Curso de Genómica - UAT (VHIR) 2012 - Arrays de Proteínas Zeptosens
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Institut de RecercaHospital Universitari Vall d’Hebron
Arrays de ProteínasZEPTOSENS
5 de Diciembre del 2012
Institut d’Investigació Sanitària de l’Instituto de Salud Carlos III (ISCIII)
Arrays de Proteínas1
2
3
4
5
6 7
7
7
Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología Zeptosens
Flujo de trabajo de un ensayo con Reverse Protein Arrays
Optimización del Servicio en la UAT
Resultados y Análisis de Datos
Programa
Arrays de Proteínas
Definición
Es una técnología de alto rendimiento que permite el estudio en forma simultánea y
masiva de miles de protéinas.
Dispositivo que utiliza proteinas inmovilizadas de forma ordenada en soportes sólidos
(vidrio, bolas, pocillos) para ser posteriormente interrogadas con otras moléculas con el
fin de detectar interacciones específicas.
Ventajas
Rápida, automatizada
Muy sensible
Económica, consume pequeñas cantidadades de muestra y reactivos
Muchos datos a partir de un experimento
1
Áreas de aplicación:
1.- Diagnóstico: Descubrir nuevos biomarcadores; efecto de nuevos fármacos.
2.- Proteómica: Estudio de perfiles diferencial de protéinas
3.- Análisis funcional Proteico: Interacciónes proteina-proteina; propiedades de unión al ligando de
receptores; actividad enzimática.
4.- Caracterización de Anticuerpos: reactividad cruzada y especificidad; epitope mapping.
Arrays de Proteínas
Tipos de Arrays de Proteínas
1
Necesidad de la técnica
El elevado grado de redundancia de las vías de señalización celular pueden compensar vías de transducción anómalas.
La cantidad de mRNA a menudo no es un reflejo de los niveles de expresión protéica.
El análisis del mRNA no proporciona información acerca de las modificaciones post-transduccionales a las que están sometidas las proteinas.
Los cambios genéticos pueden ser detectados en biopsias de tejido tumoral, pero la sangre y otros fluidos corporales contienen poca o ninguna cantidad de mRNA para propósitos diagnóstico.
Arrays de Proteínas1
Arrays de Proteínas1
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Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología Zeptosens
Flujo de trabajo de un ensayo con Reverse Protein Arrays
Optimización del Servicio en la UAT
Resultados y Análisis de Datos
Programa
Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología Zeptosens2
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Esta tecnología se basa en el Principio deConducción planar de ondas. Gracias aldiseño del vidrio donde se crean los arrayspodemos excitar solo la muestra y reducir elruido de fondo.
Arrays en fase Reversa (RPA=Reverse Protein Array)
Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología Zeptosens
ZeptoMark RPA
• 1x32x4_3T_AAAAAA
• 3x32x4_3T_ABCABC
• 6x32x4_3T_ABCDEF
Distribución Muestras en el chip:
2 Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología Zeptosens
• Lisados proteicos de tejidos• Lisados proteicos de cultivos de células• Suero• Orina
Tipo de Muestras que admite el chip:
Nanoplotter 2.1(80 chips/480 arrays)
Arrayer- Cell Lysate Spotter
ZeptoGOGChip blocking Station
Zeptocarrier
Equipamiento
Lysis buffer &Spotting Buffer
2 Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología Zeptosens
ZeptoreaderMicroarray Reader
1 Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología Zeptosens
Arrays de Proteínas1
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Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología Zeptosens
Flujo de trabajo de un ensayo con Reverse Protein Arrays
Optimización del Servicio en la UAT
Resultados y Análisis de Datos
Programa
Flujo de Trabajo
Test d
e Bra
dfor
d
Test de Bradford para la Normalización del lisado protéico a 2 mg/ml. Los pasos 1-3 los realiza el usuario y el resto el personal técnico de la UAT.
1 2 3 4
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3
Guía Experimental Arrays de Proteínas Elaboración del Diseño experimental entre las partes implicadas en la realización del experimento.
Consideraciones:
• Aplicación
• Elección de Anticuerpos. Los anticuerpos los proveerá el usuario. Zeptosens dispone de una lista
validada de anticuerpos:
Zeptosens dispone de: list of validated antibodies:
http://www.zeptosens.com/en/pdf/ZeptoMARK_Reverse_Array_Validated_Antibodies_LR.pdf
• En caso de necesitar un Anticuerpo que no figure en la lista, se requerirá una validación previa del
mismo.
La obtención del Lisado proteico la realiza el usuario. Consideraciones:
• Diferentes protocolos con diferentes tampones de lisis en función fuente proteica
• Si la fuente protéica es a partir de suero, se recomienda la realización del llamado proceso de depleción de
plasma, con el que se eliminan las proteinas más abundantes así como tb las inmunoglobulinas, previa al
espoteado de la muestra. (IgY/Supermix plasma depletion columns; Genway, from Sigma-Aldrich)
La cuantificación proteica (así como el resto de la técnica) la realiza la parte técnica responsable de la
plataforma en la UCTS mediante Test de Bradford. Consideraciones:
• Se necesitan 2.5 µl de lisado proteico para la cuantificación.
• Para proceder al espoteado se recomienda empezar con un mínimo de 2 mg/ml de lisado proteico en un
volumen mínimo de 10 µl. En caso de no conseguir la mínima concentración recomendada es decisión del usuario la
continuación del procedimiento del experimento o la obtención de más lisado proteico con el fin de conseguir las
cantidades recomendadas.
Flujo de Trabajo3
Arrays de Proteínas1
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Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología Zeptosens
Flujo de trabajo de un ensayo con Reverse Protein Arrays
Optimización del Servicio en la UAT
Resultados y Análisis de Datos
Programa
Optimización del Servicio en la UAT
Fuente protéica: Lisados celulares de MCF7 obtenidos por el personal técnico de la UCTS. Lisados celulares de JIMT1 y KPL4 obtenidos por personal grupo Violeta (Onco). Muestras humanas de orina obtenidas por personal grupo Ana Meseguer (dpt
Nefropatologia renal)
Fuente de Anticuerpos Primarios (Validados previamente por western Blot)
Comprados por la UCTS (AKT, p-AKT, P53, p-P53) Cedidos por los usuarios
Fuente de Anticuerpos Secundarios Comprados por la UCTS
El resto de reactivos necesarios, incluidos los arrays, son los que se compraron por la UCT en el 2010.
4
Obtención Lisado Proteico de MCF7
Lisado 1
+ =
450 µl Tampón Lisis zeptosens
+1.4 mg/ml
Lisado Proteico
Lisado 2
~70% confluentes
~70% confluentes ~50% confluentes
+ + =3 mg/ml
Lisado Proteico
MCF7 es una línia celular humana de cáncer de mama. Tampón de Lisis CLB1, Zeptosens#9000 (75 µl/10cm2 pocillo en placas de 6p y 450 µl en placa de 60cm2) Cuantificación proteica mediante Test de Bradford (recomendado por zeptosens) El lisado proteico tiene que estar normalizado a 2 mg/ml.
75 µl/pocillo Tampón Lisis
zeptosens
+
Test de Bradford
4 Optimización del Servicio en la UAT
Lisado 22 mg/ml
1A_Exp3 Humidificat/estufa
Lisado 11.4 mg/ml
Mg/ml0.2 0.1
0.050.150.2 0.1
0.05
L1 L1
L1
L1
L1
L2
L2
L2
L2
L2
(Mg/ml)
0.150.2 0.10.05
Diluciones Lisado
A
B
C
D
E
F
Chip-1
1/500PS6-240/244
1/500P4EBP16S
1/500P53-p
1/250AKT
1/250PS6-240/244P
1/250P4EBP16S
EXPRESION PROTEICA DE PS6-240/244 EN MCF7
BSA-AlexaFluor647
4 Optimización del Servicio en la UAT
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Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología Zeptosens
Flujo de trabajo de un ensayo con Reverse Protein Arrays
Optimización del Servicio en la UAT
Resultados y Análisis de Datos
Programa
Institut de RecercaHospital Universitari Vall d’Hebron
Arrays de ProteínasZEPTOSENS
5 de Diciembre del 2012
Institut d’Investigació Sanitària de l’Instituto de Salud Carlos III (ISCIII)
Ferran Briansó Castilla (UEB) [email protected]
Resultados y Análisis de Datos
de Zeptosens
Arrays de Proteínas1
2
3
4
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6 7
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Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología Zeptosens
Flujo de trabajo de un ensayo con Reverse Protein Arrays
Optimización del Servicio en la UAT
Resultados y Análisis de Datos
Programa
Ferran Briansó Castilla (UEB) [email protected]
5Resultados y Análisis de Datos
5.1 - Visualizado y análisis básico de resultados (ZeptoView)
5.2 - Exportar resultados
5.3 - Análisis y representación de datos “a medida” en la UEB
Visualización de resultados: Calcular datos a partir de las imágenes5
Árbol del
experimento(nodos
expandibles)
Selector de
imágenes
Panelde visualización
de resultados
Visualización de resultados: Calcular datos a partir de las imágenes5
Calcular resultados
Visualización de resultados: Calcular datos a partir de las imágenes5
Configuraciónde
parámetros
Visualización de resultados: Árbol de selección de datos5
Selección del chip
Visualización de resultados: de un array en un chip5
Selección del
array
Visualización de resultados: “Base Module” (RNFI values)5
Valores obtenidos porcada dilución
Visualización de resultados: “Base Module” (RNFI values)5
Visualización delarray completo
Visualización de resultados: “Reverse Array Module” (RFI values)5
Valores calculados por cada posición
Visualización de resultados: “Reverse Array Module” (RFI values)5
Gráfico de valores RFI calculados
Visualización de resultados: “Concentration Series”5
Series de concentración(2 valores por cada dilución relativa)
Resultados y Análisis de Datos
5.1 - Visualizado y análisis básico de resultados (ZeptoView)
5.2 - Exportar resultados
5.3 - Análisis y representación de datos “a medida” en la UEB
5
Exportar resultados: tablas de RNFI5
Desde el nodo de imágenes exportar tablas RNFI
Exportar resultados: tablas de RNFI5
Exportar resultados: tablas de RFI5
Desde el nodo de imágenes exportar tablas RFI
Exportar resultados: tablas de RFI5
Exportar resultados: gráficos (?!?)5
Parámetros gráficos configurables caso a caso
(no en global?!?!)
Resultados y Análisis de Datos
5.1 - Visualizado y análisis básico de resultados (ZeptoView)
5.2 - Exportar resultados
5.3 - Análisis y representación de datos “a medida” en la UEB
5
Análisis avanzado y representación de datos “a medida”5
Análisis avanzado y representación de datos “a medida”
Estudio de los valores obtenidos en cada serie de 8 lecturas de cada posición del array
5
0.2 0.10.05
0.150.2 0.10.05
L1 L1
L1
L1
L1
L2
L2
L2
L2
L2
(Mg/ml)
0.150.2 0.10.05
Diluciones Lisado
Análisis avanzado y representación de datos “a medida”
Construcción de la regresión linealy detección de valores extraños
5
Análisis avanzado y representación de datos “a medida”
RFI = Valor predicho parauna RelDilution de 0.625
lecturas reales a cada dilución relativa
límite superior de la predicción puntual
límite superior de la predicción conjunta
recta de regresión a partir de los 8 valores
límite inferior de la predicción conjunta
límite inferior de la predicción puntual
según el nivel de confianza(usualmente a 95%)
5
Análisis avanzado y representación de datos “a medida”
Representación gráfica agrupando por
experimentos, chips, arrays, anticuerpo factores secundarios ...
Que nos permitan comparar muestrasentre ellas, según condiciones expe-rimentales...
5
Análisis avanzado y representación de datos “a medida”5
Análisis avanzado y representación de datos “a medida”
Otras formas de representación gráfica
5
Análisis avanzado y representación de datos “a medida”
Outputs (pdf, jpg...) hechos a medida(y con calidad para ser publicados!)
5
http://ueb.vhir.org/NGS2012
Materiales disponibles en: