin elevar mucho la temperatura, para evitar la hidrolisis de péptidos con el CIH del disolvente. Para ello se somete el tubo a una corriente de aire seco previamente calentado. 6-El residuo seco se extrae con acetona clorhídrica corno anteriormente, con la diferencia que ahora quedan las sales y azúcares prácticamente sin disolver. Finalmente esta disolución de aminoácidos se evapora para eliminar el C l H y se diluye con un volumen de agua igual al primitivo (1 ml.). 7-Se lava con éter (5 ce.) y decanta después de agitar para extraer las grasas. Se añ2de nuevo éter y ya puede pipetearse la muestra para la cromatografía. 8--Se tornan 100-150 p. l. de líquido acuoso guardado bajo éter y se va colocando en la mancha de origen del cromatograma sobre el papel de filtro. Se desarrolla igual que el anterior.
En los cromatcgramas más modernos se invierte el orden de Jos líquidos de desarrollo porque las impurezas del fenol eran arrastradas con dificultad al
secar el cromatograma y el butano! corría mal. Cuando éste se corre primero no hace falta secar tanto tiempo entre los des jes2rrolbs debido a mayor volatilid2d del butano!.
Las m2nch'tS son más déb;Ies como corresponde a un2 cantidad menor de muestra tomada (fíg. 3).
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f'B ' · ............
Sangre
Fig. 3.--Cromatograma de plasma extraído con acetona clorhídrica. ·--Aparecen los mismos aminoácidos· pero sin sustancias interferentes. Las manchas son más definidas y no tan intensas por haberse tomado una muestra
menor.
Están situadas en los puntos más acordes con el mapa de distribución de aminoácidos puros. ya que no hay sales que desvíen las posiciones. Finalmente no hay huellas de azúcares ni CINa.
2. Cromatografía de aminoácidos libres en líquido céfalorraquídeo. - El líquido céfalorraquídeo es esencialmente agua que lleva en disolución sales minerales y glucosa. Las proteínas y los aminoácidos libres en él son tan escams. que ha de tomarse una muestra muy
21'!
t
2 oc. Fenol 30,lb
Fig. 4.-Cromatograma del líquido cefalorraquídeo desproteinizado.-Eliminadas las proteínas con alcohol, quedan cantidades grandes de sales y azúcares que deforman el cromatograma. La glutamina es constante y abun-
dante.
grande para que aparezcan éstos en cantidad apreciable. Por lo tanto, carece de dificultades la eliminación de proteínas mientras que debe procederse con esmero a la eliminación de sales. Los procedimientos seguidos tienen el proceso inicial común. l -Se recoge una muestra de 4 ce. de líquido céfalorraquídeo en un tubo de centrífuga grande debiendo aparecer limpio y transparente como agua destilada. 2-Se le agregan 6 volúmenes (24 ce.) de alcohol absoluto, se mezcla bien y se deja en frío durante 24 horas. 3-Al día siguiente aparece un pequeño precipitado blanco debido a las proteínas que coagularon. Entonces se separa una fracción del líquido (8-14 ce.) y se pueden seguir uno de los caminos siguientes.
Cromatograma directo (sin proteínas). 4a-Se acaba de evaporar a sequedad y se diluye a 0,5 ce. de agua, se agregan
Vol. I
1 O ce .de éter y se toma directamente la mitad del agua para cromatografiar. En el cromatograma aparecen claramente las manchas de azúcares. sales y los aminoácidos distorsionados (fig. 4).
Crcm<itograma de aminoácidos extraídos con acetona clorhídrica. 4b-Se evapora a sequedad y se extraen los aminoácidos ccn acetona clorhídrica, como se ha descrito antes. 5b-Se vuelve a evaporar eliminando el CI H y se diluye en la cantidad medida de agua (0.5 ce.) se agrega 1 O ce. de éter para extraer lípidos y se hace un cromatograma con la mitad de la muestra (0,25 ce.). Se observa, comparando con el anterior, que las manchas de aminoácidos son más regulares y están mejor distribuídas. La cantidad de azúcar es muchísimo menor. pero la glutamina sigue algo deformada por residuos escasos de sal (fig . .5).
Cromatograma de líquido electrodializado. 4c-Se toman los 8 ce. de disolu-
,~ ........ • 24 ·, ...........
C.S.F. 2 oo. Fenol 80~
(.i"l .. 4. ..
+ Fig. 5.--Cromatograma de líquido cefalorraquídeo extraído con acetona clorhídrica.-Aparecen sólo las manchas de aminoácidos y tra.rns de azúcar. Las manchas están mejor defi-
nidas y se identifican bien.
Scpt.bre., 1957 Ll\(nJ\TOGH·IFil somu: l'APEL DE \\flNO~CIDOS 21.)
cien hidroalcohólica de líquido céfalorraquídeo desproteinizado, se le agrega 4 ce. de agua y se somete a desalado electrolítico en ((de-Salting apparatus". 5c-El aparato construído y montado en nuestro laboratorio concuerda en líneas generales con el de Gordon 9 , con la modificación de renovarse el líquido aniónico previamente enfriado para evitar sobrecalentamientos al paso de la corriente. Un papel celofán envuelve el ánodo que está bañado en una corriente de S01H, enfriado. El cátodo es el fondo de mercurio circulante por impulso de una corriente de agua del grifo. El mecanismo del proceso es el siguiente. Se conectan los electrodos a los bornes ( y de un generador de corriente continua de 100 a 200 voltios. se trabaja primeramente a potencial hasta que no se presentan sales en concentración apreciable, quedando en cambio los azúcares, y se va subiendo a medida que decrece la intensidad de la corriente. Sí había Cl Na en la disolución hidroalcohólica (o acuosa) el ion CI- pasa el celofán camino del ánodo. pero no a descargarse pues arrastrado por la corriente de SO,H, dando ClH. El ion que se descarga es el OH- que da agua y O, atacando al electrodo, si es de grafito. El ion sodio se descarga sobre el cátodo dando amalgama de sodio, que tratada por el agua del grifo se descompone en NaOH + En el propio cátodo se desprende desde el principio por des-carga de los iones H+. El desprendimiento crece a medida que se el ion Na+. La operación de desalado se da por terminada cuando de salir sosa (control con fenolftaleína) y decrece la intensidad de corriente a 2 rniliamperios. 6c-El líquido céfalorraquídeo desalado se coloca en tubo de y se evapora a sequedad con corriente de aire caliente. Se diluye con 05 ce. de agua, se agrega éter (5 y se toma la mitad de la solución acuosa para desarrollar el cromatograma. Las man-
chas de aminoácidos salen limpias aunque aparecen también las de azúcares (fig. 6).
3. CronBtograrna de aminoácidos libres en vinos, mostos y zumos de fru<tas.---Los aminoácidos suelen estar en pequefias cantidades en estos líquidos de origen vegetal, por otra parte muy ricos
t
+, Fig. 6.-Cromatograma de líquido cefalorraquídeo desalado electrolíticamente. - Aparece como el extraído con acetona, con más azúcar y una intensidad ligeramente superior en algu-
nas manchas.
en azúcares (glucosa y fructosa). Para su análisis se deberá tomar muestras considerablemente grandes y por lo tanto la interferencia de Jos azúcares es en general seria.
Como ejemplo de marcha pondremos el camino seguido en una serie de cromatogramas de aminoácidos en vinos pendiente de próxima publicación 15 . 1-Se parte de 20 ce. de vino. Se evapora
vacío en una cápsula de Petri, en desecador conectado a la trompa con ligero calentamiento con infrarrojos. En
dos horas se consigue llegar a la consistencia de jalea y calentando dos horas más queda prácticamente sólido sin llegar a eiiminar tcdo el agua. 2--Se extraen los aminoácidos con acetona clorhídrica removiendo el precipitado para que la extracción sea completa. Los aminoácidos se separan de las sales y prácticamente de los azúcares que quedan inwlubles. Los colorantes del vino se d;suelven en parte, pero no interfieren en la cromatografía. 3~Se evapora a sequedad y s~ diluyen con 5 ce. de agua. Se trata con éter como en los otros carns. y se guarda la muestra para todos los análisis que se desee hacer. Aparece: mucho ácido ·¡ -amino butírico. una cantidad muy grande de prolim. algo de citrulina y un péptido constank (mancha 31) (fig. 7).
Ultimamente estos métodos van siendo unificados con la utilización casi ex-
Vino JOO l"e Fenol 80',.h
1 o " ·.-<
Fig. 7. -Cromatograma de vino extraído c;on acetona c]orhídrica.-----Aparecen los ammoac1-dos corrientes con una riqueza especial en prolina, alanina v ácido ¡-aminobutírico y están presentes Ja citrulina. un péptido constante Y
algunos colorantes.
Vol. I
elusiva del desalado electrolítico o de resinas.
RESUiVIEN Y CONCLUSIONES
Se ha puesto en marcha un método eficaz y sencillo de análisis de aminoácidos en líquidos biológicos por cromatografía scbre papel. ~ Primeramente se ha construído un mapa de aminoácidos puros con su disposición sobre la lámina de papel cuidadosamente determinada. Se han escogido dos sistemas disolventes accesibles, fácilmente purificables y no alterables por los cambios de temperatura ambientales. Son el butanol-ácido acético-agua ( 4: l: l en volumen), corno primer disolvente. perfectamente eliminable por ventilación a 30º C.. y fenol-agua (4: l peso/volumen) como segundo, también elirninable con más tiempo de ventilación.
Siempre se ha seguido la técnica de revelado normal con disolución de ninhidrina descrita por Crarner 1 y calefacción en estufa a 90º C. durante seis minutos. El fijado con nitrato de cobre no resultó tan . perfecto corno el que utiliza nitrato de cobalto en disolución hidroalcohólica ligeramente ácida.
El método~ óptimo de trabajo para aislar v analizar aminoácidos. consta de la elin{inación de proteínas con disolución alcohólica o acetóníca y la disolución posterior en agua para separar electrolitos por de-Salting.
El método de separación de aminoácidos en plasma por simple diálisis ( crornatograma de la fig. 2), ofrece las ventajas de simplificar la manipulación de la. muestra y alternr al mínimo el estado físico-Lrnímico de sus componentes. Pero tiene les inconvenientes de no ofrecer les aminoácidos en concentración cuantitativamente determinable y dejar en el cromato~rama numerosas sustancias interferent~s (sales, azúcares. oligopéptidos ... ) que despbzan la posición de las manchas y deforman o difuminan sus
Septbre., 1957 Cl\O.\IATOGRAFÍA SOBRE PAPEL m: AMINOÁCIDOS 217
contornos. El tratamiento completo con acetona clorhídrica, tanto en plasma, como en líquido céfalorraquídeo o vinos, presenta la ventaja, dentro de la mayor laboriosidad de operaciones y lavados sucesivos, de dar prácticamente los aminoácidos puros sobre la hoja, con cantidades pequeñísimas de azúcares, si éstos abundaban en la muestra primitiva; come la extracción es prácticamente total, los aminoácidos son perfectamente determinables ( cromatograma de la figura 3). El método que utiliza el desalado por electrodiálisis ( de-Salting), una vez elimin'.tdas las proteínas, es simple, cómodo y no altera en general los aminoácidos -exceptuando algunos de naturaleza básica- aunque los azúcares quedan intactos en la mezcla y daría por tanto malos resultados en vinos y zumos de frutas.
El número de aminoácidos que aparecen en cualquier líquido biológico, crece lógicamente con el volumen de la muestra tomada, pues al ser éste mayor, las concentraciones de afaunos de ellos van alcanzando el umbral mínimo detectable. En el plasma dializado (250 :d.) suelen aparecer todos los aminoáci-
dos clásicamente conocidos en la sangre, junto con algunos péptidos en concentración no muy elevada y abundantes sales y azúcares. Del plasma extraído con lcetona clorhídrica (125 p.l.), sacamos 12-14 aminoácidos con manchas mucho mejor definidas. De 2 ce. de líquido céfalorraquídeo, simplemente desproteinizado se sacan 8-10 aminoácidos corrientes -con especial abundancia de glutamina-, pero el cromatograma sale distorúonado por la gran abundancia de sales y azúcares (crom. de la fig. 4). El mismo volumen de muestra tratado por de-Salting o extraído con acetona da los mismos aminoácidos, pero solamente con b mancha de azúcar, reducida al mínimo en el método de la acetona clorhídr~ca (figs. 5 y 6).
Finalmente los vinos (fíg. 7) tienen, en 300 ¡J.l. de muestra, una gran riqueza de aminoácidos, especialmente alanina y dos aminoácidos curiosos: la prolina-en cantidad muy superior a cualquier otro y producida, según hemos comprobado, en la fermentación del mosto-y el ácido 1-aminobutírico, que da una mancha intensa a la izquerda de la alanina.
SmvrlVIARY
Paper chromatography of amino tluids. lnterference by proteins, electrolytes and sugars.
A map has been constructed of the distribution of amino acids in paper chromatography when using n-butanol-acetic acíd-water and 80'}ü phenol, in arder to facilitate rapid interpretation of chromatognms of these substances in biologícal fluids. Protein, e!ectrolyte and sugar interference. in theory and practice. is
studie::I and the methods recommended for its elimination are revised. Finally the methods followed in our laboratory are detailed and the results obtained with each one discussed. Sorne typical chromatograms of the fluids investig<1ted are presented.
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