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Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular

Práctica 3 Metodología y aplicaciones de la amplificación de material genético: Introducción a la bioinformática. Curso 1 Medicina (Abril) 2012 BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR HUMANA Mohammed Rafii-El-Idrissi Benhnia Ph.D. Phone: 954559852 Email: rafiim@us.es

1.  Familiarizarse con el proceso de amplificación mediante

polimerasas

2.  Identificar los parámetros críticos de una PCR y familiarizarse con el fundamento de la electroforesis de ácidos nucleicos

3.  Secuenciación de ADN.

4.  Identificar en el laboratorio virtual una especie patógena mediante PCR

5.  Retrotranscripción-amplificación en cadena de la polimerasa (RT-PCR)

6.  Caso práctico: uso de las bases de datos de genes (BLAST) y familiarizarse con la notación

Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular

OBJETIVOS

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OBJETIVOS 1.  Familiarizarse con el proceso de amplificación mediante

polimerasas

2.  Identificar los parámetros críticos de una PCR y familiarizarse con el fundamento de la electroforesis de ácidos nucleicos

3.  Secuenciación de ADN.

4.  Identificar en el laboratorio virtual una especie patógena mediante PCR

5.  Retrotranscripción-amplificación en cadena de la polimerasa (RT-PCR)

6.  Caso práctico: uso de las bases de datos de genes (BLAST) y familiarizarse con la notación

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¿Qué es la PCR?

•  PCR: Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction, Kary Mullis-1985)

•  Amplificación selectiva de un segmento particular de ADN

•  El segmento puede representar una parte

pequeña de entre una mezcla heterogénea de AND: e.g. un exón específico de un gen humano

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•  Herramienta muy poderosa de amplificar y/o detección de fragmentos de ADN de interés ~2 horas.

•  La técnica de la PCR tiene multitud de aplicaciones: Ø  Diagnóstico (prenatal, infecciones microbianas,

mutaciones de oncogenes, …etc) Ø Medicina forense Ø Antropología o Arqueología molecular Ø Microbiología ambiental

¿Qué es la PCR?

¿Qué hay en la reacción?

•  Molde de ADN •  Tampón or “buffer” de la reacción – mantener pH

adecuado para el funcionamiento de ADN polimerasa (Tris, iones amonio, iones magnesio, albúmina bovina sérica)

•  4 nucleótidos trifosfato (dNTPs): dATP, dCTP, dTTP y dGTP

•  Cebadores (primers) •  ADN polimerasa (normalmente Taq)

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¿Qué hay en la reacción?

Reagent for PCR Volume (µ l) for each (25 µ l total)

Final concentration

Taq DNA polymerase (added last)

0.25 50 U/ml

10x buffer 2.5 1x

dNTPs (10 mM each, combined)

0.5 200 µM

Forward primer 0.5 1.2 µM Reverse primer 0.5 1.2 µM dH2O (nuclease free) 19.75 or 19.25 Template (AND) 1

CONTROLES EN LA REACCIÓN DE PCR

CONTROL NEGATIVO TaqPol, dNTPs, buffer, cebadores

+ H2O FALSOS POSITIVOS

CONTROL POSITIVO TaqPol, dNTPs, buffer, cebadores

+ DNA conocido

CONTROL DE LA AMPLIFICACIÓN

MUESTRA PROBLEMA TaqPol, dNTPs, buffer, cebadores

+ DNA desconocido

DIAGNÓSTICO SEGURO

¿Qué hay en la reacción?

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Termocicladores •  Gran variedad de suministradores.

•  Gran variedad de formatos.

•  Reacciones se llevan a cabo en tubos o en placas de 96.

Cebadores

•  Oligonucleótidos deben tener ~20 bases.

•  El contenido G/C debe ser del 45–55%.

•  La base en el extremo 3´ debe ser G o C.

•  Los cebadores no deben ser complementarios entre ellos o formar bucles consigo mismo.

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Cebadores que forman bucles

•  5´-GTTGACTTGATA ||||| T 3´-GAACTCT

Cebadores

•  Un cebador puede formar un dímero consigo mismo o con otro cebador.

5´-ACCGGTAGCCACGAATTCGT-3´ |||||||||| 3´-TGCTTAAGCACCGATGGCCA-5´

•  Los cebadores pueden ser excelentes, pero no deseados, substratos para la Taq polimerasa.

Cebadores

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1- Desnaturalización “denaturation” 95°C, 30 sec. 2- Alineamiento “Annealing” 55–60°C, 30 sec. 3- Extensión “extension/elongation” 72°C, 45 sec. Tiempo depende del tamaño del producto. 30–35 ciclos

Etapas de un ciclo de PCR

1.  Desnaturalización (denaturation)

95º C

Etapas de un ciclo de PCR

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2.  Alineamiento o unión de los cebadores (Annealing)

Cebadores (primers)

55º C

5´

5´ 3´

3´

3´ 5´ 5´ 3´

La PCR amplifica una zona de ADN flanqueada entre dos cebadores

Etapas de un ciclo de PCR

Etapas de un ciclo de PCR

3. Extensión (extension/elongation)

Polimerasa Taq

72º C

72º C

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30–35 ciclos: Desnaturalización. Alineamiento. Extensión.

Etapas de un ciclo de PCR

¿Cuántas copias se generan?

•  No hay amplificación de la secuencia deseada hasta el tercer ciclo.

•  La acumulación no es estrictamente el doble tras cada ciclo en las primeras fases.

•  Tras 30 ciclos, hay 1,073,741,764 copias específicas (~1×109).

•  Hay también otras 60 copias de ADN.

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www.dnalc.org/shockwave/pcranwhole.html

1. Visita la página web que se indica abajo 2. Entra en el apartado “Amplification” 3. Observa cómo se comportan los parámetros siguientes:

Temperatura, número de ciclos y etapas de PCR Nota cómo en el ciclo 3 hay 8 copias de ADN y 2 copias de la

secuencia diana

Comprueba las etapas de PCR

Video

¿Ha funcionado PCR? Electroforesis de ADN

•  Comprobación mediante una electroforesis (densidad eléctrica K)

•  http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/ •  ¿Es el tamaño del producto el esperado? •  ¿Hay más de una banda? •  Quizás haya que optimizar la reacción. Video

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Optimización de PCR

T° de alineamiento •  Cebadores tienen una temperatura

de alineamiento de 54°C). •  La T debe confirmarse

empíricamente. •  Saltos de T de 2°C arriba y abajo. •  Uso de cicladores con gradiente.

50 52 54 56 58 60

Concentración de Mg2+ •  La fidelidad de la PCR depende

[Mg2+]. •  Variaciones de [Mg2+] de 0.5 mM.

1.2 2 2.5 3 3.5 4

Optimización de PCR

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¿Cómo es la longitud del fragmento amplificado?

•  Típicamente entre 100-1500 bp.

•  Es posible amplificar — >25 kb.

•  Requiere modificar el tampón de la reacción, tiempo de extensión y tipo de polimerasa

•  Limitación por la integridad del material de partida.

¿Cuántos ciclos? Acerca de la sensibilidad

Saturación: Los reactivos se agotan Los productos se alinean La polimerasa se degrada Los productos no deseables se acumulan.

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¿Son importantes los errores?

•  Sí, si quieres clonar el fragmento amplificado de ADN — una molécula individual puede tener varias mutaciones.

•  No, si quieres secuenciar el fragmento amplificado o digerirlo con enzimas de restricción.

•  Usa un enzima con capacidad correctora.

1.  Familiarizarse con el proceso de amplificación mediante

polimerasas

2.  Identificar los parámetros críticos de una PCR y familiarizarse con el fundamento de la electroforesis de ácidos nucleicos

3.  Secuenciación de ADN.

4.  Identificar en el laboratorio virtual una especie patógena mediante PCR

5.  Retrotranscripción-amplificación en cadena de la polimerasa (RT-PCR)

6.  Caso práctico: uso de las bases de datos de genes (BLAST) y familiarizarse con la notación

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OBJETIVOS

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Método de Sanger para secuenciación de nucleótidos

Método enzimático •  El ADN molde. •  Un enzima que replique el ADN. •  Un cebador o "primer" marcado radiactivamente. •  Los cuatro nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y

dTTP). •  Nucleótidos dideoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP).

Son nucleótidos modificados que han perdido el grupo hidroxilo de la posición 3' de la desoxirribosa.

•  Deben realizarse en 4 tubos diferentes, 4 mezclas de reacción. Cada mezcla de reacción contiene 4 nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, de dTTP y dGTP), ADN polimerasa I, un cebador marcado radiactivamente y un nucleótido dideoxi, por ejemplo ddGTP, a una concentración baja.

•  El nucleótido dideoxi utilizado (ddGTP) competirá con su homólogo (dGTP) por incorporarse a la cadena de ADN que se está sintetizando, produciendo la terminación de la síntesis en el momento y lugar donde se incorpora.

Método de Sanger para secuenciación de nucleótidos

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- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -

- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACG

3’

3’

3’ 5’

5’

5’

1. Sea un DNA que se desea secuenciar:

2. Disponemos de un oligonucleótido complementario a la secuencia, que se hibrida con el DNA cuya secuencia deseamos conocer, y que vale como cebador de la nueva síntesis. Este oligonucleótido está marcado radioactivamente.

TAGGCACG

Método de Sanger para secuenciación de nucleótidos

- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGAAG*

- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGAAGG*

- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGAAGGCACATTCG*

- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGAAGGCACATTCGATG*

- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCAATCG*

- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCAATCGAATCG*

3’

3’

5’

5’

3

4

12

15

21

26

Síntesis en presencia de ddGTP

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G A T C60

50

40

30

20

10

+

- A continuación, las cuatro mezclas se someten a electroforesis en poli- acrilamida-SDS. Este método sepa- ra polinucleótidos en función de su tamaño, de forma que los más cortos se desplazan más rápidamente. Como el cebador está marcado Radioactiva-mente, revelamos la plancha de electroforesis por autorradiografía.

Con esto leemos directamente la secuencia complementaria del poli- nucleótido inicial: 5’-AAGGCACATTCGATGCAAT- CGAATCGAACGTCCCAAAAG- GATTCCGGGAAAATG-3’

SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA DE ADN

Detección al mismo tiempo

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Aplicación de la PCR identificación de bacterias

www.hhmi.org/biointeractive/vlabs/index.html

Entra en “The bacterial identification lab”

Elección del caso práctico

1.  Familiarizarse con el proceso de amplificación mediante

polimerasas

2.  Identificar los parámetros críticos de una PCR y familiarizarse con el fundamento de la electroforesis de ácidos nucleicos

3.  Secuenciación de ADN.

4.  Identificar en el laboratorio virtual una especie patógena mediante PCR

5.  Retrotranscripción-amplificación en cadena de la polimerasa (RT-PCR)

6.  Caso práctico: uso de las bases de datos de genes (BLAST) y familiarizarse con la notación

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OBJETIVOS

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¿Podemos amplificar por PCR ARN?

•  No directamente — la ADN polimerasa necesita un molde de ADN y no copia ARN.

•  mRNA puede copiarse antes en ADN complementario al ARN (cDNA) usando la transcriptasa inversa.

•  cDNA es un molde para la PCR

Retrotranscripción-amplificación en cadena de la polimerasa (RT-PCR)

RT PCR master mixes

Reagent for PCR Volume (µ l) for each (25 µ l total)

Final concentration

Quiagen RT PCR buffer 5x 5 1x One step RT PCR enzyme Mix

1

dNTPs (10 mM each, combined)

1 400 µM each dNTP

Primers A 0.5 0.6 µM Primers B 0.5 0.6 µM dH2O (nuclease free) 5.75

Template (mRNA) 10

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5´ 3´

3´ 5´ 5´

5´ 5´

5´ 5´ PCR

RT

1er paso: retrotranscripción a partir del ARN.

2º paso: amplificación a partir de la primera hebra de ADNc.

.3er paso: PCR estándar.

Retrotranscripción-amplificación en cadena de la polimerasa (RT-PCR)

Retrotranscripción-amplificación en cadena de la polimerasa (RT-PCR)

exon 1 intron 1 exon 2

7 kB A

B 7 kB

exon 1 intron 1 exon 2 exon 3

A B

600 pb 1200 pb

M

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Trabajando con secuencias…

1.  Localiza en la base de datos el gen para óxido nítrico sintasa inducible, iNOS, NM_010927.3

2.  Familiarizarse con la notación ¿la secuencia de nt pertenece a ARN o es genómica? ¿Dónde comienza y acaba la proteína?

Entra en la base de datos NCBI para ver el gen de la iNOS murine http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_010927

Caso práctico: BLAST

Videos

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•  Identifica los cebadores en la secuencia usando BLAST contra el gen (NOS2) www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi Seq 1 introduce en GI el número del gen NM_010927.3 Seq 2 introduce (copy-paste) el oligo 5´ y el oligo ´3 Oligo 5´ CAgCTCATCCggTACgCTggCTAC Oligo 3´ ACTTCCTCCAggATgTTgTAgCg •  ¿Cuál es el tamaño amplificado tras RT-PCR? 397 pb

Caso práctico: BLAST

Video

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Gracias Thanks

Mohammed Rafii-El-Idrissi Benhnia Ph.D. Scientist Infectious diseases and vaccine discovery