CONCEPTOS y TECNICAS de BIOTECNOLOGIA (FCEyN UBA ) Biotecnologa Industrial Produccin industrial de Metabolitos BiorreactoresMiryan Cassanello PINMATE Dep. Industrias, FCEyN-UBA E-mail: miryan@di.fcen.uba.ar

Productos biotecnolgicos: estn en todos los sectores de lavida diaria: drogas (genricas y no-genricas) productos de belleza procesamiento de alimentos para humanos y animales procesamiento textil y artculos de limpieza aplicaciones industriales: produccin masiva de alcohol suplementos nutricionales Relevancia econmica de los productos generados industrialmente mediante procesos biotecnolgicos Estadstica: ao 2002(Fuente: Kent y Riegel, 2007)

Productos obtenidos mediante procesos biotecnolgicosProductos Organismo tpico utilizado Mercado mundial (ton/ao) 20 millones 2.000 230.000 50.000 20.000 300.000 30.000 2.000 2.000 40.000 10.000 10.000 (Fuente: Doran, 1995)

Alcoholes cidos orgnicos

Etanol Butanol/acetone Acido ctrico Acido glucnico Acido lctico

Saccharomyces cerevisiae Clostridium acetobutylicum Aspergillus niger Aspergillus niger Lactobacillus delbrueckii Corynebacterium glutamicum Brevibacterium flavum Corynebacterium glutamicum Brevibacterium flavum Penicillium chrysogenum Cephalosporium acremonium Streptomyces aureofaciens

Aminocidos Acido Lglutmico L-lisina L-fenilalanina L-arginina Antibiticos Penicilinas Cefalosporinas Tetraciclinas

Producto Enzimas Proteasas -Amilasa Glucoamilasa Pectinasa Polmeros Vitaminas Vacunas Protenas teraputicas Xantanos Dextrano B12 Difteria Ttanos Insulina Interfern-2 Hormona de crecimiento

Organismo tpico utilizado Bacillus spp. Bacillus amyloliquefaciens Aspergillus niger Aspergillus niger Xanthomonas campestris Leuconostoc mesenteroides Propionibacterium shermanii Corynebacterium diphterie Clostridium tetani Escherichia coli recombinante Escherichia coli recombinante Escherichia coli recombinante o clulas recombinantes de mamferos

Mercado mundial (ton/ao) 600 400 400 100 10 5.000 200 10 < 50 kg/ao Pequea < 20 kg/ao 10 Pequea

Glucosa isomerasa Bacillus coagulans

Biologa BioqumicaBiotecnologa ROJA: Aplicacin en medicina

Ingeniera Qumica QumicaBiotecnologa AZUL: Aplicacin en organismos marinos

Biotecnologa ROJA

Biotecnologa AZUL

BIOTECNOLOGIABiotecnologa VERDEBiotecnologa VERDE: Aplicacin en agroalimentos

Biotecnologa BLANCABiotecnologa BLANCA (o industrial): Aplicacin en la industria en general, productos qumicos, nuevos materiales, biocombustibles, etc.

BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

Biotecnologa : actividad multidisciplinaria que comprende la aplicacin de los principios cientficos y de la ingeniera al procesamiento de materiales por agentes biolgicos para proveer bienes y servicios. (Definicin de la OECD) Agentes biolgicos: clulas microbianas, animales, vegetales y enzimas. Bienes: cualquier producto industrial (alimentos, bebidas, productos medicinales, etc. Servicios: especialmente los relacionados con la purificacin de aguas y tratamiento de efluentes.

Bibliografa libros de textoBioprocess Engineering. Basic concepts, Michael L. Shuler, Fikret Kargi, Prentice Hall Int. Series, 2nd Ed. 2002. Kent and Riegels Handbook of Industrial Chemistry and Biotechnology, J.A. Kent (Ed.), Chapter 30: Industrial Biotechnology: Discovery to Delivery, G. Chotani, T. Dodge, A. Gaertner, M. Arbige, Springer, 11th Ed. 2007. Principios de Ingeniera de los bioprocesos, Pauline M. Doran, Editorial Acribia S.A, Zaragoza, Espaa. 1995. (Traducido 1998) Biochemical Engineering Fundamentals, James E. Bailey, David. F. Ollis, McGraw-Hill Int. Ed., 2nd. Ed. 1986. Biochemical engineering and biotechnology, Ghasem Najafpour, Elsevier, (2007) ISBN-10: 0444528458; ISBN-13: 978-0444528452 Bioreaction Engineering Principles, Jens Nielsen, John Villadsen, Gunnar Lidn. Springer, 2da. Ed. (2005). ISBN-10: 0306473496; ISBN-13: 978-0306473494

Bibliografa algunos reprints de biotecnologia industrialXu, J., Ge, X., Dolan, M.C., Towards high-yield production of pharmaceutical proteins with plant cell suspension cultures. Biotechnology Advances 29 (2011) 278299 Brennan, L., Owende, P., Biofuels from microalgaeA review of technologies for production, processing, and extractions of biofuels and co-products. Renewable and Sustainable Energy Reviews 14 (2010) 557577 Huang, T-K., McDonald, K.A., Review: Bioreactor engineering for recombinant protein production in plant cell suspension cultures. Biochemical Engineering Journal 45 (2009) 168184 Rosche, B., Li, X.Z., Hauer, B., Schmid, A., Buehler, K., Microbial biofilms: a concept for industrial catalysis? Trends in Biotechnology 27 (2009) 636643 Lacaze, G., Wick, M., Cappelle, S., Emerging fermentation technologies: Development of novel sourdoughs. Food Microbiology, 24 (2007) 155160 Gavrilescu, M., Chisti, Y., Biotechnologya sustainable alternative for chemical industry. Research review paper. Biotechnology Advances, 23 (2005) 471499 Butler, M., Animal cell cultures: recent achievements and perspectives in the production of biopharmaceuticals. Appl Microbiol Biotechnol, 68 (2005) 283291 Kretzmer, G., Industrial processes with animal cells. Appl Microbiol Biotechnol, 59 (2002) 135142

Objetivo de la produccin industrial de clulas o de microorganismos

Producir las mismas clulas o microorganismos (biomasa) en gran escala Producir en gran escala compuestos (intracelulares o extracelulares) resultantes del crecimiento celular (metabolitos)

Metabolitos Primarios

Metabolitos Secundarios

Metabolitos primarios-Molculas generalmente sencillas, que participan de los caminos metablicos esenciales. Son casi idnticos en todos los organismos. -Son ms baratos y sencillos de producir, tienen bajo contenido de actividad biolgica y frecuentemente son commodities 1. Componentes esenciales de las clulas/microorganismos: protenas, cidos nuclicos, polisacridos (gelanos, xantanos) y polisteres, cidos grasos (insaturados), esteroles. 2. Derivados del metabolismo intermedio: azcares (fructosa, ribosa, sorbosa), cidos orgnicos (gluconato, cido lctico, ctrico, actico, propinico, succnico, fumrico), alcoholes (xilitol, etanol, glicerol, sorbitol, butanol), aminocidos (Lys, Thr, Glu, Trp, Phe), vitaminas (B2, B12), nucletidos saborizantes (cidos inocnico y guanlico), polisacridos y polisteres de reserva. Microorganismos productores: bacterias, levaduras y hongos

Metabolitos secundarios-Molculas mas complejas, que participan de caminos metablicos no-esenciales, pero confieren capacidades de supervivencia en situaciones de stress. -Son muy variados y su estructura es fuertemente dependiente de la especie y variedad utilizada para su produccin. Se generan en condiciones particulares y son ms valiosos y complicados de producir alto contenido de actividad biolgica -Generalmente son productos especiales (alto precio). Funcionan en los organismos que los producen como: 1. Armas contra otros microorganismos (antibiticos, toxinas, inhibidores enzimticos, pesticidas) 2. Factores de crecimiento (hormonas) 3. Ionforos 4. Agentes de interaccin microbiana 5. Efectores externos

PROCESOS BIOTECNOLOGICOS o FERMENTACIONESProcesos que se llevan a cabo en un bio-reactor mediante los cuales se transforman los sustratos de un medio de cultivo (materias primas) en metabolitos y/o en biomasa (productos) empleando para este fin microorganismos, clulas o enzimas. Biorreactor o Fermentador Operaciones unitarias Operaciones unitarias

Principales etapas de un proceso biotecnolgico industrial:Fermentacin Propagacin de los cultivos Esterilizacin Preparacin de medios Separacin Purificacin Tratamiento de efluentes

1) Propagacin de cultivos: comienza en un tubo de ensayo o un tubo congelado o liofilizado donde se conserva la cepa de inters, o de una colonia del microorganismo previamente seleccionado. Se propaga en el laboratorio progresivamente aumentando el volumen del medio de cultivo. 2) Fermentacin: Se prepara el medio de nutrientes y se esteriliza. Se siembra un tanque de inculos cuyo volumen depende de la escala industrial. Vinoculos~50-1000L y Vfermentador industrial~10-1000 m3).

Principales etapas de un proceso biotecnolgico industrial:Fermentacin Propagacin de los cultivos Esterilizacin Preparacin de medios Separacin Purificacin Tratamiento de efluentes

3) Separacin y purificacin: operaciones mecnicas de ruptura de clulas; separacin de insolubles por filtracin, centrifugacin o sedimentacin; separaciones primarias por extraccin, absorcin, adsorcin, ultrafiltracin; purificacin por extraccin lquidolquido, extraccin en dos fases acuosas o cromatografa de afinidad; aislamiento y acondicionamiento del producto. 4) No tiene relacin directa con el producto pero es una etapa imprescindible por los volmenes involucrados y para preservar el medio.

Seleccin (screening)En la seleccin del microorganismo/clula, se debe tener en cuenta: 1. La cepa a utilizar debe ser genticamente estable. 2. La velocidad de crecimiento debe ser alta. 3. La cepa debe estar libre de contaminantes. 4. Sus requerimientos nutricionales deben cubrirse con medios de cultivo de costo reducido. 5. Deben ser de fcil conservacin por largos perodos de tiempo sin prdida de sus caractersticas. 6. Debe realizar el proceso fermentativo completo en tiempo corto. 7. Si el objetivo es un producto, este debe ser de alto rendimiento y de fcil recuperacin a partir del medio de cultivo.

Los nuevos mtodos de screening incorporan tcnicas de ingeniera gentica para crear diversidad.

Preparacin de medios de cultivo EsterilizacinLos componentes de los medios de cultivo son los efectores externos de naturaleza qumica que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formacin de productos y suministrar energa para el mantenimiento celular. Componentes de un medio de cultivo: 1. Macronutrientes, agregados en concentraciones de g/L, fuentes de C, N, S, P, K y Mg 2. Micronutrientes o elementos trazas, representados por las sales de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co, agregados en conc. de mg o g/L 3. Factores de crecimiento, constituidos por compuestos orgnicos que no son sintetizados por las clulas y de funcin metablica especfica; se suministran en baja concentracin (vitaminas, algunos aminocidos, etc.)

Preparacin de medios de cultivo EsterilizacinLos medios pueden clasificarse considerando la naturaleza qumica de los componentes en: 1. Medios sintticos o medios qumicamente definidos 2. Medios complejos, en cuya composicin intervienen sustancias de origen animal o vegetal (ej.: extracto de levadura, macerado de maz, harina de soja, etc.) que aportan las sustancias fundamentales pero son qumicamente indefinidas y de composicin variable. Cualquiera sea el medio de cultivo, se debe esterilizar previamente a ponerse en contacto con el inculo. Esterilizar significa eliminar toda forma de vida de un medio o material. Generalmente se lleva a cabo por filtracin o calentamiento.

Separacin y purificacin (downstream): depende de laeficiencia del proceso y del producto a obtener

Fermentaciones - fermentadores o biorreactoresEs el corazn del proceso y debe optimizarse para evitar posteriores etapas de separacin y purificacin. discontinuas o batch semicontinuas (fed-batch) Fermentaciones continuas Para el diseo de los biorreactores se debe considerar la cintica del crecimiento de las clulas o microorganismos (biomasa) y la velocidad de formacin de los productos deseados. Cintica de crecimiento de biomasa Definiciones Crecimiento en cultivos discontinuos o batch: Factores que afectan Cuantificacin de la velocidad de crecimiento: Modelos, Ecuacin de Monod Crecimiento en cultivos continuos: Quimiostato, turbidistato

Cintica de crecimiento microbianoSustrato + biomasa mayor cantidad productos + de biomasa extracelulares

S + XCrecimiento

P

+

nX

aumento en el nmero de clulas aumento del tamao de las clulas

El crecimiento microbiano es un ejemplo de reaccin autocataltica. La velocidad de crecimiento est relacionada con la concentracin de clulas. Velocidad especfica neta de crecimiento (h-1): X: concentracin msica de clulas (g/L) t: tiempo (h)

1 dX neta X dt

La velocidad especfica neta de crecimiento es la diferencia entre la velocidad de crecimiento y la velocidad de desaparicin de biomasa por muerte celular o por metabolismo endgeno:

neta = g k dTambin se puede expresar la velocidad en funcin de la concentracin de nmero de clulas en lugar de la concentracin msica de las mismas. Si no se pueden medir las dos, se prefiere la concentracin msica. Formas de medir la concentracin de clulas Se busca un mtodo rpido, fcil de seguir en lnea o de respuesta rpida. Directos Mtodos Indirectos

Determinacin de la concentracin msica de clulas:Mtodos directos (en ausencia de otros slidos en suspensin): Masa de clulas secas (centrifugado/filtrado/lavado/secado) Volumen de clulas centrifugadas en condiciones estndar Absorcin de luz por clulas en suspensin Mtodos indirectos: se basan en un efecto que inducen, como ser la velocidad de consumo de un sustrato o de formacin de un producto. Productos: etanol, CO2 Sustratos: consumo de O2 o de un sustrato base de C o N Propiedades fsico-qumicas: viscosidad, pH Ejemplo: seguir la concentracin de ATP, proporcional a la masa de clulas.

luciferina + ATP + O 2 LUZ

luciferasa

Sensible > 10-12 gATP/L

Cintica de crecimiento de un cultivo en batchEtapas: 1) de latencia o induccin 2) de crecimiento exponencial 3) de desaceleracin 4) estacionario 5) de muerte o declinacin celular 3)4) Estacionario: velocidad de crecimiento nula. Las clulas an son de Desaceleracin: por consumo de un nutriente esencial o generacin 5) Muerte: baja exponencial:inculo multiplicacin de lmiteinculo el nmero rpida al medio. Depende del con 1) Latencia: adaptacin crecimiento desbalanceado, clulas deben 2) Crecimientotxicos del clulas, difcil definir el las clulas la subproductos activas y pueden producir metabolitos secundarios (ej. antibiticos, etapa anterior. (edad y a las condiciones hostiles. los crecimiento balanceado (composicin de clulas constante). readaptarsetamao) y dede lanutrientes. Se puede adaptar ex-situ. hormonas) productos desregulacin celular

1) Latencia: adaptacin del inculo al medio. Depende delinculo (edad y tamao) y de los nutrientes. Se puede adaptar ex-situ. 2) Crecimiento exponencial: rpida multiplicacin de clulas crecimiento balanceado (composicin de clulas constante). 3) Desaceleracin: por consumo de un nutriente esencial o generacin de subproductos txicos crecimiento desbalanceado, las clulas deben readaptarse a las condiciones hostiles. 4) Estacionario: velocidad de crecimiento nula. Las clulas an son activas y pueden producir metabolitos secundarios (ej. antibiticos, hormonas) productos de la desregulacin celular 5) Muerte: baja el nmero de clulas, difcil definir el lmite con la etapa anterior.

Crecimiento balanceado: todos los componentes de las clulas crecen con la misma velocidad la composicin media de las mismas permanece constante. Es vlido para la etapa de crecimiento exponencial. exponencial En este perodo, la velocidad de crecimiento es independiente de los nutrientes y resulta en una cintica de primer orden.

1 dX dX neta t g neta = = neta dt X = X 0e X dt XTiempo necesario para duplicar la biomasa:

X = 2X 0

ln(2) d = neta

Crecimiento no balanceado: los componentes de las clulas no crecen con la misma velocidad la composicin media se modifica. Esta situacin caracteriza especialmente a la etapa estacionaria El estrs producido por la falta de nutrientes o por la existencia de subproductos o toxinas inhibidoras que generan un medio hostil induce una reestructuracin de las clulas para adaptarse a las nuevas condiciones. Puede ocurrir: La concentracin msica de clulas (X) es constante pero baja el nmero de clulas viables. X baja por lisis de clulas. Puede aparecer un segundo perodo de crecimiento, los productos de lisis o las clulas muertas constituyen un sustrato alternativo (crecimiento crptico). X constante pero su metabolismo es activo; cambia la regulacin celular produciendo metabolitos secundarios.

g neta = g k d

Coeficiente de mantenimiento: se emplea para definir la velocidad especfica de consumo de sustrato para energa de mantenimiento.

1 dS m= X dt m

Energa de mantenimiento: necesaria para mantener la membrana celular activa y el transporte de nutrientes, y para funciones metablicas esenciales como la movilidad y la reparacin de estructuras daadas.

Si no hay sustrato disponible, el mantenimiento inducir prdida de masa celular (metabolismo endgeno para adaptarse al medio).

Otras definiciones: Coeficientes de rendimiento: se definen en base rendimiento a la cantidad consumida de otro componente. Rendimiento de formacin de clulas por masa X YX /S = de sustrato consumida (g clulas/g S) S YX/S es un valor constante en la etapa de crecimiento exponencial. Luego de la etapa de crecimiento exponencial, YX/S deja de ser constante, es un rendimiento aparente porque el sustrato se emplea para otros fines:

S = Sformacion + Sformacion + Senergia + Senergiade biomasa de productos para crecimiento

para mantenimiento

Tambin se pueden definir rendimientos basados en otros componentes:

X P Y ; YP/S = = X / O2 DO S

Ejemplo: Organismos creciendo en condiciones aerbicas en glucosa; para la mayora de las bacterias y levaduras: (en condiciones anaerbicas suelen ser menores) Los rendimientos dependen del medio y de la fuente de C. Para la mayora de los casos:

YX /S = 0,4 0,6 g / g ; YX/O = 0,9 1,4 g/g2

YX /S = 1 0,4 g/g g biomasa g de C consumido

Relacin del crecimiento de biomasa con la formacin de productos: Definimos la velocidad 1 dP especfica de formacin qP = = YP / X g X dt de producto, qPSe encuentran 3 situaciones: (a) qP asociada al crecimiento celular, ej: produccin de una enzima constitutiva de la biomasa (metabolito primario).

q P = g = YP / X

(b) qP parcialmente asociada (etapa de desaceleracin y estacionaria), ej: fermentacin de cido lctico, xantanos y algunos metabolitos secundarios. q = +P g

(c) qP no-asociada al crecimiento celular (etapa estacionaria, donde la g=0) ej.: metabolitos secundarios como antibiticos.

q P = = cons tan te;

g = 0

Relacin del crecimiento de biomasa con la formacin de productos: 1 dP 1 dX = YP / X g = YP / X qP = X dt X dt

q P = g

Asociada

Parcialmente asociada

q P = g +

No asociada

qP =

Metabolitos primarios

Metabolitos secundarios

Factores que influyen Temperatura del medioLa velocidad de crecimiento disminuye por encima de la Top La velocidad de crecimiento aproximadamente se duplica cada T = 10C

-psicrfilos (Top < 20C) -mesfilos (20