DE TESIS PARA OPTAR EL GRADO ACADÉMICO DE

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

ESCUELA DE POSGRADO

UNIDAD DE POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

Eficiencia de la bioaumentación y bioestimulación en la

biodegradación de petróleo por bacterias nativas,

provincia de Talara, región Piura

TESIS

PARA OPTAR EL GRADO ACADÉMICO DE:

MAESTRA EN CIENCIAS

MENCIÓN:

GESTIÓN AMBIENTAL

Autora: Br. Baca Llontop, Katty Yesenia

Asesor: Dr. Gonzales Veintimilla, Federico

TRUJILLO - PERÚ

2019

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

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ii

JURADO EVALUADOR

_____________________________

Dr. Heber Robles Castillo

Presidente

_____________________________

Angelo Lujan Bulnes

Secretario

_____________________________

Federico Gonzales Veintimilla

Vocal / Miembro



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iii

DEDICATORIA

A mi esposo y compañero de vida Derson,

por su apoyo constante, por la paciencia,

motivación y gran soporte que me ha

brindado todo este tiempo, pero más que

nada, por su amor incondicional.

A mi hijo Derson Antonio, porque

es mi orgullo y mi principal motivo,

porque aun a su corta edad me ha

enseñado y me sigue enseñando

muchas cosas.

A mis padres Maritza y Antonio, por

haberme formado en la persona que soy,

por confiar en mí y brindarme su apoyo

para no rendirme en el trayecto de mi

formación personal y profesional.

A mi hermanas, Janira, Yuri y

Maryan, porque han estado a mi lado

siempre, y por incentivarme para

seguir adelante y alcanzar mis

objetivos.



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iv

AGRADECIMIENTO

Gracias a Dios por la vida, porque su amor

y bondad no tiene fin, por iluminarme el

camino y darme sabiduría para permitir

cumplir esta meta en mi vida profesional.

A mi hijo Derson Antonio por ser

mi razón y ganas de seguir saliendo

adelante y por llenarme de amor y

alegría con solo mirarlo.

A mi esposo Derson por ser mi

complemento en la vida, por su amor y

comprensión y por incentivarme a culminar

esta tesis.

A mis padres Maritza y Antonio, por

ayudarme en todo momento de mi

formación académica; y a mis

hermanas, por estar presentes en cada

etapa importante en mi vida, y porque

en conjunto ustedes llenan mi vida de

orgullo.

A mi estimador asesor de Tesis, Dr.

Federico, por haber aceptado ser mi guía en

esta tesis, por su apoyo incondicional, su

confianza y disponibilidad que ha tenido en

todo momento.



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ÍNDICE

RESUMEN

ABSTRACT

I. INTRODUCCIÓN .............................................................................................................. 1

1.1. Realidad problemática ............................................................................................ 1

1.2. Antecedentes de la investigación ............................................................................ 3

1.3. Objetivos ................................................................................................................. 7

1.4. Hipótesis ................................................................................................................. 7

1.5. Justificación ............................................................................................................ 7

II. MARCO TEÓRICO ........................................................................................................... 8

2.1. Biodegradación del petróleo ................................................................................. 10

2.2. Biorremediación .................................................................................................... 13

2.3. Bioestimulación .................................................................................................... 15

2.4. Bioaumentación .................................................................................................... 17

2.5. Consorcio microbiano ........................................................................................... 18

III. MATERIAL Y MÉTODO ............................................................................................... 19

3.1. Material de estudio ................................................................................................ 19

3.1.1. Material biológico ................................................................................................. 19

3.2. Métodos y Técnicas .............................................................................................. 19

3.2.1. Población y muestra de estudio ........................................................................... 19

3.2.2. Variables en estudio .............................................................................................. 19

3.2.3. Tipo de estudio y diseño de contrastación de hipótesis .................................... 19

3.2.4. Reactivación de cultivos de bacterias hidrocarbonoclásticas ........................... 22

3.2.5. Primera fase: Cuantificación del tiempo de utilización del petróleo y número

de unidades de actividad emulsificante (UAE mL-1) ........................................................ 22

3.2.6. Segunda fase: Eficiencia de la bioaumentación y bioestimulación en la

biodegradación de petróleo .................................................................................................. 25



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vi

a. Lugar de recolección del suelo experimental contaminado ............................. 25

b. Obtención del suelo experimental contaminado ................................................ 25

c. Caracterización del suelo experimental contaminado ....................................... 27

d. Acondicionamiento de suelo experimental contaminado en terrarios ............ 33

e. Propagación de bacterias para la bioaumentación ............................................. 33

f. Eficiencia de la bioaumentación y bioestimulación .......................................... 35

g. Análisis estadístico de los datos .......................................................................... 37

IV. RESULTADOS................................................................................................................. 38

4.1. Tiempo de utilización del petróleo y número de unidades de actividad

emulsificante .................................................................................................................... 38

4.2. Características químicas, microbiológicas y toxicidad del suelo experimental

contaminado con petróleo ................................................................................................ 38

4.3. Eficiencia de la bioaumentación y bioestimulación en la biodegradación de

petróleo ............................................................................................................................ 41

V. DISCUSIÓN...................................................................................................................... 49

VI. CONCLUSIONES ............................................................................................................ 55

VII. RECOMENDACIONES .................................................................................................. 56

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................... 57

IX. ANEXOS ........................................................................................................................... 66



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vii

Índice de tablas

Tabla 1. Tiempo requerido para la utilización del petróleo como fuente de carbono y

energía por los cultivos de trabajo .................................................................... 39

Tabla 2. Unidades de actividad emulsificante alcanzadas por los cultivos de trabajo ... 40

Tabla 3. Contenido de hidrocarburos totales y número más probable de

microorganismos totales e hidrocarbonoclásticos en el suelo experimental

contaminado con petróleo ................................................................................. 40

Tabla 4. Nivel de toxicidad del suelo experimental contaminado con petróleo

determinado en la germinación de Raphanus sativus L., 2018......................... 41

Tabla 5. Número más probable de microorganismos totales (NMP g-1) durante la

biodegradación de petróleo en terrarios ............................................................ 43

Tabla 6. Número más probable de microorganismos hidrocarbonoclásticos (NMP g-1)

durante la biodegradación de petróleo en terrarios ........................................... 44

Tabla 7. Índice de germinación de Raphanus sativus L. durante la biodegradación de

petróleo en terrarios .......................................................................................... 45

Tabla 8. Nivel de toxicidad en el índice de germinación de Raphanus sativus L. durante

la biodegradación de petróleo en terrarios ........................................................ 46

Tabla 9. Características del suelo biodegradado con bioaumentación consorcio mixto +

bioestimulación durante 120 días ..................................................................... 48



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viii

Índice de figuras

Figura 1. Vía principal en el metabolismo microbiano de los hidrocarburos aromáticos

policíclicos ........................................................................................................ 12

Figura 2. Diseño experimental completamente aleatorio para determinar la eficiencia de

la bioaumentación y bioestimulación en la biodegradación de petróleo en

suelos contaminados ......................................................................................... 21

Figura 3. Colonias características de las bacterias hidrocarbonoclásticas ....................... 23

Figura 4. Caldo Bushnell Haas - 1% de petróleo (50 µL) con indicador púrpura de

bromocresol ...................................................................................................... 23

Figura 5. Caldo extracto de levadura para la cuantificación del número de unidades

emulsificantes .................................................................................................. 24

Figura 6. Vista satelital del lugar de muestreo en el distrito de Puerto Eten, región

Lambayeque ...................................................................................................... 26

Figura 7. Muestra lista para la técnica de “cuarteo y amontonamiento” ......................... 28

Figura 8. Suspensión del suelo experimental contaminado ............................................. 28

Figura 9. Dilución de la submuestra de suelo experimental contaminado ....................... 29

Figura 10. Caldo nutritivo con microorganismos totales ................................................... 31

Figura 11. Caldo Bushnell con microorganismos hidrocarbonoclásticos .......................... 31

Figura 12. Prueba de germinación de semillas de Raphanus sativus L. ............................ 32

Figura 13. Semillas de rabanito en Placa conteniendo suelo humedecido .......................... 32

Figura 14. Medición de las radículas emergidas ................................................................ 34

Figura 15. Suelo contaminado distribuido en terrarios ...................................................... 34

Figura 16. Determinación del tiempo de utilización del petróleo (a) testigo (b) caldo

inoculado........................................................................................................... 39



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ix

RESUMEN

El objetivo de la investigación fue determinar la eficiencia de la bioaumentación y

bioestimulación en la biodegradación de petróleo por bacterias nativas de la provincia de

Talara, región Piura. En la fase descriptiva, se cuantificó el tiempo de utilización del

petróleo y el número de unidades de actividad emulsificante (UAE) de cinco cultivos de

bacterias hidrocarbonoclásticas. En la fase explicativa, se determinaron las características

químicas, microbiológicas y toxicidad del suelo experimental, así como la eficiencia de la

bioaumentación y bioestimulación en la biodegradación de petróleo. Se determinó que las

bacterias hidrocarbonoclásticas utilizaron el petróleo en un tiempo de 60 y 80 horas, y la

cuantificación de UAE estuvo en un rango de 0,716 - 1,569 UAE mL-1. El suelo

experimental presentó un contenido de hidrocarburos totales (38 899 mg kg-1),

microorganismos totales (2,4x106 NMP g-1) e hidrocarbonoclásticos (1,5x105 NMP g-1) y

nivel de toxicidad severo según el índice de germinación del rabanito. La máxima

población de microorganismos totales e hidrocarbonoclásticos se alcanzó a los 60 y 90

días, respectivamente. Los índices de germinación incrementaron y los niveles de toxicidad

disminuyeron. Con el tratamiento bioaumentación consorcio mixto + bioestimulación se

alcanzó un nivel bajo de toxicidad a los 90 días y 78% de eficiencia en la biodegradación

de petróleo. Se demostró la eficiencia de la biodegradación de petróleo por bioaumentación

con un consorcio mixto más bioestimulación.

_________________________________________________________________

Palabras clave: Bioaumentación, bioestimulación, bacterias hidrocarbonoclásticas,

hidrocarburos.



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ABSTRACT

The objective of the research was to determine the efficiency of bioaugmentation and

biostimulation in the biodegradation of petroleum by bacteria native to the province of

Talara, Piura region. In the descriptive phase, the time of use of the petroleum and the

number of emulsifying activity units (EAU) of five cultures of hydrocarbonoclastic

bacteria were quantified. In the explanatory phase, the chemical, microbiological and

toxicity characteristics of the experimental soil were determined, as well as the efficiency

of the bioaugmentation and biostimulation in the petroleum biodegradation. It was

determined that the hydrocarbonoclastic bacteria used the oil in a time of 60 and 80 hours,

and the quantification of EAU was in a range of 0,716 – 1,569 EAU mL-1. The

experimental soil presented a total hydrocarbon content (38899 mg kg-1), total

microorganisms (2,4x106 NMP g-1) and hydrocarbonoclastic microorganisms (1,5x105

NMP g-1) and severe toxicity level according to the germination index of the radish. The

maximum population of total microorganisms and hydrocarbonoclastic was reached at 60

and 90 days, respectively. Germination rates increased and toxicity levels decreased. With

the bioaugmentation mixed consortium bioassay + biostimulation treatment, a low level of

toxicity was reached at 90 days and 78% efficiency in petroleum biodegradation. The

efficiency of the biodegradation of oil by bioaugmentation was demonstrated with a mixed

consortium plus biostimulation.

___________________________________________________________________

Key words: Bioaugmentation, biostimulation, hydrocarbonoclastic bacteria, hydrocarbons.



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1

I. INTRODUCCIÓN

1.1. Realidad problemática

Los hidrocarburos de petróleo (PH) son considerados como la principal fuente de

energía y materiales para la mayoría de industrias (Varjani & Upasani, 2016); los

contaminantes producto de la extracción e industrialización de estos combustibles fósiles

son compuestos recalcitrantes, los cuales son clasificados como prioritarios por la Agencia

para Sustancias Tóxicas y Registro de Enfermedades (ATSDR, 2011). Uno de los problemas

ambientales más importantes es la contaminación de ecosistemas terrestres y acuáticos por

derrames de hidrocarburos de petróleo y sus derivados. En el caso de los suelos, las

principales consecuencias ambientales son: la reducción o inhibición del desarrollo de la

cobertura vegetal en el lugar del derrame, cambios en la dinámica poblacional de la fauna,

de la biota microbiana y contaminación por infiltración a cuerpos de agua subterráneos.

Además del impacto ambiental negativo, los derrames de hidrocarburos generan impactos de

tipo económico, social y de salud pública en las zonas aledañas al lugar afectado (Díaz,

Alarcón, Ferrera, Almaraz y García, 2013; Pardo, Perdomo y Benavides, 2004).

Actualmente se hace uso de técnicas físico-químicas para la recuperación de áreas

contaminadas, tales como la extracción de hidrocarburos por vacío, lavado del suelo

contaminado con agua, incineración y recuperación electrocinética. Con algunas de estas

técnicas se han conseguido efectos positivos, pero su elevado costo económico constituye un

obstáculo para su empleo. Por ello, se ha optado por la búsqueda de alternativas viables que

sean ambientalmente correctas, simples y económicas para la eliminación de los

hidrocarburos contaminantes de los suelos. En este contexto, las técnicas de biorremediación

son una alternativa saludable frente al deterioro progresivo de la calidad del ambiente por el

derramamiento de crudos.



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La biorremediación consiste en el uso de plantas y microorganismos naturales o

modificados genéticamente para neutralizar sustancias tóxicas, disminuyendo o eliminando

su toxicidad para la salud humana y el ambiente. La biorremediación con microorganismos

es una tecnología muy competitiva, que permite reducir al mínimo los contaminantes,

recuperando en parte el suelo impactado, sin riesgos colaterales en la estabilidad de los

ecosistemas (Chávez, 2010). Los procesos de biorremediación pueden ser divididos

básicamente en tres clases. Primero, en atenuación natural, donde la concentración de

contaminantes es reducida por los microorganismos nativos del suelo. Segundo, la

bioestimulación, donde se adicionan nutrientes y un aceptor de electrones al sistema para

mejorar su efectividad y acelerar la biodegradación. Finalmente, la bioaumentación, en

donde se inocula el sistema con uno o varios microorganismos apropiados

La bioestimulación combinada con la bioaumentación es una estrategia para acelerar

el proceso de biorremediación y por ende la biodegradación de los contaminantes. La

aplicación de microorganismos nativos puede beneficiarse de la bioestimulación por la

adición de fuentes de energía y/o aceptores de electrones. El proceso convencional de la

biorremediación asume que el suelo contaminado contiene las especies de bacterias

necesarias para la degradación; sin embargo, la proliferación y la actividad puede ser

afectada por la población muy baja o por condiciones inadecuadas, como la elevada

concentración de metales.

En el distrito de Puerto Eten, región Lambayeque existen grandes áreas de suelo

contaminadas con hidrocarburos de petróleo; sin embargo, no se cuenta con estudios previos

de biorremediación sobre esta zona. La presente investigación permitirá evaluar la eficiencia

de la bioaumentación y bioestimulación en la biodegradación del petróleo por cepas

bacterianas con potencial hidrocarbonoclástico, aisladas y seleccionadas de suelos

contaminados con hidrocarburos de la provincia de Talara, región Piura. Por lo expuesto, se



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planteó el siguiente problema: ¿Cuál es la eficiencia de la bioaumentación y bioestimulación

en la biodegradación de petróleo por bacterias nativas de la provincia de Talara, región

Piura?

1.2. Antecedentes de la investigación

Para determinar la eficiencia de biorremediación de suelos contaminados con

petróleo se realizó un estudio con bacterias nativas. Las muestras de suelo a biorremediar

fueron enriquecidas en caldo Bushnell Haas y las bacterias se aislaron en agar nutritivo,

King B y Mac Conkey, obteniendo 104 aislados de los que 92,31% fueron Gram negativos,

necesitaron 2 – 10 días para utilizar el petróleo como fuente de carbono y energía y

alcanzaron 0,010 – 0,924 unidades de actividad emulsificante. Para la biorremediación del

suelo contaminado (23 570 mg/kg TPH), se aplicó bioestimulación y bioaumentación, para

lo cual diez bacterias nativas seleccionadas se incrementaron e inocularon (10%)

independientemente y en consorcios en terrarios con 4 kg de suelo, se aplicó nitrógeno y

fósforo en la proporción C:N:P de 100:10:1. Durante 90 días el pH fue de 7,3 – 8,3; con

1,2x103 – 1,7x107 UFC/ml de bacterias heterótrofas y 1x103 – 9 x 103 NMP/ml de bacterias

hidrocarbonoclásticas. Se obtuvo 45,3% en la eficiencia de la biorremediación frente a los

testigos con N-P y absoluto con 39,6 y 22,7%, respectivamente (Llanos, 2012).

Se evaluó el efecto de la bioaumentación y bioestimulación en sedimentos

contaminados con hidrocarburos de la Estación de Servicio de Combustible INTEGRA de

Dosquebradas, Risaralda, Colombia. Para esta investigación se utilizaron ocho mesocosmos,

compuestos por canastas de polietileno de alta densidad (57x37x15 cm), estos estaban

conformados, primero, solo los sedimentos contaminados de la Estación de Servicio,

segundo se tomaron sedimentos contaminados y se les adicionó urea como nutriente, tercero

se tomaron 40% de suelos con microorganismos adaptados, más 60% de sedimentos

contaminados y cuarto se tomó nuevamente 40% de suelos con microorganismos adaptados,



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más 60% de sedimentos contaminados y se le adicionó urea como nutriente, a cada

mesocosmo se les realizó una réplica. Se realizaron mediciones a lo largo de los

experimentos una vez al mes, con una duración total de 23 semanas. Concluyendo que los

mesocosmos presentaron tasas de degradación entre el 87,32 mg de Hidrocarburos totales de

petróleo (HTP)/kg de suelo seco y 105,41 mg de HTP/kg de suelo seco, con porcentajes de

reducción de contenido de hidrocarburo entre 79,7% y 95,1%; donde las dos estrategias de

biorremediación, la bioestimulación y bioaumentación, no presentaron diferencias

estadísticamente significativas (Ñustez, 2012).

Los factores que favorecen el rendimiento de la biorremediación de los

Hidrocarburos Totales de Petróleo (HTP) en suelo contaminado con petróleo crudo se

investigaron en condiciones de laboratorio y observaciones de campo. Para la

bioaumentación se utilizado consorcios microbianos locales (MC1, MC2 y MC3) y en la

bioestimulación, nutrientes en una relación CNPK de 100:10:1:3 y aire mejorado con

compuesto liberador de oxígeno (ORCTM). La investigación de laboratorio se realizó en

microcosmos con dos diseños experimentales, en tanques de vidrio y suelo dispuesto en

columnas de PVC, mientras que la prueba de campo se realizó en parcelas de prueba. En el

experimento de microcosmos en tanques de vidrio, la combinación de bioaumentación (10%

de inóculo MC3) y bioestimulación produjo la mayor degradación (79%) de HTP. En los

microcosmos en columnas, la degradación de HTP en el suelo superior fue mayor con la

combinación de bioaumentación y bioestimulación, mientras que en el suelo inferior, la

degradación fue mayor con bioaumentación, bioestimulación y aire mejorado. En la prueba

de campo, se cuantificó el 97% de degradación de HTP en el suelo bioaumentado con el

consorcio MC2. El estudio de análisis cinético indicó que el mejor método de tratamiento es

la combinación de bioaumentación con el consorcio MC3 (Acinetobacter sp. y

Pseudomonas sp.) y bioestimulación (Suja et al., 2014).



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Una investigación a nivel de laboratorio se realizó para determinar el efecto de la

bioaumentación y la bioestimulación en la eficiencia de biorremediación de un suelo

contaminado con hidrocarburos de petróleo crudo liviano. La muestra de suelo (HTP

21 200 – 22 900 mg kg-1), presentaron una población de microorganismos totales de 4,6x106

– 1,1x107 NMP g-1, hidrocarbonoclásticos de 1,5x104 – 4,3x104 NMP g-1 y un nivel de

toxicidad severo en el índice de germinación de Raphanus sativus L. “rabanito”. Para el

aislamiento de las bacterias se usó agar Plate Count y MacConckey, seleccionando aquellos

que utilizaron el petróleo en 40 horas y los que alcanzaron 1,254 – 2,007 UAE mL-1. Se

identificaron Acinetobacter, Bacillus, Enterobacter y Pseudomonas. La bioaumentación y

bioestimulación con úrea y fosfato diamónico (relación C:N:P de 100:10:1) incrementaron la

población microbiana y disminuyeron la toxicidad de los contaminantes. Con el tratamiento

de bioaumentación + bioestimulación se alcanzó 75% de eficiencia de biorremediación,

demostrándose que la reintroducción de microorganismos tiene mayor efectividad en la

biorremediación con la aplicación de fertilizantes inorgánicos (Cabanillas y Pissani, 2015).

En experimentos de microcosmos se evaluó el potencial de biotransformación de

residuos de hidrocarburos en suelo de dos refinerías de petróleo (suelo A y B). El suelo A

había sido sometido previamente a biorremediación in situ y el suelo B no había sido

sometido a ningún tratamiento. Se aplicó bioaumentación con bacterias

hidrocarbonoclásticas, bioestimulación con nutrientes en forma de nitrato de amonio y

ortofosfato de potasio para obtener una proporción 100:10:1 de C:N:P y la molienda del

suelo. La concentración de hidrocarburos se determinó durante 112 días. Los microcosmos

tratados con bioestimulación (BS) y bioestimulación / bioaumentación (BS+BA) mostraron

las reducciones más significativas en las fracciones de hidrocarburos alifáticos y aromáticos.

Se demostró que la molienda del suelo reduce la efectividad de un tratamiento con nutrientes

en 25% y 20% para las fracciones de alifáticos y aromáticos, respectivamente; esto



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probablemente se deba a la alteración de la comunidad microbiana autóctona en el suelo.

Los ensayos ecotoxicológicos con semillas de Brassica alba “mostaza” y ensayos de

Microtox, mostraron que la reducción de la concentración de HTP no fue directamente

proporcional a la reducción de la toxicidad. El monitoreo de la HTP por sí solo no es

suficiente para evaluar el riesgo ambiental de un sitio contaminado después de la

remediación (Jiang et al., 2016).

Un estudio de microcosmos se realizó para determinar el impacto de la

bioaumentación con Acinetobacter SZ-1 cepa KF453955 y la bioestimulación en la

eficiencia de degradación de HTP y la dinámica de la comunidad microbiana durante la

biorremediación de un suelo contaminado con petróleo; se usaron nutrientes en forma de

(NH4)2SO4 y KH2PO4 para obtener la proporción C:N:P de 100:10:1. Los suelos (HTP 44

600 mg kg-1) se incubaron sin agitación a temperatura ambiente durante 10 semanas y se

determinó la eficiencia de degradación de HTP, actividad de catalasa, población de bacterias

hidrocarbonoclásticos y diversidad de la comunidad bacteriana. La bioestimulación y

bioaumentación promovieron 60% y 34% de degradación, respectivamente, después de seis

semanas de incubación. La actividad de la catalasa y las poblaciones de

hidrocarbonoclásticos fueron mayores con la bioestimulación, la diversidad bacteriana no

aumentó para el tratamiento con bioestimulación. Las poblaciones de hidrocarbonoclásticos

se relacionaron positivamente con la eficiencia de la degradación de HTP (Wu et al., 2016).



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1.3. Objetivos

El objetivo general fue determinar la eficiencia de la bioaumentación y

bioestimulación en la biodegradación de petróleo por bacterias nativas de la provincia de

Talara, región Piura.

Los objetivos específicos fueron: Cuantificar el tiempo de utilización del petróleo y

número de unidades de actividad emulsificante de los cultivos hidrocarbonoclásticos,

determinar las características químicas, microbiológicas y toxicidad del suelo experimental,

determinar el efecto de la bioaumentación y bioestimulación en la población microbiana,

toxicidad de los contaminantes y concentración de hidrocarburos totales de petróleo, HTP.

1.4. Hipótesis

La hipótesis planteada fue: La eficiencia de la bioaumentación y bioestimulación en

la biodegradación de petróleo por bacterias nativas de la provincia de Talara es mayor al

50%.

1.5. Justificación

La eficacia y efectividad de la biodegradación de petróleo se incrementa con la

investigación y selección de microorganismos autóctonos que puedan ser incrementados y

reintroducidos en ambientes contaminados. La capacidad catabólica de estas bacterias para

crecer bajo las condiciones fisicoquímicas y de estrés a las que están sometidas, supera los

problemas de toxicidad por metales, sales o condiciones inadecuadas, que afectan

negativamente la actividad degradadora de microorganismos foráneos.

Desde el punto de vista económico, la utilización de microorganismos para la

biorremediación de suelos contaminados con petróleo es una técnica de bajos costos de

operación, no implica gastos de equipo, materiales, productos y maquinaria necesarios para

los tratamientos físicos y químicos y pueden aplicarse en el mismo sitio de la contaminación



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sin requerir el desplazamiento de los suelos contaminados. Estas características compensan

el tiempo que demanda la recuperación biológica del suelo.

En el contexto social, los lugares contaminados con petróleo en el distrito de Puerto

Eten tienen una diversidad biológica que no ha sido investigada, para la búsqueda de

bacterias degradadoras de petróleo, adaptadas a las condiciones ecológicas y por lo tanto,

eficaces eficientes. Se presenta una importante oportunidad para obtener bacterias que

posteriormente puedan formar parte de un paquete tecnológico propio, permitiendo la

disminución de la dependencia técnica – económica del país y el desarrollo de las

capacidades de la población peruana.

En el contexto ambiental, el suelo y las aguas subterráneas soportan el impacto

negativo de los derrames de hidrocarburos. La utilización de microorganismos para la

biorremediación es una tecnología muy competitiva, que permite reducir al mínimo los

contaminantes, recuperando el suelo afectado sin riesgos colaterales en la estabilidad de los

ecosistemas.

La investigación considera la tecnología de biorremediación con las estrategias de

bioestimulación y bioaumentación, que se pueden llevar a cabo dentro de cualquier área,

contribuyendo así a la disminución de los impactos negativos a los recursos naturales.

El crecimiento y manejo adecuado de los microorganismos autóctonos de los sitios con

derrames de petróleo permitirá su aplicación en las áreas impactadas; validando tecnologías

propias de biorremediación efectivas, para la recuperación de áreas contaminadas,

disminuyendo los riesgos para la salud de los humanos y seres vivos en general.

II. MARCO TEÓRICO



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Los contaminantes orgánicos pueden ser transformados de manera física, química y

biológica. El proceso de transformación más importante es el biológico o biodegradación

(Viñas, 2005). Algunos contaminantes solo son transformados parcialmente, condición que

implica la eliminación o reducción de su peligrosidad. Por esta razón, se consideran,

biotransformaciones primarias, parciales y totales. En la biodegradación primaria, un cambio

menor en una molécula es suficiente para eliminar su toxicidad, ejemplo: la deshalogenación

de los insecticidas clorados. En la degradación parcial se lleva a cabo una fragmentación del

contaminante, tal que la estructura original de la molécula aún se mantiene en los

fragmentos, ejemplo, la hidrólisis de la celulosa a glucosa. Por otra parte, en la

biodegradación completa, total o mineralización, un contaminante orgánico pasa a su estado

más oxidado o inorgánico (Carreño, Mendoza y Villanueva, 2009; Buendía, 2012).

La eficacia y efectividad de la biodegradación de petróleo se incrementa con la

investigación y selección de microorganismos autóctonos que puedan ser incrementados y

reintroducidos en ambiente contaminados. La capacidad catabólica de estas bacterias para

crecer bajo las condiciones fisicoquímicas y de estrés a las que están sometidas, supera los

problemas de toxicidad por metales, sales o condiciones inadecuadas, que afectan

negativamente la actividad degradadora de microorganismos foráneos.

La teoría de Infalibilidad Microbiana, sostiene que todo compuesto orgánico

biológicamente sintetizado puede ser descompuesto por los microorganismos (Alexander,

1994). En este contexto, la comunidad microbiana desempeña un papel importante en el

flujo de energía, transformación de nutrientes y reciclaje de elementos en el ambiente16 y los

contaminantes como el petróleo, pueden ser degradados por los entes biológicos hasta

dióxido de carbono y agua (Filip, 2002).

En un suelo con contaminación recurrente o con episodios previos de contaminación,

generalmente las poblaciones microbianas autóctonas se seleccionan en favor de la



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metabolización del contaminante. Por esta razón, la bioestimulación de la población

microbiana autóctona, puede acelerar el proceso de biodegradación de los contaminantes,

siempre y cuando, éstos no sean recalcitrantes, en cuyo caso se requiere la bioaumentación o

inoculación de microorganismos con capacidad degradativa especializada, propios del sitio

contaminado e incrementados en el laboratorio (Viñas, 2005; Ortega, 2012). La

bioinoculación es la incorporación de microorganismos comerciales en un lugar, para

biodegradar un contaminante. Este proceso es una técnica de biorremediación; no obstante,

la falta de adaptación de las poblaciones microbianas exógenas, no garantiza su

supervivencia, por lo que se prefiere la bioaumentación. Con esta técnica, los

microorganismos autóctonos son aislados, caracterizado e incrementados en laboratorio y

luego reintroducidos en los ambientes contaminados (Carreño et al., 2009; Ortega, 2012).

2.1. Biodegradación del petróleo

El crudo de petróleo es una mezcla de compuestos que se pueden separar en cuatro

fracciones SARA: saturados, aromáticos, resinas y asfáltenos (Pernía, Demey, Inojosa y

Naranjo; 2012). El petróleo, es biodegradado en aerobiosis con mayor eficiencia, pero

también en anaerobiosis. Los contaminantes, que pueden ser degradados o transformados

por los seres vivos son susceptibles de ser eliminados mediante procesos de biorremediación

cuyo fundamento está en la serie de reacciones de óxido-reducción que se producen en la

cadena respiratoria o transportadora de electrones de la célula. La cadena la inicia el

compuesto hidrocarbonado como donador de electrones, de modo que la actividad

metabólica de la célula lo consume y degrada. Los aceptores son el oxígeno, los nitratos,

hierro III, sulfatos y dióxido de carbono en procesos respiratorios y anaerobios,

respectivamente (Braibant, 2014; Ponce, 2014).

Los alcanos lineales son los hidrocarburos del petróleo más biodegradables debido a

la simplicidad de su estructura molecular, sin embargo, altas concentraciones de alcanos con



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5-10 carbonos inhiben la degradación de muchos hidrocarburos, porque como solventes

rompen la membrana lipídica de los microorganismos. A su vez, alcanos con 20-40 carbonos

tienen muy baja solubilidad en agua, lo cual interfiere en la biodegradación. En los alcanos

las monooxigenasas incorporan un átomo de oxígeno en el extremo terminal metilo y se

forma un hiperóxido. El NADPH2 dona sus electrones y reduce el átomo de oxígeno que

quedó libre, formándose agua más un alcohol primario, que posteriormente es oxidado hasta

acetaldehído, a su vez éste es oxidado hasta ácido graso, que finalmente es degradado por β-

oxidación sucesiva (Loya, 2012; Ramírez, 2014).

La degradación bacteriana de los hidrocarburos aromáticos (Figura 1) de forma

aeróbica se lleva a cabo mediante la oxidación o dihidroxilación del anillo aromático por parte

de mono o dioxigenasas para formar cis-dihidrodiol. Estos dihidrodioles son dehidrogenados,

formando intermediarios dihidroxilados precursores de la ruptura del anillo, la escisión puede

ocurrir intradiol u orto para originar ácido mucónico y extradiol o meta para formar el

derivado de hidroxi-muconaldehídico, estos derivados entraran al metabolismo centra,

degradandose hasta CO2 y agua. Por su parte, algunas bacterias pueden catalizar la

degradación de HAPs a trans-dihidrodioles, mediante la acción del enzima citocromo P450

monooxigenasa. Los sustitutos alifáticos de los compuestos aromáticos, posteriormente son

oxidados para formar ácidos grasos que son utilizados por los microorganismos en la síntesis

celular y producción de energía (Lladó, 2012; Loya, 2013).



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Figura 1. Vía principal en el metabolismo microbiano de los hidrocarburos aromáticos policíclicos (Lladó, 2012).



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2.2. Biorremediación

En el tratamiento biológico o biorremediación la actividad metabólica de plantas,

hongos, algas, bacterias naturales o modificadas genéticamente, en condiciones controladas,

degradan, transforman o remueven los contaminantes a productos inocuos (Arrieta, 2011;

Loya, 2013).

El fundamento bioquímico de la biorremediación está en la serie de reacciones de

óxido-reducción que se producen en la cadena respiratoria o transportadora de electrones de

la célula. La cadena lo inicia el sustrato orgánico o compuesto hidrocarbonado que actúa

como dador de electrones, de modo que la actividad metabólica de la célula consume y

degrada el compuesto hidrocarbonado. Los aceptares más comúnmente usados son el

oxígeno, pero también, los nitratos, hierro III, sulfatas y dióxido de carbono en procesos

respiratorios y anaerobios, respectivamente (Ponce, 2014).

Las técnicas de remediación más importantes son degradación natural,

biorremediación in situ y ex situ. En la biorremediación in situ se incluye la bioaumentación,

bioestimulación y bioventing. En la biorremediación ex situ se consideran landfarming,

biopilas y compostaje. En la degradación natural o atenuación, las fracciones volátiles se

evaporan con rapidez, quedando los componentes alifáticos y aromáticos de cadena más

larga, los cuales son oxidados por los microorganismos nativos del suelo hasta dióxido de

carbono. La bioaumentación consiste en la adición controlada de microorganismos de acción

dirigida, especialmente formulados y de ocurrencia natural para ayudar a los que se

encuentran naturalmente y promover la biodegradación. La bioestimulación es la activación

de los microorganismos autóctonos degradadores de hidrocarburos, mediante la adición de

nutrientes y aceptares de electrones al entorno contaminado, en función de las deficiencias.

Por su parte, en el bioventing o bioventeo se suministra aire al terreno, para promover la



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actividad de los microorganismos presentes y degradar los hidrocarburos (Cando, 2011;

Ñustez, 2012).

La técnica ex situ de landfarming es la más antigua y consiste en tratar el suelo

contaminado previamente excavado y trasladado en grandes superficies abiertas, protegido

en una base impermeable, donde se voltea y airea para favorecer la actividad de las bacterias

nativas. A su vez, con la técnica de biopilas o bioceldas se forman montones de dimensiones

variables con una mezcla de suelo contaminado y materia orgánica y se airean de forma

activa o pasiva. Por su parte, en el compostaje el suelo contaminado se mezcla con paja,

astillas de madera u otro agente que le proporcione porosidad, para permitir un mejor flujo

de aire y el material es degradado en aerobiosis bajo condiciones controladas de humedad y

temperatura (Cando, 2011; Loya, 2013).

La implementación de una tecnología de biorremediación requiere de etapas: i)

investigación del emplazamiento en relación con los contaminantes, el tipo de suelo y el

entorno, es decir caracterización físico-química del suelo, estudio geotécnico e

hidrogeológica y análisis de riesgos, ii) desarrollo de ensayos de tratabilidad a escala de

laboratorio, iii) desarrollo de ensayos a escala piloto e iv) implementación de la tecnología

de biorremediación seleccionada. Los ensayos de tratabilidad se definen como un conjunto

de experimentos a escala de laboratorio previos a la implementación de cualquier tecnología

de biorremediación. Su objetivo es determinar si un tratamiento es apropiado para la

descontaminación, requiriéndose caracterizar las poblaciones microbianas y la

biodegradabilidad de los contaminantes del suelo, así como también, se debe investigar la

influencia de los parámetros físico-químicos y biológicos que afectan la biodegradación

(Viñas, 2005).



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Los ensayos de tratabilidad o conjunto de experimentos a escala de laboratorio,

previos a la implementación de cualquier tecnología de biorremediación representan una

parte muy pequeña de los costos totales de recuperación de cualquier emplazamiento; sin

embargo, la información que proporcionan es fundamental para aumentar la posibilidad de

éxito. Primero se realiza una caracterización físico-química y microbiológica, se cuantifica

la población microbiana degradadora de los contaminantes y su proporción respecto a la

heterótrofa del suelo contaminado. Asimismo, se investiga si la población microbiana es

metabólicamente activa o es activable en condiciones de bioestimulación. Una vez

caracterizado el suelo, los contaminantes y la población microbiana, es necesario determinar

la biodegradabilidad mediante ensayos rápidos y en caso afirmativo investigar los factores

físicos-químicos y biológicos que afectan la biodegradación (Fase II) en ensayos de

microcosmos (Ponce, 2014).

En la fase I de los ensayos de tratabilidad se investiga la presencia de poblaciones

microbianas, la actividad metabólica real y potencial y la biodegradabilidad de los

contaminantes presentes en el suelo. En la fase II se optimizan las condiciones físico-

químicas (húmedas, aireación, nutrientes inorgánicos) y biológicas (posibilidad de inocular

poblaciones microbianas alóctonas) que pueden condicionar el proceso de biodegradación

durante la biorremediación de suelos contaminados. La información obtenida en la fase I

permite decidir en un corto intervalo si es factible la aplicación de la biorremediación. La

fase II permite establecer las condiciones óptimas de biorremediación en procesos aerobios

(Arrieta, 2011; Ponce, 2014).

2.3. Bioestimulación

Es una técnica de biorremediación in situ con la que se modifica el medio

contaminado, facilitando la proliferación y actividad de los microorganismos autóctonos a



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través de la adición de nutrientes, aceptores de electrones o surfactantes (Singh, Parmar,

Kuhad, & Ward, 2011). Nutrientes como el fósforo, nitrógeno, oxígeno y carbono, en la

mayoría de casos están disponibles en cantidades lo suficientemente bajas como para

restringir la actividad microbiana (Adams, Fufeyin, Okoro, & Ehinomen, 2015).

Se suministra oxígeno para estimular la actividad microbiana y mejorar las tasas de

biodegradación aeróbica cuando el O2 es considerado como un factor limitante. El

suministro de oxígeno puede ser por labranza o arado, aireación forzada y métodos

químicos; el primer método es efectivo cuando las zonas contaminadas son superficiales. La

aireación forzada es la inyección de agua rica en oxígeno u oxígeno puro, en una técnica útil

en suelos y cuerpos de agua subterráneos. Los métodos químicos implican la adición de

fuentes alternativas de oxígeno, como los compuestos liberadores de oxígeno ORC®, u otros

agentes como el permanganato de potasio, peróxido de hidrógeno y O3 (Zawierucha &

Malina, 2011).

La aplicación de fertilizantes orgánicos e inorgánicos favorece la degradación de

hidrocarburos de petróleo en los suelos contaminados mediante la mejora de la relación

C:N:P (Pardo et al., 2004; Sarkar, Ferguson, Datta & Birnbaum, 2005). Según Crawford &

Crawford (2005), se requiere aproximadamente 150 mg de nitrógeno y 30 mg de fósforo

para la conversión de 1 g de hidrocarburo en materiales celulares; en base a esto, la relación

molar óptima C:N:P recomendada para mejorar la remoción de hidrocarburos es de

100:10:1.

Un punto crítico en la biorremediación de suelos contaminados con petróleo es la

disponibilidad limitada de los contaminantes para los microorganismos debido a su

solubilidad en el agua (Menéndez et al., 2007). Los microorganismos con capacidad

hidrocarbonoclástica producen biosurfactantes, estos son tensioactivos que mejoran la



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solubilidad y disponibilidad del contaminante al reducir la tensión interfacial entre los

hidrocarburos y el agua del suelo, (Urum, Grigson, Pekdemir, & McMenamy, 2006). La

aplicación de surfactantes sintéticos es útil cuando los contaminantes son altamente

hidrofóbicos y/o se absorben firmemente en partículas de arcilla o materia orgánica del suelo

(Menéndez et al., 2007).

2.4. Bioaumentación

Consiste en la adición de microorganismos alóctonos o autóctonos, microorganismos

modificados genéticamente o consorcios bacterianos con capacidad de degradar

contaminantes orgánicos (Volke & Velasco, 2002; Castillo et al., 2005), con la finalidad de

incrementar la densidad poblacional y las enzimas adecuados para la degradación. Este

método es utilizado en suelos contaminados donde la población nativa se encuentra en un

número muy bajo o carecen de capacidad enzimática para degradar compuestos orgánicos

tóxicos (Gentry, Rensing, & Pepper, 2004).

La bioaumentación se puede realizar de tres maneras: (a) aislamiento y

enriquecimiento de microorganismos autóctonos para su posterior reinoculación;

(b) aislamiento, enriquecimiento e inoculación de microorganismos alóctonos; y (c)

aplicando microorganismos modificados genéticamente (Zawierucha & Malina, 2011). La

supervivencia y capacidad de degradación de los microorganismos introducidos en un sitio

contaminado dependen en gran medida de las condiciones ambientales (Vogel 1996).

Para la selección de un cultivo microbiano apropiado para la bioaumentación se debe

tener en cuenta características como: rápido crecimiento, facilidad de cultivo, resistencia a

altas concentraciones de contaminantes y capacidad de adaptación a las condiciones

ambientales (Mrozik & Piotrowska, 2009). Para llevar a cabo un óptimo proceso, se debe

evaluar las fracciones de los contaminantes disponibles para determinar la concentración del

inóculo que se aplicará (Zawierucha & Malina 2006).



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2.5. Consorcio microbiano

En los procesos de biodegradación un microorganismo puede descomponer un

número limitado de componentes del contaminante, por lo que es necesario encontrar

microorganismos que puedan degradar los componentes en su totalidad. La construcción de

consorcios microbianos es una alternativa viable para la eliminación de sustancias complejas

y mezclas de contaminantes. Los microorganismos que se utilizan en un proceso, pueden ser

obtenidos por aislamiento a partir de fuentes naturales o de una colección de cultivos

(García, 2012).

Los cultivos mixtos pueden ser consorcios definidos y consorcios no definidos. Los

primeros se caracterizan por ser una combinación de cepas aisladas con capacidades

degradativas conocidas complementarias entre sí. Algunas desventajas de estos consorcios

son el gran número de cepas distintas para conseguir una degradación extensa del crudo de

petróleo, debido a la cantidad de componentes presentes y al espectro metabólico limitado

de una cepa bacteriana (Leahy et al., 1990). Otra desventaja es la posible formación de

metabolitos intermediarios que sean tóxicos para las cepas que conforman el consorcio

(Kazunga et al., 2000).

Los consorcios no definidos se caracterizan por ser obtenidos a partir de procesos de

enriquecimiento de muestras ambientales con episodios previos y recurrentes de

contaminación. Como resultado la población microbiana se seleccionada de forma natural, la

cual potencialmente dispone de una mayor eficiencia en la degradación de compuestos

conocidos y desconocidos que un consorcio definido. Por lo tanto, es más probable que en

un consorcio no definido se hayan seleccionado degradadores de productos finales que se

acumulan como resultado de procesos cometabólicos (García, 2012).



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III. MATERIAL Y MÉTODOS

3.1. Material de estudio

3.1.1. Material biológico

Semillas de Raphanus sativus L. “rabanito” y 5 cultivos de bacterias degradadoras de

petróleo aisladas de suelo contaminado con hidrocarburos durante agosto de 2014,

caracterizadas in vitro como hidrocarbonoclásticas (Cabanillas y Pissani, 2015) y

proporcionadas por el laboratorio de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Ciencia

Biológicas en la Universidad Pedro Ruiz Gallo.

3.2. Métodos y Técnicas

3.2.1. Población y muestra de estudio

En la investigación descriptiva la población estuvo constituida por el suelo

contaminado con hidrocarburos de petróleo en el distrito de Puerto Eten, región

Lambayeque y se investigó una muestra probabilística de suelo contaminado. En la

investigación explicativa la población universal fueron las bacterias hidrocarbonoclásticas,

la población muestreal fueron las bacterias hidrocarbonoclásticas aisladas del suelo

contaminado durante agosto 2014, en Talara, región Piura y la unidad muestreal fueron los

cinco cultivos de bacterias hidrocarbonoclásticas Y5, 97a, 14c, 60b y 23b, seleccionadas por

conveniencia.

3.2.2. Variables en estudio

a. Variable Independiente: Bioaumentación y bioestimulación

b. Variable dependiente: Eficiencia de biodegradación de petróleo

3.2.3. Tipo de estudio y diseño de contrastación de hipótesis

La investigación se realizó en dos fases. En la primera fase descriptiva, se cuantificó

el tiempo de utilización del petróleo y el número de unidades de actividad emulsificante



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(UAE) de los 5 cultivos de bacterias hidrocarbonoclásticas. En la segunda fase explicativa,

se determinaron las características químicas, microbiológicas y toxicidad del suelo

experimental, y se realizó un ensayo en condiciones de invernadero para determinar la

eficiencia de la bioaumentación y bioestimulación en la biodegradación de petróleo.

La hipótesis en la primera fase se contrastó con el diseño de una sola casilla

(Vásquez, Díaz, Vásquez y Vásquez; 2012) de Goode y Hatt (1986) y en la segunda fase con

el diseño experimental completamente aleatorio, DCA (Hernández, Fernández y Baptista,

2014). Los tratamientos fueron 15 (Figura 2), correspondientes a T1: Bioaumentación cultivo

bacteriano Y5, T2: Bioaumentación cultivo bacteriano 97a, T3: Bioaumentación cultivo

bacteriano 14c, T4: Bioaumentación cultivo bacteriano 60b, T5: Bioaumentación cultivo

bacteriano 23b, T6: Bioaumentación consorcio mixto, T7: Bioaumentación cultivo bacteriano

Y5 + Bioestimulación, T8: Bioaumentación cultivo bacteriano 97a + Bioestimulación, T9:

Bioaumentación cultivo bacteriano 14c + Bioestimulación, T10: Bioaumentación cultivo

bacteriano 60b + Bioestimulación, T11: Bioaumentación cultivo bacteriano 23b +

Bioestimulación, T12: Bioaumentación consorcio mixto + Bioestimulación, T13: Testigo sin

bioaumentación, sin bioestimulación, T14: Testigo con bioestimulación, T15: Testigo

abiótico.



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Figura 2. Diseño experimental completamente aleatorio para determinar la eficiencia de la

bioaumentación y bioestimulación en la biodegradación de petróleo en suelos

contaminados.

T1 T1 T1 T1 T1 T2 T3

T2 T3 T4

T3 T4 T5

T4 T5 T6

T5 T6 T7

T6 T7 T8

T7 T8 T9

T8 T9 T10

T9 T10 T11

T10 T11 T12

T11 T12 T13

T12 T13 T14

T13 T14 T15

T14 T15 T1

T15 T1 T2



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3.2.4. Reactivación de cultivos de bacterias hidrocarbonoclásticas

Las bacterias fueron cultivadas en tubos 13 x 100 mm conteniendo caldo nutritivo a

30ºC, con agitación constante, durante 24 horas. A continuación, se sembraron mediante la

técnica de agotamiento y estría en agar Bushnell Haas (Anexo 1) suplementado con petróleo

comercial 1%, incubando a 30ºC. Se seleccionaron cinco colonias características (Figura 3)

y se cultivaron en viales con agar Bushnell Haas - 1% de petróleo durante 24 horas,

constituyendo las bacterias reactivadas o cultivos de trabajo.

3.2.5. Primera fase: Cuantificación del tiempo de utilización del petróleo y número de

unidades de actividad emulsificante (UAE mL-1)

Las bacterias cultivadas en agar Bushnell Haas se inocularon por triplicado en 5 mL

de caldo Bushnell Haas - 1% de petróleo (50 µL) con indicador purpura de bromocresol

(Figura 4), incluyendo tres tubos con caldo no inoculado (Testigo). La incubación se realizó

a 30°C, con agitación manual diaria por 10 minutos, registrando los días requeridos para la

observación del viraje del indicador, interpretándose como positivo el cambio de color de

lila a amarillo, indicando la utilización del petróleo como fuente de carbono y energía.

Para la determinación del número de unidades de actividad emulsificante (Escalante,

2002), los cultivo en agar Bushnell Haas con petróleo, fueron inoculados por triplicado en

5 mL de caldo extracto de levadura (Figura 5, Anexo 1) y se agregó 2% (0,1 mL) de etanol,

incluyéndose tres tubos con caldo de cultivo no inoculado como testigo. La incubación se

realizó a 30 °C, durante 96 horas, con agitación manual diaria durante 10 minutos.

Posteriormente, los caldos se centrifugaron a 3500 rpm, durante 5 minutos, se tomaron 2 mL

de cada sobrenadante y se depositaron en tubos de ensayo de 16x100 mm, donde se agregó

2,2% (44 µL) de petróleo crudo. Los tubos se taparon herméticamente, se agitaron

manualmente durante 5 minutos, hasta lograr una emulsión.



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Figura 3. Colonias características de bacterias hidrocarbonoclásticas

Figura 4. Caldo Bushnell Haas - 1% de petróleo (50 µL) con indicador púrpura de

bromocresol.



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Figura 5. Caldo extracto de levadura para la cuantificación del número de UAE.



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Se realizó la lectura de la absorbancia en espectrofotómetro digital de luz visible,

GREETMED, a 540 nm. Los valores se corrigieron con el testigo caldo extracto de

levadura-etanol y se realizó la conversión (Escalante, 2002) de la absorbancia de cada

muestra a unidades de actividad emulsificante por mililitro, considerando 0,826 de

absorbancia como 1 unidad de actividad emulsificante por mililitro, UAE mL-1.

3.2.6. Segunda fase: Eficiencia de la bioaumentación y bioestimulación en la

biodegradación de petróleo

En terrarios conteniendo suelo experimental contaminado con petróleo, se aplicaron

las tecnologías de bioaumentación y bioestimulación, y se determinó la eficiencia de la

biorremediación.

a. Lugar de recolección del suelo experimental contaminado

En la periferia del terminal de ventas petrolera Eten, carretera Playa Lobos Km. 5, en

el distrito de Puerto Eten (Figura 6), región Lambayeque, se colectó el suelo experimental

contaminado con hidrocarburos de petróleo. Puerto Eten está comprendido entre los

paralelos 6° 56’ 30” latitud sur y 82° 1’ 24” longitud oeste. Según el Instituto Nacional de

Defensa Civil (INDECI, 2003), la zona presenta un clima desértico subtropical, con una

temperatura media de 21°C.

b. Obtención del suelo experimental contaminado

El suelo contaminado con petróleo fue colectado con una palana a 10 cm de

profundidad, depositándolo en un saco de polietileno densa (MINAM, 2014) debidamente

etiquetado, inmediatamente se transportó hacia el laboratorio de Microbiología y

Parasitología, sección Biotecnología Microbiana de la Facultad de Ciencias Biológicas,

Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo, en Lambayeque.



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Figura 6. Vista satelital del lugar de muestreo en el distrito de Puerto Eten, región

Lambayeque (https://www.google.com.pe/maps/@-6.9545445,-79.853050430

0a,35y,90h,39.45t/data=!3m1!1e3).

Lugar de muestreo

(627023.14 m E – 9231150.38 m S)



https://www.google.com.pe/maps/@-6.9545445,-79.85

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c. Caracterización del suelo experimental contaminado

En el laboratorio se tomaron tres muestras de 1 kg, con las que se realizó el análisis

químico, microbiológico y determinación de la toxicidad de los contaminantes del suelo. La

obtención de las muestras se realizó según el método de “cuarteo y amontonamiento”

(Figura 7); el suelo experimental se extendió sobre una superficie impermeable, para separar

las piedras y disgregar las partículas gruesas. Con ayuda de una palana, la masa del suelo del

extremo inferior derecho se mezcló cinco veces con el superior izquierdo, el inferior

izquierdo con el superior derecho, el superior con el inferior y el derecho con el izquierdo.

Después de la mezcla se formó un “montón” con el suelo y se tomaron las muestras

requeridas.

El análisis químico del suelo contaminado se realizó en una muestra de 1 Kg,

determinándose la cantidad de hidrocarburos totales (HTP) mediante cromatografía de gases

acoplada a espectrometría de masas (GC-MS), utilizando un cromatógrafo de gases modelo

6890N (Net Work GC system) y un espectrómetro de masas modelo 5975 inert XL (Agilent

Tecnologies).

El análisis microbiológico se realizó por triplicado a partir de una submuestra de

10 g, con las que se determinó el número más probable (NMP g-1) de microorganismos

totales y degradadores de hidrocarburos o hidrocarbonoclásticos32. La submuestra se

depositó en un matraz con 90 mL de solución salina, NaCI 0,85% (p/v), obteniéndose una

suspensión de suelo, con la que se realizó diluciones decimales hasta 10-8 (Figuras 8, 9).



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Figura 7. Muestra lista para la técnica de “cuarteo y amontonamiento”

Figura 8. Suspensión del suelo experimental contaminado.



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Figura 9. Dilución de la submuestra de suelo experimental contaminado.



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Para determinar el número más probable de microorganismos totales, 1 mL de las

diluciones 10-6, 10-7 y 10-8 se inocularon por triplicado en tubos de 150x20 mm conteniendo

5 mL de caldo nutritivo (Figura 10). Para el número más probable de microorganismos

hidrocarbonoclásticos, 1 mL de las diluciones 10-5, 10-6 y 10-7 se inocularon por triplicado

en tubos con 5 mL de caldo Bushnell Haas e inmediatamente después en cada tubo se

vertieron 0,025 mL (25 µL) de petróleo (Figura 11) como fuente de carbono (Cabanillas y

Pissani; 2015). Todos los tubos se incubaron a 30°C por 10 días y la turbidez del medio de

cultivo se consideró positivo a la presencia de microorganismos totales e

hidrocarbonoclásticos, realizándose el cálculo correspondiente (Blodgett, 2010; Huapaya,

2011) según el método estándar (Anexo 2).

La toxicidad de los contaminantes del suelo (Salas y Meza; 2011) se determinó por

triplicado en submuestras de 10 g, utilizando semillas de rabanito, a las que previamente se

les determinó el porcentaje de germinación (Flores y Benites; 2015). En cuatro placas de

Petri con papel filtro esterilizado y humedecido con agua destilada se depositaron

25 semillas por placa, se taparon y mantuvieron a temperatura ambiental (28°C),

humedeciéndolas interdiariamente, hasta obtener el máximo de germinación (Figura 12),

que fue 100%, después de 120 horas.

Para el ensayo de toxicidad, en placas de Petri, se depositaron las submuestras de

10 g de suelo, se humedecieron con 12 mL de agua destilada y en cada placa, con una pinza

se depositaron 25 semillas de rabanito (Figura 13). Todas las placas de Petri se cubrieron

con papel metálico durante 120 horas, a 30°C, cada 48 horas se vertieron 5 mL de agua

destilada para mantener la humedad requerida. A las 120 horas se contaron las semillas

germinadas y se midió la longitud de las radículas emergidas (Figura 14), calculándose

(Llanos, 2012) el porcentaje relativo de germinación (PGR), crecimiento relativo de la

radícula (CRR) e índice de germinación (IG):



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Figura 10. Caldo nutritivo con microorganismos totales.

Figura 11. Caldo Bushnell con microorganismos hidrocarbonoclásticos.



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Figura 12. Prueba de germinación de semillas de Raphanus sativus L.

Figura 13. Semillas de rabanito en Placa conteniendo suelo humedecido.



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PGR = Número de semillas germinadas en el suelo contaminado

Número de semillas germinadas en el testigo x 100

CRR = Longitud promedio de radículas en el suelo contaminado

Longitud promedio de radículas en el testigo x 100

IG = PGR x CRR

100

La fitotoxicidad se determinó con el criterio de interpretación (Rodríguez; 2012):

IG ≥ 80% indica que no hay sustancias fitotóxicas o están en muy baja concentración, 80%

> IG > 50% se interpreta como presencia moderada de estas sustancias y un IG ≤ 50% indica

fuerte presencia de sustancias fitotóxicas, criterios correspondientes a niveles de

fitotoxicidad bajo, moderado y severo (Purisaca y Quevedo; 2015).

d. Acondicionamiento de suelo experimental contaminado en terrarios

El suelo experimental se homogenizó sobre una manta de polietileno, se tamizó a

través de una malla metálica de 15 mm de diámetro y se distribuyó en 45 bandejas de

polipropileno (Figura 14), a razón de 1,200 kg de suelo por terrario.

e. Propagación de bacterias para la bioaumentación

El inóculo de los cultivos de trabajo se obtuvo por el método de siembra a gran

escala (Llanos, 2012), trabajando con un inóculo madre, intermedio y definitivo. Las

bacterias se cultivaron en 3 mL de caldo nutritivo, a 30 °C, durante 24 horas.

Con los cultivos de bacterias, se obtuvo un paquete celular cuya concentración se

estandarizó con el tubo 3 del nefelómetro de Mc Farland, obteniendo una suspensión

bacteriana con 9,0x108 cel mL-1. La propagación se trabajó con 0,2mL de la suspensión

bacteriana estandarizada, la cual se inoculó en 1,8 mL de caldo Bushnell Haas con 5 % de

petróleo crudo, incubando a 30°C por 24 horas; estos constituyeron el inóculo madre. Este

fue inoculado en 18 mL de caldo Bushnell Haas con 5% de petróleo crudo, incubándose a

30°C por 24 horas para constituir el inóculo intermedio, el cual a su vez fue inoculado en

200 mL del mismo caldo, incubado en las mismas condiciones y constituyó el inóculo

definitivo en una cantidad de 220 mL.



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34

Figura 14. Medición de las radículas emergidas.

Figura 15. Suelo contaminado distribuido en terrarios.



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NT

35

f. Eficiencia de la bioaumentación y bioestimulación

La eficiencia de la bioaumentación y bioestimulación en la biodegradación de

petróleo en suelos contaminados se investigó en un ensayo con 15 tratamientos. Los

tratamientos correspondieron a:

Bioaumentación cultivo bacteriano Y5 (T1)

Bioaumentación cultivo bacteriano 97a (T2)

Bioaumentación cultivo bacteriano 14c (T3)

Bioaumentación cultivo bacteriano 60b (T4)

Bioaumentación cultivo bacteriano 23b (T5)

Bioaumentación consorcio mixto (T6)

Bioaumentación cultivo bacteriano Y5 + Bioestimulación (T7)

Bioaumentación cultivo bacteriano 97a + Bioestimulación (T8)

Bioaumentación cultivo bacteriano 14c + Bioestimulación (T9)

Bioaumentación cultivo bacteriano 60b + Bioestimulación (T10)

Bioaumentación cultivo bacteriano 23b + Bioestimulación (T11)

Bioaumentación consorcio mixto + Bioestimulación (T12)

Testigo sin bioaumentación, sin bioestimulación (T13)

Testigo con bioestimulación (T14)

Testigo abiótico (T15)



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36

En los tratamientos con bioaumentación, se aplicaron 120 mL (10%) del cultivo

bacteriano por terrario. Inmediatamente después, el contenido de los terrarios se mezcló

durante 5 minutos.

En la bioestimulación, se aplicaron los nutrientes nitrógeno y fosforo (Carreño et

al., 2009; Chávez, 2010) en la relación C:N:P de 100:10:1 (Anexo 3), correspondiendo

0,128 g de úrea (46% N) y 0,029 g de fosfato diamónico (18% N, 46% P) por terrario. En

los tratamientos respectivos, los nutrientes se aplicaron antes de la bioaumentación. Todos

los terrarios fueron removidos cada 6 días hasta por 120 días y se regaron según los

requerimientos con agua declorada durante 24 horas.

Cada 30 días, hasta por 120 días se tomaron submuestras para el análisis

microbiológico y ensayo de toxicidad respectivo. A los 120 días, se seleccionó el suelo del

tratamiento con el que se alcanzó el mayor índice de germinación de rabanito,

correspondiente a la menor toxicidad, para determinar la concentración de hidrocarburos

totales de petróleo, (TPH) y calcular la eficiencia de la biodegradación de petróleo (Ramírez,

2005):

E = Si−Sf

Si x 100

Donde:

E = Eficiencia de la biodegradación de petróleo (%)

Si = Concentración inicial de HTP

Sf = Concentración final de HTP

Durante la biorremediación se registraron las temperaturas máxima (31ºC), mínima

(18ºC) y media (12,5ºC), datos obtenidos por la Estación Meteorológica de la Universidad

Nacional Pedro Ruiz Gallo, ubicada en el fundo “El Ciénago” en Lambayeque.



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37

g. Análisis estadístico de los datos

Los datos obtenidos fueron ordenados en tablas y figuras. Se realizó el análisis de

varianza de los índices de germinación obtenidos y la superioridad entre los tratamientos se

determinó mediante la prueba múltiple de Tukey, con un nivel de significancia (Hernández,

Fernández y Baptista, 2014) de 0,05, utilizando los programas Microsoft Office Word y

Excel versión 2013.



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38

IV. RESULTADOS

4.1. Tiempo de utilización del petróleo y número de unidades de actividad

emulsificante

Las bacterias hidrocarbonoclásticas investigadas utilizaron el petróleo como fuente

de carbono y energía en un tiempo de 60 y 80 horas (Tabla 1, Figura 16), correspondiendo el

menor tiempo, 60 horas, a los cultivos Y5, 97a y 60b, y 80 horas a los cultivos 14c y 23b. A

su vez, la cuantificación del número de unidades emulsificantes (UAE) se encontró en un

rango de 0,716 - 1,569 UAE mL-1 (Tabla 2), correspondiendo el mayor valor al cultivo Y5 y

el menor valor al cultivo 23b.

4.2. Características químicas, microbiológicas y toxicidad del suelo experimental

contaminado con petróleo

El suelo experimental presentó un contenido de hidrocarburos totales, HTP de

38 899 mg kg-1 (Tabla 3). El número más probable de microorganismos totales fue de

2,4x106 NMP g-1, población que supero a la hidrocarbonoclástica de 1,5x105 NMP g-1. En

cuanto al nivel de toxicidad del suelo experimental, fue severo (Tabla 4) en el índice de

germinación del rabanito.



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39

a b

Tabla 1.

Tiempo requerido para la utilización del petróleo como fuente de carbono y energía por los

cultivos de trabajo

Cultivo

Bacteriano

Tiempo

(horas)

Y5

97a

60b

14c

23b

60

60

60

80

80

Figura 16. Determinación del tiempo de utilización del petróleo (a) testigo (b) caldo

inoculado.

a b



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40

Tabla 2.

Unidades de actividad emulsificante alcanzadas por los cultivos de trabajo

Cultivo

bacteriano UAE

Y5

97a

14c

60b

23b

1,569

1,315

1,254

0,770

0,716

Tabla 3.

Contenido de hidrocarburos totales y número más probable de microorganismos totales e

hidrocarbonoclásticos en el suelo experimental contaminado con petróleo

Características Valor

TPH (mg kg-1)

Microorganismos totales (NMP g-1)

Microorganismos hidrocarbonoclásticos (NMP g-1)

38 899

2,4 x 106

1,5 x 105



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41

Tabla 4.

Nivel de toxicidad del suelo experimental contaminado con petróleo determinado en la

germinación de Raphanus sativus L., 2018

Características Valor

Promedio elongación radicular (mm)

Porcentaje relativo de germinación (PGR)

Crecimiento relativo de radícula (CRR)

Índice de germinación (% IG)

Nivel de fitotoxicidad

4,1

5,0

74

3,7

Severo

Fitotoxicidad: Baja (IG ≥ 80%), Moderada (80% > IG > 50%), Severa (IG ≤ 50%)

4.3. Eficiencia de la bioaumentación y bioestimulación en la biodegradación de

petróleo

Durante el proceso de biodegradación de petróleo en el suelo experimental inoculado

con los cultivos de bacterias hidrocarbonoclásticas, se observó que la población de

microorganismos totales a los 0 días osciló entre 2,1x106 - 3,5x106 NMP g-1 (Tabla 5); en

cuanto a los testigos, el mayor valor se observó en el testigo con bioestimulación (T14) con

2,7 x 106 NMP g-1 y el menor valor correspondió al testigo abiótico (T15) con una población

< 3,0 x 106 NMP g-1. A los 30 días, los microorganismos se incrementaron en todos los

tratamientos y a los 60 días alcanzaron su máxima población. A los 90 días la población de

microorganismos comenzó a disminuir en todos los tratamientos a excepción de los testigos

T13 y T14 donde alcanzaron su máxima población.



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42

La población de microorganismos hidrocarbonoclásticos fue de 2,1x105 - 3,6x105

NMP g-1 a los 0 días (Tabla 6), valores que se incrementaron conforme transcurrió el tiempo.

A los 90 días se alcanzó la máxima población, observándose los mayores valores en los

tratamientos con bioaumentación más bioestimulación correspondiendo una población

> 1,1 x 107 NMP g-1 al tratamiento Bioaumentación consorcio mixto + Bioestimulación

(T12). En los testigos la población de hidrocarbonoclásticos se incrementó hasta 3,5 x 105

NMP g-1 y 3,8 x 105 NMP g-1 a los 90 días con T13 y T14, respectivamente.

El índice de germinación de rabanito osciló entre 0 a 18% en todos los tratamientos a

los 0 días, significando un nivel de toxicidad severo de los contaminantes del suelo

experimental (Tablas 7 y 8, anexos 4 al 8). El nivel de toxicidad disminuyo conforme

transcurrió el tiempo, lo cual se vio reflejado en el incremento del índice de germinación; a

los 30 días el nivel de toxicidad fue moderado con los tratamientos de bioaumentación

consorcio mixto y todos los de bioaumentación-bioestimulación (IG 52–58%) y a los 60 días

en los demás tratamientos con bioaumentación (IG 55-58%).



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43

Tabla 5.

Número más probable de microorganismos totales (NMP g-1) durante la biodegradación de petróleo en terrarios

Tratamientos NMP g-1 / días

0 30 60 90 120

T1: Bioaumentación cultivo bacteriano Y5

T2: Bioaumentación cultivo bacteriano 97a

T3: Bioaumentación cultivo bacteriano 14c

T4: Bioaumentación cultivo bacteriano 60b


T6: Bioaumentación consorcio mixto

T7: Bioaumentación cultivo bacteriano Y5 + Bioestimulación

T8: Bioaumentación cultivo bacteriano 97a + Bioestimulación

T9: Bioaumentación cultivo bacteriano 14c + Bioestimulación

T10: Bioaumentación cultivo bacteriano 60b + Bioestimulación


T12: Bioaumentación consorcio mixto + Bioestimulación

T13: Testigo sin bioaumentación, sin bioestimulación

T14: Testigo con bioestimulación

T15: Testigo abiótico

2,8 x 106

2,8 x 106

2,1 x 106

2,8 x 106

2,1 x 106

3,5 x 106

2,8 x 106

3,5 x 106

2,8 x 106

2,1 x 106

2,1 x 106

2,1 x 106

2,0 x 106

2,7 x 106

<3,0 x 106

3,5 x 106

2,9 x 106

2,8 x 106

3,5 x 106

2,8 x 106

2,9 x 106

3,5 x 106

2,9 x 106

2,9 x 106

3,5 x 106

2,9 x 106

2,9 x 106

3,5 x 106

3,5 x 106

7,4 x 105

>1,1 x 108

1,1 x 108

1,1 x 108

4,6 x 107

1,1 x 108

>1,1 x 108

1,1 x 108

>1,1 x 108

>1,1 x 108

1,1 x 108

1,1 x 108

>1,1 x 108

2,1 x 107

4,6 x 107

1,1x 106

9,3 x 106

4,3 x 106

2,4 x 107

2,1 x 107

7,5 x 106

1,1 x 108

4,6 x 107

1,1 x 108

1,1 x 108

4,6 x 107

4,6 x 107

1,1 x 108

2,4 x 107

>1,1 x 108

1,5 x 106

7,5 x 106

2,3 x 106

9,3 x 106

7,5 x 106

2,3 x 106

1,5 x 107

1,5 x 107

2,1 x 107

2,1 x 107

1,5 x 107

1,5 x 107

2,1 x 107

7,5 x 106

1,5 x 107

2,0 x 106



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44

Tabla 6.

Número más probable de microorganismos hidrocarbonoclásticos (NMP g-1) durante la biodegradación de petróleo en terrarios

Tratamientos NMP g-1 / días

0 30 60 90 120
















2,9 x 105

3,6 x 105

3,5 x 105

3,5 x 105

2,1 x 105

3,6 x 105

3,6 x 105

3,6 x 105

3,5 x 105

3,5 x 105

2,1 x 105

3,6 x 105

1,5 x 105

2,0 x 105

<3,0 x 105

1,5 x 106

9,3 x 105

9,3 x 105

3,6 x 105

1,5 x 106

2,1 x 106

2,1 x 106

1,1 x 107

4,6 x 106

2,3 x 105

2,4 x 106

4,6 x 106

2,8 x 105

3,5 x 105

3,6 x 104

2,1 x 106

2,4 x 106

2,4 x 106

2,3 x 105

2,1 x 106

2,1 x 106

4,6 x 106

4,6 x 106

1,1 x 107

9,3 x 105

4,6 x 106

1,1 x 107

2,0 x 105

3,5 x 105

7,2 x 104

2,9 x 106

4,6 x 106

4,6 x 106

2,3 x 105

4,6 x 106

4,6 x 106

1,1 x 107

1,1 x 107

1,1 x 107

1,1 x 107

1,1 x 107

>1,1 x 107

3,5 x 105

3,8 x 105

7,4 x 104

1,5 x 106

2,1 x 106

1,5 x 106

3,5 x 105

1,5 x 106

9,3 x 15

9,3 x 105

9,3 x 105

1,5 x 106

4,3 x 105

9,3 x 105

2,4 x 106

9,2 x 104

2,0 x 105

1,1 x 105



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45

Tabla 7.

Índice de germinación de Raphanus sativus L. durante la biodegradación de petróleo en terrarios

Tratamientos Índice de germinación (%) Significancia

(α = 0,05) 0 30 60 90 120
















6

5

6

8

6

12

11

10

14

12

10

18

3

5

0

32

34

36

34

32

52

54

54

55

55

54

58

18

24

0

56

55

56

58

56

62

61

60

64

62

60

68

23

35

6

62

66

64

62

65

67

72

76

73

74

73

82

39

42

16

75

72

74

73

75

76

86

86

85

85

82

94

53

55

30

c

c

c

c

c

c

b

b

b

b

b

a

d

d

e



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46

Tabla 8.

Nivel de toxicidad en el índice de germinación de Raphanus sativus L. durante la biodegradación de petróleo en terrarios

Tratamientos Nivel de toxicidad / días

0 30 60 90 120
















Severo

Severo

Severo

Severo

Severo

Severo

Severo

Severo

Severo

Severo

Severo

Severo

Severo

Severo

Severo

Severo

Severo

Severo

Severo

Severo

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Severo

Severo

Severo

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Severo

Severo

Severo

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Bajo

Severo

Severo

Severo

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Bajo

Bajo

Bajo

Bajo

Bajo

Bajo

Moderado

Moderado

Severo



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47

A los 90 días el nivel de toxicidad fue moderado en todos los tratamientos

inoculados, a excepción de T12 Bioaumentación consorcio mixto + Bioestimulación con el

que se alcanzó un nivel bajo de toxicidad (IG 82%). A los 120 días los índices de

germinación fueron de 72 a 76% con los tratamiento de bioaumentación y de 82 a 94% con

los tratamientos de bioaumentación – bioestimulación, correspondiendo el mayor valor a T12

(IG 94%).

Los testigos T13 y T14 alcanzaron un nivel de toxicidad moderado a los 90 días, con

índices de germinación de 53% y 55%, respectivamente. El testigo abiótico (T15) presentó

un nivel de toxicidad severo durante todo el proceso de biodegradación.

La prueba F del análisis de varianza de los promedios del índice de germinación

demostró alta significancia (Anexo 9) y según la prueba múltiple de Tukey, el mayor valor

correspondió a tratamiento Bioaumentación consorcio mixto + Bioestimulación (T12),

diferenciándose significativamente de los demás tratamientos (Tabla 7)

Con el tratamiento T12 se cuantificó el HTP final determinándose 8 653 mg kg-1,

correspondiendo a 78% de eficiencia en la biodegradación de petróleo (Tabla 9), del suelo

contaminado con hidrocarburos de petróleo.



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48

Tabla 9.

Características del suelo biodegradado con bioaumentación consorcio mixto + bioestimulación durante 120 días

Características Días

0 30 60 90 120

Microorganismos totales (NMP g-1)

Microorganismos hidrocarbonoclásticos (NMP g-1)

Índice de germinación (%)

Nivel de toxicidad

HTP (mg kg-1)

Eficiencia (%)

2,1 x 106

3,6 x 105

18

Severo

38 899

-

2,9 x 106

4,6 x 106

58

Moderado

-

-

>1,1 x 108

1,1 x 107

68

Moderado

-

-

1,1 x 108

>1,1 x 107

82

Bajo

-

-

2,1 x 107

2,4 x 106

94

Bajo

8 653

78



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49

V. DISCUSIÓN

Las bacterias hidrocarbonoclásticas previamente aisladas de un suelo contaminado

con hidrocarburos de petróleo mejoraron la calidad del suelo experimental, demostrándose

la capacidad metabólica de los microorganismos individuales o consorcios nativos y

alóctonos para mejorar la tasa de degradación de los contaminantes (Fodelianakis, 2015;

Varjani, 2017). En zonas impactadas con hidrocarburos de manera recurrente o con

episodios previos de contaminación, los microorganismos se seleccionan en favor de la

metabolización del contaminante (Buendía, 2012; Lladó, 2012).

La capacidad metabólica de los microorganismos frente a los contaminantes del

suelo, es la base sobre la cual se sustenta la presente investigación de biodegradación en la

cual las bacterias utilizan los contaminantes como sustrato para su desarrollo y crecimiento,

significando una degradación gradual de la molécula para formar al final uno o más

fragmentos menos tóxicos, en algunos casos mineralizando hasta dióxido de carbono y agua

(Samanez, 2008; Lladó, 2012).

El tiempo requerido para la utilización de petróleo por los cultivos de bacterias

hidrocarbonoclásticas de 60 y 80 horas, fue el tiempo reportado por Cabanillas y Pissani

(2015). Al igual que los valores de actividad emulsificante con un máximo de

1,569 UAE mL-1, valor que se encuentra en el rango 0,069 – 2,75 UAE mL-1, mencionado

por otros investigadores (Arizaca, 2015; Quiliche, Cortez, Rodríguez, Silva y Huayna,

2016).

En la primera etapa de degradación de los hidrocarburos, se metabolizan las

fracciones más sencillas: n-alcanos de cadena corta, por oxidaciones sucesivas a través de la

vía de β-oxidación. En la segunda etapa se degradan las fracciones pesadas, como los



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50

isoprenoides, cicloalcanos y aromáticos (Llanos, 2012). Los microorganismos facilitan la

difusión hacia el interior de compuestos orgánicos hidrófobos, como los hidrocarburos, por

medio de biosurfactantes y bioemulsificantes, mejorando la disponibilidad del contaminante

(Arrieta, 2011).

El suelo experimental presentó microorganismos e hidrocarburos totales de petróleo

(HTP), requeridos para la investigación de la degradación microbiana de este contaminante

(Purisca y Quevedo, 2015). El contenido de HTP fue de 38 899 mg kg-1, valor superior al

rango de 19 000 – 25 000 mg kg-1 registrados por Buendía (2012), Ñustez (2012) y Purisaca

y Quevedo (2015). La fracción TPH se define como aquellos hidrocarburos del extracto

orgánico total pertenecientes a las fracciones saturada y aromática (Viñas, 2005), cuya

concentración sirve como indicador general del tipo de contaminación26. Al respecto,

Buendía (2012) mencionó que para biorremediar un suelo contaminado, el HTP debe ser

menor de 50 000 mg kg-1.

La cuantificación de las poblaciones de microorganismos totales e

hidrocarbonoclásticos fue de 2,4x106 NMP g-1 y 1,5x105 NMP g-1, respectivamente; valores

menores a los reportados por Contreras y Carreño (2018), >1,1x107 NMP g-1 para

microorganismos totales y 1,1x106 NMP g-1 para hidrocarbonoclásticos.

Los microorganismos totales o heterótrofos totales metabolizan como fuente de

carbono sustancias orgánicas y los microorganismos hidrocarbonoclásticos degradan el

petróleo como única fuente de carbono y energía (Acuña, Pucci, Morales y Pucci, 2010).

Los contaminantes del petróleo se depositan principalmente en la zona más superficial del

suelo, donde se encuentra el mayor contenido de materia orgánica que incluye a los

microorganismos en general. Los suelos expuestos a contaminación recurrente con

hidrocarburos de petróleo constituyen un microhábitat adecuado para la evolución de



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51

especies microbianas degradadoras. El contaminante es un factor importante en la selección

de microorganismos capaces de sobrevivir y adaptarse (Gómez et al., 2008).

El nivel de toxicidad del suelo experimental fue severo, parámetro valorado

utilizando como bioindicador semillas de Raphanus sativus L. “rabanito”, material biológico

también utilizado por otros investigadores en un suelo impactado con hidrocarburos

(Contreras y Carreño, 2018; Oliva, 2018); un bioindicador alternativo es Lactuca sativa L.

“lechuga” (Purisaca y Quevedo, 2015) y Brassica alba L. “mostaza blanca” (Jiang et al.,

2016). Los hidrocarburos son los compuestos mayoritarios (50 – 98%) del petróleo

(Ramírez, 2014), predominando los de cadena lineal n-alcanos y en menor proporción los

alcanos ramificados, cicloalcanos e hidrocarburos aromáticos (HAPs), estos últimos

representan una peligrosidad intrínseca, toxicidad aguda, teratogenica, mutagenica y

carcinógena. Los HAPs se bioacumulan y son recalcitrantes, resistiendo a la degradación

fotolítica, química y biológica (Viñas, 2005).

La tasa de biodegradación es influenciada por las condiciones ambientales y la

población microbiana, al igual que por factores físico-químicos como pH, humedad,

temperatura, contenido de agua, salinidad, oxígeno y disponibilidad de nutrientes (Varjani &

Upasani, 2016). Por esta razón esta investigación se aplicaron riegos, volteos y técnicas de

bioaumentacion y bioestimulación (Cabanillas y Pissani, 2015). La bioaumentación la

adición de microorganismos degradadores seleccionados naturalmente en el ambiente

contaminado. Estos microorganismos se aíslan, caracterizan y después se reintroducen para

la degradación de los contaminantes (Arrieta, 2011). En la bioestimulación, la actividad

microbiana es estimulada o incrementada por la adición de nutrientes como el nitrógeno,

fósforo y potasio (Gómez et al., 2008).

En la bioaumentación se aplicó 5% del inóculo o consorcio bacteriano

correspondiente (Llanos, 2012), no obstante, se puede utilizar hasta 10% según Samanez



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(2008). En la bioestimulación, se adicionaron los fertilizantes sintéticos úrea (46%N) y

fosfato diamónico (18% N, 46%P) en la relación C:N:P de 100:10:1 al igual que Llanos

(2012), Cabanillas y Pissani (2015) y Gómez et al. (2008); otros investigadores utilizan

nutrientes en forma de nitrato de amonio y ortofosfato de potasio (Jiang et al., 2016) para

obtener la relación 100:10:0,1.

La temperatura ambiental en el proceso de fue de 12,5 – 31ºC; valores aceptables y

dentro del rango de 30 - 40 ºC, considerado óptimo y en el que se intensifica la actividad

enzimática de los microorganismos, acelerando al máximo la degradación. Cuando la

temperatura es menor, la viscosidad del petróleo aumenta, varia su solubilidad en agua y

disminuye la volatilización de algunas fracciones tóxicas para los microorganismos. Por el

contrario, a temperaturas mayores, la toxicidad de los hidrocarburos se incrementa,

inhibiéndose la actividad microbiana (Pardo et al., 2004).

Durante la biodegradación, el suelo fue removido para favorecer la aireación. La tasa

de degradación es directamente proporcional a la disponibilidad de oxígeno, ya que es

utilizado como aceptor final de electrones y también como sustrato en las reacciones

catalizadas por las oxigenasas (Lladó, 2012); además la oxigenación facilita la volatilización

de los compuestos tóxicos (Arrieta, 2011). La humedad se mantuvo en 60% de la capacidad

de campo (cc), valores muy bajos pueden significar una inactividad metabólica de los

microorganismos, así como una reducción del transporte de nutrientes y contaminantes, es

decir, de su biodisponibilidad. Un exceso de agua, por el contrario, podría suponer una

disminución en la circulación del aire y, por tanto, una disminución de la disponibilidad del

oxígeno. El rango óptimo de contenido de agua en un suelo para la biodegradación (Realp et

al., 2008), suele estar entre 30% y 80% cc.



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La eficiencia de la biodegradación de los hidrocarburos de petróleo se determinó

indirectamente mediante la cinética de la población microbiana y la toxicidad de los

contaminantes del suelo experimental y directamente a través de la cuantificación del HTP,

coincidiendo con Cabanillas y Pissani (2015) y Purisaca y Quevedo (2015).

Los microorganismos se incrementaron, alcanzando la máxima población de

heterótrofos totales a los 60 días y de hidrocarbonoclásticos a los 90 días, resultado que

puede ser explicado porque el hidrocarburo como fuente de carbono puede sostener la

población microbiana (Hernández et al., 2003). El aumento de la población microbiana se

asoció al mayor porcentaje de biodegradación de hidrocarburos de petróleo como lo

demostró Pardo et al. (2004). Estos investigadores determinaron a los 30 días 38,6% de

degradación, en comparación 28,1% a los 60 días y 4,7% a los 90 días de iniciado el proceso

de biorremediación.

Los microorganismos totales e hidrocarbonoclásticos disminuyeron a partir de los

90 días y 120 días, respectivamente. Esta disminución de la población microbiana también

fue observada por Samanez (2008) y Contreras y Carreño (2018), lo cual es explicado por la

disminución en la disponibilidad de los sustratos hidrocarbonados más fácilmente

biodegradables. Conforme transcurre el tiempo, permanecen los compuestos más resistentes

a la degradación microbiana, sobreviviendo los microorganismos previamente

seleccionados, propagados y reintroducidos en los suelos contaminado según la tecnología

de la bioaumentación (Cabanillas y Pissani, 2015).

La bioestimulación incrementó la biorremediación del suelo experimental

contaminado. La combinación de las técnicas de bioumentación y bioestimulación mejoran

la eficiencia de biorremediación en comparación de un suelo remediado solo con atenuación

natural. La adición de nutrientes, como el nitrógeno y fósforo, es parámetro clave para

promover la biodegradación. Los hidrocarburos de petróleo presentan pocos elementos



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esenciales para la célula bacteriana como son N, P, K y algunos minerales traza (Llanos,

2012); estos elementos representan un factor limitante en la biodegradación de

hidrocarburos por lo que se debe ajustar la proporción C:N:P mediante la adición de úrea y

fosfato, lográndose de esta manera, acelerar el proceso de degradación (Arrieta, 2011).

El consorcio mixto constituido por los cultivos de bacterias hidrocarbonoclásticos

fue más eficiente que las bacterias aplicadas independientemente. Esto se debe a que los

consorcios microbianos con los que establecen procesos simbióticos de comensalismo y

cometabolismo, que en conjunto mineralizan el contaminante (Gómez, 2008). La aplicación

de varios géneros bacterianos asegura mayor efectividad en la biorremediación, debido a que

se metabolizan diferentes compuestos (Arrieta, 2011).

La bioaumentación aplicada junto a la bioestimulación con un consorcio mixto

demostró mayor eficiencia en la degradación del contaminante y consecuentemente la

disminución de la toxicidad a un nivel bajo a los 90 días, lográndose una eficiencia de

degradación de 78%. El porcentaje de eficiencia supero al 71,4% reportado por Samanez

(2008) con bioaumentación + bioestimulación y 61,9% con bioaumentación, y 75% con

bioaumentación + bioestimulación por Cabanillas y Pissani (2015); concluyéndose que la

reintroducción de microorganismos aislados previamente de un ambiente contaminado tiene

mayor efectividad en la biodegradación de petróleo, cuando los microorganismos disponen

de compuestos inorgánicos.



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VI. CONCLUSIONES

Se demostró la eficiencia del 78% en la biodegradación de petróleo por bioaumentación

con un consorcio mixto más bioestimulación.

Los cultivos de bacterias hidrocarbonoclásticas utilizaron el petróleo como fuente de

carbono y energía en un tiempo de 60 y 80 horas, y la cuantificación del número de unidades

emulsificantes se encontró en un rango de 0,716 - 1,569 UAE mL-1.

El suelo experimental contaminado presentó un contenido de HTP de 38 899 mg kg-1,

población de microorganismos totales (2,4x106 NMP g-1) e hidrocarbonoclásticos

(1,5x105 NMP g-1) y un nivel de toxicidad severo en el índice de germinación de Raphanus

sativus L. “rabanito”.

La bioaumentación y bioestimulación incrementaron la población de microorganismos

totales e hidrocarbonoclásticos, disminuyó la toxicidad de los contaminantes y

concentración de hidrocarburos totales de petróleo, alcanzándose con el tratamiento

bioaumentación consorcio mixto + bioestimulación el mayor valor de eficiencia.



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VII. RECOMENDACIONES

Caracterizar a nivel molecular los cultivos bacterianos Y5, 97a, 60b, 14c y 23b.

Investigar sustratos de bajo costo para el incremento a gran escala de los consorcios

mixtos bacterianos.

Investigar la biorremediación de suelos contaminados a nivel de campo en lotes de

explotación comercial o áreas de interés agrícola.



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Volke, S. y Velasco, T. (2002). Tecnologías de Remediación para Suelos Contaminados.

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Wu, M., Dick, W., Li, W., Wang, X., Yang, Q., Wang, T., Xu, L., Zhang, M. & Chen, L.

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Zawierucha, I. & Malina, G. (2006). Bioaugmentation as a method of biodegradation

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6: 163–169. doi: https://doi.org/10.1016/S1642-3593(06)70138-0

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Enhancing Biodegradation of Oil Hydrocarbons Contaminated Soils. Soil Biology, 28:

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https://doi.org/10.1016/j.biortech.2016.09.080

https://doi.org/10.1016/S0958-1669(96)80036-X

https://doi.org/10.1016/j.ibiod.2015.11.019

https://doi.org/10.1016/S1642-3593(06)70138-0

BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

66

IX. ANEXOS



BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

67

ANEXO 1

Composición (gL-1) de medios de cultivo para la cuantificación del tiempo de

utilización del petróleo y número de unidades emulsificantes en Cabanillas y Pissani

(2015)

a. Caldo Bushnell Haas

Componentes gL-1

KH2PO4

K2HPO4

(NH4)2SO4

MgSO4

Cl2Ca

FeCl3

Agua destilada

1,0

1,0

1,0

0,20

0,02

0,005

1000 mL

Ajustar a pH 7,0

b. Caldo extracto de levadura etanol

Componentes gL-1

KH2PO4

K2HPO4

(NH4)2SO4

MgSO4

Extracto de levadura

Etanol

Agua destilada

18,0

6,0

4,0

0,2

3,0

20 mL

1000 mL

Ajustar a pH 7,0



BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

68

ANEXO 2

Tabla para el cálculo del Número Más Probable (NMP) para serie de diluciones de tres

tubos, 95% de confiabilidad en Blodgett (2010)

NMP/100ml = (Tabla NMP/100 ml) x 10/V

Donde: V= volumen de muestra de la dilución más baja seleccionada.



BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

69

ANEXO 3

Cálculo de la concentración de úrea y fosfato diamónico requeridos para alcanzar una

relación C:N:P de 100:10:1 en Carreño et al. (2009) y Chávez (2010)

a. Cálculo de FDA (18%N – 46%P)

100 kg FDA 46 U/P

x 1 U/P

Adición por terrario:

0,217 g FDA 1 m2

x 0,0726 m2

100 kg FDA 18 U/N

0,000016 kg FDA x

b. Cálculo de Urea (46%N)

100 kg urea 46 U/N

x 1 U/P

Adición por terrario:

2,174 g urea 1 m2

x 0,0726 m2

0,157 g N (urea) – 0,029 g N (FDA)

x = 1,128 g urea

x = 2,174 kg FDA ha-1

x = 0,217 g FDA m2

x = 0,016 g FDA

x = 0,000029 kg N

x = 0,029 g N FDA

x = 0,0157 g N

x = 21,739 kg urea ha-1

x = 2,1739 g urea m2



BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

70

ANEXO 4

Germinación de Raphanus sativus L. sembrado en el suelo experimental contaminado con hidrocarburos de petróleo al inicio de la

biodegradación

Tratamientos

Promedio

elongación

radicular

(mm)

Porcentaje

relativo de

germinación

(PGR)

Crecimiento

relativo de

radícula (CRR)

Índice de

germinación

(%IG)

Nivel de

fitotoxicidad
















33

39

33

36

33

40

28

28

41

44

28

38

25

28

0

10

7

10

12

10

24

22

20

19

24

20

26

7

8

0

59

71

59

65

59

50

50

50

73

50

50

69

45

62

0

6

5

6

8

6

12

11

10

14

12

10

18

3

5

0

Severo

Severo

Severo

Severo

Severo

Severo

Severo

Severo

Severo

Severo

Severo

Severo

Severo

Severo

Severo



BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

71

ANEXO 5

Germinación de Raphanus sativus L. sembrado en el suelo experimental contaminado con hidrocarburos de petróleo a los 30 días de la

biodegradación

Tratamientos

Promedio

elongación

radicular

(mm)

Porcentaje

relativo de

germinación

(PGR)

Crecimiento

relativo de

radícula (CRR)

Índice de

germinación

(%IG)

Nivel de

fitotoxicidad
















38

44

36

38

36

46

36

33

46

47

35

45

32

34

0

50

52

52

50

55

60

62

62

65

64

60

66

37

38

0

64

65

69

68

58

87

87

87

84

86

90

88

48

63

0

32

34

36

34

32

52

54

54

55

55

54

58

18

24

0

Severo

Severo

Severo

Severo

Severo

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Severo

Severo

Severo



BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

72

ANEXO 6


biodegradación

Tratamientos

Promedio

elongación

radicular

(mm)

Porcentaje

relativo de

germinación

(PGR)

Crecimiento

relativo de

radícula (CRR)

Índice de

germinación

(%IG)

Nivel de

fitotoxicidad
















44

48

42

44

46

54

40

41

55

53

52

58

42

44

40

64

64

68

58

68

70

70

65

66

65

65

70

40

44

42

87

85

82

92

82

88

87

92

97

95

92

97

57

79

14

56

55

56

58

56

62

61

60

64

62

60

68

23

35

6

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Severo

Severo

Severo



BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

73

ANEXO 7


biodegradación

Tratamientos

Promedio

elongación

radicular

(mm)

Porcentaje

relativo de

germinación

(PGR)

Crecimiento

relativo de

radícula (CRR)

Índice de

germinación

(%IG)

Nivel de

fitotoxicidad
















44

48

42

44

46

54

40

41

55

53

52

58

42

44

40

74

78

78

71

71

73

76

78

78

75

75

83

50

52

44

84

84

82

87

91

91

95

97

93

98

97

99

78

80

36

62

66

64

62

65

67

72

76

73

74

73

82

39

42

16

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Bajo

Severo

Severo

Severo



BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

74

ANEXO 8


biodegradación

Tratamientos

Promedio

elongación

radicular

(mm)

Porcentaje

relativo de

germinación

(PGR)

Crecimiento

relativo de

radícula (CRR)

Índice de

germinación

(%IG)

Nivel de

fitotoxicidad
















52

58

50

54

57

55

60

60

65

63

62

68

54

56

48

88

84

84

82

84

82

90

89

93

93

84

98

62

64

50

85

85

88

89

89

92

95

96

91

91

94

95

85

86

60

75

72

74

73

75

76

86

86

85

85

82

94

53

55

30

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Moderado

Bajo

Bajo

Bajo

Bajo

Bajo

Bajo

Moderado

Moderado

Severo



BIBLIO

TECA D

E POSGRADO - U

NT

75

ANEXO 9

Prueba de homogeneidad de varianzas y análisis de varianza de los valores promedios

del índice de germinación de Raphanus sativus L.

Prueba de homogeneidad de varianzas

Estadístico de

Levene

gL1 gL2 Sig

0,945 14 30 0,566

Anova de un factor

Fuente de

variación

Suma de

cuadrados

gL

Media

cuadrática

F Sig.

Inter-grupos

Intra-grupos

Total

14060,800

68,000

14128,800

14

30

44

1004,343

2,267

443,092 0,000



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