Cromatografía de intercambio iónico en aminoacidos

La cromatografía de intercambio iónico se lleva a cabo con resinas sintéticas que

contengan grupos reactivos básicos o ácidos o usando celulosa modificada con

grupos funcionales adecuados. (Warton 1973) La separación de una mezcla de

aminoácidos en una columna de intercambio de iones resulta de las interacciones

ionicas e hidrofóbicas entre las moléculas del aminoácido y la resina. El grado

de resolución obtenido depende de estas interacciones y en el flujo de

amortiguadores eluyentes a través de la columna. Una gran cantidad de variables

influencian estas interacciones. El cambio de algunos parámetros puede cambiar

el orden de elusión, pero generalmente los aminoácidos serán eluídos en el orden

del grupo ácido, neutro y básico. Este orden surge de los valores del pKa de los

aminoácidos y de las interacciones hidrofóbicas entre las cadenas laterales no

polares y la resina, las ramificaciones o el tamaño pequeño de las cadenas

laterales no polares disminuyen el tiempo de elusión. (Blackburn 2000)

Para alcanzar una buena separación de una mezcla de aminoácidos, los dos

principales requerimientos son resolución adecuada y buena sensibilidad. La

resolución de dos picos adyacentes depende de la separación de las bandas de sus

centros y del ancho de sus bandas. Una buena sensibilidad para un sistema

requiere una alta concentración del aminoácido en el centro de la

banda. (Blackburn 2000)

El alto de un pico es directamente proporcional al área de la columna y a la raíz

cuadrada de su longitud. Para aumentar la resolución y la sensibilidad se usan

diámetros más pequeños y longitudes más cortas. (Blackburn 2000)

El tamaño de la muestra no debe exceder el 6% del volumen de la columna de

preferencia se usa una muestra más pequeña. El pH del buffer puede ser de

elección personal. Se ha reportado que el pH de la muestra puede favorecer la

resolución del análisis en las primeras partes del cromatograma, pero alteración

de amortiguadores de elusión puede alcanzar los mismos efectos aún con

muestras aplicadas en el buffer de pH2.2 de Moor y Stein. (Blackburn 2000)

Las dimensiones de los picos son afectadas por la tasa de flujo a través de la

columna. El grueso de los picos en el cromatograma varía directamente como

función de la raíz cuadrada de la tasa de flujo y la altura varía inversamente a esta

misma función. En la práctica es difícil conseguir una buena resolución con un

flujo muy lento porque esto aumenta la presión en la parte de atrás de la

columna. (Blackburn 2000)