Historia de la Cromatografia.-

• En 1906, Martin Tswett publico un articulo sobre la Cromatografia. Tswett separó los componentes de la Clorofila utilizando Carbonato de Calcio como Absorbente y Eter de Petróleo como eluyente.

• En 1931, Kuhn y sus colaboradores aislaron y carotenos de la zanahoria, empleando el mismo método de Tsweet.

Historia de la Cromatografia.-

• Por los años de 1940, Martin y Synge trabajaron en las bases Teóricas de la Cromatografia, lo cual hizo posible definir Métodos que habilitan la eficiencia de la separación cromatografica. Ello hizo posible que la Cromatografia tuviera una amplia aceptación.

• En la decada de 1950, el método cromatografico fue aplicado a la Cromatografia de Gases.

• En 1957, Golay propuso el uso de Columnas Capilares para la Cromatografia de Gases.

Historia de la Cromatografia.-

• En la decada de 1960, nació la Cromatografia Líquida.

• En 1975, En la decada de 1950, Small y sus colaboradores propusieron la Cromatografia de Intercambio Ionico de Alta Performance.

• En 1979, Gierde y sus colaboradores desarrollaron el sistema de Cromatografia de iones sin supresores.

Introducción a la Cromatografia

• La Cromatografia es una Técnica de separación (al igual que la destilación).

• El proposito de la Cromatografia es “Separar y Cuantificar” analitos en mezcla (por lo general en matrices complejas).

Que es la Cromatografia?

Ventajas de la Cromatografia:1. Análisis Simultaneos.2. Alta Resolución.3. Alta Sensibilidad (niveles

de ppm - ppb)

4. Pequeños Volumenes de Inyección (de 1 a 100 uL).

Tipos de Cromatografia:1. Cromatografia de Capa Fina

(Thin-layer Chromatography - TLC).

2. Cromatografia de Columna (Column Chromatography).

3. Cromatografia de Gases (Gas Chromatography - GC).

4. Cromatografia Líquida de Alta Performance (High performance liquid Chromatography - HPLC).

5. Cromatografia de Fluido Supercrítico (Supercritical Fluid Chromatography - SFC).

6. Electroforesis Capilar (Capillary electrophoresis - CE).

TLC?

HPLC?

GC?

CC?

CE?SFC?

Como es que ocurre la separación en Cromatografia?

• La separación ocurre por migración de los analitos en mezcla a diferentes velocidades a lo largo del sistema cromatográfico.

• La velocidad de migración esta gobernada por diferentes interacciones entre la muestra (conducida por un líquido o gas en movimiento) y el Absorbente (sólido o líquido).

• Definimos así a la “Fase Móvil” y la “Fase Estacionaria”.

Solventes para HPLC

Columnas

y

Fases

Estacionaria

s

Como se ha podido observar, la separación se ha realizado como resultado de una diferencia entre la interacción entre los analitos y la fase estacionaria.

Como es que ocurre la separación en Cromatografia?

Que es un Cromatograma?

Un “Cromatograma” es el registro de los componentes de una mezcla (en forma de un “Pico” y en función del tiempo). Los componentes (separados por la columna), pasan a través de un detector, el cual registra la señal de cada componente en forma de un pico.

Compuesto 1

Compuesto 2

Intensidad de la Señal

Inyección de la muestra

tR1

tR2

t (min)

Que características presenta un Cromatograma?

Un “Cromatograma” debe de presentar Picos de forma simétrica y bien definidos.

Debe de presentar alturas de Pico dentro de la escala de registro.

Debe de tener una línea base consistente.

No debe de presentar bandas anchas.

Para obtener Picos bien definidos deben de controlarse una serie de factores, en caso contrario ocurrirán los ensanchamientos de bandas.

Que información me da un Cromatograma?

Un Cromatograma nos da dos tipos de información:

1. Información Cualitativa: El “Tiempo de Retención” casi siempre es constante bajo las mismas condiciones cromatográficas. Esto nos sirve como un parametro de identificación de sustancias.

2. Información Cuantitativa: El Area del Pico de cada componente es proporcional a la concentración del componente en la mezcla, y este valor es utilizado para realizar cálculos de concentración.

Que información me da un Cromatograma?

Un Cromatograma tambien puede utilizarse para evaluar la eficiencia de separación y la performance de la columna.

Los Principales Parametros de evaluación son:

Factor de Capacidad: k’. Selectividad: Número de Platos Teóricos: N Platos Teóricos Equivalentes: HETP Resolución: Rs

Factor de Capacidad (k’)Que es el Factor de Capacidad?El Factor de Capacidad es un valor númerico que nos indica el grado de separación que puede tener una columna en función del volumen retenido de un analito y el volumen retenido del solvente. El factor de capacidad se expresa en función del volumen por que: El tiempo de retención depende de la razón de flujo y las

dimensiones de la columna, por ello no es un valor apropiado para la comparación de Cromatogramas.

El Factor de Capacidad es independiente de la razón de flujo y de las dimensiones de la columna.

El valor de el Factor de Capacidad utilizando razones de Volumen por lo general debe de oscilar entre 1 a 5 (preferentemente).

Factor de Capacidad (k’)

Inje

cció

n

1 2 3 4

V0

Vr

Vok´ = 0

kV V

Vr' 0

0

Vr = Volumen de Retención del Pico de un Soluto.

V0 = Volumen del Solvente (Pico no retenido)

El tiempo de Retención puede utilizarse para fijar el

Volumen de Retención.

Factor de Capacidad (k’)

k' = k' = 44

6.0 mm ID x 150 mm L. (1 mL/min)(1 mL/min)

2 min (t0)

10 min (t1)

k' = k' = 22

4.6 mm ID x 250 mm L. ((0.60.6 mL/min) mL/min)

4 min (t0)

12 min (t1)

El número de Platos Teóricos (N)Que es el Número de Platos Teóricos?

N = 15000

Columna con buena eficiencia, alto valor de N

El Número de Platos Teóricos es un indice númerico que nos indica el grado de eficiencia de la columna cromatográfica.

Columna con pobre eficiencia, bajo valor de N

N = 2500

El número de Platos Teóricos (N)Que es el Número de Platos Teóricos?

Cromatograficamente, el número de Platos Teóricos es la relación entre el tiempo de retención del soluto y el ancho de la banda del mismo (el incremento del ancho del pico del analito).

Consideraciones:• Los picos de los analitos deben de ser simétricos y de bandas

delgadas.• Los Picos de los analitos que presenten bandas anchas y que

además se encuentren muy cercanos entre si no podrán ser resueltos y serán coeluidos.

El número de Platos Teoricos se expresa como:

Ecuación Original:

N = 16 (tr / W )2

Ecuación Modificada para las mediciones actuales:

N = 5.54 ( tr / W1/2 )2

W

W1/2

H1/2

H

tr

Area

El número de Platos Teóricos (N)Matematicamente y en función de los siguientes parametros cromatograficos:

Altura Equivalente a un Plato Teórico (HETP)

Que es una HETP?

Una altura Equivalente a un Plato Teórico es otro indice númerico que nos indica el grado de eficiencia de la columna cromatográfica. Matematicamente se expresa como:

HETP = L / NL = Longitud de la ColumnaN = Número de Platos Teóricos

El valor de una HETP se traduce como el Plato Teórico mas corto que puede colocarse dentro de la longitud de columna. Esto significa que mientras mas pequeño sea una HETP, podemos colocar mas HETP y la eficiencia de la columna sera mayor.