DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA - Universidad de El...

MANUAL DE LABORATORIO

DE

DIAGNOSTICO PARASITOLÓGICO

Departamento de Microbiología Facultad de Medicina

Universidad de El Salvador

2019

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PREFACIO

El contenido de este manual es fruto del esfuerzo de generaciones de profesores de parasitología de la Facultad de Medicina en la Universidad de El Salvador, quienes con su experiencia han enriquecido su contenido y contribuido a la formación de profesionales en el área de la salud. Es necesario aclarar a los estudiantes que si bien es cierto este manual es un instrumento en el curso de la asignatura, su uso más importante será en el ejercicio profesional como material de referencia y consulta obligatoria ya que, dependiendo del empeño que cada estudiante ponga en su elaboración, en él se exponen experiencias, imágenes, ideas, métodos, procedimientos y porque no, los problemas más frecuentes con que el parasitólogo clínico puede encontrarse.

En él se ha incorporado una selección de métodos con base en su eficiencia,

sensibilidad, especificidad y factibilidad, todas ellas características imprescindibles al momento de intentar un diagnostico adecuado. El conocimiento de tales métodos no se limita aquí únicamente a la mera secuencia de pasos en una técnica sino que pretende relacionarlos con los principios teóricos respectivos de tal manera que el estudiante pueda discernir y decidir según el caso que se presente las ventajas, desventajas y pertinencia de los mismos y que logre interpretar adecuadamente los resultados obtenidos de ellos.

Por otra parte, este manual incluye procedimientos actualizados y de reciente publicación que sirven de soporte a las técnicas utilizadas tradicionalmente. Por supuesto, es innegable que el trabajo de campo puede verse influido por multitud de limitantes en nuestro país y es por ello que no se prescinde en este manual de las técnicas básicas que han acompañado a los parasitólogos en su trabajo técnico por años.

En suma, la experticia técnica se gana con la experiencia repetida en el trabajo diario pero si esta no se registra aquella no se consigue pues los eventos tienden a olvidarse o a convertirse en simples anécdotas. El formato de este documento promueve en el estudiante la escritura de técnicas y resultados así como la resolución a problemas, con el fin de que, al adquirir el hábito, se beneficie el trabajo técnico de todos los días y se encuentren a mano las soluciones a eventos e inquietudes que por poco frecuentes no son menos importantes en el área de parasitología.

Esperamos por tanto que sea de gran ayuda para los futuros profesionales a la vez que esperamos sus observaciones y sugerencias acerca de su contenido. M.Sc. Rafael Oswaldo Ángel Belloso. M.Sc. Miguel Ángel Minero Lacayo. Sección de Parasitología, Departamento de Microbiología, UES.

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INSTRUCCIONES GENERALES Y DE BIOSEGURIDAD PARA EL TRABAJO DE LABORATORIO

1. Es en extremo necesario que antes de cada práctica el/la estudiante haya realizado las

tareas indicadas en el manual y realizado las investigaciones teóricas respectivas.

2. Se hace énfasis en la identificación morfológica por lo que es recomendable tener siempre a mano libros, referencias, atlas, fotos, u otros elementos útiles como material de apoyo. Esto permite optimizar el tiempo de uso de los microscopios.

3. En todo momento se deberán cumplir las medidas básicas de bioseguridad. Quien no

practique adecuadamente estas normas y/o carezca de su manual al inicio de la misma no podrá realizar la práctica perdiendo el derecho a la evaluación respectiva

4. Podrán traerse a la práctica todas aquellas muestras clínicas para análisis que el

estudiante desee, incluso las de animales domésticos y silvestres.

5. Es responsabilidad de los estudiantes traer las muestras clínicas en el momento que se les solicite. Cuando ante la petición expresa estas faltaren, quedará a discreción del personal docente realizar o no la práctica.

6. Se requiere de puntualidad, orden y disciplina durante la práctica. El uso correcto de la

gabacha blanca manga larga y el lavado constante de manos es obligatorio.

7. Durante el desarrollo de las prácticas se prohíbe ingerir alimentos o agua, mascar chicle, maquillarse, fumar, el uso del teléfono celular y el uso inadecuado de guantes. No se permiten audífonos ni ningún otro dispositivo electrónico.

8. Es imperativo reconocer la ubicación y hacer uso adecuado de los descartes para

material contaminado y la basura, cada uno en los recipientes señalados para ello.

9. Si necesita salir del laboratorio por razones fisiológicas o personales comuníqueselo al instructor respectivo, retire su gabacha, lave sus manos, salga y regreso lo más pronto posible.

10. Antes de retirarse del laboratorio el material, equipo y lugar de trabajo, deben quedar

limpios, desinfectados y en orden.

11. Para esquematizar adecuadamente en el manual los agentes que observará, es preferible disponer de lápices de colores y otros materiales e instrumentos para dibujo.

12. Desinfectar la mesa de trabajo antes y después de realizar la práctica de laboratorio

13. Es necesario que para hacer frente a cualquier eventualidad, el estudiante conozca el

sitio del botiquín de primeros auxilios, puertas de salida, extintores de incendios, etc.

14. Se cuenta con material didáctico y equipo valioso por la utilidad que presta para la enseñanza. Si dicho material se daña o destruye por uso irresponsable, el estudiante deberá cancelar el importe y someterse a la sanción que el Departamento estipule.

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PRÁCTICA № 1

MICROSCOPIO: USO CORRECTO, ILUMINACION, MEDICION Y CUIDADOS.

OBJETIVOS: Al finalizar la práctica los estudiantes serán capaces de:

1. Explicar las partes del microscopio, el respectivo procedimiento de enfoque y los cuidados que deben tenerse al manipularlo.

2. Interpretar los tamaños de los objetos observados en el microscopio al compararlo con otros objetos para que de esta forma puedan estimar y relacionar el tamaño de lo que observan.

3. Conocer los procedimientos de calibración de un microscopio.

DESARROLLO: Antes de iniciar las actividades prácticas de cualquier trabajo frente al microscopio, aquel personal que no lo utiliza de rutina debe familiarizarse con sus diferentes partes, sus funciones y lo que debe hacer para lograr un enfoque adecuado. ACTIVIDAD #1: MANIPULEO Y ENFOQUE a) Siéntese en forma confortable frente a su microscopio. Retire el protector plástico y guárdelo en la

gaveta. b) Si el microscopio tiene polvo limpie su exterior con una toalla de papel o pedazo de gasa, sin tocar

los lentes. c) Después limpie los lentes con el papel respectivo, usando movimientos suaves y circulares. d) Utilizando el esquema de la página 6 identifique con sus compañeros de lado de mesa, las partes del

microscopio y sus funciones. e) Realice junto sus compañeros de mesa un montaje al fresco entre lámina y laminilla de la suspensión

suministrada para el caso. Coloque el montaje en la platina. f) Proceda ahora a hacer el enfoque interpupilar. El espacio o distancia entre pupila y pupila varia de

una persona a otra y. por ello necesitan ajustarse los oculares a esa distancia interpupilar para ver a través de los dos oculares un solo campo luminoso.

g) Encienda el microscopio a una intensidad de luz media. Ahora mire por los oculares, verá un campo luminoso con el ojo izquierdo y otro con el ojo derecho. Para lograr la distancia interpupilar correcta continué viendo el campo a través de un ocular mientras acerca o separe los oculares tomándolos con ambas manos y presionando para juntarlos o separarlos. Cuando la imagen del ojo izquierdo y la imagen del ojo derecho se fusionan o juntan y se ve un solo campo luminoso con ambos ojos, habrá encontrado su distancia correcta.

h) Cada uno los/las estudiantes del lado de mesa repetirán este procedimiento. i) El siguiente paso es el Enfoque ocular. Este consiste en ajustar los oculares al grado de visión de

cada ojo. Si no hace esto antes de iniciar el trabajo, nunca verá una imagen nítida y al poco tiempo sentirá molestias por el sobreesfuerzo.

j) Enfoque la preparación con el tornillo micrométrico lo más claro que pueda, viendo con ambos ojos. Ahora coloque una tarjeta o cartón en frente del ojo izquierdo y vuelva a enfocar lo más claro que pueda, haciendo girar suavemente la rosca macrométrica o micrométrica. Cuando logre esto, coloque la tarjeta cubriendo el ojo derecho. Al hacer esto, ya no toque ni el macro ni el micrométrico. Para enfocar la imagen, mueva la rosca del ocular izquierdo hacia un lado u otro hasta que vea nítidamente el objeto enfocado. Ahora los oculares ya están ajustados a cada ojo, asegurando así una observación clara y que la vista no se canse ni se sobreesfuerce.

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ACTIVIDAD #2: ENFOQUE DE LA ILUMINACION Una buena iluminación es aquella que ofrece el mejor contraste y es vital para la correcta visualización de los materiales y por ende, para un buen diagnóstico. Para lograrla, es necesario familiarizarse con los siguientes pasos:

1. Enfoque la preparación proporcionada con el objetivo de 4X. 2. Abra a su máxima capacidad el diafragma de apertura que se encuentra en el condensador. 3. Ajuste la luz a una intensidad confortable a su vista y que le permita identificar la preparación. 4. Viendo por los oculares, disminuya la abertura del diafragma hasta una pequeña luz. Si esta luz

se ve a los lados, arriba o abajo, como lo muestra la figura A, quiere decir que el condensador no está centrado. Usando ambos tornillos del condensador, deles vuelta despacio y alternativamente, hasta colocar la luz en el centro del campo, como en la figura B

A B

5. Ahora abra despacio el diafragma hasta que apenas desaparezca del campo visual. 6. Ajuste el condensador. Para ello suba o bájelo hasta que obtenga una imagen clara sin difracción

y buen contraste. Ya puede trabajar con su microscopio alineado y debidamente iluminado. 7. Ahora gire el revolver al objetivo de 10X y repita los pasos 5 y 6. 8. Gire el revolver al objetivo de 40X y repita los pasos 5 y 6. Si es necesario ajuste la luz a una

intensidad confortable ya que en este paso el campo microscópico se oscurecerá un poco. 9. Coloque aceite de inmersión gire el revolver al objetivo de 100X y repita los pasos 5 y 6. Si es

necesario ajuste la luz a una intensidad adecuada pues el campo tiende a oscurecerse un poco. 10. Recuerde la importancia de hacer este ajuste CADA VEZ QUE CAMBIE DE OBJETIVO y las

veces que sea necesario mientras realiza su trabajo. ACTIVIDAD #3: ESTIMACION DEL TAMAÑO DE LAS ESTRUCTURAS MICROSCOPICAS:

El tamaño es una característica ESPECÍFICA e importante de todas las criaturas vivientes. De allí que es un dato útil en la identificación entre organismos y estructuras que se les semejan.

Para un trabajo exacto en microscopía se usa un micrómetro calibrado pero existen alternativas tales como: comparar con otras estructuras de medidas conocidas, utilizar punteros oculares de medida aproximada, programas digitales computarizados e incluso el sentido de las proporciones, que se desarrolla con el trabajo continuado.

PROCEDIMIENTO:

a. Revise la preparación proporcionada con objetivo 10X e identifique un quiste o huevo cualquiera que se encuentre cercano a un glóbulo rojo. Enfoque el campo con el objetivo 45X y sabiendo que el diámetro del eritrocito es de 7 um de diámetro, calcule el tamaño del quiste. Consulte inquietudes con el instructor y discuta sus resultados con sus compañeros de mesa

b. En la mesa de demostración encontrará el montaje de una serie de helmintos. Mida el tamaño original de cada uno con una regla milimetrada o “pie de rey”. Trasládelos al microscopio

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estereoscópico y obsérvelos con los aumentos que proporciona el equipo. Consulte inquietudes con el instructor y discuta sus resultados con sus compañeros de mesa.

c. Su instructor hará una demostración del uso de programas digitales para la toma de imágenes fotográficas y cálculo de la medida de las mismas. Discuta con sus compañeros las ventajas y/o desventajas que presenta el uso de estos sistemas.

ACTIVIDAD #4: CALIBRACION DEL MICROSCOPIO CON EL MICROMETRO Para identificar parásitos correctamente, el microscopista debe ser capaz de medir exactamente

los elementos parasitarios, de allí que se hace indispensable el uso de un ocular calibrado. Los oculares micrométricos son discos de vidrio, baratos, sobre los cuales se ha rayado una escala dividida en unidades de 50 a 100. Estas divisiones tendrán medidas diferentes dependiendo de los objetivos utilizados, por lo que es necesario calcular los valores de las unidades del ocular micrometrado con cada objetivo. Esto se logra imponiendo la escala del ocular a la escala grabada sobre un portaobjetos, la cual sí está grabada con una escala de medidas conocidas, en divisiones de 0.1 y 0.01 mm. Una vez que cada objetivo ha sido calibrado, ni el ocular con el disco micrométrico ni los objetivos pueden ser intercambiados con otros oculares u objetivos. Si es necesario cambiarlos, debe calibrar de nuevo. PROCEDIMIENTO DE CALIBRACION:

1. Desatornille la lente por arriba o por abajo del ocular, dependiendo de su manufactura y coloque el disco micrometrado. Reponga la lente e inserte el ocular en su lugar. Debe usar papel lente para limpiar el disco y las lentes del ocular.

2. Coloque el porta-objetos calibrado sobre la platina del microscopio y enfoque la escala. Es más fácil iniciar la calibración de los objetivos de menor aumento primero y luego continuar con los demás.

3. Enfoque el micrómetro para ver claramente las líneas grabadas y que pueda distinguir las divisiones de 0.1 y de 0.01 mm.

4. La línea O del ocular micrometrado debe coincidir con el O del porta-objetos milimetrado. 5. Cuando estas dos líneas están sobre impuestas, sin mover la platina, mire hacia la derecha

de los ceros y determine cuándo puede ver de nuevo líneas sobre impuestas entre sí. Procure encontrarlas lo más alejado hacia la derecha; ésta distancia va a variar según el objetivo utilizado. A una mayor magnificación, el grosor de las líneas grabadas va a resultar tan grande, que cuando sobre imponga las líneas podrá hacerlo ya sea hacia la izquierda o hacia la derecha de las líneas individuales.

6. Cuente el número de divisiones en el ocular que hay entre el O y las nuevas líneas sobre impuestas. Entonces, en el porta-objetos grabado, cuente el número de divisiones de 0.1 mm que hay entre el O y las nuevas líneas sobre impuestas a la derecha.

7. Calcule la porción de un milímetro que se mide con una unidad ocular, según lo ilustrado en el siguiente ejemplo:

33 unidades del ocular = 0.22 mm 1 unidad del ocular = 0.22 mm = 0.0066 mm

33 = 0.0066 mm X 1 µmCCCCC

1,000 mm 1 unidad del ocular = 6.6 µm (para ese objetivo determinado)

Cada objetivo del microscopio debe ser calibrado separadamente. 8. Cuando la calibración ha sido completada con todos los objetivos, prepare una tabla sencilla

que muestre los valores para cada uno de los objetivos. Se ofrece un ejemplo:

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CUIDADOS CON EL MICROSCOPIO 1. Procure dejar su microscopio en un mismo sitio y evite arrastrarlo y el transporte innecesario. 2. Cuando no esté en uso manténgalo cubierto y protegido del polvo y de manos sucias o grasosas. 3. Utilizar correctamente el condensador y diafragma aumenta la vida útil de la lámpara. 4. Evite el contacto con líquidos, ácidos o aceites. Limpie siempre el objetivo de 100X con papel. 5. Nunca utilice lentes de mayor aumento sin cubrir la preparación con un cubreobjetos. 6. Si falta uno o varios objetivos, tape inmediatamente el agujero con un tapón de rosca especial para

ello o con esparadrapo si no hay otra cosa. 7. Cuando el objetivo de 100X tenga aceite resecado, puede usarse un hisopo con éter.

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PRÁCTICA № 2

EXAMEN GENERAL DE MATERIAS FECALES FRESCAS.


1. Explicar las características normales tanto macroscópicas como microscópicas de las heces. 2. Explicar en qué consiste el examen coproparasitológico en preparaciones húmedas. 3. Identificar las estructuras que pueden causar confusión en el diagnóstico (artefactos). 4. Reconocer formas y recipientes adecuados para la toma de la muestra

MATERIALES QUE DEBERÁ TRAER EL ESTUDIANTE

Una muestra de heces frescas por pareja. Se recomienda que sea personal o de pariente cercano aunque no necesariamente positiva a parásitos intestinales.

Diferentes recipientes utilizados por la población para recolectar muestras de heces

Un par de guantes de látex ACTIVIDAD #1: RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA.

Comente en grupo y con ayuda de su instructor las ventajas y/o desventajas que significa el uso de diferentes formas y métodos de recolección de la muestra de heces y cómo influye esto en la calidad de la muestra. Elabore un listado breve de las mismas: ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________

ACTIVIDAD #2: EXAMEN MACROSCÓPICO Y QUIMICO DE LAS HECES. 1. Revise la muestra a simple vista y/o con la ayuda de aplicadores de madera. 2. Anote los resultados de las características físicas usando las categorías para cada caso. 3. Revise la muestra en búsqueda de formas adultas de helmintos. 4. Determine algunas propiedades químicas de la muestra siguiendo las indicaciones de su

instructor. 5. Discuta con sus compañeros sus resultados y cómo reportar en cada caso.

Color_____________________________ Olor_________________________________

Consistencia_______________________ Mucus_______________________________

pH_______________________________ Sangre_______________________________

Restos alimenticios__________________ Helmintos adultos ______________________

Sangre Oculta _____________________ Azúcares reductores ____________________

ACTIVIDAD #3: EXAMEN MICROSCÓPICO DE LAS HECES.

Un buen montaje es vital para el diagnóstico adecuado y comienza con la selección de la porción más representativa de la muestra. Cuando esta es líquida debe tomarse una gota del fondo del frasco o bien, centrifugar una porción y examinar el sedimento. En caso contenga moco/sangre debe hacerse otro montaje con ese material ya que podrían contener mayor número de estructuras parasitarias. Cuando sea blanda, pastosa o dura, el montaje se hará a partir del material que queda en el aplicador posterior a la revisión macroscópica.

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Procedimiento: a) Por pareja, rotular con los datos de la muestra el lado izquierdo de un portaobjeto de 3x1½”, b) Cerca del rótulo colocar una gota de solución salina fisiológica y del lado derecho una gota de

solución de Lugol de trabajo. c) Diluir 2 mg de heces (aprox. “un grano de arroz”) en la gota de solución salina fisiológica y luego

en la gota de solución de Lugol de trabajo EN ESE ORDEN. NOTA: La práctica le irá dictando la cantidad correcta tanto de heces como de reactivos.

d) Cubrir las preparaciones con laminillas cubreobjetos 22 x 22 mm cuidando de no dejar burbujas de aire, ni partículas gruesas de restos alimenticios ni la laminilla levantada “en ángulo”. NOTA: Se dice que el grosor ideal de la preparación es aquel que a través de él permite la lectura de letra impresa (de una hoja de papel periódico, por ejemplo).

e) Buscar ordenada y sistemáticamente en toda la preparación, conforme con cualquiera de las siguientes secuencias:

f) Usar primero el objetivo panorámico (4X) para tener una noción de la calidad de la preparación, reconocimiento general en búsqueda de signos inflamatorios e irritativos (moco, epitelio), restos vegetales (células, fibras) y huevos y larvas de helmintos.

g) Usar el objetivo seco de bajo poder (10X) para buscar trofozoitos y quistes de protozoarios, moco con leucocitos, sangre, hongos (levaduras y micelios) e identificar detalles de huevos y larvas.

h) Hacer uso del objetivo seco de alto poder (40X/45X) para la exacta identificación de las etapas evolutivas y características morfológicas típicas de cada parásito o artefacto: quistes, ooquistes, trofozoitos, cristales, restos alimenticios, etc. NOTA: Recuerde que al hacer algún cambio de objetivo SIEMPRE requerirá cambios o ajustes en la intensidad de la luz.

i) Con el fin de que Usted sepa diferenciar los estadíos evolutivos parasitarios de las estructuras que podrían confundirse con ellos, utilice el esquema de la página 10 para guiarse en su revisión. Consulte con el mismo fin el Atlas de Parasitología Humana / Ash página 388 y siguientes

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TAREA: Haga un breve resumen del proceso de formación de las heces incluyendo el origen de los aspectos macroscópicos que se evalúan en las mismas. __________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ Haga un breve resumen de la preparación, almacenamiento y control de calidad de los reactivos utilizados en el Examen General de Heces. _________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________

Frecuentes causas de error que se cometen al preparar un montaje al fresco:

1. Esperar más de dos horas antes de buscar trofozoitos de protozoos

2. Hacerlos muy gruesos o muy delgados.

3. Que queden con demasiadas burbujas o con la laminilla inclinada

4. Revisar con demasiada o muy poca iluminación.

5. No examinar la preparación en forma sistemática (ordenada).

6. No usar laminillas cubreobjetos.

7. Usar agua en vez de solución salina fisiológica

8. Obviar el uso de la solución de Lugol.

9. Usar solución de Lugol muy concentrada o muy diluida.

10. Usar portaobjetos de ancho menor que el indicado, pues no queda suficiente espacio y la

muestra suele mezclarse, derramarse y/o contaminar el microscopio y al operador.

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LEYENDA 1. Macrófago. 2. Leucocito polimorfonuclear. 3. Célula del epitelio escamoso intestinal 4. Célula plasmática. 5. Levaduras. 6. Pseudomicelio septado de Candida. 7. Conidia del hongo Alternaria. 8. Conidia del hongo Helminthosporium. 9. Cristales de Charcot-Leyden. 10. Cristales de colesterol. 11. Partícula de caseina parcialmente digerida. 12. Burbuja de aire. 13. Gota de aceite. 14. Diatomea. 15. Diatomea. 16. Granos de polen.

17. Pelo de planta. 18. Fragmento de fibra de algodón. 19. Pelo de mamífero. 20. Restos de músculo de res o cerdo. 21. Restos de carne de cangrejo. 22. Restos de carne de pescado. 23. Restos de granos de trigo. 24. Restos de maiz. 25. Restos de ejotes. 26. Tubos conductores fibrovasculares. 27. Granos de harina de papa. 28. Granos de harina de arroz. 29. Harina de plátano. 30. Harina de camote.

31. Pared de célula de madera

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PRÁCTICA № 3

REPORTE DEL EGH. PRESERVACION Y FIJACION DE MATERIAS FECALES.

OBJETIVOS: Al finalizar la práctica los estudiantes serán capaces de: 1. Explicar las técnicas de fijación y preservación de muestras de materiales fecales en aquellos casos

en que no se pueden examinar inmediatamente o es necesario enviarlas a un laboratorio de referencia.

2. Reconocer sustancias químicas como preservantes y fijadoras de materias fecales 3. Discutir sobre la forma correcta y fundamentada de reportar los hallazgos en el examen

coproparasitológico

MATERIALES QUE DEBERÁ TRAER EL ESTUDIANTE

1 Muestra de heces frescas por pareja. Se recomienda que sea personal o de pariente cercano.

1 Boleta de Examen General de Heces de cualquier laboratorio clínico.

1 Par de guantes de látex ACTIVIDAD #1: EXAMEN MACROSCÓPICO DE LAS HECES.

De manera ideal, toda muestra de heces que se ha de preservar debe ser revisada con anterioridad. Por ello revise la muestra de heces según lo descrito en la práctica No 2. Haga el reporte respectivo.

Color_____________________________ Olor__________________________ Consistencia_______________________ Mucus________________________ pH_______________________________ Sangre________________________ Restos alimenticios___________________________________________________ Helmintos__________________________________________________________ Observaciones ______________________________________________________

ACTIVIDAD #2: EXAMEN MICROSCÓPICO DE LAS HECES Continúe con el montaje y revisión microscópica de la muestra según lo descrito en la práctica No 2. Haga el reporte respectivo

Protozoarios__________________________________________________________ Helmintos____________________________________________________________ Observaciones ________________________________________________________

ACTIVIDAD #3: FORMAS ADECUADAS DE REPORTE DEL EGH Pegue aquí la boleta utilizada para el reporte del Examen General de Heces que trajo y describa errores en el reporte y las fortalezas y/o debilidades que identifique en la misma. Comente sus ideas con sus compañeros. :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________

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ACTIVIDAD #4: PRESERVACION Y FIJACION DE MATERIAS FECALES.

Las heces y otros materiales, salvo si se examinan pronto después de su obtención, deben preservarse para que algunas formas parasitarias conserven una condición satisfactoria que permita su transporte y posterior identificación. No hay una sustancia universal que conserve todas las fases de desarrollo de todos los parásitos en un mismo momento ni tampoco que permita que un material pueda concentrarse y colorearse permanentemente al mismo tiempo. Por lo tanto es necesario disponer de varias soluciones preservadoras según el caso que se presente y el objetivo que se persiga.

1. Formol.

Aunque el formol (formalina) no es el preservador ideal para los quistes de protozoarios, es el que resulta más satisfactorio para conservar muestras en donde han de buscarse tanto huevos como larvas y también quistes. NO SIRVE PARA IDENTIFICAR TROFOZOITOS. Por otra parte, es fácil de preparar, es estable y se encuentra en el mercado. Se recomiendan dos concentraciones: al 5% para muestras que contienen protozoarios y al 10% para muestras que contienen helmintos.

Procedimiento: 1. Por pareja, tome un frasco tipo Gerber limpio y seco y con la ayuda de una paleta coloque en

el fondo un volumen de las heces que revisó. 2. Agregue un aproximado de tres volúmenes de solución de formol a la concentración que

convenga) y desmenuce hasta lograr una suspensión homogénea. 3. Tape muy bien y rotule con la fecha, su nombre y el de los parásitos que contiene. Este es el

método “rápido” utilizado en muestras para estudio ordinario.

Para muestras de referencia o enseñanza, se sigue la técnica prolongada: 1. Se desmenuza cuidadosamente la muestra fecal en solución salina fisiológica o en agua, y

se filtra por gasa húmeda para eliminar los restos gruesos. Pueden usarse frascos corrientes de boca ancha o vasos cónicos de sedimentación.

2. Se deja reposar la muestra durante una hora por lo menos. Mejor por 24 horas. 3. Se vierte cuidadosamente el sobrenadante y el sedimento se diluye con tres volúmenes de

formol al 5 ó 10% según se requiera. 4. Si se desea guardar este material para estudio ulterior, se recomienda evitar la evaporación

del formol y hacer cambios de este preservador a intervalos de 6 meses.

2. Fijador de alcohol de Polivinilo. (PVA) Esta solución fijadora permite preservar y fijar los quistes y trofozoitos de protozoarios, y resulta especialmente útil para el envío de muestras a laboratorios de referencia donde se pueden preparar frotis de inmediato o después de varios meses para tinción permanente.El fijador PVA tiene las ventajas de permitir una buena tinción de los parásitos en muestras liquidas, y al adherirse al vidrio, evita la desaparición de los parásitos durante la tinción. Procedimiento para su uso:

Las muestras deben mezclarse bien con la solución, inmediatamente después de

recogidas, evitando así que los parásitos pierdan su morfología característica, en la proporción de un volumen de heces para tres volúmenes de fijador. La preservación se hace en los frascos que contienen la solución preservadora. Es conveniente fijar directamente el material sobre el portaobjeto cuando hay poca cantidad de él, (como en el caso de la sigmoidoscopía o material por aspiración), cuando se han encontrado trofozoitos en preparaciones directas, si se necesita tinción permanente para su identificación, o en ambos casos conjuntamente. El material de sigmoidoscopía o de aspiración puede examinarse directamente en solución salina 0.85% y se puede hacer el frotis para tinción ulterior.

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Preparar el extendido de la siguiente manera: En una lámina 3x1” colocar 2 a 3 gotas de la muestra preservada en aproximadamente el tercio medio de la superficie de la lámina, extender con un aplicador de madera procurando que el extendido llegue hasta cerca de los bordes de la lámina para que exista una mejor fijación del frotis (ver esquema de preparación en la práctica 4). NOTA: Estas preparaciones se dejan secar varias horas o toda la noche en una estufa a 37º C o a temperatura ambiente. Ya secas pueden permanecer sin alteración y teñirse hasta 2 meses depués. Guardar estas preparaciones para uso posterior protegiéndolas del polvo y laluz solar directa.

3. Solución Mertiolate-Yodo-Formol (MIF).

Es otra solución útil para preservar y colorear muestras de heces. Procedimiento para su uso: De las muestras revisadas en la práctica y positivas a quistes de protozoarios escoja una y mezcle cuidadosamente un fragmento de heces con la solución preservadora MIF en la proporción aproximada de un volumen de heces en 2 ó 3 volúmenes de MIF. Por pareja, haga un montaje entre lámina y laminilla tomando una porción de la parte superior del sedimento con pipeta Pasteur o un gotero, y observe al microscopio con el objetivo seco débil y seco fuerte (10X y 45X). Describa si observa resultados microscópicos diferentes entre esta solución y la de Lugol ___ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________

TAREA Haga un breve resumen de cómo se preparan los reactivos fijadores y preservadores que utilizo en esta práctica. ___________________________________________________________________________________

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EL EXAMEN GENERAL HECES.

La confiabilidad de los resultados de este examen depende en gran medida del cuidado ejercido en la recolección de la muestra. De manera general, las heces emitidas espontáneamente son adecuadas para el estudio siendo necesario recoger por lo menos 4 cms3 (4 ml) en un frasco de vidrio, cartón o plástico que esté seco y limpio y que tenga boca ancha y cierre hermético. Se puede obtener material por rectosigmoidoscopía, sondaje duodenal, tacto rectal, etc. que también es adecuado para el análisis.

Son muestras inaceptables todas aquellas que revelen contaminación con orina y/o agua,

las que se han mantenido por más de dos horas a temperatura ambiente antes de su revisión, las contaminadas con bario luego de un examen radiográfico y cuando el paciente haya ingerido sustancias con fines terapéuticos tales cómo: aceites, bismuto, antimaláricos, antibióticos, etc. El agua contaminante puede albergar microorganismos de vida libre que se confundirían con los de las heces y la orina puede destruir formas móviles debido a diferencias de pH. Si se ha administrado bario se recomienda esperar de 5-10 días para hacer el examen y si lo que se ha ingerido son antibióticos, se recomienda esperar al menos 2 semanas debido a que el efecto del fármaco hace disminuir el número de formas de protozoarios, siendo más difícil su diagnóstico. Si en un laboratorio se recibe cierto número de muestras deben apartarse aquellas de consistencia blanda a líquida o las que tienen moco y sangre y examinarse primero ya que pueden haber trofozoitos móviles que mueren rápidamente. Deben revisarse más de una muestra cuando en el primer estudio no se obtiene el resultado que clínicamente se presume o cuando se sospecha de una parasitosis intestinal y exámenes previos han sido negativos. Por ejemplo: en amibiasis crónica o estrongiloidiasis es necesario repetir el examen 2 ó 3 veces (hasta 6 según algunos autores) a intervalos separados debido al escaso número de trofozoitos y a la eliminación irregular de larvas. Debido a que son fuente potencial de infección, todas las muestras de heces deben ser manejadas con cuidado y todo el material que se utilice para su estudio, debe ser descartado o esterilizado. El examen general de heces (EGH) está constituido de dos partes: la revisión macroscópica y la revisión microscópica. Cada una de ellas se trata a continuación. Examen Macroscópico Es talvez la parte del EGH que agrada menos a la mayoría de analistas y por eso es también la que tiende a hacerse con menos cuidado, tiempo y acuciosidad. Sin embargo, es parte vital del examen porque identifica patologías que por no tener origen infeccioso, no presentan estructuras microscópicas que orienten el diagnóstico y nos permite además, hacer proyecciones de los posibles hallazgos en el montaje al fresco. Deben revisarse y reportarse: 1. La consistencia: depende de la concentración de agua. Cuando se altera esta en relación

a la presencia de parásitos se utiliza como referencia el que los trofozoitos y ooquistes se hallan en heces líquidas a pastosas y en cambio los quistes y huevos se encuentran en mayor proporción en heces pastosas o duras, aunque esto no es una regla. Por ejemplo, la posibilidad de encontrar cualquier estadío de cualquier parásito es mucho menor en heces líquidas si se considera el factor de dilución que da el número de deposiciones que el paciente haya tenido. Por otra parte, las esporas de microsporidios pueden encontrarse en heces de cualquier consistencia.

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2. La presencia de mucus y sangre indica anormalidad y SIEMPRE debe reportarse. El

montaje al fresco deberá incluir estas porciones ya que existe la posibilidad de que haya mayor cantidad de algunas formas parasitarias.

3. El olor brinda información clínicamente importante y en muchos casos se prescinde de este

elemento debido a la incomodidad que provoca. Sin embargo, un olor fétido puede ser indicativo de patología y debe consignarse en el reporte.

4. Muchas sustancias pueden hacer cambiar el color de las heces y no necesariamente

indican patología pero en otros casos se relacionan directamente con ella. Compuestos ricos en hierro como algunos alimentos y vitaminas, la ingesta de antidiarreicos con bismuto y el sangrado esofágico las tornan negras; la obstrucción hepática, la digestión incompleta de lácteos y la ingesta de bario las cambia a blanco; las primeras heces de los bebés (o meconio fetal ) son verdes al igual que la digestión incompleta de vegetales de ese color; la presencia de sangre en el colon y algunos alimentos las vuelve rojas; la infecciones por Giardia lamblia las vuelve amarillentas etc. El médico deberá juzgar, a la luz de la condición clínica y el resto del reporte, si este elemento se asocia a enfermedad o a cambios fisiológicos del paciente.

5. La presencia de restos alimenticios no digeridos observables a simple vista pueden

orientar al facultativo en desórdenes digestivos del paciente y aunque no siempre se relacionan con procesos infecciosos, también deben reportarse. No existe una escala cuantitativa para valorar su cantidad. La escala que se usa es más bien subjetiva y depende de la experiencia del laboratorista.

6. Los proglótidos y adultos de helmintos pueden aparecer en las deposiciones al ser

expulsados espontáneamente o después del tratamiento, de tal manera que la revisión exhaustiva y no superficial es necesaria para descartar su presencia.

Examen Microscópico

El examen microscópico completo comprende tres técnicas separadas: el montaje directo

al fresco, el frotis teñido y un método de concentración. Se trata aquí el montaje directo. Las dos restantes serán vistas más adelante. Si bien es cierto que la presencia de restos alimenticios microscópicos, cristales y levaduras puede relacionarse con desórdenes digestivos, el objetivo principal de esta técnica es la búsqueda de los estadíos de parásitos intestinales tales como quistes y trofozoitos de protozoarios, huevos y larvas de helmintos, ooquistes de coccidios, esporas de microsporidios además de células inflamatorias como glóbulos blancos, macrófagos y hematíes. La mezcla natural de las heces durante su formación asegura una distribución uniforme de los parásitos y entonces puede hacerse un montaje de cualquier parte de la muestra existiendo la misma posibilidad de encontrarlos, al menos en teoría. Es importante recordar que la biología del parásito, el momento de la evolución de la enfermedad, la tasa de infección y el número y consistencia de deposiciones previas, entre otros, puede determinar el reporte de falsos negativos. Lo anterior explica que la sensibilidad del montaje al fresco solo, aún cuando se realice bajo las mejores condiciones, ronde el 70% de sensibilidad y justifica el uso de otras técnicas complementarias para aumentar el reporte de verdaderos positivos.

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Muchos restos alimenticios de origen diverso, especialmente de origen vegetal, pueden semejar parásitos por lo que se les denomina artefactos. El laboratorista debe saber

discriminar exactamente entre ambos. El montaje directo al fresco en lámina se prepara tomando una pequeña porción de muestra (aproximadamente 2 mg) con el extremo de un aplicador de madera y mezclándolo con una gota de solución salina 0.85% y luego con una gota de solución de Lugol. La suspensión debe quedar uniforme y delgada de tal manera que pueda leerse la letra impresa a través de ella. La primera sirve para observar trofozoitos en movimiento tanto de flagelados como de amebas y la segunda, para teñir de café o amarillo claro las estructuras de los quistes y poder así establecer diferencias. Puede utilizarse el mismo palillo si se sigue el orden mencionado. NUNCA debe contaminarse la preparación de solución salina con la solución de lugol ya que esta última mata las formas móviles.

Ambas se cubren con laminillas 22x22 mm evitando la formación de burbujas y se revisan al microscopio inmediatamente para evitar que se sequen utilizando los objetivos 10x (para una búsqueda amplia) y 40x (para confirmar la morfología de estructuras sospechosas). El uso del objetivo 100x no se recomienda de rutina porque los detalles morfológicos son fácilmente distinguibles a menor aumento, sin embargo, puede usarse si la preparación se sella previamente con parafina, vaselina o esmalte de uñas. Se debe revisar completamente ambas preparaciones de una manera sistemática con base en el siguiente esquema:

Para conseguirlo, se escoge un objeto que se encuentre en la orilla del campo microscópico y se mueve el portaobjetos a través de la platina del microscopio, examinando el campo hasta que el objeto escogido se encuentre en la orilla contraria y así sucesivamente hasta completar la lámina. Si se estableciera una analogía del campo visual con la carátula de un reloj, el procedimiento mencionado equivaldría a mover un objeto de las 9 a las 3 ó de las 12 a las 6 horas. Una de las limitantes del examen microscópico en general es que no se observan con

detalle las diferencias de protozoarios muy pequeños, que incluso a veces pasan desapercibidos. En tales casos es necesaria la tinción de frotis para lograr el reporte. En la práctica diaria no es común que se hagan tinciones ni concentrados de heces y peor aún, se omiten o realizan de manera incompleta las técnicas básicas reduciendo en mucho la utilidad que presta este método. Por lo anterior deben evitarse situaciones tales como: no utilizar la solución de Lugol, retrasar la observación, refrigerar las muestras, usar equipo mal calibrado, hacer montajes muy diluidos, etc, etc. Es común en la práctica el uso de una escala semicuantitativa, basada en el reporte por cruces (de negativo a 4+), para valorar el número relativo de formas parasitarias observadas por campo microscópico e incluso, para valorar la cantidad de bacterias. Al respecto debemos apuntar el escaso fundamento que tiene el uso de tal escala. En primer lugar es inexacta y subjetiva, no estandarizada, el tratamiento es el mismo si se observa un quiste o cien por

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campo y nada más lógico que hayan bacterias en una muestra de heces. Sin embargo, puede resultar de alguna utilidad cuando se evalúa la efectividad de un tratamiento a través de exámenes seriados.

Las consideraciones estándar de cualquier laboratorio clínico deben ser practicadas en el laboratorio de parasitología, pero se debe prestar atención particular al aseo personal y al manipuleo de muestras, reactivos y equipos. Debido a que muchas infecciones parasitarias se adquieren por la ruta oral es imperativo que el parasitólogo practique una excelente higiene personal. El lavado escrupuloso de manos con agua y jabón y el apego a las técnicas establecidas son dos de las más importantes formas de evitar la infección en el lugar de trabajo. Se recomienda además el uso adecuado de guantes, lo que implica ponérselos al

momento de hacer el montaje y manipular la muestra pero quitárselos al momento de tocar el microscopio, saludar a otras personas, tocar el picaporte, contestar el teléfono, etc. Si esto no se hace así, lo que el laboratorista hace es únicamente cambiar la forma en que tanto él como el resto de personas pueden infectarse. Independientemente de que se tenga o no ese recurso, las precauciones universales deben ser observadas en todo momento, especialmente porque no existe hasta el momento inmunizaciones profilácticas efectivas contra las enfermedades por parásitos. Por otra parte se debe tomar en cuenta que las muestras frescas negativas a parásitos pueden aún contener agentes de otros tipos como Salmonella sp., Shigella sp., Escherichia coli, virus de la hepatitis

A y C y otros virus entéricos no hepatotrópicos, por lo que absolutamente todas las muestras deben manipularse como potencialmente infecciosas .y descartarse posterior a ser esterilizadas o incinerarlas En relación a la preparación y almacenaje de los reactivos existen algunas consideraciones básicas y que deberían ser incluidas en la rutina diaria. Se pueden mencionar las siguientes:

a- La solución salina 0.85% se guarda estéril en frascos ámbar preferiblemente a 4º C bien tapada y dándole un tiempo de expiración no mayor a un año; después es mejor preparar una nueva. Los frascos ámbar disminuyen la posibilidad de contaminación con protozoarios de vida libre. y tenerla bien tapada disminuye la posibilidad de evaporación.

b- Pueden encontrarse diferentes métodos de preparación de la solución de Lugol pero es

mejor preparar una solución madre y almacenarla a temperatura ambiente, en lugar seco y fresco, en frasco ámbar y en la oscuridad. A partir de esta se prepara el Lugol de trabajo diluido 1:5 con agua destilada. Cuando pierde el color debe ser descartada y reemplazada.

c- En relación a otros químicos debe considerarse si son inflamables, como el éter, o

corrosivos y evitar su exposición a la llama del mechero y usar frascos contenedores pequeños para sustancias inflamables en uso.

d- Si el reactivo es tóxico o venenoso debe ser etiquetado con el símbolo correspondiente (

“calavera con huesos cruzados)

e- Es necesario un inventario anual y descartar todos los químicos que muestran signos de deterioro o que hayan pasado de la fecha de expiración.

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PRÁCTICA № 4

TINCIONES PERMANENTES PARA PROTOZOARIOS INTESTINALES.

OBJETIVOS. Al finalizar la práctica los estudiantes serán capaces de:

1. Interpretar los principios en que se basan los procedimientos en las coloraciones permanentes a través de la realización de de frotis o extendidos de muestras de heces frescas o preservadas y su posterior tinción.

2. Diagnosticar infecciones por protozoarios intestinales a través de la revisión de láminas teñidas.

MATERIALES INDISPENSABLE QUE DEBERÁ TRAER EL ESTUDIANTE:

1 clip para papel con un trozo de cordel amarrado en un extremo, o bien 1 pinza sin garra 1 muestra de heces positiva a trofozoitos y/o quistes de protozoarios por pareja

TAREA: Documéntese, piense y escriba el mayor número que pueda, de ventajas que las tinciones permanentes aportan al diagnóstico parasitológico. _______________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ACTIVIDAD #1: PREPARACIÓN DE LOS FROTIS.

1. Con muestras frescas de heces. Con un aplicador de madera se hace un extendido delgado y uniforme sobre un portaobjeto de 3 x 1”; si es necesario se diluyen las heces con solución salina fisiológica. Se debe tener la precaución de sumergir inmediatamente la preparación todavía húmeda en la solución fijadora, evitando que se seque durante todo el proceso de coloración.

2. Con muestras fijadas en PVA, (Heces y cultivos de E. histolytica) a) Con un aplicador se extienden de dos a tres gotas de la muestra preservada sobre

aproximadamente la tercera parte de la superficie de un portaobjetos de 3 x 1½ y se procura que el frotis llegue hasta los bordes laterales del portaobjetos, con lo cual se conseguirá una mayor adherencia del frotis, como en la figura.

b) Los frotis se dejan secar a temperatura ambiente por 24 h o toda la noche en estufa a 37ºC. c) La preparación debe estar completamente seca para que el frotis no se desprenda del

portaobjetos durante el proceso de tinción. Puede dejarse en este estado sin teñir, hasta por dos meses.

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ACTIVIDAD #2: TINCION TÉCNICA CON HEMATOXILINA FÉRRICA DE HEIDENHAIN

La técnica de Heidenhain con hematoxilina férrica es muy utilizada y es descrita en numerosos libros de texto. El método “clásico” –prolongado- da excelentes resultados si se sigue cuidadosamente el procedimiento, especialmente en cuanto al aclaramiento de los protozoarios. Calentando el fijador, el mordiente y el colorante, se puede acortar mucho el tiempo sin que se pierdan los detalles de tinción. Técnica 1. El frotis preparado según literal A (muestras frescas de heces) se coloca en un frasco Koplin

con solución de Shaudinn de tal manera que quede en contacto con este líquido fijador por 2 a 5 minutos.

2. Colocar en alcohol de 70% para endurecer la preparación durante un tiempo mínimo de 5 minutos. En este punto se puede conservar el material hasta que se haga la tinción.

3. Colocar en alcohol de 70% yodado por 5 minutos para eliminar los restos de mercurio. 4. Colocar en alcohol de 70% por 5 minutos con el fin de eliminar el yodo. (Nota: el frotis deberá

quedar sin vestigios de coloración amarillo). 5. Lavar dos veces en agua destilada, 3 minutos cada vez. A partir de este momento se

comienza la tinción de hematoxilina según Heidenhain. 6. Colocar la preparación en una solución mordiente de alumbre de hierro y amonio al 4% en

agua destilada, preparada al momento de usarla, durante una hora. 7. Enjuagar el agua destilada rápidamente. 8. Colocar en hematoxilina por 24 horas o si se desea una tinción rápida 1 hora. 9. Lavar con agua destilada hasta eliminar el exceso de colorante. 10. Diferenciar con solución de alumbre de hierro y amonio al 2% de 5 a 6 minutos. Esta fase de

la coloración es sin duda de mucha importancia. 11. Lavar en agua destilada. 12. Poner en presencia de agua amoniacal hasta que la preparación vire a azul. También puede

usarse carbonato de Litio para que el agua sea alcalina. 13. Lavar en agua destilada para eliminar el amonio. 14. Colocar en alcohol de 70% durante 5 minutos. 15. Colocar en alcohol de 95% durante 5 minutos. 16. Colocar en alcohol de 100% durante 5 minutos. 17. Colocar en xilol-fenol (solución al 10% de fenol en xilol) durante 5 minutos (opcional) 18. Colocar en xilol puro por 5 minutos. 19. Montar con Permount o Bálsamo del Canadá.

NOTA: Con frotis preparados con muestras fijadas con PVA, se omiten los pasos 1 y 2 (relativos al fijador de Shaudinn) y se siguen los pasos del 3 al 12.

TÉCNICA DE TINCIÓN TRICROMICA MODIFICADA DE WHEATLEY.

Procedimiento: Al frotis preparado según numeral 1 (muestras frescas) aplicarle el siguiente procedimiento: 1. Fijador de Schaudinn........................................ 5 minutos a 50º C / 1 hora T.A. 2. Alcohol al 70% con yodo ....................................................................1 minuto 3. Alcohol al 70%.....................................................................................1 minuto 4. Alcohol al 70%.....................................................................................1 minuto 5. Colorante tricromático..................................................................2 a 8 minutos 6. Alcohol al 90% acidificado………………….......................................10 a 20 segundos o hasta que el frotis casi ya no pierda colorante.

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El aclaramiento prolongado en alcohol al 90% acidificado (más de 20 seg.) puede hacer que los parásitos no se distingan bien, aunque los trofozoitos de Entamoeba coli pueden necesitar períodos de aclaramiento un poco mayores. 7. Alcohol al 95%.................................................................................Enjuagar dos veces 8. Alcohol al 100%(Absoluto) o Carbol-Xilol ........................................................1 minuto 9. Xilol ..........................................................1 minuto o hasta que desaparezca la refracción de la interfase frotis-xilol 10. Montar con laminilla 22 X 30 No. 1 empleando Permount u otro medio similar. PROCEDIMIENTO PARA FROTIS FIJADOS EN PVA 1. Alcohol al 70% con yodo ............................................................................10 minutos 2. Alcohol al 70%........................................................................................ 3 a 5 minutos 3. Alcohol al 70%..........................................................................................3 a 5 minutos 4. Colorante tricromático ..............................................................................10 minutos 5. Alcohol al 90% acidificado.........................................................Meter, enjuagar y sacar 6. Alcohol al 95%...........................................................................Meter, enjuagar y sacar 7. Alcohol al 95%..............................................................................................5 minutos 8. Carbol-Xilol............................................................................................5 a 10 minutos

9. Xilol........................................................................................................10 minutos 10. Montar con cubreobjetos 22 x 22 No. 1 empleando Permount u otro medio similar.

ACTIVIDAD SIMULTÁNEA: Haga un montaje al fresco de la muestra que trajo. Constate por el movimiento la presencia de trofozoitos y haga una preservación o frotis con PVA. Consulte a su instructor. En las mesas centrales encontrará una demostración de quistes y trofozoitos teñidos. Obsérvelos y búsquelos en las láminas proporcionadas. Ayúdese con atlas o fotografías en color.

TAREA: Independientemente de la técnica que se siga, el proceso de tinción permanente sigue fases comunes. Escriba en secuencia el orden de las fases, el objetivo respectivo de la cada fase y los reactivos utilizados en cada una. _______________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________

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MÉTODOS DE TINCIÓN DE PROTOZOARIOS INTESTINALES

Para el trabajo general en el laboratorio de parasitología, los métodos o técnicas de examen escogidas deben permitir el hallazgo de todas las fases de desarrollo y especies de parásitos. Por lo tanto estas técnicas deben permitir obtener e identificar tanto trofozoitos como quistes de protozoarios, huevecillos y larvas de helmintos. En general los métodos que se recomiendan en cuanto al diagnóstico de protozoarios son:

Examen directo al fresco.

Métodos de concentración.

Tinciones permanentes.

Cultivo. Es difícil identificar a veces en forma definitiva, los trofozoitos y quistes de protozoarios cuando se utilizan preparaciones con solución salina fisiológica, debido a que las estructuras internas están pobremente definidas o son demasiado hialinas. Excepto si se observan características típicas, la identificación debe confirmarse en frotis de heces con tinción permanente. Para este objetivo se utilizan distintos métodos y con base en el tiempo de duración se clasifican en dos grupos: tinciones temporales y permanentes. Tinciones temporales.

En este tipo, como su nombre lo indica, el colorante utilizado solamente tiñe a los protozoarios por minutos u horas y se realizan a partir de muestras de heces frescas. Ejemplos son las soluciones de yodo (Lugol), azul de metileno y de mertiolate-yodo-formol. Las soluciones de yodo sirven como tinciones negativas; esto significa que colorea el citoplasma de un color verde amarillento, no así el material de los núcleos ni los cuerpos cromatoidales que se observan por refringencia que es lo que al final hace el diagnóstico. Por lo tanto, se utilizan principalmente para teñir quistes y hacen resaltar el número de núcleos y la estructura de estos. También se tiñen las masas de glucógeno de algunas especies. Generalmente dos tipos son los más usados: la de Dobell y O’Connor y la de D’Antoni. Solucion de Lugol o D'Antoni: es la que utilizamos en nuestro país. Se debe almacenar en frascos ámbar para evitar la decoloración y es preferible prepararla cada 15 días y conservarla en frascos goteros de color ámbar. Si se tiene un Lugol que haya perdido su capacidad tintorial debe reforzarse con cristales de yodo disueltos con yoduro de potasio o descartarlo y preparar uno nuevo.Las ventajas del reactivo son: proporciona una tinción rápida, la solución es fácil de preparar y ayuda a diferenciar los quistes de los glóbulos blancos. En cuanto a las desventajas

se incluyen: se decolora rápidamente frente a la luz, no es conveniente para teñir trofozoitos pues altera su forma, tiende a formar acúmulos de materiales fecales que pueden enmascarar o envolver los parásitos y no tiñen las barras cromatoidales. En los quistes bien teñidos el citoplasma es de color amarillo, la cromatina es parda o negra y el glucógeno se observa de color pardo rojizo a café. Azul de metileno: es una tinción simple y directa que permite la observación de los detalles

morfológicos de los núcleos de protozoarios especialmente de trofozoitos. Se aplica como un colorante vital para la examinación al fresco de muestras de heces con protozoarios. Además

de la utilidad antes mencionada permite diferenciar la presencia de glóbulos blancos. Para este fin se utiliza una solución de azul de metileno amortiguado pH 3.6.

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El procedimiento consiste en mezclar una pequeña porción de heces con una gota del colorante y se deja en reposo la preparación por 10 minutos, con el objeto de que los organismos incorporen el colorante. Reacciones de tinción: El citoplasma de los trofozoitos se tiñe de azul pálido y los núcleos de

color azul oscuro. Los núcleos teñidos presentan las mismas características morfológicas que en las preparaciones teñidas permanentemente con hematoxilina férrica. Las inclusiones alimenticias también se tiñen pero en algunas ocasiones los quistes no. Solución de mertiolate-yodo-formol: su aplicación principal es teñir quistes y trofozoitos de

protozoarios y presenta las siguientes ventajas: tiñe bien el núcleo, barras cromatoidales y vacuolas de glucógeno; no hay deformación de los parásitos; en los trofozoitos de flagelados pueden verse los flagelos y las preparaciones se mantienen varias horas después sin que se vuelvan pálidos o cambien los detalles del parásito. Sin embargo, no tiñe los núcleos de Dientamoeba fragilis y algunos metaquistes tampoco se colorean bien. Tinciones permanentes.

Aunque en el examen directo al fresco las tinciones temporales facilitan la identificación rápida de protozoarios, en algunos casos la especie de que se trata no se puede identificar a través de ellas. En el examen directo al fresco, salvo si se observan características típicas indiscutibles de Entamoeba histolytica, el diagnóstico sólo es probable, por lo que es necesario entonces

utilizar tinciones permanentes con el fin de confirmar el reporte. Se las considera de utilidad para el diagnóstico de protozoosis por las siguientes razones:

a- Permiten la observación clara y precisa de las estructuras morfológicas clave (núcleos, inclusiones intracitoplasmáticas).

b- Facilitan la búsqueda de los diferentes estadíos. c- Se pueden apreciar parásitos o comensales que no se ven con otros métodos. d- Constituyen un archivo permanente de los parásitos identificados. De esta manera,

pueden ser utilizados para consulta y enseñanza. e- El resultado se considera confirmatorio.

Al igual que en las tinciones histológicas, se utilizan diversos tipos de reactivos que tienen un fin específico en cada una de las fases del proceso, las cuales son: fijación, hidratación, tinción, diferenciación, deshidratación, aclaramiento, montaje. a- Fijación :

Cuando los parásitos salen de su hábitat natural comienzan a descomponerse, lo cual es el producto de la acumulación de metabolitos, factores ambientales y químicos. En este sentido, es indispensable detener cuanto antes el proceso y con este propósito las muestras de heces deben colocarse en una sustancia fijadora después de la evacuación de la muestra. Se puede definir como el proceso mediante el cual los elementos constitutivos de la célula son

mantenidos en su estado físico y parcialmente en cuanto a su estado químico de tal manera que puedan resistir el tratamiento sucesivo con los reactivos, sin pérdida o distorsión importante Estos fijadores actúan desnaturalizando o coagulando proteínas, las que al endurecerse forman una esponja o malla que tiende a englobar los elementos celulares. Un fijador ideal es aquel que penetra rápidamente a la célula, es de acción inmediata, provoca un mínimo de distorsión o cambios degenerativos y es barato, estable y de fácil manejo.

Las soluciones más frecuentemente utilizadas son: fijador de Schaudinn modificado y la solución de alcohol de polivinilo (PVA). Estas sustancias están hechas a base de mercurio, que además de fijar funciona como mordiente, acentuando la tinción de los componentes celulares especialmente el núcleo. Después de este paso, los frotis deberán tratarse con yodo para remover los residuos de cloruro de mercurio. La fórmula química de esta reacción es:

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2HgCl + I2 = HgCl2 + HgI2

b- Hidratación : Previo al contacto del parásito con el colorante principal es necesario hidratar la preparación para que penetre adecuadamente a las células. Esto es necesario hacerlo porque generalmente las soluciones del colorante están hechas en agua. Para este propósito se colocan los frotis en pases sucesivos de alcohol etílico con concentraciones descendentes de 70 a 50%. Este paso también sirve para eliminar los restos de fijador.

b- Tinción :

Con base en la intensidad y tonalidad con que tiñen a la célula, los colorantes se clasifican en metacromáticos y ortocromáticos. Los primeros dan a las células colores diferentes al del tinte y los ortocromáticos proporcionan distintos tonos del mismo color del pigmento. Con base en su origen los tintes pueden ser: naturales y sintéticos. Los naturales son

extraidos generalmente de seres vivos, como por ejemplo la hematoxilina (que se extrae del árbol de Campeche o Hematoxilon campechanum) y el carmín (que se extrae de la cochinilla). Los sintéticos son reactivos productos de manipulación química, como por ejemplo: cromotropo 2R, verde rápido, azul de metileno y fucsina. Las tinciones pueden realizarse en dos formas: progresiva y regresiva. En la primera se utiliza

el colorante diluido y se colocan los frotis durante el tiempo que sea necesario para que lo fijen y en la segunda, se aplica el colorante concentrado y luego el exceso del mismo se elimina con un reactivo diferenciador hasta lograr la intensidad deseada.

c- Diferenciación: Se define como el proceso de eliminación selectiva del colorante. Esto se refiere a que durante dicha eliminación, algunos constituyentes celulares pierden el pigmento antes que otros. Generalmente para este objetivo se utilizan diferentes ácidos como por ejemplo: ácido acético, ácido sulfúrico y ácido clorhídrico. d- Deshidratación:

Debido a que el colorante es una solución que contiene agua, es necesario eliminarla para que no reaccione con los reactivos utilizados en el aclaramiento (esto porque tales reactivos son insolubles en agua). Es necesario entonces deshidratar y para esto se utilizan pasos sucesivos en etanol en concentraciones crecientes (70, 80, 90, 95 y 100%). e- Aclaramiento:

También llamado desalcoholización. Este paso consiste en eliminar el alcohol de las células para que adquieran un color más nítido. Para esto se utilizan reactivos que poseen un índice de refracción elevado haciendo que los colores se vean más definidos. Ejemplos son el xilol y carbol-xilol.

f- Montaje:

Consiste en proteger el frotis teñido de los efectos ambientales, deterioro y lesiones físicas. Para ello se usan medios transparentes con índices de refracción cercanos al del vidrio que impiden la dispersión de la luz. Los reactivos utilizados para este fin son resinas naturales y sintéticas como el Bálsamo de Canadá y Permount, respectivamente. Son características de un buen medio de montaje: poseer un índice de refracción similar al del vidrio, miscible en xileno, no cambiar de pH y color y no dañar los parásitos.

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Las tinciones permanentes más utilizadas son la hematoxilina férrica y la tricrómica de Wheatley. La primera se considera clásica y resulta útil para estudiar los detalles nucleares

finos pues es nítida y diferenciada y se conserva por años. Esta tinción utiliza como mordiente las sales de hierro, y de esa particularidad proviene su nombre. Cabe recordar que un mordiente es una sustancia cuya estructura físico-química facilita la fijación de un colorante

sobre las células. Los cristales de hematoxilina son blancos o amarillentos, solubles en agua y alcohol caliente; no es un colorante activo ya que primero debe oxidarse hasta hemateína, un proceso que implica la pérdida de dos átomos de hidrógeno para que uno de sus núcleos se convierta en quinona. Se la puede madurar más rápido agregando 0.21 gm de iodato de potasio por cada 100 ml de colorante 1%. Cuando la hematoxilina no se utiliza mucho en el laboratorio se puede preparar en alcohol 95% y guardarla indefinidamente diluyéndola 1:10 en agua al momento de utilizar. Es notable que casi todas las descripciones morfológicas de protozoarios en libros de texto se realizan con base en esta tinción aunque presenta algunas desventajas a saber: su

proceso es lento, la solución colorante de trabajo no es estable y no da buenos resultados con heces fijadas en PVA. Por otra parte, la tinción tricrómica en cierta manera ha reemplazado a la hematoxilina férrica, ya que se usa cada vez más en los laboratorios de parasitología. La tinción tricrómica de Wheatley es un método rápido originalmente desarrollado por Gomori en 1950 para la diferenciación de tejidos, pero Weathley la adaptó para teñir protozoarios. Entre sus ventajas

se enumeran: la sencillez y rapidez, la solución colorante es estable, no necesita mordientes antes de la tinción y los frotis son transparentes lo que permite identificar los protozoarios envueltos en restos fecales gruesos.

Aspectos importantes de las coloraciones.

1- Las muestras fijadas inadecuadamente no se tiñen o lo hacen con un tono rojizo. 2- Se debe escurrir el exceso de reactivo con papel absorbente entre cada paso pero

nunca se deben secar durante el proceso. 3- La remoción incompleta del bicloruro de mercurio provoca la presencia de gránulos

refráctiles que originan confusión. Por esto, la solución de etanol 70% más yodo debe ser reemplazada cada semana.

4- Para restaurar la tonalidad perdida del colorante tricrómico se deja destapado por unas horas para que se evapore el alcohol que se ha introducido con las láminas y luego se repone el colorante hasta el volumen original. Aquellos lotes más concentrados probablemente requieran de tiempos de decoloración más largos.

5- Los restos de yodo producen frotis predominantemente verdes. 6- En las etapas finales de deshidratación se debe mantener el xilol y el etanol 100% lo

más libre de agua como sea posible. 7- Si la tinción no es satisfactoria pero es imposible obtener o preparar otra se puede

colocar en xilol para remover la laminilla y rehidratar en etanol 50%. Ahora es necesario desteñir en ácido acético glacial por una hora para después de lavar teñir de nuevo con el colorante tricrómico.

8- La vida útil de la hematoxilina férrica se alarga si se mantiene la solución a 40ºC. Puede ser necesario filtrarla para eliminar cristales formados.

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PRÁCTICA № 5

DIAGNÓSTICO DE AMEBAS PARÁSITAS Y COMENSALES DEL HUMANO.

DIAGNÓSTICO DE Entamoeba histolytica/E. dispar/E. hartmanni, Entamoeba coli,

Endolimax nana, Iodamoeba buetschlii ( sin.= I. bütschlii) y Blastocystis sp (antes B.

hominis)

OBJETIVOS:

Al finalizar la práctica los estudiantes serán capaces de: 1. Interpretar las características morfológicas diferenciales de las amebas intestinales y Blastocystis

sp a través de la realización de exámenes microscópicos de muestras de heces al fresco. 2. Interpretar las características morfológicas diferenciales de las amebas intestinales en

preparaciones con coloraciones permanentes de manera que puedan diferenciar estadíos. MATERIALES A SER TRAIDOS POR EL ESTUDIANTE:

Una muestras de heces frescas positiva a trofozoitos y/o quistes de amebas, por pareja.

Guantes de látex

ACTIVIDAD #1: Identificación de Entamoeba histolytica / E. dispar y Entamoeba coli. 1. Siga las mismas indicaciones señaladas en la practica No. 2 en relación al manejo y montaje al

fresco de la muestra de heces. 2. Observe al microscopio la preparación de la muestra suministrada y trate de identificar la

presencia de trofozoitos por el movimiento ameboide en solución salina 0.85%. 3. El montaje con la solución de yodo le ayudará a determinar diferencias entre los quistes.

NOTA: Si se emplean heces preservadas, el formol sirve de diluyente y puede no ser necesario utilizar solución salina 0.85% pero en este caso NUNCA verá formas móviles. Al hacer el montaje se deberá tomar de las porciones de sangre y moco (si las hay) pues en estas porciones es donde se localizan usualmente los trofozoitos. Los quistes se encuentran en mayor número y más frecuentemente en heces formadas o sólidas.

Quistes y trofozoitos de Entamoeba histolytica / E. dispar y Entamoeba coli en solución

salina 0.85%. Dibuje, rotule y describa lo observado.

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Quistes de Entamoeba histolytica / E. dispar y Entamoeba coli en solución de lugol. Dibuje,

rotule y describa lo observado diferenciando entre especies.

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Puede diagnosticar trofozoitos de amebas en solución de Lugol?

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Diferencie entre un quiste inmaduro y uno maduro de ambas especies

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Existe alguna dificultad para hacer el diagnóstico de quistes usando una solución o la otra?

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Identificación de Entamoeba histolytica / E. dispar y E. coli en tinciones permanentes.

Tinción con hematoxilina férrica o tricrómica modificada. Su instructor le proporcionará frotis teñidos, examínelos bajo el microscopio con el objetivo de 45 y 100X y describa los estadíos.

Determine los rasgos típicos para hacer diagnóstico diferencial entre estas especies

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ACTIVIDAD #2: Identificación de quistes y trofozoitos de Endolimax nana e Iodamoeba büetschlii en solución salina fisiológica y Lugol

1. Siga las indicaciones descritas en la ACTIVIDAD #1 numerales 1 al 3. Describa y compare entre

los estadíos que observa.

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Identificación de quistes y trofozoitos de Endolimax nana e Iodamoeba büetschlii en

tinciones permanentes.


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Resuma las diferencias morfológicas entre estas especies y las del género Entamoeba

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ACTIVIDAD #3: Identificación de Entamoeba hartmanni y Blastocystis sp en solución salina fisiológica y Lugol

1. Siga las indicaciones descritas en la ACTIVIDAD #1 numerales 1 al 3. Describa y compare

entre los estadíos que observa.

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Identificación de quistes y trofozoitos de Entamoeba hartmanni y formas vacuolares de

Blastocystis sp. en tinciones permanentes.


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_____________________________________________________________________________ LECTURAS RECOMENDADAS: Capítulo 11 Parasitología Clínica /Beaver; Atlas de Parasitología Humana / Ash Capítulo uno páginas 2 – 66 (clave morfológica y artefactos de parásitos intestinales).

[29]

TAREA PREVIA: Dibuje un esquema resumen, sencillo pero completo del ciclo vital general de las amebas intestinales con todos sus estadíos y características morfológicas respectivas más representativas.

[30]

Ejercicio de aplicación de sus conocimientos.

Identifique géneros y/o especies de amebas de humano en los esquemas siguientes.

[34]

PRÁCTICA № 6

METODOS DE CONCENTRACION DE MATERIAS FECALES.

OBJETIVOS. Al finalizar la práctica los estudiantes serán capaces de:

1. Explicar los diferentes métodos de concentración para quistes de protozoarios, huevos y larvas de helmintos en las materias fecales frescas o preservadas, cuando estos estadíos son escasos o no se detectan en preparaciones húmedas al examen directo.

2. Interpretar los resultados obtenidos entre los diferentes métodos de concentración y la técnica del examen directo al fresco, en relación a las probabilidades para detectar las diferentes formas de parásitos intestinales.

MATERIALES TRAIDOS POR EL ESTUDIANTE.

Muestras de heces frescas o refrigeradas positivas a quistes de protozoarios y/o huevos de helmintos por pareja. Guantes de látex.

ACTIVIDAD #1: METODO DE RITCHIE (SEDIMENTACIÓN POR CENTRIFUGACIÓN FORMOL–ETER)

Este método puede considerarse entre los más eficaces con que se cuenta al presente para concentrar quistes de protozoarios, huevos y larvas de helmintos los cuales se deforman poco y resulta indicado para concentrar muestras conservadas en formol. Los resultados no son los mejores en cuanto a quistes de Giardia lamblia e Iodamoeba buetschlii, pero aún así, es el de escoge.

Procedimiento:

1. Coloque en un tubo 16 x 150 mm 10 ml de solución salina 0.85% y agregue una porción de heces (cerca de 2 g o una cucharadita aprox). Desmenuce la porción de heces haciendo uso de dos aplicadores de madera.

2. Coloque un embudo de 50 mm de diámetro en un tubo cónico de centrífuga de 15 ml y dentro de él una porción de gasa doblada en 4 capas y filtre el desmenuzado a través de ella debiendo exprimirse al final con la ayuda de dos aplicadores.

3. Centrifuge a 2,500 r.p.m. (650 g) por dos minutos y descarte el sobrenadante. 4. OPCIONAL: Si el sobrenadante está muy turbio, resuspenda bien el sedimento con 3 ml de

solución salina y luego agregue más hasta completar el volumen. Repita el paso 3. 5. Descarte el sobrenadante y resuspenda el sedimento en formalina al 10% (3 ml) agregue

formalina 10% hasta un volumen de 10 ml. En este punto este tubo puede ser conservado para uso posterior.

6. Agregue 4 ml de éter, tape con tapón de hule y agite vigorosamente por ½ a 1 minuto. (Para evitar contaminaciones cubra la boca del tubo con papel toalla. Hay que aflojar ligeramente el tapón una vez por lo menos para que se escape la presión).

7. Quite el tapón y centrifugue a 2000 r.p.m. (450-500 g) por dos minutos. Se observa que en el tubo se han formado cuatro capas: 1) una superior de éter; 2) una de restos fecales; 3) una de formalina y 4) un sedimento donde se depositan los huevos y larvas y quistes que pueda tener la muestra. (ver figura)

8. Se afloja la capa de restos fecales ayudándose de un aplicador de madera que se pasa entre dicha capa y la pared del tubo, con un movimiento circular.

9. Descarte con cuidado en un frasco con desinfectante las primeras 3 capas de manera que quede sólo el sedimento en el tubo y limpie las paredes del mismo utilizando un hisopo.

10. Agregue al sedimento 2 a 4 gotas de solución salina fisiológica y mezcle. 11. Haga preparaciones con Lugol y observe al microscopio.

[35]

ESCRIBA EL MAYOR NÚMERO DE DIFERENCIAS QUE ENCUENTRE ENTRE ESTA TÉCNICA Y LA DEL EGH AL FRESCO _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ACTIVIDAD #2: CONCENTRACIÓN CON FORMALINA-ACETATO DE ETILO.

El propósito de este método es concentrar huevos y larvas de helmintos y ooquistes y quistes de protozoos de las heces. Se recurre a este método cuando el examen directo es negativo, cuando la excreción de quistes/ooquistes es baja e intermitente o para descartar infecciones leves en general, sobre todo si otros métodos (sulfato de zinc por Ej.) no han ofrecido los resultados esperados. El método original utilizaba éter, pero esta sustancia se ha sustituido por acetato de etilo por ser menos inflamable y explosiva que el éter. Algunos sugieren centrifugar por 10 minutos en vez de dos minutos para recobrar ooquistes pero se ha encontrado que se forma demasiado sedimento que impide realizar el examen parasitológico. VENTAJAS:

Puede utilizarse con heces frescas o heces fijadas previamente en formalina o en MIF; los quistes de protozoos no se deforman; puede demorarse en examinar el sedimento más que en métodos por flotación; es adecuado tanto para huevos de nemátodos como de céstodos y tremátodos; produce menos errores técnicos que otras concentraciones.

DESVENTAJAS: Los huevos infértiles de Ascaris y en ocasiones quistes de Giardia pueden flotar y descartarse inadvertidamente con el tapón de detritus; utiliza tubos de ensayo de vidrio (cuando se usa éter), ya que los tubos de plástico son dañados por éste; no es adecuado para concentrar trofozoítos de protozoos.

[36]

Procedimiento: 1. Identificar frascos, tubos y láminas con la muestra a examinar. 2. Transferir 1-2 g de heces a un vaso de plástico o de vidrio y agregar 10 mL de formalina.

Desmenuzar y suspender completamente las heces con ayuda de aplicadores. Descartar aplicadores. Dejar fijar mínimo 30 minutos.

3. Filtrar por gasa doblada en 4 a un tubo cónico o de ensayo ayudado por embudo. Descartar gasa y embudos. Tapar tubos con tapón de hule.

4. Equilibrar los tubos en balanza de 2 platos junto con los tapones. 5. Centrifugar a 1,500 rpm por 2 minutos; destapar.y descartar el sobrenadante. 6. Agregar más formalina al sedimento, agitando éste con un aplicador, hasta la mitad del tubo. 7. Agregar 2-3 mL de acetato de etilo. 8. Tapar el tubo con parafilm o tapón de hule y agitar vigorosamente 15 segundos. 9. Centrifugar a 1,500 rpm por 2 minutos. 10. Al final de la centrifugación se obtienen 4 capas: sedimento, formalina, tapón de detritus y acetato

de etilo. Destapar con cuidado y con un aplicador desprender el tapón de detritus todo alrededor y decantar el sobrenadante de un solo movimiento.

11. Agregue al sedimento 2 a 4 gotas de solución salina fisiológica (si es necesario) ó 12. Haga preparaciones directamente con Lugol y observe al microscopio.

ACTIVIDAD #3: METODO DE FAUST. (FLOTACIÓN CON SULFATO DE ZINC) Procedimiento. 1. Preparar una suspensión fecal en agua de chorro en un frasco de boca ancha: un volumen

de heces (2-4 gm) para 10 ml de agua, desmenuzar las porciones grandes hasta obtener una suspensión uniforme.

2. Filtrar a través de gasa húmeda en un embudo de 50 mm. de diámetro a un tubo cónico de centrifuga de 15 ml. de capacidad. La gasa deberá ser doblada en 4 capas, debiendo exprimirse al final con la ayuda de dos aplicadores.

3. Centrifugar a 2500 r.p.m. (650 x g) por 1 minuto y decantar el sobrenadante. 4. Romper el sedimento con un poco de agua de chorro y disolver llenando el tubo con agua.

Centrifugar nuevamente a 2500 r.p.m. (650 x g) por un minuto. 5. Repetir este lavado nuevamente si las heces son muy grasosas o con mucho detrito. 6. Después de centrifugar, decantar el sobrenadante y disolver el sedimento con un poco de

solución de sulfato de zinc (densidad 1.18), y terminar de llenar el tubo con la misma solución hasta 1 cm de su boca.

7. Centrifugar durante 1 minuto a 2500 r.p.m. (650 x g). 8. Sin agitar o derramar, recoger parte de la película que se forma en la superficie del líquido,

por medio de un asa bacteriológica; se trasladan dos o tres asadas de material a un portaobjetos de 3x1½.”.

9. Se añade una gota de solución de Lugol de trabajo, se mezcla y se cubre con laminilla Cubreobjetos y Examinar al microscopio.

Forma de recolectar el material en

métodos de flotación.

[37]

MÉTODOS DE CONCENTRACIÓN DE MATERIAS FECALES

El empleo de los métodos de concentración cumple con el objetivo de examinar una mayor cantidad de heces en un volumen mucho menor para detectar más fácilmente parásitos que están presentes en bajo número, tanto en el examen directo al fresco como en frotis teñidos. Antes de intentar la concentración de parásitos en una muestra de heces, se debe realizar invariablemente un examen microscópico directo de la misma ya que debe tomarse en cuenta que en las preparaciones concentradas, NUNCA se encuentran formas móviles de protozoarios (trofozoitos). De lo anterior se deduce que estas técnicas son un complemento y no un sustituto del examen directo al fresco. En general, existen 2 tipos de métodos para separar los parásitos de los restos fecales y concentrarlos en un volumen más reducido, a saber: de concentración por sedimentación y de concentración por flotación. No existe ninguno de carácter universal, o sea, que sirva

idealmente para todos los casos, de tal manera que debe escogerse el más útil para el laboratorio con base en el equipo disponible y principalmente en la especie y estadío del parásito buscado. Antes de desarrollar las técnicas es necesario preparar una suspensión de heces lo más uniforme posible, con el fin de remover partículas gruesas y material no digerido. Para ello se suspenden las heces en solución salina 0.85% con la ayuda de un aplicador de madera y se tamizan a través de gasa, recogiéndose el filtrado. De aquí en adelante se procede según el método escogido. La gasa para filtrar no debería ser más gruesa de 1 ó 2 dobleces porque si es más compacta puede atrapar las porciones de mucus en las que generalmente se encuentran los ooquistes de Cryptosporidium y Cyclospora, y las esporas de microsporidios.

Métodos de sedimentación.

Si una técnica es seleccionada para uso de rutina, se recomiendan los métodos de sedimentación porque, aunque quedan más detritos, los procedimientos son más sencillos para desarrollar, la posibilidad de error técnico es mucho menor y son muy útiles para recuperar huevos operculados. Se basan en el principio de que los quistes y huevos se depositan en el fondo del tubo debido a que poseen una densidad (o gravedad específica) mayor que el medio de suspensión. Puede reducirse el tiempo de desarrollo si se usa la centrifugación.

1- Por gravedad o simple: es la más sencilla para la obtención de toda clase de huevos,

larvas y quistes. Es de utilidad especial para huevos operculados y de Schistosoma y si se

usa solución salina isotónica, se pueden encontrar trofozoitos viables. Sin embargo, los parásitos no se concentran tan efectivamente, queda gran cantidad de restos fecales de aspecto engañoso y consume mucho tiempo.

2- Con agua : se toma 1 ml del filtrado fecal y se agregan 3 ml de agua de chorro (o sea, 3

partes de agua por una de filtrado). Se centrifuga esto a 750 x g (2500 r.p.m.) durante 3-5 minutos, se descarta el sobrenadante y se repite la operación hasta que el sobrenadante quede claro. Examinar el sedimento entre lámina y laminilla. Excepto para la recogida de muestras de referencia y material para docencia, no suele utilizarse este método ya que como técnica de concentración es relativamente ineficaz, puede distorsionar la apariencia de las formas vacuolares de Blastocystis sp. y facilitar la eclosión de huevos operculados.

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3- Con ácido-éter o de Telemann : introducido por Telemann en 1908. Se toma 1 ml de

filtrado y se agregan 3 ml de ácido acético y 5 ml de éter, se invierte varias veces para conseguir una suspensión uniforme y se centrifuga a 2500 rpm por 5 minutos. Con un aplicador se deshace la capa de residuos y se descarta el sobrenadante; se examina el sedimento entre lámina y laminilla.

4- Con formol-éter o de Ritchie : introducido en 1948. A veces se afirma erróneamente que

la función del éter en las técnicas de concentración es sólo la eliminación de grasas y aceites, sin embargo se sabe que los restos fecales absorben el éter volviéndose más ligeros que el agua. Cuando la separación del material y los parásitos es completa, los residuos forman una masa por encima del líquido (en este caso, la formalina) y los estadíos se depositan en el fondo. En todo caso, por ser altamente volátil e inflamable se le considera como un reactivo muy peligroso y es por eso que en algunos países ha sido sustituido por el acetato de etilo, el cual ejerce la misma función sin ser potencialmente dañino. Se recomienda el uso de este método para todo tipo de larvas y huevos pero especialmente para quistes de protozoarios, con la desventaja general de que no permite la concentración de formas móviles de amebas y flagelados y que los resultados en cuanto a Giardia lamblia e Iodamoeba butschlii no son los mejores. También los huevos de Hymenolepis nana pueden pasar desapercibidos. Tiene la ventaja de que se pueden usar

heces preservadas en formalina pero en este caso, si ha de hacerse el filtrado, la solución salina 0.85% se sustituye por agua. Se puede introducir una variante a este método si se utiliza solución MIF en lugar de formalina.

Métodos de Flotación.

La diferencia de densidad o gravedad específica que existe entre el agua (la cual es de 1.0) y los huevos y quistes (que varía entre 1.05 y 1.15) permite la sedimentación de los últimos en virtud de su mayor peso. Cuando se usan otras sustancias químicas con mayor densidad (1.12 a 1.21), las formas parasitarias flotan en la parte superior del medio de suspensión que las contiene debido a que su peso es menor. Un requisito básico del medio de suspensión es que no deshidrate los quistes y huevos y que no sea absorbido por ellos. Para que floten, no solo debe tener la densidad precisa sino que además, no debe afectar los estadíos haciendo que se expandan o arruguen. La técnica de los métodos de flotación tiene la ventaja de eliminar la mayor parte de restos fecales (es más limpia) pero los huevos operculados y los infértiles de Ascaris son muy densos

y no se detectan por este método, a menos que también se haga una preparación del sedimento. Además, deben tomarse precauciones durante los pasos de lavado en los que se decanta el sobrenadante ya que de otro modo, podría perderse un número significativo de formas parasitarias. En los métodos de flotación, el material a examinar se recoge de la superficie del tubo con pipeta Pasteur, con una laminilla cubreobjeto o con un asa bacteriológica formando un ángulo de 90º. 1- Con sulfato de Zinc o de Faust: introducido por Faust et al. en 1938. Se concentran bien

los quistes de Giardia lamblia e Iodamoeba butschlii y los huevos de nemátodos y tenias pequeñas, pero no sirve para larvas de nemátodos, huevos infértiles de Ascaris y los de la mayoría de tremátodos (Fasciola, Schistosoma) y tenias grandes (Taenia solium, Taenia saginata). Además, tiene la desventaja de que el contacto prolongado con el sulfato de Zinc

1.18 (más de 30 minutos) deforma los quistes y dificulta su identificación, por lo que la preparación no debe pasar mucho tiempo sin ser examinada. Los huevos operculados de tremátodos pueden no ser detectados debido a que la mayor densidad de la solución

[39]

produce la apertura de los opérculos que se llenan con líquido por lo que se van hacia el fondo. La fijación previa con formalina no sólo evita esto sino que también previene la distorsión de las otras formas parasitarias. Se puede aumentar la densidad del reactivo para mejorar la recuperación de estadíos pero la distorsión de los mismos (especialmente quistes y huevos de membrana delgada) puede suceder en menor tiempo del indicado y esto no es práctico para la mayoría de laboratorios. Si este es el único método de concentración usado se recomienda examinar tanto el sobrenadante como el sedimento para no correr el riesgo de pasar por desapercibido algún parásito.

2- Con cloruro de Sodio (salmuera) o de Willis: es sencilla y eficaz para huevos de

helmintos como uncinarias, es de bajo costo y no necesita centrifugación. Se toma 1 ml de filtrado fecal y se agrega la cantidad necesaria de solución saturada de cloruro de sodio (sal de mesa es mejor) para llevar el nivel hasta el borde del tubo. Se coloca un portaobjeto en la boca del tubo y se deja en reposo de 10 a 15 minutos después de los cuales, se invierte rapidamente la lámina y se cubre con una laminilla. Este método se recomienda para huevos de uncinaria (es el mejor para Ancylostoma), H. nana, Ascaris, Taenia y tricocéfalos. No es adecuado para huevos de Schistosoma, ni larvas de Strongyloides además, no es útil para la mayoría de quistes ya que se deforman considerablemente por la hipertonicidad del medio (se contraen y arrugan).

3- Con azúcar o de Sheather: una muestra fresca a la que se le ha practicado un método de

sedimentación con el fín de encontrar ooquistes de coccidios tales como Cryptosporidium, Cyclospora e Isospora, puede ser examinada tanto por microscopía de luz como como por microscopía de campo oscuro sin embargo la disponibilidad de esta última en la mayoría de laboratorios es escasa. Por otra parte es importante recordar que el número de ooquistes en las heces se correlaciona directamente con la consistencia de las mismas: mientras más líquidas sean mayor número de ooquistes estarán presentes y que debido a esto, la técnica de Sheather es la más efectiva para la recuperación de ooquistes de coccidios intestinales. La solución se prepara agregando 530 gm de azúcar corriente a 1 lt de agua más 8 ml de fenol 80% como preservante. En un tubo de centrífuga se coloca un ml de heces blandas o líquidas o de suspensión de ellas si son pastosas. Se añade solución saturada de azúcar sin llegar hasta el borde, se tapa y se invierte varias veces con el fin de homogenizar. Luego se centrifuga durante 2 minutos a 200 rpm y el material flotante se recoge con pipeta Pasteur para revisar entre lámina y laminilla.

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PRÁCTICA № 7

DIAGNÓSTICO DE Entamoeba gingivalis Y AISLAMIENTO DE AMEBAS DE VIDA LIBRE

OBJETIVOS. Al finalizar el laboratorio el alumno será capaz de:

a) Explicar cómo se toman las muestras de cavidad bucal para el estudio de E. gingivalis. b) Explicar los procedimientos para el aislamiento de amebas de vida libre de muestras

ambientales y clínicas para su posterior identificación. MATERIAL TRAIDO POR EL ESTUDIANTE Muestra de agua de charco por pareja. Tomar de la parte superficial en varios puntos del sedimento. ACTIVIDAD #1: Examen de material tomado de las encías para investigar Entamoeba gingivalis.

Con la ayuda de palillos de dientes hacer llegar la punta de este hasta la unión de la corona de la pieza dentaria con la encía, especialmente en piezas en donde existan caries.

Luego mezclar con una gota de solución salina fisiológica previamente colocada en un portaobjeto.

Cubrir con laminillas y examinar al microscopio la preparación con los objetivos de 10 y 40X.Dibuje y describa lo que observa.

Describa______________________________________________________________________ _ ____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _ ____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________

En qué circunstancias o muestras clínicas puede usted encontrar trofozoitos de E. gingivalis? Con que otros agentes debe hacerse diagnóstico diferencial _____________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ LECTURAS RECOMENDADAS: Cap 12 Parasitología Clínica / Beaver (morfología); pág 36 Atlas de Parasitología Humana / Ash.

Incluya una fotografía del agente correspondiente

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ACTIVIDAD #2 Aislamiento de amebas de vida libre de especimenes biológicos, agua y suelo.

Procedimiento.

a) Retire las placas con agar no nutritivo del refrigerador y colocarlas en una incubadora a 37º C por 30 minutos.

b) Añada 0.5 ml de solución de Page a un cultivo de Escherichia coli o Enterobacter aerogenes.

c) Con un asa bacteriológica raspe suavemente el bisel y posteriormente resuspenda las bacterias

con una pipeta Pasteur con sumo cuidado. d) Agregue 2 a 3 gotas de esta suspensión en el centro de placa de Petri con agar no nutritivo e) Distribuya las bacterias de manera uniforme en la superficie del agar con un asa bacteriológica.

f) Inocule la muestra en el centro de la placa como se describe a continuación:

1. Líquido cefaloraquídeo. (LCR)

i. Centrifugue el Líquido cefalorraquídeo a 1000 r.p.m. por 5 a 8 minutos. ii. Con una pipeta Pasteur estéril transfiera todo el sobrenadante a otro tubo estéril. De este

pueden hacerse pruebas bioquímicas o guardarse a 4º C para uso posterior no parasitológico.

iii. Mezcle el sedimento con el sobrenadante que haya quedado en el tubo y con una pipeta Pasteur estéril coloque 2 a 3 gotas en el centro de la placa con agar no nutritivo, que fue previamente estriado con la bacteria.

iv. Espere a que el líquido sea absorbido por el medio y luego selle la placa de Petri con papel Parafilm.

v. Incube la placa a 36º C +/- 1º C por 24 horas.

2. Tejidos.

i. Triture en mortero una pequeña pieza del tejido (cerebro, pulmón, absceso de piel, biopsia de córnea, etc.) en una pequeña cantidad (0.5 ml) de solución de Page.

ii. Proceda a inocular las placas posibles idem a lo explicado en el procedimiento con LCR.

3. Muestras de agua. i. Filtre el volumen agua a través de gasa estéril doblada en cuatro. Con esto se remueven

detritos grandes como restos vegetales, tierra, piedras, etc. ii. Luego, filtrar el agua a través de una membrana de acetato de celulosa estéril de 5 µm y

de 47 mm de diámetro. iii. Retirar del dispositivo la membrana de manera aséptica y en área del mechero. iv. Invertir la membrana sobre una placa de agar no nutritivo cubierto con bacterias e

incube a temperatura ambiente (25-28º C).

También se puede centrifugar el agua ya filtrada por gasa, por 10 minutos a 1000 r.p.m. Aspirar el sobrenadante y suspender el sedimento en 0.5 mI de solución de Page y depositar esta suspensión en el centro de una placa de agar no nutritivo cubierto con bacterias. Incube a temperatura ambiente (25-28º C).

4. Soluciones para lentes de contacto Volúmenes de 1 a 2 ml pueden ser inoculados directamente en las placas de Petri con agar no nutritivo con bacterias. Si se trata de grandes volúmenes realice el procedimiento descrito para muestras de agua.

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5. Suelo. Mezcle aproximadamente 1 g de la muestra con 0.5 a 1 ml de solución de Page para hacer una suspensión gruesa. lnocuIe este material en una placa sin bacterias e incube a temperatura ambiente.

g) Examine las placas en el microscopio con los objetivos 4 y 10X para la búsqueda de amebas

(Quistes o trofozoitos) cada día por 10 días. Si observa amebas circule el área con un lápiz de cera. Usando una espátula fina corte una porción de agar de esa área y transfiérala, con la cara hacia abajo a una superficie de agar fresco, cubierto con bacterias e incube de la misma forma.

ACTIVIDAD #3: Experimento de Exflagelación.

Si ha aislado amebas con la técnica anterior, siga el siguiente procedimiento: 1. Usando un asa bacteriológica raspe la superficie de la placa que es positiva para amebas y

transfiera algunas asadas del raspado a un tubo estéril que contiene 1 ml de agua destilada. Otra forma es, agregar a la superficie del agar 10 ml de agua destilada estéril, raspar la superficie con un asa y transferir el líquido estéril a un tubo.

2. Incubar a 37ºC por 2 a 3 horas.

3. Periódicamente examine los tubos con un microscopio invertido para buscar la presencia de

flagelados. Si no se tiene microscopio invertido, mezcle suavemente el tubo y con una pipeta Pasteur estéril coloque una gota de esta suspensión en el centro de un portaobjetos, cúbralo con un cubreobjeto y observe al microscopio con el objetivo seco débil y seco fuerte.

4. Colocar la lámina en una cámara húmeda e incubar a 37ºC o por 2-3 horas y examinar

periódicamente la lámina en búsqueda de fIagelados.

Preparaciones al fresco pueden sellarse con gelatina de petróleo, esmalte de uñas u otro similar. A. Morfología de las amebas de los géneros Acanthamoeba y Naegleria. Con base en los

resultados y/o material que le entregue su instructor dibuje y complete una descripción diferencial entre las principales especies de los géneros en estudio.

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Incluya una fotografía del agente correspondiente.

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Qué es la vacuola pulsátil y a quienes caracteriza ____________________________________________

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Si en un examen de esputo usted encontrara trofozoitos de una ameba, en qué especies pensaría y

cómo las diferenciaría a través del laboratorio? ____________________________________________________________________________________

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En qué consiste un medio de cultivo moxénico ______________________________________________

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LECTURAS RECOMENDADAS: Atlas de Parasitología Humana / Ash pag 68 y siguientes; Cap 12 Parasitología Clínica / Beaver; Apéndice Técnico (preparación de reactivos).

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PRÁCTICA № 8

DIAGNÓSTICO DE FLAGELADOS Y CILIADOS DEL TRACTO GASTROINTESTINAL. Y

UROGENITAL GÉNEROS Giardia, Chilomastix, Retortamonas, Enteromonas,

Pentatrichomonas, Trichomonas y Balantidium. Incertae sedis: Dientamoeba fragilis

OBJETIVOS: Al finalizar la práctica el estudiante será capaz de:

a) Interpretar las características morfológicas de los flagelados y ciliados intestinales a través de la realización del EGH al fresco con el fin de identificarlos, con base a su morfología, dimensiones, movilidad y ciertas estructuras diferenciales.

b) Interpretar las características morfológicas de los protozoarios en preparaciones con coloraciones permanentes de manera que puedan identificar las estructuras diferenciales de los trofozoitos y quistes.

Las especies que se pueden encontrar en el humano están incluidas en las siguientes familias:

Tetramitidae Enteromonas hominis

Hexamitiidae Giardia lamblia

Chilomastigidae

Chilomastix mesnili

Trichomonadidae Pentatrichomonas hominis Trichomonas tenax Trichomonas vaginalis

Bodonidae Retortamonas intestinalis

Balantiidae Balantidium coli

MATERIALES A SER TRAIDOS POR EL ESTUDIANTE:

Una muestras de heces frescas positiva a trofozoitos y/o quistes de flagelados, por pareja. NOTA: puede ser de humano o perro. Una muestra de secreción vaginal o sedimento urinario positiva a Trichomonas vaginalis Guantes de látex

ACTIVIDAD #1: Identificación de Giardia lamblia y Chilomastix mesnili.

1. Siga las mismas indicaciones señaladas en la práctica No. 2 en relación al manejo y procesamiento de la muestra de heces.

2. Observe la preparación de la muestra suministrada en solución salina 0.85% y trate de identificar la presencia de trofozoitos por el movimiento. No olvide regular la luz para lograr esto. Si se emplean heces preservadas, puede no ser necesario utilizar solución salina 0.85% pero recuerde que NUNCA verá formas móviles en una muestra preservada. Esquematice y diferencie entre las especies:

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3. Haga un montaje en solución de Lugol que le ayudará a determinar las diferencias entre los quistes. Estos se encuentran en mayor número y con frecuencia en heces formadas o sólidas. Dibuje, rotule y describa los quistes y complete la descripción, diferenciando entre ambas especies. En algunas ocasiones es posible observar la morfología de trofozoitos MUERTOS.

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Revise las preparaciones permanentes teñidas que se encuentran en la mesa de demostración y luego identifique los estadios que observó en las láminas suministradas por su instructor. En el siguiente cuadro dibuje, describa y diferencie entre las dos especies y todos sus estadios.

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ACTIVIDAD #2: Identificación de Retortamonas intestinalis y Enteromonas hominis. 1. Siga las mismas indicaciones señaladas en la práctica No. 2 en relación al manejo o

procesamiento de la muestra de heces. 2. Observe la preparación de la muestra suministrada en solución salina 0.85% y trate de

identificar la presencia de trofozoitos por el movimiento. No olvide regular la luz para lograr esto. Si se emplean heces preservadas, el formol sirve de diluyente y no es necesario utilizar solución salina 0.85% pero NUNCA verá formas móviles en una muestra preservada. Esquematice y diferencie entre las especies:

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3. Haga un montaje en solución de Lugol que le ayudará a determinar las diferencias entre los quistes. Los quistes se encuentran en mayor número y más frecuentemente en heces formadas o sólidas. Dibuje, rotule y describa los quistes y complete la descripción, diferenciando entre ambas especies.

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Revise las preparaciones permanentes teñidas que se encuentran en la mesa de demostración y luego identifique los estadios que observó en las láminas suministradas por su instructor. En el siguiente cuadro dibuje, describa y diferencie entre las dos especies y todos sus estadios.

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_____________________________________________________________________________ ACTIVIDAD #3: Identificación de Dientamoeba fragilis.

No es fácil tener muestras positivas de este parásito en el momento adecuado, además la identificación al fresco es muy difícil porque el trofozoito es extremadamente hialino y por ello se hacen necesarias las tinciones permanentes para su identificación. No existe estadío de quiste. Revise las demostraciones y luego identifique el estadío en las láminas teñidas suministradas. Describa lo que observa:

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ACTIVIDAD #4: Identificación de Balantidium coli. La balantidiasis es una infección poco frecuente en nuestro medio pero el agente puede describirse e identificarse fácilmente:

En muestras de heces al fresco: En corte histológico teñido:

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ACTIVIDAD #5: Identificación de tricomonadidos- Pentatrichomonas hominis y Trichomonas vaginalis. Los miembros de la familia Trichomonadidae no presentan el estadío de quiste y residen en hábitats muy específicos por lo que su transmisión es directa de persona a persona y además de su morfología, el origen de la muestra facilita mucho la identificación a nivel de especie. Esta última se dificulta si la muestra clínica se contamina o ha pasado demasiado tiempo desde su evacuación hasta su revisión.

De la manera usual, monte una muestra de heces positiva a Pentatrichomonas hominis y/o revise las tinciones permanentes suministradas y complete el estudio respectivo.

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Para identificar a este agente y aunque no es lo frecuente, usted puede preparar un frotis teñido por

Giemsa de la manera que se describe para Trichomonas vaginalis pero debe monitorearse la técnica

según los insumos de cada laboratorio pues los resultados que se obtienen son variables.

Identificación de Trichomonas vaginalis por examen al fresco.

Muestras clínicas de mujer y hombre en las que es posible el diagnóstico de esta especie: secreción vaginal y sedimento urinario (las más frecuentes), secreción uretral espontanea u obtenida por hisopado, secreción o líquido obtenido por masaje prostático. PROCEDIMIENTO

1. La muestra más común es secreción vaginal y se toma con un hisopo estéril que se sumerge en 0.5 ml. de solución salina fisiológica en un tubo de 12 x 75 mm.

2. Centrifugar a 1000 r.p.m. por 1 a 2 minutos (este paso es opcional). 3. Decantar el líquido sobrenadante y tomar una gota del sedimento con pipeta Pasteur y

colocarla en una lámina de 3 x 1½”, cúbralo con un cubreobjeto 22 x 22 mm. 4. Examinar al microscopio con el objetivo de 10 y 40X. 5. Solamente la observación de formas con movimientos característicos permitirán hacer el

diagnóstico de Trichomonas vaginalis.

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Identificación de Trichomonas vaginalis en frotis coloreados por Giemsa.

PROCEDIMIENTO 1. En la extremidad de una lámina colocar con una pipeta una gota de suero humano, equino o

de bovino. 2. Con una pipeta Pasteur tome una gota de la muestra colóquela a la par de la gota de suero y

luego mézclelas de manera homogénea. 3. Hecha la mezcla se extiende como se hace para un frotis de sangre. 4. Se deja secar a temperatura ambiente y se fija con alcohol metílico absoluto (100%) durante

1 minuto o bien, hasta que el alcohol se evapore completamente. 5. Dejar secar a temperatura ambiente. 6. Colorear con Giemsa en la proporción 1:10 con buffer para Giemsa, durante 8-15 minuto.

Este tiempo podría alargarse dependiendo de la madurez de la solución madre de Giemsa 7. Se lava con agua corriente, se deja secar al ambiente y se examina al microscopio con

objetivo de inmersión 8. El organismo es ligeramente más grande que los polimorfonucleares, mide de 7 a 23 µm de

largo por 5 a 15 µm de ancho. Las características que ayudan a identificarlo son: flagelo anterior, membrana ondulante, axostilo y el núcleo.

9. Realice los esquemas correspondientes a esta actividad y complete la descripción.

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Cómo debe reportarse el hallazgo de Trichomonas vaginalis en muestras clínicas de un varón?

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_____________________________________________________________________________ TAREA PREVIA: escriba circunstancias del diagnóstico de tricomoniasis en las que usted podría por error generar un reporte:

FALSO POSITIVO: ______________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ FALSO NEGATIVO: ____________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________

LECTURAS COMPLEMENTARIAS. Capítulo 9 Parasitología Clínica / Beaver. Atlas de Parasitología Humana/ Ash pags 77 y siguientes.

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PRÁCTICA № 9

DIAGNÓSTICO DE PARÁSITOS DEL GÉNERO Leishmania. IDENTIFICACIÓN DEL VECTOR

OBJETIVOS: Al finalizar los estudiantes serán capaces de:

1. Interpretar los métodos de diagnóstico de leishmaniasis basándose en la identificación de los parásitos que pueden observarse en material de raspado, biopsia y cultivo.

2. Describir las características morfológicas de Lutzomyia spp. vectores de la leishmaniasis en América.

ACTIVIDAD #1: Preparación de frotis por aposición a partir de material de lesión:

1. Si la lesión es cutánea y cerrada, límpiela muy bien con un algodón con etanol 70%. Espere a que seque y corte un pedazo de tejido con un bisturí o tijera de disección.

2. Tome el tejido con una pinza con garra y haga frotis por aposición, esto es, haciendo repetidos toques sobre la lámina. Deje secar al aire libre.

3. Si la lesión es cutánea y ulcerada, límpiela muy bien como en el paso 1. 4. Tome un bisturí y seccione la lesión prefiriendo los bordes de la misma para evitar la presencia

de bacterias y tejido necrótico. Haga frotis por aposición. (Una vez utilizadas para frotis, las biopsias pueden depositarse en formalina y ser enviadas al laboratorio de patología).

5. Puede sustituir la biopsia por raspado de la lesión con bisturí siguiendo las indicaciones 1 y 3 y depositando el material obtenido sobre láminas portaobjetos extendiéndolo cuidadosamente. Deje secar al aire libre.

6. O bien, puede recibir material de punción de vísceras o médula ósea, en cuyo caso puede tomar una gota con pipeta Pasteur estéril y realizar el frotis directamente. Deje secar al aire libre.

7. En cualquier caso procure realizar frotis delgados y en el mayor número posible. Fije con metanol absoluto por 1 minuto.

8. Deje secar y tiña los frotis con el colorante de Giemsa 1:10 por 30 minutos. 9. Observe al microscopio con el objetivo de inmersión en busca de amastigotos.

Revise los frotis teñidos en la mesa de demostración y luego busque las mismas estructuras en los frotis proporcionados para el caso. Esquematice los resultados y realice la descripción respectiva.

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ACTIVIDAD #2: Estudio de Leishmania a partir de cultivo.

1. Examen al fresco. a) Identifique las partes de que consta el medio bifásico proporcionado b) Con pipeta Pasteur tome una gota de la parte líquida del cultivo y colóquela en un

portaobjeto de 3 x 1½”. c) Cubra la gota con laminilla 22 x 22 mm. d) Examine al microscopio con objetivo 10X y luego con 40X para visualizar los parásitos

por medio de la forma y el movimiento.

2. Examen por coloración. b) Extraer el líquido de los cultivos con pipetas Pasteur y pasar a tubos de ensayo estériles

con cuidados asépticos. (Identificar los tubos). c) Agregar a cada tubo 5 ml. de solución salina fisiológica estéril y fría. Centrifugar a 1500

r.p.m. por 5 minutos. d) Extraer el líquido sobrenadante con la pipeta Pasteur respectiva, agregar 5 ml. de

solución salina fisiológica estéril y fría al sedimento y mezclar; centrifugar de nuevo a 1500 r.p.m. por 5 minutos.

e) Extraer el líquido sobrenadante. Suspender el sedimento con 1 ml. de suero humano estéril al 10%.

f) Con la pipeta Pasteur respectiva, preparar frotis de 1 cm de diámetro en portaobjetos nuevos y desengrasados.

g) Dejar secar al aire y colorear por el método de Giemsa. Observe al microscopio con el objetivo de inmersión.

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ACTIVIDAD #3: Inoculación de animales con material mucocutáneo o a partir de cultivo.

1. Tome 1 ml del líquido del cultivo y centrifugue a 1500 rpm por 3 minutos. 2. Rápidamente, separe el sobrenadante y transfiéralo a otro tubo. 3. Resuspenda el sedimento en 0.5 ml de solución salina fisiológica. 4. Con una aguja No. 26 y jeringa de tuberculina, inocule 0.1 ml de este material en la nariz de

ratones blancos o hámster. (Pregunte a su instructor la manera correcta de sujetar el animal). Para facilitar el manejo, puede dormir al animal en un frasco grande que contenga en el fondo una torunda de algodón impregnado con éter.

[53]

5. Mantenga en observación a los animales hasta el aparecimiento de lesiones (no menos de dos meses).

6. Si la lesión es cerrada, límpiela muy bien con un algodón con etanol 70%. Espere a que seque y corte un pedazo de tejido con un bisturí o tijera de disección. Haga frotis por aposición.

7. Si la lesión es ulcerada, proceda como en el paso 6, pero prefiera los bordes de la misma para evitar la presencia de bacterias y tejido necrótico. Haga frotis por aposición.

8. Tiña los frotis con el colorante de Giemsa. 9. Observe al microscopio con el objetivo de inmersión en busca de amastigotos.

ACTIVIDAD #4: Identificación del vector.

Revise las preparaciones permanentes de Lutzomyia spp. suministradas. Con la ayuda de su instructor y de las claves entomológicas que se utilizan para el caso, identifique las características de sexo y género. Observe al microscopio con los objetivos de 4 y 10X. Haga su esquema y descripción respectiva.

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TAREA PREVIA Escriba los tres principales síndromes clínicos de la leishmaniasis en América y por cada uno de ellos escriba 1) la especie “tipo” y 2) por lo menos tres especies adicionales que producen ese síndrome. ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________

Haga una revisión bibliográfica o en internet acerca de otras especies de Lutzomyia involucradas en la transmisión de Leishmania. Existe alguna relación geográfica? ________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________

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Dibuje un esquema resumen sencillo pero lo más completo que pueda del ciclo de transmisión de Leishmania. Relacione el ciclo de vida del vector y del parásito. LECTURAS RECOMENDADAS: Parasitología Clínica / Beaver cap 10. Atlas de Parasitología Humana / Ash pags 155 y siguientes.

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PRÁCTICA № 10

DIAGNOSTICO DE TRIPANOSOMIASIS AMERICANA. IDENTIFICACIÓN DEL AGENTE

ETIOLOGICO y VECTORES.

El diagnóstico de las infecciones parasitarias sigue siendo un problema. La enfermedad de

Chagas no es la excepción. La principal dificultad se debe al especial curso de la infección en el huésped humano. Durante la fase aguda que dura, entre 1 y tres meses, el número considerable de parásitos liberados en la sangre son fácilmente detectados por exámenes parasitológicos. En cambio, la fase crónica (10 a 30 años después de la infección inicial, 20 y 30% de las personas presentarán esta fase) se caracteriza por la presencia de un numero muy pequeño de parásitos en la sangre que hace que los métodos parasitológicos sean poco sensibles. En general los métodos para el diagnóstico de la enfermedad se dividen en métodos parasitológicos y los métodos serológicos. Métodos parasitológicos. Estos se dividen en métodos directos e indirectos. Los métodos directos se basan en la detección de los propios parásitos o de sus productos. Estos procedimientos (directos) son usualmente utilizados solo en la fase aguda de la enfermedad de Chagas, o sea, cuando los pacientes presentan una alta parasitemia y los parásitos son encontrados rápidamente. Por lo general, la observación directa del parásito se efectúa en la sangre. Las técnicas mas comúnmente empleadas son el frotis sanguíneo delgado o extendido y el frotis sanguíneo grueso (conocido como gota Gruesa) y el examen de una muestra de sangre fresca colocada en el portaobjetos y cubreobjetos. Estas preparaciones con sangre fresca permiten detectar más fácilmente los parásitos debido a su movilidad. En tanto que el examen de preparaciones coloreadas permite la caracterización morfológica del parásito (lo cual es importante en zonas donde también se encuentran Trypanosoma rangeli), existen otros métodos que aumentan la posibilidad de encontrarlos en sangre, estos son los de concentración. El más sencillo es el de centrifugación de la sangre. Otro método consiste en dejar que la sangre se coagule, centrifugar el suero a baja velocidad para eliminar los glóbulos rojos restantes y luego centrifugar a una mayor velocidad (800 r.p.m) para concentrar los parásitos en el sedimento (método de Strout). Una forma eficiente de mejorar este método es recolectar la sangre en un tubo capilar, centrifugar el tubo y examinar bajo el microscopio la interfase entre los glóbulos rojos y la capa amarillenta entre los glóbulos rojos; este método se conoce como Hemoconcentrado. Métodos parasitológicos indirectos Debido al número reducido de parásitos presente en la sangre en las primeros días de la enfermedad la detección de parásitos exige en primer lugar un paso de amplificación que se consigue en medios de cultivo (hemocultivo) o en el insecto vector (xenodiagnóstico) Para el xenodiagnóstico es necesario contar con triatominos libres de infección criados en el laboratorio. La técnica consiste en emplear 40 ninfas del tercer o cuarto grado de Triatoma infestans (Suramérica) o Rhodnius prolixus, distribuidas 8 a 10 por cada caja, las cuales luego se alimentan del paciente. A los 30 y 60 días después de la succión de la sangre, se examinan las heces y el intestino bajo el microscopio para detectar tripomastigotas o epimastigotas de Trypanosoma cruzi. No deben confundirse con Blastocrithidia triatoma, que es un tripanosomátido morfológicamente similar al epimastigota de T. cruzi. Otra fuente de error en el xenodiagnóstico es la presencia de T. rangeli, que se encuentra en seres humanos (pero no es patógeno) en Centroamérica y en el norte de Sudamérica. Además, se recomienda que los triatominos usados para xenodiagnóstico deban ser las especies involucradas en la transmisión de la enfermedad en el área en la cual el paciente adquirió la enfermedad. Ocasionalmente reacciones irritantes de la piel pueden resultar en individuos sensibilizados. Cultivo de sangre e inoculación en animales.

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El cultivo sanguíneo se utiliza para la amplificación del número de parásitos en el diagnóstico de la enfermedad de Chagas en las zonas endémicas. Se emplean medios líquidos, tales como el medio LIT (“liver infusion and triptose” = infusión de hígado y triptosa), de Schneider o bifásicos (Seneckjie, Rugai, BHI – “brain & heart infusión”etc.) y la eficacia del método puede aumentarse mediante la centrifugación diferencial de la sangre antes de inocular el medio. La inoculación en animales es poco usado con fines diagnósticos, por los inconvenientes prácticos que ofrece. Para este fin se pueden utilizar ratones blancos, cobayos, o perros jóvenes. La inoculación se hace vía intraperitoneal y cuando el resultado es positivo, los parásitos sanguíneos aparecen después de 10 a 15 días pero se le considera un método tardío y poco seguro; y por lo tanto, sólo como método auxiliar Según los resultados de varios autores el xenodiagnóstico y el hemocultivo tienen alta sensibilidad en la fase aguda y baja en la crónica. Además estos métodos tienen otras desventajas importantes. Sé tardan varios días o semanas en obtener un numero de parásitos lo bastante elevado como para detectarlo al microscopio. Además estas pruebas son complicadas y exigen un lugar para criar los insectos, así como equipos y suministros para cultivar los parásitos. Está claro que estos métodos no son los ideales en la etapa crónica. Otro método utilizado para determinar la presencia del parásito es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), es usada como un método altamente sensible para detectar DNA de parásito. Se ha determinado que esta prueba puede detectar 0.1% del genoma del parásito, aun en presencia de billones de ADN humano. Otra investigación llegó a determinar que se puede identificar cantidad tan pequeña de ADN como de 0.05%; se ha determinado basándose en esto que esta prueba puede llegar a determinar o detectar 1 parásito en 20 ml de sangre.

Métodos parasitológicos para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas

Métodos Tipo de

Iaboratorioa

Porcentaje de sensibilidadb

Etapa aguda

Etapa crónica

Directos

Frotis delgado A/B <60 <10

Frotis sanguíneo grueso A/B <70 <10

Examen de sangre fresca A/B 80-90 <10

Método de Strout A/B 90-100 <10

Capa amarillenta sobre portaobjetos

A/B 90-100 <10

Indirectos

Xenodiagnóstico B 100 20-50

Cultivo sanguíneo B 100 40-50

A: Laboratorios de centros de salud situados en zonas de riesgo de transmisión vectorial y no vectorial (la

infraestructura va del primer nivel de atención médica para arriba). B: Laboratorios especializados en diagnóstico parasitológico. B. En comparación con el xenodiagnóstico correspondiente a la etapa aguda de la infección y con el diagnóstico serológico de la etapa crónica.


a) Interpretar las características morfológicas de Trypanosoma cruzi y especies relacionadas a través de la realización de exámenes microscópicos.

b) Explicar las características morfológicas y fisiológicas de los vectores de la enfermedad. MATERIALES TRAIDOS POR EL ESTUDIANTE

Ejemplares vivos de Triatoma dimidiata Guantes de látex y lentes protectores 1 jeringa de 10 ml por estudiante Lupas

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ACTIVIDAD #1: EXAMEN DIRECTO DE SANGRE.

A - EXAMEN AL FRESCO: Es una técnica sencilla y rápida de realizar, y consiste en observar al microscopio una gota de sangre al fresco con el objetivo de 10 y 40X. Para fines de enseñanza se utilizará sangre de ratón. En pacientes se puede realizar con sangre periférica y las estructuras a observar son las mismas.

1. Introduzca el ratón infectado en un frasco o si lo prefiere sólo colóquelo sobre la jaula. 2. Con una tijera corte una porción de la punta de la cola y prepare los frotis y gotas gruesas

que pueda, siguiendo la técnica usada descrita en la práctica de paludismo. 3. Poner otra gota pequeña de sangre en un portaobjetos 3 x 1½”, cubrir con laminilla y

observar al microscopio con objetivos secos 10X y 40X.

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B - OBSERVACIÓN DE T. cruzi EN FROTIS Y GOTA GRUESA COLOREADOS. De las láminas que Ud. ha coloreado con tinción de Giemsa o que se le han proporcionado haga la revisión respectiva bajo el microscopio con el objetivo de inmersión. Dibuje y describa lo que observa.

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Qué problemas o ventajas encuentra entre el frotis y la gota gruesa para la identificación de T. cruzi? ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________

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ACTIVIDAD #2: MÉTODOS DE CONCENTRACIÓN.

Estos métodos son más valiosos que el examen directo al fresco y el frotis coloreado ya que se utiliza mayor cantidad de sangre y la probabilidad de encontrar parásitos es más alta.

a) Método de Strout.

Procedimiento: 1. Extraiga unos 10 ml. de sangre del paciente y transfiéralos a un tubo de ensayo sin

anticoagulante; cuando el coágulo se haya retraído, se extrae el suero por medio de una pipeta Pasteur y se pasa a un tubo de 16 x100 mm.

2. Centrifugar a 800 r.p.m. por 5 minutos (ó a 1000 rpm x 3 mn) para lograr la sedimentación de los glóbulos rojos.

3. Transferir el sobrenadante a otro tubo de 16 x100 mm. 4. Centrifugar a 1,500 r.p.m. por 5 minutos. (ó 3,000 x 1 mn) 5. Examinar el sedimento, colocando una gota entre lámina y laminilla con 10 y 40X.

NOTA: Este proceso se verifica con cuidados de esterilidad, pudiéndose utilizar el sedimento para cultivar o el suero para verificar pruebas serológicas.

b) Método por Centrifugación triple.

Procedimiento: 1. Colocar 8 - 10 ml. de sangre venosa en un tubo de centrifuga con heparina o citrato de sodio. 2. Centrifugar a 800 a 1000 r.p.m. por 10 minutos. 3. Trasladar el sobrenadante a otro tubo cónico y centrifugar esta vez a 1500 r.p.m. por 10 min. 4. Trasladar el nuevo sobrenadante a otro tubo y centrifugarlo a 2500 r.p.m. durante 10 min. 5. Decantar el líquido sobrenadante y tomar una gota del sedimento; ponerla en un portaobjeto

y cubrir con laminilla. Examinar al microscopio con objetivos 10X y 40X. 6. Con otra gota del sedimento hacer una preparación al fresco (Se puede realizar extensión o

frotis delgado y colorear con Wright o Giemsa). Observar al microscopio con el objetivo 40X.

c) Método del Hemoconcentrado. El método del hemoconcentrado es mucho más sensible y requiere menos tiempo de observación para demostrar la presencia de tripomastigotos. Procedimiento: 1. Llenar de 1 a 5 tubos capilares para hematócrito con sangre venosa o capilar. 2. Sedimentar en centrifuga de hematócrito. 3. Colocar los capilares sobre un portaobjetos, poner sobre ellos en la zona de interfase

(Células y plasma) dos o tres gotas de aceite de inmersión. 4. Poner sobre el aceite un cubreobjetos. Observar con el objetivo de 10X en la zona de

interfase. Los tripanosomas podrán ser observados con su movimiento característico en el plasma sobre la capa de leucocitos.

5. Con cuidado con una sierrita fina romper los capilares en la zona de blancos y realizar frotis para ser teñidos con Wright o Giemsa para determinar si se trata de T. cruzi o T. rangeli.

ACTIVIDAD #3: Estudio de Trypanosoma cruzi en cultivos.

De la sangre obtenida de animales o pacientes infectados, inocular en los medios de cultivo colocando unas 5 gotas de sangre con una pipeta Pasteur en la zona de seguridad del mechero. También puede utilizar el sedimento obtenido en el método de Strout. Identificar los cultivos e incubarlos a temperatura ambiente. Examinar a partir de los 7 días hasta un máximo de 4 semanas, de la forma siguiente: a) Con pipeta Pasteur tomar una gota del medio líquido del cultivo de Seneckjie con T. cruzi y

colocarla en un portaobjeto de 3 x 1½”. b) Cubrir la gota con portaobjeto 22 x 22 mm y examinar al microscopio con objetivo 10X y 40X. c) Realizar frotis según el procedimiento descrito en examen de cultivos para lesishmaniasis,

Dibuje y describa lo que observa.

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ACTIVIDAD #4: Observación de T. cruzi en cortes histológicos.

En necropsias de corazón o cortes de musculo estriado es posible hacer el diagnóstico de infección si se tiñen los cortes con Hematoxilina Eosina (HE) y coloración de Gallego. Dibuje y describa lo que observa.

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ACTIVIDAD #5: Demostración del Xenodiagnóstico.

1. Deben usarse ninfas de Rhodnius prolixus “limpias”, es decir exentas con seguridad de infección por T. cruzi o por T. rangeli, criadas en el laboratorio a partir de huevos y que han sido alimentadas en palomas o gallos, animales inmunes a la infección por estos microorganismos.

2. Para verificar el xenodiagnóstico se utilizan pequeñas cajas de madera o de cartón (de aproximadamente 4 centímetros de diámetro), en las cuales se colocan 6 ninfas de Rhodnius prolixus o de la especie más común en la localidad. La abertura de la caja se cubre con una gasa que es sujetada con una banda de hule.

3. La caja se aplica al brazo del paciente por unos 20 a 30 minutos con el fín de que todas las ninfas puedan llenarse de sangre totalmente. Cuando están repletas las ninfas se retiran espontáneamente.

4. Los insectos deben ser examinados entre 15 y 45 días (máximo de 60 días) después de haberse alimentado, a fin de comprobar la presencia o ausencia de tripanosomas en sus materias fecales. Para esto deben tomarse los insectos con pinzas y tratar de obtener una gota de heces, haciendo presión con las pinzas en el abdomen. En caso de que de esta manera no se obtenga materias fecales, puede sondearse el recto de uno de los triatomineos usando una pipeta Pasteur a la cual se la haya afinado la punta hasta que quede capilar.

[61]

5. Las materias fecales obtenidas deben examinarse entre lámina y laminilla, diluidas con una gota de solución salina fisiológica. De ser positivas a tripanosomas, otra gota de heces del insecto debe de diluirse en una gota de igual tamaño de plasma o suero, extenderse sobre un portaobjeto y dejar secar para luego fijarla y colorear con Giemsa, afín de observar la morfología de los tripanosomas encontrados y diferenciar las especies T. cruzi y T. rangeli.

6. Para la observación de las diversas formas evolutivas y principalmente las formas metacíclicas de estos tripanosomas, se pueden disecar tanto el tracto digestivo (T. cruzi) como las glándulas salivales (T. rangeli)

NOTA: Recordar que se está trabajando con material altamente infectante. Hay que evitar que heces infectadas se pongan en contacto con las conjuntivas oculares o con laceraciones en la piel.

Su instructor hará una demostración de cómo se examinan las heces de las chinches cuando se ha hecho un xenodiagnóstico o en el caso de que al laboratorio el paciente lleve una chinche extraída de la casa de habitación.

Dibuje y describa lo que observa. ______________________________________

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ACTIVIDAD #6: Identificación de los vectores. El estudiante deberá examinar cuidadosamente las características morfológicas de los estadíos que se le han suministrado, realizar un dibujo con el nombre correspondiente de cada una de las partes principales que identifique y describir los rasgos morfológicos más notables. Auxíliese de la lupa y figuras al final de la práctica.

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DIFERENCIAS MORFOLOGICAS ENTRE T. cruzi y T. rangeli

FORMA EVOLUTIVA

T. cruzi

T. rangeli

TRIPOMASTIGOTA

20 micras Cinetoplasto grande y subterminal

35 micras. Cinetoplasto puntiforme y alejado del extremo posterior.

AMASTIGOTA

Presenta forma de amastigota en órganos y tejidos, que se multiplican por división binaria.

No se conocen formas de amastigota de multiplicación en tejidos.

LECTURAS RECOMENDADAS: Cap 10 Parasitología Clínica /Beaver. Atlas de Parasitología Humana / Ash pags 161 y siguientes.

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TAREA PREVIA Realice un esquema sencillo pero completo del ciclo vital de Trypanosoma cruzi en el hospedero vertebrado.

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MÉTODOS DE CONCENTRACIÓN DE PARÁSITOS SANGUÍNEOS

Los procedimientos de concentración aumentan el número de organismos recuperados de muestras sanguíneas, remitidas para el diagnóstico de tripanosomiasis, filariasis y leishmaniasis; uno de estos métodos debería ser desarrollado de rutina cuando se sospecha de esas enfermedades en zonas endémicas y no se han encontrado los agentes en el frotis o gota gruesa teñidos por Giemsa, o bien, cuando son tan pocos que se necesita de una mayor cantidad para hacer una correcta identificación de especie.

Concentración de glóbulos blancos: Los amastigotos de Leishmania donovani y levaduras de Histoplasma capsulatum son difíciles de detectar en sangre circulante pero ocasionalmente pueden encontrarse en macrófagos y monocitos infectados, especialmente cuando grandes volúmenes de sangre se centrifugan de manera fracccionada. Debe recordarse que entre ambos gentes debe hacerse diagnóstico diferencial. El procedimiento es sencillo y sirve además para recuperar tripomastigotos y microfilarias, los cuales también pueden encontrarse libres en el plasma. Se usa sangre anticoagulada con EDTA, heparina o citrato de sodio. Después de centrifugar el o los tubos con sangre a 100 x g (330 r.p.m.) por 15 minutos se remueve la capa de glóbulos blancos con una pipeta Pasteur y se examina al microscopio mezclando con solución salina o bien, pueden prepararse frotis para teñir con el colorante de Giemsa. No observar amastigotos intracelulares no descarta el padecimiento de la leishmaniasis pero en cambio el hallazgo de los mismos es confirmatorio. Igual consideración debe hacerse con el hallazgo de tripomastigotos y microfilarias. Se necesita de alguna experiencia para identificar amastigotos al fresco por eso es mejor hacer el frotis y teñirlo. Este mismo procedimiento puede ser desarrollado en un tubo para microhematócrito con la variante de que se observa la interfase al microscopio buscando formas móviles con los objetivos 10x y 40x. Luego puede quebrarse cuidadosamente y de la zona de glóbulos blancos se hace el frotis para teñir, pero por la posibilidad de generar un accidente que pueda infectar al manipulador, este procedimiento se recomienda menos.

Concentración por filtración con membrana: Modificado por Desowitz, este método se desarrolló para recuperar microfilarias de pacientes con infecciones leves y tiene la ventaja sobre el anterior en que grandes cantidades de sangre (más de 20 ml) se pueden usar si es necesario. La técnica comentada aquí es una de las más eficientes para el laboratorio clínico cuando otros procedimientos han sido insatisfactorios. Sin embargo, aunque se recupera a la mayoría de especies de microfilarias, esto no ocurre con Mansonella perstans y M. ozzardi debido a su pequeño tamaño. Se utiliza sangre anticoagulada

con EDTA, heparina o citrato de sodio y se mezcla por 2 ó 3 minutos o hasta que se hayan

lisado todos los eritrocitos. Se prepara un filtro Nuclepore de 25 mm (5m de porosidad) sobre un adaptador Swinney y se hace pasar consecutivamente la sangre hemolisada, 10 ml de agua

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destilada para lavar los restos y 3 ml de etanol absoluto para fijar las larvas. Se remueve el papel filtro y se tiñe por Giemsa para buscar los estadíos al microscopio. Tiene la desventaja de que aunque se encuentren las microfilarias, no se observan tan bien como para identificar especie.

Concentración de Knott : Tiene el mismo fín que el método anterior y utiliza el mismo tipo de muestra pero se distingue porque los organismos se concentran del fluido sobrenadante por centrifugación. La desventaja de la técnica radica en que las microfilarias se mueren e inmovilizan de tal manera que su identificación es más dificil y que los detalles morfológicos no son visibles sino hasta que se hace una tinción. La muestra de sangre se mezcla con formalina al 2% y se centrifuga a 300 x g (1000 r.p.m.) por 5 minutos y luego se revisa el sedimento entre lámina y laminilla. Una de las ventajas es que este material puede ser enviado a otro laboratorio como referencia o para confirmar el diagnóstico. Concentración por centrifugación triple:

En muchas ocasiones, el número de tripomastigotos presentes en sangre periférica es demasiado pequeño para ser detectado en montajes al fresco o frotis teñidos, de tal manera que la centrifugación triple es efectiva para recuperar los estadíos de una cantidad relativamente grande de muestra. Después de cada ciclo, se remueve el sobrenadante fluido muy cuidadosamente y al final se observa entre lámina y laminilla y se hacen frotis para teñir. El método tiene la limitante de que aunque la movilidad es evidente, los detalles morfológicos no son visibles a menos que se haga la tinción.

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PRÁCTICA № 11

DIAGNOSTICO DE PARASITOS DEL GÉNERO Plasmodium. IDENTIFICACIÓN DE

VECTORES.

El paludismo es una enfermedad grave ante la cual el estudiante deberá poseer la destreza

necesaria para hacer un diagnóstico preciso, así como el reconocimiento de los insectos transmisores de la enfermedad para poder diferenciarlos de otros géneros afines. OBJETIVO:

Al finalizar los estudiantes serán capaces de: a) Interpretar las características de Plasmodium sp. a través de la realización de exámenes

microscópicos con el fin de identificarlos basados en su morfología, dimensiones, y ciertas estructuras diferenciales.

b) Cuantificar la carga parasitaria en una muestra clínica c) Identificar a los insectos vectores.

ACTIVIDAD #1: PREPARACION Y COLORACION DE FROTIS Y GOTA GRUESA Los extendidos o frotis y las gotas gruesas de sangre son de fácil ejecución y se usan en el diagnóstico de protozoarios sanguíneos y de los tejidos, que causan enfermedades como paludismo ( = malaria ), enfermedad de Chagas ( =tripanosomiasis americana) , leishmaniasis, babesiosis, etc.

1. Preparación del material. Por pareja de estudiantes tome dos portaobjetos limpios y desengrasados e identifíquelos como GG (gota gruesa) y F (frotis). Cerciorarse además de tener a la mano una lanceta, algodón seco y un frasco con algodón impregnado con alcohol etílico (etanol) al 70%.

2. Toma de muestras de sangre. Puede usarse sangre periférica o sangre venosa. La sangre periférica puede obtenerse de varios sitios del organismo, siendo las más frecuentes: el pulpejo de los dedos, el lóbulo de la oreja y el talón del pie si se trata de recién nacidos. Si la sangre es venosa con anticoagulante, la muestra debe ser reciente pues los parásitos se deforman con el paso tiempo. Técnica:

a) Limpiar bien con algodón con alcohol la piel de la región seleccionada (pulpejo del dedo). b) Dejar secar el alcohol. c) Con una lanceta estéril puncionar con un movimiento rápido y firme. d) Limpiar con algodón seco la primera gota que fluye. e) Dejar fluir la sangre y colocar una gota en una lamina según sea GG o F. f) Si la muestra es sangre venosa simplemente coloque una gota directamente de la jeringa.

3. Preparación del frotis.

Técnica

a) Colocar una gota pequeña de sangre en el extremo de una lámina portaobjeto y rápidamente extenderla (si no lo hace rápido la gota de sangre se coagulará) ayudándose de otro portaobjeto, recortado de sus esquinas. La experiencia enseñará cual es el tamaño ideal de la gota, el ángulo en que debe colocarse el portaobjeto recortado y la velocidad con que debe desplazarse sobre el primero para que la película tenga un espesor fino y uniforme.

b) Dejar secar.

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NOTA: Cuando la preparación no se ha de colorear inmediatamente debe ser fijada con alcohol metílico absoluto (100%); en esta forma se conserva por algunas semanas pero la pérdida de afinidad por el colorante es directamente proporcional al tiempo transcurrido antes de la tinción.

4. Preparación de gota gruesa.

Técnica: a) Colocar dos gotas de sangre en los tercios medio y final de una lámina 3 x 1”, y luego con

la esquina de otro portaobjetos, extender la gota con movimiento circular hasta alcanzar el tamaño aproximado de un centímetro de diámetro. Al finalizar deberá quedar un cuadrado o círculo de 0.5 a 10 mm de diámetro. La experiencia enseñará el espesor ideal de la preparación.

b) Dejar secar a temperatura ambiente al abrigo del polvo y de los insectos

NOTA: puede prepararse una sola gota gruesa junto al extendido fino, ambas en una sola lámina. En estos casos debe tenerse mucho cuidado pues el proceso de tinción para cada una es diferente.

5. Métodos de tinción.

I. Método de Giemsa para frotis.

1. Fijar el frotis con unas 10 gotas de alcohol metílico absoluto, durante un minuto. 2. Cubrir la preparación con el colorante de Giemsa diluido por 30 minutos. También se

pueden colocar los frotis en frascos Koplin con el colorante. 3. Lavar con agua de chorro. 4. Dejar secar en posición vertical.

II. Método de Giemsa para gota gruesa.

1. Deshemoglobinizar la gota de sangre sumergiendo la preparación bien seca, en la solución buffer para Giemsa por 5 a 10 min. Este paso se obvia en algunos lugares.

2. Escurrir el buffer dejando la preparación en posición horizontal. 3. Cubrir la preparación con colorante de Giemsa diluido por 30 a 40 minutos. También se

pueden colocar los frotis en frascos Koplin con el colorante. 4. Lavar cuidadosamente por rebalsamiento con agua de chorro. 5. Dejar secar a temperatura ambiente.

III. Método de Wright para frotis.

1. Fijar el frotis cubriéndolo con 10 ó 15 gotas de colorante de Wright por 1 minuto. 2. Agregar al colorante, el doble número de gotas de agua destilada neutra y mezclar con

perilla de hule, dejando la mezcla durante 5 a 7 minutos. 3. Lavar con agua de chorro. 4. Dejar secar a temperatura ambiente.

ACTIVIDAD #2: Estudio de frotis delgados y gota gruesa de sangre que contienen distintas formas evolutivas de Plasmodium vivax.

Su instructor le entregará frotis de sangre de paciente malárico, coloreados con Giemsa o Wright. Trate cuidadosamente estos frotis y enfóquelos en el microscopio con el objetivo de 100X. En el siguiente cuadro dibuje y describa TODOS los estadios que usted sabe pueden observarse en la muestra así como las respectivas alteraciones celulares que le indican la parasitación. Use lápices de colores para mejor descripción.

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Proceda de igual manera con las preparaciones de Plasmodium vivax en gota gruesa. Repare en que a pesar de no haber formas celulares completas existen mayor cantidad de formas del parásito.

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ACTIVIDAD #3: Estudio de frotis delgado y gota gruesa de sangre que contienen distintas formas evolutivas de Plasmodium falciparum.

Realice el mismo trabajo indicado en la parte de frotis para P. vivax

Realice el mismo trabajo indicado en la parte de gota gruesa para P. vivax

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ACTIVIDAD #4: Estudio de frotis delgado de sangre que contienen distintas formas evolutivas de Plasmodium malariae.

Realice el mismo trabajo indicado en la parte de frotis para P. vivax

ACTIVIDAD #5: Cálculo de la densidad parasitaria La determinación de la densidad parasitaria en pacientes con malaria es una herramienta auxiliar para el adecuado manejo clínico del paciente verificando la eficacia terapéutica en asociación a la gravedad de las manifestaciones clínicas. Este procedimiento no se verifica con fines diagnósticos sino de evaluación terapéutica, principalmente en infecciones por P. falciparum. Existen varios métodos para el cálculo de la densidad parasitaria pero el que calcula el número de parásitos por microlitro de sangre (uL/s) es más práctico y de precisión aceptable. El número de parásitos se calcula comparando el número de parásitos asexuados con el número de leucocitos en la gota gruesa en base a un recuento medio estimado en cerca de 6000 leucocitos por uL. Aunque existen variaciones, el número obtenido nos permite comparaciones razonables, en particular cuando se comparan densidades de muestras obtenidas sucesivamente del mismo paciente. PROCEDIMIENTO:

1. Inicie la revisión sistemática de la gota gruesa que se la ha suministrado utilizando aceite de inmersión e iluminación adecuada.

2. Para poner en práctica este método se necesitan dos contadores: uno para contar los parásitos y

3. otro para contar los leucocitos. Puede utilizarse un contador múltiple (“piano”). 4. Haga un recuento simultáneo de leucocitos y de formas parasitarias por campo microscópico.

Aplicar los siguientes criterios, según se presente el caso:

a) Si después de contar un aproximado de 200 leucocitos se identifican 10 ó más parásitos reporte el número/ por 200 leucocitos.

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b) Si después de contar un aproximado de 200 leucocitos se identifican menos de 10 parásitos continúe el recuento de leucocitos hasta 500 leucocitos y reporte de la manera descrita

. El número relativo de parásitos según el número de leucocitos contados puede ser convertido a parásitos por microlitro de sangre usando la siguiente fórmula:

N° de parásitos x 6000 = Parásitos / μL N° de leucocitos

Dónde: N° de parásitos = Número de parásitos contados. N° de leucocitos = Número de leucocitos contados. μL= microlitro Ejemplos: Si se cuentan 205 leucocitos y 50 parásitos, al aplicar la fórmula se tendrá:

50 parásitos X 6000 leucocitos = 1463 parásitos/uL 205 leucocitos

NOTA: En el caso de P. falciparum, el recuento se realiza de manera independiente para los estadios de trofozoito (formas asexuadas) y gametocito (formas sexuadas). Para el recuento de P. vivax, todos los estadios ingresan al recuento sin dependencia alguna. REPORTE SUS RESULTADOS _____________________________________________________ ACTIVIDAD #6: Revisión de pruebas de diagnóstico rápido Las pruebas rápidas para diagnóstico de malaria también llamadas PDR, dipsticks o tiras reactivas detectan antígenos (proteínas) específicas producidas por los plasmodios vivos. Algunas pruebas diferencian entre una o más especies de Plasmodium y algunos productos pueden alcanzar una sensibilidad similar a la del examen microscópico en gota gruesa (100 parásitos/UL). TAREA PREVIA: investigue y haga un breve resumen del fundamento inmunológico de las PDR para malaria _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ Usos potenciales de estas pruebas: como medida de contingencia en brotes y epidemias en zonas de alto riesgo, herramienta complementaria al diagnóstico microscópico, en regiones con población dispersa y escaso acceso a los servicios de salud, como opción cunado no se cuente con la microscopía.

PROCEDIMIENTO: Revise los paneles proporcionados e interprete los resultados que observa. ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________

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ACTIVIDAD #6: Estudio de las preparaciones permanentes de Anopheles albimanus. Su instructor le proporcionará laminas permanentes con adultos de A. albimanus. Identifique y mencione las diferencias entre cabeza, torax y abdomen de este insecto. Además establezca la diferencia entre macho y hembra. Dibuje las cabezas de los mosquitos y descríbalas en el espacio siguiente:

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LECTURAS RECOMENDADAS: Parasitología Clínica / Beaver Capítulo14; Atlas de Parasitología Humana / Ash pags 129- 147.

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CARACTERÍSTICAS DIFERENCIALES EN FROTIS COLOREADOS POR GIEMSA O WRIGHT DE LAS ESPECIES DE PLASMODIUM MAS FRECUENTES EN EL SALVADOR.

FASE EVOLUTIVA Plasmodium vivax Plasmodium falciparum

Trofozoito joven ó Trofozoito anular

Anillo de citoplasma azul con núcleo rojo periférico, presencia de vacuola. Afinidad por eritrocitos jóvenes (reticulocitos). Parasitación múltiple posible.

Anillo y núcleos finos; frecuente la parasitación múltiple; no hay preferencia por eritrocitos jóvenes o adultos. Es común observar formas “aplicadas= appliqué”.

Trofozoito maduro ó Trofozoito ameboide

Citoplasma irregular; la vacuola persiste; núcleo sin división; tamaño relativamente grande. Con gránulos de pigmento color amarillo – café o negro, gránulos de Schuffner.

Formas anulares únicamente. Es posible observar dos masas de cromatina nuclear. Frecuentemente parasitación múltiple de los eritrocitos.

Esquizonte inmaduro

Dos o más masas de cromatina. Cuerpo irregular con abundante pigmento, presentes en sangre periférica.

Cuerpo celular compacto. pigmento concentrado. No se observan en sangre periférica.

Esquizonte maduro

División nuclear terminada. Diferenciación de merozoitos, aprox. 16 en total. Llena el eritrocito casi en su totalidad. Pigmento acumulado en el centro. Presentes en sangre periférica

Formación de 6 a 32 merozoitos. No se observan en sangre periférica.

Macrogametocito

Redondo. Llena el eritrocito casi en su totalidad. Núcleo compacto, citoplasma celeste. Pigmento difuso.

En forma de banano o salchicha. Citoplasma celeste. Núcleo central compacto. Presencia de pigmento. Casi siempre fuera del eritrocito.

Microgametocito

Redondeado. Núcleo difuso a menudo en forma de banda, citoplasma rosado. Pigmento difuso.

En forma de banano o salchicha. Citoplasma rojizo o rosado. Núcleo y pigmento difusos. Casi siempre fuera de los eritrocitos.

Características de los eritrocitos parasitados.

En su mayoría aumentados de tamaño. Deformes, pálidos. Presencia de gránulos de Shuffner.

Tamaño y color normal. A veces se distinguen las llamadas manchas o gránulos de Maurer.

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TAREA PREVIA: COLOREE Y NOMINE LOS ESTADIOS DEL CICLO QUE SE PRESENTA

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TINCIONES Y PROCEDIMIENTOS PARA DETECTAR PROTOZOARIOS SANGUÍNEOS Y DE OTROS TEJIDOS.

Dependiendo de su ciclo vital, cierto número de parásitos pueden ser recuperados en muestras de sangre fresca o en coloraciones permanentes. Tales parásitos incluyen los géneros Plasmodium, Babesia, Trypanosoma, Leishmania y microfilarias. Aunque en preparaciones al fresco algunos parásitos son móviles y se les identifica por esa característica, generalmente el estudio completo abarca la revisión de “películas” sanguíneas teñidas. Tales películas se pueden preparar a partir de sangre fresca, con anticoagulante o sin él, de biopsia o raspado de piel o del sedimento de los métodos de concentración que se explican más adelante. Cuando se usa sangre existen dos tipos comunes: la “gota gruesa” y la extensión delgada o “frotis”, propiamente dicho. La tinción recomendada es la de Giemsa, sin embargo también pueden observarse parásitos

en preparaciones teñidas por la coloración de Wright. La tinción de hematoxilina de Delafield se usa más que todo para resaltar la cubierta de las microfilarias ya que la de Giemsa no aporta gran calidad para la diferenciación de las mismas. Se debe recordar que cuando se manipula sangre de cualquier paciente, se está manejando material con alto potencial infeccioso de tal manera que se deben observar las reglas básicas mínimas de bioseguridad; y los parásitos del paludismo son más numerosos en la sangre al final de un paroxismo febril por lo que este es el mejor momento para obtenerla cuando se intenta el diagnóstico inicial y nunca después de la medicación antipalúdica, a menos que se esté evaluando la efectividad del tratamiento .

Gota Gruesa:

Esta técnica permite revisar una mayor cantidad de sangre en un área menor por lo que la posibilidad de detectar infecciones leves aumenta. La desventaja es que aquellos parásitos

intracelulares generalmente salen presentando una morfología atípica que sólo es reconocida por un observador experimentado. Para mejorar la calidad de la preparación deben usarse láminas portaobjetos sin rayaduras, sin restos de detergente y desengrasadas. Cuando se utiliza sangre capilar obtenida por punción dactilar, lo mejor es usar sangre que fluya libremente ya que aquella que se obtiene “ordeñando el dedo” se diluye con fluidos tisulares, disminuyendo el número de parásitos observables por campo microscópico. Para evitar esto, la gota gruesa puede prepararse a partir de sangre anticoagulada en tubo con ácido etilendiaminotetracético (EDTA, por sus siglas en inglés) que es el más recomendado. En todo caso, no deberían pasar más de 6 horas después de la toma de muestra con EDTA para hacer el frotis porque puede producir distorsión de los parásitos Cuando se depende de la punción dactilar para la obtención de la muestra, se prefieren los dedos medio o anular de la mano izquierda (si el paciente es diestro). Algunos autores recomiendan hacer la punción en la zona lateral del dedo escogido porque se supone que la sensibilidad es menor, pero otros indican hacerlo en la punta debido a que existe mejor irrigación sanguínea. En niños menores de 6 meses puede usarse el talón, el dedo gordo del pié o el lóbulo de la oreja. Para hacer la preparación se colocan dos o tres gotas pequeñas de sangre fresca sobre una lámina limpia y con la esquina de otra lámina se mezclan y esparcen las gotas haciendo un movimiento circular en un área de aproximadamente 2 cms de diámetro después de lo cual se deja secar al aire a temperatura ambiente, en un lugar libre de polvo e insectos. El grosor ideal es aquel que permite la lectura de letra impresa a través de ella. NUNCA se debe aplicar calor directo a la lámina para acelerar el secado debido a que el calor fija los glóbulos rojos y estos permanecen intactos durante y después de la tinción, lo que conduce al impedimento de

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observar a los parásitos. El mismo efecto se dá si se fijan con metanol, por eso las gotas gruesas NUNCA deben entrar en contacto con este reactivo.

El movimiento circular por algunos segundos sirve para prevenir la formación de hebras de

fibrina que pudieran simular u ocultar al parásito. Si se usa sangre anticoagulada, el movimiento no es necesario ya que no se han de formar hebras de fibrina. Si la preparación es demasiado gruesa o la lámina está grasosa, la sangre puede desprenderse durante la tinción. Después que se han secado completamente, debe removerse la hemoglobina y esto se logra

colocando la preparación en una solución amortiguadora antes de teñirla o directamente en el colorante de Giemsa, el cual por tener una base acuosa, lisa los eritrocitos. Si la gota gruesa será teñida después, deben ser deshemoglobinizadas antes de su almacenamiento, el cual no puede ser mayor a los 4 días porque si no, las estructuras pierden afinidad por el colorante.

La ventaja de este método es la mayor posibilidad de encontrar parásitos más rápidamente a

pesar incluso de que sean escasos, ya que al teñir la gota de sangre seca, la hemoglobina de los eritrocitos se disuelve y es arrastrada por el agua de la solución que contiene al reactivo de tal manera que sobre la lámina quedan visibles únicamente los parásitos ( si el paciente los tiene ) y los núcleos de los glóbulos blancos:

La gota gruesa contiene 6-20 veces más sangre por unidad de superficie y el grosor equivalente a varias capas celulares en comparación al frotis, por lo que su sensibilidad sube y a la vez se reduce el tiempo necesario para el examen. Como ya se explicó, es fundamental que el material no se fije antes de la tinción y aunque resulta útil para el diagnóstico rápido de parasitemias leves, no es ideal para estudios morfológicos finos.

Frotis sanguíneo:

Se utiliza rutinariamente para el conteo diferencial de leucocitos circulantes y para la identificación específica de parásitos aunque el número de organismos que pueden verse por campo microscópico es mucho más bajo si se compara con la gota gruesa. Un frotis bien preparado es grueso en un extremo y delgado en el otro, debe ocupar la parte central de la lámina dejando márgenes laterales libres y tener por lo menos 2 cms de longitud. Para hacer el frotis se coloca una gota de sangre en el extremo de una lámina y con el borde esmerilado y recortado de otra se permite que por contacto la sangre se distribuya a lo largo del borde, formando un ángulo de 30 a 45º y luego se lleva hacia delante con un movimiento suave pero rápido y firme

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El borde final debe ser homogéneo, terminar suave y gradualmente sin rayaduras, cortes, vetas ni espacios vacíos ya que estos son indicadores de que se usó demasiada o muy poca sangre para prepararlos y una lámina astillada sin borde esmerilado y/o grasosa.

A diferencia de la gota gruesa, el frotis puede teñirse por las técnicas de Wrigth y Giemsa y dependiendo de la que se pretenda utilizar se hace necesario o no el paso previo de fijación. Como ya se dijo, el colorante de Giemsa está en una solución acuosa que rompe los glóbulos rojos si no están fijados por lo que se debe colocarlos en metanol absoluto 2 ó 3 minutos antes de la tinción. En cambio, el colorante de Wright está en una solución alcohólica y la preparación se fija al mismo tiempo que se tiñe. De esto se desprende que si el frasco queda destapado por mucho tiempo (por ejemplo durante la noche) la fijación y la tinción serán deficientes, debiendo descartarse el reactivo. Una vez se ha concluido la tinción se procede a su estudio con el objetivo de inmersión pero si se han de conservar por largo tiempo, lo mejor es cubrir con una capa delgada de medio de montaje bajo un cubreobjeto #1 (los de otra medida resultan demasiado gruesos, interfiriendo en la revisión). El proceso mecánico al hacer un frotis produce que las microfilarias sean depositadas en los bordes laterales o el extremo delgado del frotis . Por esta razón, la examinación inicial se debe hacer con el objetivo seco fuerte primero para descartar la posibilidad de pasar por alto esos parásitos que normalmente no están en gran cantidad. Los errores más frecuentes en la preparación de un frotis son: mala ubicación de la sangre en

la lámina, exceso de sangre, muy poca sangre, portabjetos grasosos, frotis demasiado largos, uso de portaobjetos extensores astillados, retardo en iniciar la coloración, empaque de frotis húmedos. Aunque pueden prepararse extensiones a partir de sangre con anticoagulante como se dijo, es preferible que no se hagan porque dichas sustancias pueden causar distorsión del

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organismo al interferir con la tinción, particularmente con los estadíos antiguos de malaria que se pueden teñir poco o aparecer degenerados. Este cuidado no aplica para el estudio de microfilarias, las cuales no se ven afectadas. En una gota gruesa bien preparada se puede examinar en 5 minutos la misma cantidad de sangre con objetivo de inmersión que en un frotis en 30 minutos pero aún con esta ventaja, la morfología de los parásitos, particularmente los de la malaria, es más definitiva en el frotis. En vista de esto, se recomienda que SIEMPRE se hagan ambas.

Aspectos relacionados a la tinción

Las extensiones de sangre se colorean con las tinciones derivadas del método original descrito por Romanowsky que contienen azul de metileno y eosina en diferentes proporciones. Entre las más usadas están: 7. La de Leishman y la de Wright, usadas de manera individual dan resultados similares. 8. La de May-Grünwald y la de Jenner, que pueden combinarse con la de Giemsa. 9. La de Giemsa, que es la más usada. 10. La A y B de Field, que se preparan en agua a diferencia de la anteriores y pueden usarse

tanto en frotis como en gota gruesa. Generalmente los tiempos de coloración varían de 7 a 10 minutos pero es posible que se necesite cambiar los tiempos especialmente si el lote de colorantes es nuevo o si han permanecido guardados durante algún tiempo. En el primer caso el tiempo aumenta y en el segundo, disminuye. Los colorantes de añilina ampliamente usados en los extendidos sanguíneos son de dos tipos generales: los básicos tales como el azul de metileno y los ácidos como la eosina. Los

núcleos tienen afinidad por los básicos por lo que se tiñen de azul y se les denomina basófilos. En cambio, otras estructuras toman los colorantes ácidos, se presentan anaranjadas o rojizas y se les denomina acidófilas o eosinófilas. Finalmente , algunas otras estructuras se tiñen por una combinación de ambas y se les denomina neutrófilas. El azul de metileno y la eosina son los pigmentos derivados del método original de Romanowsky y se usan mucho porque como pudo haberse deducido ya, tiñen diferencialmente los elementos normales y anormales de la sangre. Los componentes básicos de los colorantes mencionados son las tiacinas, y los acídicos, las eosinas; esta clase de pigmentos se conoce por tanto con la designación de Eosinatos de Tiacina. Las tiacinas consisten de azul de

metileno (o tetrametiltionina) y diversas proporciones de sus análogos producidos por desmetilación oxidativa o en otras palabras, por la sustitución de grupos metilo por moléculas de oxígeno de manera gradual y directamente proporcional al tiempo : azur A (dimetiltionina), azur B (trimetiltionina) y azur C (monometiltionina). La derivación de la eosina es más sencilla ya que proviene de un esqueleto del xanteno. Muchas tinciones de Romanowsky (llamadas en conjunto así en nombre del investigador ruso que las encontró) se disuelven en alcohol metílico y combinan fijación con tinción. Se dijo ya que existen diversos tipos como la de Leishman, Jenner, May-Grünwald, MacNeal, etc, pero se pueden hacer múltiples combinaciones entre ellas para mejorar los resultados, esto debido a las diferentes proporciones del azul de metileno y de sus intermediarios policromos desmetilados que se logra. Estos últimos pueden revelarse por envejecimiento del colorante o por la adición de agentes oxidantes (“maduración”). Las diferentes proporciones usadas producen variantes entre una técnica de coloración y otra pero también dentro de diferentes lotes del mismo colorante. El tiempo de preparación del reactivo y las condiciones de almacenaje influyen mucho en esto. La reacción de tinción es oxidativa y cualquier molécula

de oxígeno en el agua inicia el proceso y destruye el colorante del stock. Es por esta razón que la solución acuosa de trabajo diluida 1:10 sólo dura 24 horas.

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Una regla general práctica para los tiempos de tinción es relacionarlos con las diluciones que

se usan del colorante. Por ejemplo 10 minutos con una dilución 1:10, 20 con una 1:20, etc. Sin embargo se deberá determinar el mejor tiempo de tinción para cada lote de reactivos en cada laboratorio, aunque algunos autores sostienen que un resultado de mejor calidad se obtiene con una mayor dilución y un tiempo más prolongado de tinción. La solución stock de Giemsa se prepara en metanol absoluto que si se guarda en la oscuridad y bien tapada es estable por años. Debe evitarse mezclar soluciones stock de diferente edad y lote.

Problemas de Tinción

a- Tinción azul: se puede deber a un frotis muy grueso, tiempo prolongado de tinción,

colorante alcalino, lavado inadecuado, alcalinidad de la solución amortiguadora. b- Tinción rosada: tiempo de tinción insuficiente, lavado excesivo, acidez del colorante o

solución amortiguadora, montaje de frotis húmedos. c- Precipitados: uso de portaobjetos sucios; secado durante alguna fase de la tinción; lavado

inadecuado, presencia de polvo sobre la lámina, filtrado inadecuado del colorante. d- Fijación de hematíes: contacto de metanol, contacto de etanol 70% cuando se hizo la

punción dactilar, aplicación de calor para secar. e- Tinción escasa: pérdida de afinidad por los colorantes después de tres días de almacenaje

de los frotis sin deshemoglobinización.

Todas las muestras de sangre se deben considerar potencialmente infecciosas. Dos de las enfermedades más peligrosas transmitidas por la sangre son la hepatitis B y C y el VIH/SIDA. Al recoger muestras de sangre para el diagnóstico de parásitos sanguíneos (y también con otros fines) se deben observar las normas de bioseguridad pertinentes. El principal peligro para los laboratoristas es la contaminación de las manos y de las mucosas (ojos, nariz, boca). Esa contaminación se produce a raiz de lesiones penetrantes causadas por objetos punzantes o cortantes y de derrames o salpicaduras de la muestra. Aquí se presentan prácticas y procedimientos concebidos para reducir al máximo esos accidentes.

1- Todo laboratorista debe estar capacitado en relación a las tareas que desempeña. 2- El proceso estándar de funcionamiento de cualquier proceso debe estar consignado

convenientemente por escrito y en un lugar visible. 3- Se debe usar siempre ropa de protección dentro del laboratorio (gabacha). 4- Se deben usar guantes al tomar y manipular muestras de sangre. 5- No se deben tocar los ojos, nariz u otras mucosas con las manos enguantadas. 6- Los guantes deben quitarse al salir del laboratorio. Cuando se considere que los

guantes están contaminados deben descartarse y ser repuestos por otros. 7- Se deben lavar las manos con agua y jabón inmediatamente después de cualquier

contaminación y una vez terminado el trabajo. 8- Las heridas punzantes y cortes de piel contaminados con salpicaduras de sangre deben

lavarse a fondo con agua y jabón. Conviene hacer sangrar la herida. 9- Las lancetas y jeringas usadas deben ser colocadas en un recipiente resistente a los

pinchazos y esterilizadas antes de su descarte final. 10- Se deben desinfectar las superficies de trabajo al concluir el trabajo y al final del día. 11- No se debe comer, fumar, beber ni usar cosméticos en el laboratorio. 12- Toda la cristalería reutilizable que fue usada en los procedimientos debe ser colocada

en una solución de hipoclorito de sodio 1g/l antes de ser lavada.

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PRÁCTICA № 12

DIAGNÓSTICO DE COCCIDIOS INTESTINALES DEL HUMANO: Isospora belli (sin =

Cystoisospora belli), Cyclospora cayetanensis y Cryptosporidium sp.

La criptosporidiosis es una parasitación intestinal que fué descrita originalmente en pacientes con síndrome de inmunodeficiencia adquirida pero en la actualidad se le considera una infección bastante frecuente en personas adultas. Las técnicas más importantes para el diagnóstico de estos patógenos son las siguientes: el examen directo de heces frescas y técnicas de tinción.

Actualmente, el método de diagnóstico de Cyclospora cayetanensis e Isospora belli más práctico consiste en la identificación de ooquistes en muestras de heces por microscopía de luz. Otros métodos también están disponibles, como por ejemplo inmunofluorescencia y técnicas de biología molécular, pero el costo del equipo que se utiliza es muy elevado. OBJETIVOS

Al finalizar las actividades propuestas los alumnos serán capaces de: a) Describir e identificar los ooquistes de I. belli, C. cayetanensis y Cryptosporidium sp al examen

directo al fresco y por métodos de tinción. b) Realicen una comparación de los métodos de diagnóstico y con base en esto seleccionen el

método más adecuado según la ocasión. MATERIALES TRAIDOS POR EL ESTUDIANTE

Muestras de heces frescas de preferencia positivas a coccidios y/o protozoarios intestinales ACTIVIDAD #1: Examen directo al fresco Haga el montaje por pareja de las muestras que encontrará en la mesa de demostración y revise con el objetivo de 10X y 40X haciendo los cambios de luz que sean necesarios en busca de ooquistes de los coccidios mencionados. Luego haga montaje de las muestras que ha traído y dibuje y describa lo que observa.

Isospora belli ______________________________________

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Cyclospora cayetanensis

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Cryptosporidium sp

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ACTIVIDAD #2: Preparación del frotis de heces para posterior tinción.

Procedimiento: 1. Coloque una gota de solución salina 0.85% o Fosfato buffer salino (PBS) en un portaobjeto

limpio y desengrasado. Si se trata de muestras líquidas se hace un extendido homogéneo a partir de la muestra original

2. Tomar una pequeña porción de la muestra de heces con un aplicador de madera y hacer una suspensión de aproximadamente el 50% de la gota de solución.

3. Con el mismo aplicador de madera, extienda la suspensión para formar una capa delgada uniforme, que cubra por lo menos tres cuartas partes del portaobjetos.

4. Dejar secar al aire. 5. Cubrir el frotis con metanol (Alcohol metílico absoluto) durante 3 a 5 minutos. 6. Dejar secar al aire.

Si las muestras son mucoides o están formalinizadas siga estos pasos:

Preparación de frotis a partir de heces mucoides. 1- Agregue 10 gotas de KOH al 10% al sedimento de heces concentradas. 2- Mezcle hasta homogenizar en un Vortex. 3- Agregue 10 ml de formalina al 10% y centrifugue a 300 r.p.m. por 10 minutos. 4- Sin descartar el sobrenadante prepare un frotis como ya se indicó.

Preparación de frotis a partir de muestras de heces formalinizadas

1. Centrifugue las heces formalinizadas durante 2 minutos a 300 rpm. 2. Sin descartar el sobrenadante, tome una gota de la parte superior del sedimento y

prepare un frotis delgado con la ayuda de otra lámina. 3. Secar el frotis al aire y fíjelo por un simple pasaje a la llama de un mechero o a 70º C por

10 minutos o con metanol ácido (3% HCL en metanol) por 3 ó 5 minutos.

[87]

ACTIVIDAD #3: Tinción de los frotis. Método de Acido Resistencia Modificada de Kinyoun ( método “en frío” )

1. Hacer un frotis de heces (preparado con el método anterior) 2. Dejar secar al aire. Colorear con Carbol fucsina de Kinyoun por 5 minutos sin calentar. 3. Lavar de 3 a 5 segundos con alcohol etílico al 50%. 4. Lavar con agua de chorro abundantemente. 5. Decolorar con ácido sulfúrico al 1% por 2 minutos o hasta que el frotis no desprenda más

colorante. (en esto radica la modificación de las tinciones de AR para coccidios) 6. Lavar con agua de chorro. Dejar escurrir el frotis. 7. Constrastar con azul de metileno o verde de malaquita al 5% por 2 minuto 8. Lavar con agua. Dejar secar al aire. 9. Observar con el objetivo 40X. Para ver morfología interna, utilice el objetivo 100X.

Método de Ziehl Neelsen Modificado ( método “en caliente” ) 1. Hacer un frotis de heces (preparado con el método anterior) 2. Dejar secar al aire. Colorear con Carbol fucsina, calentando con un flameador hasta que emita

vapores. Repetir este procedimiento por 5 minutos. 3. Lavar con agua de chorro abundantemente. Escurrir. 4. Decolorar con ácido sulfúrico al 5% por 30 segundos (frotis gruesos es necesario decolorar mas

tiempo o hasta que el frotis no desprenda más colorante). En esto radica la modificación de las tinciones de ácido resistencia para coccidios.

5. Lavar con agua de chorro. Dejar escurrir el frotis. 6. Constrastar con azul de metileno o verde de malaquita al 5% por 1 minuto 7. Lavar con agua. Dejar secar al aire. 8. Observar con el objetivo 40X con un microscopio de campo brillante. Para ver morfología interna,

utilice el objetivo 100X. De las láminas coloreadas o de las que le entregue su instructor dibuje y describa los estadios.

Cyclospora cayetanensis. ____________________________________

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Cryptosporidium sp ____________________________________

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Isospora belli

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Reporte del resultado:

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ACTIVIDAD #4: MÉTODO DE CONCENTRACIÓN DE SHEATHER MODIFICADA POR BENBROOK. (FLOTACIÓN CON AZUCAR)

El método de flotación con azúcar de Sheather se recomienda para la concentración de ooquistes de Isospora belli en el laboratorio. Ooquistes de Cryptosporidium sp, y Cyclospora cayetanensis pueden también concentrarse; sin embargo para asegurar el diagnostico de estas dos especies es preferible procesar las muestras por métodos de coloración. Aunque los ooquistes se concentran también con las técnicas de formol-etil acetato o sulfato de zinc, esta técnica se utiliza porque se detectan más rápidamente y microscópicamente los ooquistes se destacan mejor. La técnica puede ser desarrollada con muestras frescas y también formalinizadas. Para proceder a realizar el método es necesario recordar las siguientes observaciones: Heces líquidas

a) Tomar una muestra del fondo del frasco con una pipeta Pasteur; o b) Mezclar las heces con la pipeta Pasteur y aspirar una cantidad; o c) Mezclar las heces, verter 2-3 mL en un tubo de ensayo rotulado, centrifugar, descartar el sobrenadante al frasco con la muestra original de heces o en un recipiente con desinfectante y continuar trabajando con el sedimento.

Heces con moco a) Tomar una porción del moco y examinar al microscopio como frote directo; o, b) Utilizar un mucolítico (10 gotas de KOH al 10%) para disolver el moco y liberar ooquistes que estuvieran atrapados. Dejar actuar el mucolítico a temperatura ambiente durante 1 - 5 minutos, agitando con un aplicador. Una vez disuelto, agregar agua destilada, mezclar, centrifugar, decantar y continuar la técnica utilizando el sedimento.

Procedimiento:

1. Hacer una suspensión de heces colocando aproximadamente 1mL ó 1 g de heces en un tubo de 16 por 100 mm.

2. Filtrar en gasa doblada en 4 a otro tubo de ensayo. 3. Equilibrar en balanza y centrifugar a 1,500 rpm por 2 minutos. Decantar el sobrenadante. 4. Agregue solución de Sheather hasta la mitad del tubo y con dos aplicadores de madera

homogenice la porción de heces con la solución. 5. Agregue solución de Sheather llenando el tubo hasta 2 cm de la boca del tubo y tapar. 6. Centrifugue la muestra fecal a 1,000 rpm (400 g) por 10 minutos. 7. Retirar el tubo con sumo cuidado para no agitar y con un asa bacteriológica cuyo extremo ha

sido doblado (ver figura) tomar varias asadas de la parte superior de la solución y colóquelas en un portaobjetos 3 x 1 1/2". Cúbralo con un cubreobjetos y observe al microscopio con el objetivo seco fuerte.

[89]

ACTIVIDAD #5: EXPERIMENTO DE MADURACIÓN DE OOQUISTES. Este experimento lo realizan laboratorios de referencia y para fines de investigación.

Debido a la similitud morfológica entre preparaciones hechas al fresco de los ooquistes inmaduros de Cyclospora y las algas azul-verdes (cuerpos parecidos a Cyanobacterium), se ha asegurado que para confirmar el diagnóstico de Cyclospora, deben examinarse ooquistes por un tiempo de 2 a 3 semanas hasta evidenciar el aparecimiento de esporoquistes. Esto se lleva a cabo poniendo una alícuota de heces frescas en dicromato de potasio 2.5%, el cual reduce el crecimiento bacteriano excesivo, bajo observación microscópica frecuente hasta la maduración de los ooquistes. Esto también se puede realizar en ooquistes de Isospora belli aunque la posibilidad de confusión es mucho menor.

Procedimiento: a. Mezcle una porción de heces frescas con ooquistes con 2-3 volúmenes de dicromato de

potasio 2.5%. b. Tape el frasco con gasa (para promover aeración) y colóquelo en un rotador mecánico. En el

caso de que no se tenga este aparato agite el frasco de vez en cuando durante el período de la incubación.

c. Realice observaciones microscópicas del material frecuentemente a partir del quinto día, aunque el porcentaje de ooquistes que maduran puede variar.

Si el número de ooquistes es pequeño, el material contenido en el dicromato de potasio puede centrifugarse y examinarse el sedimento. Antes del examen, la solución de dicromato de potasio debe diluirse (disminuye la fluorescencia): agregue al espécimen un volumen igual de agua destiladad/desionizada y elimine el dicromato por centrifugación, luego realize varios lavados con agua destilada/desionizada o PBS. Para un examen óptimo del espécimen, realice una preparación húmeda para epifluorescencia (para identificar la autofluorescencia de los ooquistes) seguido por DIC, microscopía de contraste de fase o la microscopía de campo luz convencional (para identificar los esporoquistes y esporozoitos). Los ooquistes esporulados maduros contienen dos esporoquistes cada uno de los cuales contienen dos esporozoitos. Debido a que los esporozoitos se condensan herméticamente dentro del esporoquiste, ellos son difíciles de visualizar

ACTIVIDAD #6: OTRAS TINCIONES UTILIZADAS Identificación de ooquistes de Cryptosporidium sp. en frotis teñidos con Giemsa.

Procedimiento: 1. Prepare un frotis según la técnica explicada anteriormente. 2. Prepare una dilución 1:10 a partir del colorante de Giemsa concentrado (1 parte de Giemsa

más 9 partes de solución amortiguada de fosfatos, pH 7.2) 3. Cubra la lámina (previamente fijada con metanol) con el colorante diluido durante 30 minutos.

También se puede utilizar un frasco Koplin con Giemsa y sumergir en él los frotis y de esta manera evitar la precipitación indeseable del colorante sobre ellos.

4. Lavar con agua de chorro. Dejar secar al aire. El frotis de heces teñido con Giemsa se examina al microscopio de luz y en bajo poder. La observación se confirma con el objetivo de aceite de inmersión. A partir de los frotis teñidos que se le proporcionarán dibuje (si es posible coloree) y describa los ooquistes.

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Identificación de ooquistes de Cryptosporidium sp por la técnica de Koster modificada.

Procedimiento: 1. Realizar un frotis según se describe en la práctica anterior y dejar secar al aire. 2. Fijar en alcohol metílico por 2 - 5 minutos 3. Secar en mechero por poco tiempo (hasta que el alcohol se queme). 4. Teñir por 5 minutos con el colorante de Koster. 5. Lavar con agua. 6. Diferenciar en H2SO4 al 0.1% por 10 segundos. 7. Lavar con agua. 8. Contrastar con solución acuosa de verde de malaquita 5% por 10 a 15 segundos. 9. Lavar con agua. 10. Observar al microscopio con objetivo de 40 y 100X.

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Reporte del resultado:

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TAREA PREVIA: esquematice el ciclo de vida general de un coccidio y resuma en una tabla las diferencias morfológicas más notables entre los ooquistes de los coccidios intestinales humanos.

LECTURA RECOMENDADA: Atlas de Parasitología Humana /Ash. Pags 106 - 117

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PRÁCTICA № 13

DIAGNOSTICO DE LOS AGENTES DE LA MICROSPORIDIOSIS

En los últimos años han aparecido una serie de organismos pertenecientes al Phylum

Microspora, que, a raíz de los problemas de inmunosupresión y SIDA, están parasitando al humano

especialmente a nivel intestinal. Los géneros involucrados son Microsporidium, Nosema,

Encephalitozoon, Septata, Enterocytozoon y Pleistophora. En nuestro país al momento no se han

encontrado casos por lo que es necesario que el Licenciado en Laboratorio Clínico tenga una noción de

la morfología de estos organismos, así como las técnicas para su diagnóstico.

OBJETIVOS

Al finalizar el laboratorio el estudiante será capaz de:

a) Interpretar la morfología de las esporas de microsporidios a través de la observación de

preparaciones de heces al fresco y coloreadas.

MATERIALES TRAIDOS POR EL ESTUDIANTE

Muestras de heces (o esputo) de preferencia positivas a microsporidios o protozoarios intestinales

ACTIVIDAD #1: Observación de microsporidios al fresco en muestras de heces.

Observe una preparación de las muestras de heces proporcionadas e identifique las esporas en cuanto a su tamaño y formación de grumos. Dibuje y describa las estructuras que observa en el espacio asignado.

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TAREA: Encuentra diferencias entre estas estructuras y levaduras o bacterias?. Escríbalas________

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ACTIVIDAD #2: Observación de microsporidios muestras de tejidos

El diagnóstico de la microsporidiosis es posible en cortes histológicos pero se requiere de mucha experiencia para diferenciar entre estos agentes y otros o estructuras celulares. Observe porciones de mucosa intestinal teñidas con hematoxilina eosina (HE) y describa y dibuje lo que observa

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A. Estudio de microsporidios por el método de tinción Tricrómico modificado por Weber.

(Weber R et al. N Engl J Med 1992; 328:181-188)

1. Tomar 1 gota de una suspensión de heces o heces en formalina 10% y extenderla sobre un área de 45 x 25 mm.

2. Fijar las extensiones en metanol por 5 minutos 3. Colorear por 90 minutos en el colorante tricrómico modificado. El colorante estará en un frasco

Koplin. 4. Luego de la tinción, las láminas se lavan en alcohol ácido durante 10 segundos. 5. Luego son pasados brevemente por alcohol de 95%. 6. Luego son deshidratados sucesivamente en alcohol de 95% por 5 minutos, alcohol de 100%

por 10 minutos. 7. Colocarlos en xilol por 10 minutos. 8. Se revisan 100 campos con el objetivo de inmersión para dar el diagnóstico.

A partir de los frotis preparados por Ud. y los entregados por su instructor dibuje y describa lo que observa al microscopio.

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LECTURA RECOMENDADA: Atlas de Parasitología Humana / Ash pags 123 – 127.

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PRÁCTICA № 14

DIAGNÓSTICO DE PARÁSITOS DE LOS GÉNEROS Trichuris, Trichinella,y Strongyloides

PRIMERA PARTE: Trichuris trichiura

OBJETIVOS Al término de las actividades propuestas, el estudiante será capaz de:

a) Explicar esquemáticamente las estructuras generales que diferencian a hembra y macho. b) Describir los huevecillos en muestras de heces al fresco. c) Describir con ayuda del microscopio las estructuras internas y la reacción tisular observadas

en cortes transversales del parásito. MATERIALES TRAIDOS POR EL ESTUDIANTE: Muestras de heces positivas a helmintos intestinales de preferencia tricocéfalos y Strongyloides. Guantes de látex y regla milimetrada

ACTIVIDAD #1: Estudio de especímenes adultos. Examine, dibuje y describa brevemente haciendo uso del microscopio estereoscópico un ejemplar macho y hembra al fresco de T. trichiura. Incluya en su descripción las dimensiones aproximadas del parásito.

A) Macho_____________________

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B) Hembra_____________________

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ACTIVIDAD #2: Revisión de cortes cortes histológicos de macho y hembra teñidos. Complete sus observaciones tratando de identificar las estructuras más importantes. Señale en sus dibujos esquemáticos los números que corresponden a las siguientes partes: 1 esticosoma, 2 intestino, 3 testículo, 4 ovario, 5 banda bacilar, 6 útero, 7 huevecillos, 8 cutícula, 9 musculatura. De los anteriores señale aquellas estructuras que se observan exclusivamente en miembros de la familia Trichuroidea: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________

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MACHO

HEMBRA

ACTIVIDAD #3: Identificación del huevecillo. Observe el huevecillo con menor y mayor aumento en un montaje al fresco de heces. Dibuje y describa en los espacios dados.

10X

40X

Descríbalo ___________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ Necesita solución de Lugol para el diagnóstico? SI/No Porqué?_________________________________ ____________________________________________________________________________________

SEGUNDA PARTE: Strongyloides stercoralis

OBJETIVOS a) Explicar la morfología de las larvas rabditoides y filariformes de Strongyloides stercoralis. b) Describir los estadíos, lugares de paso y variantes del ciclo de vida del parásito.

ACTIVIDAD #1: Estudio de las formas larvales .Observe, dibuje y describa la larva rabditoide.

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Observaciones__________________

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Observe, dibuje y describa la larva filariforme de S. stercoralis. ________________________________

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En qué lugares y/o muestras clínicas puede observar a cada una? ______________________________

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TERCERA PARTE: Trichinella sp.

OBJETIVOS a) Describir y esquematizar las larvas enquistadas en cortes histológicos y la reacción tisular.

ACTIVIDAD #1: Identificación de larvas. Observe microscópicamente, describa y esquematice los cortes histológicos de músculo parasitado con larvas enquistadas de Trichinella sp.

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TAREA PREVIA: Haga un esquema y compare entre las larvas filariformes de uncinarias y Strongyloides dando el mayor número de diferencias que pueda.

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TAREA: Esquematice el ciclo vital de Strongyloides stercoralis y haga un listado de las posibles formas de infección humana LECTURAS RECOMENDADAS: Parasitología Clínica /Beaver: caps 18 y 19. Atlas de Parasitología Humana / Ash. Pags 172 a 182 y 203 a 208.

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PRÁCTICA № 15

DIAGNOSTICO DE NEMATODOS BURSADOS. GÉNEROS Ancylostoma, Necator y

Angiostrongylus.

PRIMERA PARTE: GÉNEROS Ancylostoma y Necator

OBJETIVOS a) Describir las estructuras generales que diferencian géneros, especies y sexos de uncinarias. b) Identificar en muestras de heces los huevecillos y las formas larvales de estos parásitos. c) Describir los estadíos y localización de los sitios en la migración durante el ciclo de vida de estos

parásitos e indicar en algunos su tiempo de duración. MATERIALES TRAIDOS POR EL ESTUDIANTE Muestras de heces positivas a helmintos de preferencia positivas a uncinarias (puede ser de perro) Guantes de látex. Regla milimetrada ACTIVIDAD #1: Revisión macroscópica. Utilizando regla milimetrada o escalímetro mida los adultos que encontrará en las mesas de demostración y anote las dimensiones obtenidas __________________ Anote además el color ___________________________ y cómo reconoce a simple vista o a menor aumento a un macho de una hembra ______________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ACTIVIDAD #2: Revisión microscópica anterior. Los géneros de uncinarias que infectan al humano pueden establecerse por la revisión de las piezas que se encuentran en las cápsulas bucales. Examínelas y descríbalas en forma breve.

Ancylostoma Necator

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ACTIVIDAD #3: Revisión microscópica posterior. El sexo, el género y aún, la especie de un nematodo bursado puede definirse por la revisión de su extremo caudal. Examine los ejemplares macho y hembra de Ancylostoma, Necator o Angiostrongylus, dibújelos y describa brevemente.

[98]

MACHO

HEMBRA

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ACTIVIDAD #4: Revisión de bolsas copulatrices. Revise las demostraciones de especímenes machos de Ancylostoma sp y Angiostrongylus costaricensis y dibuje y describa haciendo énfasis en las diferencias que encuentre. Trate de observar en cada caso la forma y posición de los rayos; presencia o ausencia de gubernáculo y dimensión de las espículas. NOTA: recuerde que para lograr el diagnóstico definitivo de un helminto en muchas ocasiones debe considerarse el origen del espécimen. A. costaricensis vive en el mesenterio de roedores y aunque el humano es hospedero definitivo accidental, no es frecuente contar con adultos para el diagnóstico

ACTIVIDAD #4: Estudio del huevecillo. Dibuje esquemáticamente y describa en forma breve un huevecillo de uncinaria en montaje al fresco de heces con objetivo de bajo y alto poder.

10X

40X

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Puede hacer el diagnóstico de especie de uncinaria observando el huevecillo en solución salina 0.85%?

_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Debe hacerse diagnóstico diferencial entre las larvas rabditoides de uncinarias y las de Strongyloides en una muestra de heces? Razone su respuesta___________________________________________ _______________________________________________________________________________

SEGUNDA PARTE: Angiostrongylus costaricensis

Las infecciones con este agente suceden con relativa poca frecuencia pero cuando ocurren comprometen la vida del paciente si el diagnóstico se retrasa o se realiza inadecuadamente OBJETIVOS

A Explicar con ayuda del microscopio el parásito y la reacción tisular observados en un corte transversal del intestino.

ACTIVIDAD #1: Revisión de cortes histológicos. Examine y dibuje los cortes histológicos de intestino o apéndice humano con A. costaricensis y haga las observaciones pertinentes en relación a las formas observadas, localización y reacción granulomatosa.

Huevecillos ____________________________________

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Corte de adulto ____________________________________

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LECTURAS RECOMENDADAS: Parasitología Clínica / Beaver: cap 20. Atlas de Parasitología Humana / Ash. Pags 172 a 185 , 213 a 221, 224 - 225.

[100]

Necator americanus Ancylostoma duodenale

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PRÁCTICA № 16

DIAGNÓSTICO DE PARÁSITOS DE LOS GÉNEROS Ascaris Y Enterobius.

PRIMERA PARTE: ESTUDIO DE Ascaris lumbricoides.

OBJETIVOS: Al finalizar las actividades se espera que los estudiantes serán capaces de:

a) Describir y la estructura general interna y externa de los adultos. b) Identificar las diversas presentaciones de los huevecillos en muestras de heces al fresco. c) Describir la migración y localización de los estadios según el ciclo vital.

MATERIALES TRAIDOS POR EL ESTUDIANTE: Muestras de heces positivas a helmintos intestinales de preferencia positivas a Ascaris. Regla milimetrada. Guantes de látex ACTIVIDAD #1: Estudio de especímenes adultos. Observe y describa los ejemplares macho y hembra proporcionados. Revise además los respectivos cortes transversales. En cada caso identifique las características anatómicas que definen el sexo y coloque el nombre a las diferentes estructuras.

MACHO HEMBRA

[103]

ACTIVIDAD #2: Estudio de huevecillos. Revise la demostración que encontrará en la mesa respectiva e identifique los diferentes tipos de huevos. De las muestras de heces proporcionadas haga un montaje al fresco en solución salina y trate de encontrar lo visto antes. Dibuje y describa los diferentes tipos de huevecillos.

DESCRIPCION _________________________________________________

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SEGUNDA PARTE: ESTUDIO DE Enterobius vermicularis. OBJETIVOS

a) Describir la estructura general de la hembra de E. vermicularis. b) Identificar las principales estructuras internas preparaciones teñidas. c) Identificar los huevecillos obtenidos por raspado perianal, método de Graham o hisopo de Hall.

ACTIVIDAD #1: Identificación de hembras adultas: Dibuje y describa brevemente el ejemplar que se observa de E. vermicularis así como su corte transversal. Anote las principales características.y ubique en sus esquemas los números que corresponden a las siguientes partes: 1. Boca, 2. Expansiones cuticulares, 3. Itsmo, 4. Bulbo posterior, 5. Útero, 6. Cutícula, 7. Ano, 8. Musculatura, 9. Huevos.

MONTAJE AL FRESCO

CORTE TRANSVERSAL

FECUNDOS O FERTILES

INFECUNDOS O INFERTILES

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ACTIVIDAD #2: Estudio de los huevecillos. Haga un montaje al fresco de heces con la muestra proporcionada y trate de encontrar en ella lo observada en la demostración respectiva. Revise además las preparaciones en cinta adhesiva. Dibuje y describa el huevecillo observado en ambos casos

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ACTIVIDAD #3: Método de Graham o de la cinta adhesiva. Trabaje con un compañero en la simulación de la toma de muestras de huevecillos de Enterobius vermicularis. Siga los pasos siguientes:

1. Tome un bajalenguas y marque en él dos puntos ubicados en la linea central a 3.5 cm de cada extremo

2. Se desea llegar a obtener un sistema parecido al siguiente, visto de perfil:

Portaobjeto Cinta adhesiva Fig. A Portaobjeto Fig. B

3. Entonces corte un trozo de cinta adhesiva transparente de una extensión igual al doble de los 2/3 de la longitud del bajalengua (10-12 cm).

[105]

4. Rodee con la cinta, CON LA GOMA HACIA FUERA, el bajalengua (Fig. A) y sosteniéndola con la yema del dedo indice y pulgar y ubicando enseguida el portaobjeto entre los dos puntos señalados en 1.

5. Presione el portaobjetos a la madera con el pulgar y el índice en el lugar donde termina la cinta señalada con puntos.

6. Ahora usted actua sobre la zona que simula el ano (por ejemplo: mano cerrada vista por la zona del pulgar), aplicando el sistema a las paredes del “orificio” con un movimiento tal que permita que la cinta “toque” las paredes del ano simulado.

7. Efectuada la toma de la muestra, lleve la cinta con su parte “contaminada” a la cubierta libre del portaobjeto, doblándola y pegándola sobre él (Fig. C). Para facilitar la observación puede agregar una gota de xilol o tolueno al portaobjeto antes de pegarle la cinta.

Portaobjeto Bajalengua Fig. C Cinta adhesiva

8. Descarte las partes de la cinta que sobra a ambos lados del portaobjeto y la cinta que estaba debajo de la misma. Enseguida observe al microscopio.

TAREA: Enliste diferencias y similitudes entre los ciclos vitales de Ascaris lumbricoides y Enterobius vermicularis

DIFERENCIAS SIMILITUDES LECTURAS RECOMENDADAS: Parasitología Clínica / Beaver cap 21. Atlas de Parasitología Humana / Ash. Pags 172 a 182; 191 a 201.

[108]

PRÁCTICA № 17

MÉTODOS ESPECIALES PARA EL DIAGNOSTICO DE HELMINTOS.

OBJETIVO:

a) Interpretar los métodos y técnicas especiales de diagnóstico para helmintos que se aplican en aquellos casos en que los métodos rutinarios no son efectivos; además se estudiarán técnicas especiales usadas en investigación, enseñanza y encuestas epidemiológicas.

NOTA: Se trabaja con material potencialmente infeccioso por lo que el estudiante DEBERA USAR GUANTES

MATERIALES TRAIDOS POR EL ESTUDIANTE.

Muestras de heces positivas a huevos/larvas de helmintos, POR PAREJA. (INDISPENSABLES) Guantes de látex y lentes protectores

ACTIVIDAD #1: Concentración de larvas de nemátodos por el Método de Baerman y Morais.

Este método se utiliza para separar larvas de nemátodos del material de cultivo (materias fecales o tierra), y se basa en el hecho de que una gran mayoría de larvas de nemátodos emigran hacia el agua que se pone en contacto con la muestra, siempre y cuando el agua esté a una temperatura aproximada de 45ºC.

El dispositivo de Baerman consta de:

1. Un embudo de vidrio conectado en la espiga (extremidad de su tallo) con un corto tubo de hule.

2. Una pinza de presión para el tubo de hule. 3. Un cedazo o malla de alambre fino (colador de cocina)

que ajuste por debajo del borde del embudo y un pedazo de tela de algodón (gasa) bastante fino que no deje pasar partículas gruesas en caso de trabajarse con cultivos de tierra o heces.

4. Un pie universal con anillo.

Procedimiento:

1. Colocar el cedazo en el embudo con la tela o gasa. 2. Sobre esto y en forma delicada colocar el tejido o la

muestra. 3. Llenar el embudo con agua a 45º C poco a poco hasta que se ponga en contacto con el nivel

inferior de la muestra contenida en la malla. 4. El medio líquido y el calor atraerán los parásitos en forma singular sedimentándose la

mayoría en el término de una hora. La muestra puede dejarse por 2 horas o más. 5. Retirar la primera porción abriendo la llave y recogiendo el líquido en un tubo cónico que

luego puede centrifugarse por 2 min a 500 x g para concentrar aún más los parásitos y examinar el sedimento bajo el microscopio (100X y 400X) para observar la presencia de

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larvas móviles. Es difícil observar los detalles debido a que las larvas se mueve rápidamente, si esto ocurre, use una gota de solución de Lugol o formol al 10% para inmovilizar las larvas.

La técnica sirve para aislar larvas parásitas y de vida libre. Si la muestra a analizar (heces) se sospecha que está contaminada con tierra o agua conteniendo estas últimas, es necesario diferenciar entre ambas lo cual es posible debido a que las formas parásitas son más resistentes a ácidos que las de vida libre. Para esto proceda a realizar lo siguiente: Añada 0.3 ml de ácido clorhídrico concentrado por 10 ml de agua que contengan larvas (dilución 1:30). Las larvas de vida libre mueren instantáneamente y las parásitas viven cerca de 24 horas.

Reporte de resultados. Reporte sus hallazgos como “Larvas no detectadas” si no se encuentran larvas al final de la incubación. En caso contrario reporte las larvas detectadas, por ejemplo: “Larvas de Strongyloides stercoralis detectadas por concentración fecal”.

ACTIVIDAD #2: Método de Harada Mori. (Cultivo de larvas en tubo de ensayo) Para obtener larvas a partir de huevos de helmintos, un método simple fue diseñado inicialmente por Harada y Mori en 1955, el cual fue modificado por otros investigadores. El método requiere solamente materiales con los que cuenta cualquier laboratorio.

Procedimiento: 1. Se prepara una tira de papel filtro de aproximadamente 0.8 por 5 pulgadas ( 2 cm. de ancho

por 13 cm. de largo 2. Se extiende aproximadamente de 0.5 a 1 g de material fecal sobre el centro del papel filtro,

por un solo lado. 3. Agregar 3 a 4 ml de agua destilada al tubo de centrífuga cónico.

4. Insertar el papel filtro dentro del tubo procurando que 1.5 cm de la

parte inferior del papel se encuentre inmersa en el agua. No es necesario tapar el tubo, sin embargo se puede cubrir con un tapón de algodón (ver figura).

5. Coloque el tubo en posición vertical en una gradilla e incubar en la oscuridad a temperatura ambiente (25 a 28º C) por 10 días. Agregar agua destilada cuidadosamente para mantener el nivel del agua. El agua sube por capilaridad y mantiene las heces húmedas.

6. Sostenga el tubo con pinzas o guantes para evitar la infección por

larvas. Examine diariamente observando una gota del líquido del fondo del tubo. Las larvas migran del papel al líquido. Realice una preparación al fresco y obsérvela con el objetivo 10X.

7. Examine la movilidad de las larvas y las características morfológicas

para identificar las larvas de uncinarias, Strongyloides spp., y Trichostrongylus spp. Puede usar solución de Lugol para matar las larvas.

Reporte de resultados. Reporte sus hallazgos como “Larvas no detectadas” si no se encuentran larvas al final de la incubación. En caso contrario reporte las larvas detectadas, por ejemplo: “Larvas de Strongyloides stercoralis detectada por cultivo fecal”.

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ACTIVIDAD #3: Método de Clemente Pereira. (Cultivo de larvas en tierra vegetal) En muestras fecales viejas pueden existir larvas rabditoides de uncinarias y Strongyloides; si existen dudas acerca de la especie presente, pueden cultivarse las heces hasta obtener larvas filariformes. Las uncinarias necesitan de 5 a 6 días para desarrollarse y las de Strongyloides solamente de 2 a 3.

Procedimiento:

1. Se coloca tierra seca vegetal previamente calentada a 60º C en la tapa inferior de una caja de Petri, en cantidad suficiente para cubrir el fondo.

2. Se homogenizan las heces con un poco de agua de chorro y un bajalenguas hasta darle una consistencia líquida pero gruesa. (Si las heces son líquidas se omite este paso.)

3. Se colocan una capa del homogenizado sobre la capa de tierra 4. Luego se coloca otra capa de tierra que cubra completamente las heces. Esta última capa de

tierra tiene la finalidad de retardar el crecimiento de hongos. 5. Sobre la parte interna de la tapa de la caja de Petri y cercana al borde, se coloca una capa de

cera o parafina fundida. Tapar con ella inmediatamente la base de tal manera que al solidificar quedará sellada herméticamente, evitando así que las larvas puedan escapar de su interior.

6. Después de la eclosión de los huevos, las larvas se desplazan en todas direcciones, tratando de abandonar el medio donde nacieron, lo que hace que suban y se acumulen en los bordes de la caja y principalmente en las gotas de condensación de la tapa superior. Las larvas quedan así concentradas en las gotas pendientes del techo de la caja y pueden ser observadas con lupa o microscopio entomológico.

Estos cultivos serán observados entre el 4 y 12 día de incubación. Reporte de resultados. Igual que en los métodos anteriores.

2ª capa de tierra.

Capa de heces.

1ª Capa de tierra.

ACTIVIDAD #4: Método de la caja de Petri-papel filtro inclinado. (Método de Little)

Esta técnica tiene la ventaja de que las larvas parásitas y larvas de vida libre pueden observarse directamente con el microscopio o preferiblemente con un microscopio estereoscópico al enfocar la masa fecal o el agua, sin necesidad de hacer preparaciones microscópicas.

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Procedimiento: 1. Cortar tiras de papel filtro de 3 x 1”. 2. Con un aplicador de madera hacer extensión de heces tomando aproximadamente 1 a 2 g

de heces en el centro de l papel. 3. Colocar el papel sobre un portaobjetos 3 x 1” Colocar el portaobjeto en forma inclinada

(10º) sostenida en una varilla de vidrio en una caja de Petri (ver figura). 4. Agregar agua destilada a la caja de Petri hasta que ¼ del portaobjetos esté sumergido en el

agua. Tapar la caja de Petri y incubar a 25 – 28º C por 10 días. Cuando sea necesario, agregue agua para mantener el nivel original.

5. Examine diariamente utilizando un microscopio estereoscópico o si el microscopio compuesto lo permite, coloque la caja de Petri abierta en la platina. También puede hacer preparaciones al fresco del líquido y observando con el objetivo de 10X.

6. Examine la movilidad y las características morfológicas para identificar las larvas de uncinarias, Strongyloides spp., y Trichostrongylus spp. Puede usar solución de Lugol para matar las larvas

Reporte de resultados. Igual que en los métodos anteriores.

ACTIVIDAD #5: Migración de larvas en agar o Método de Koga.

Este metodo aumenta la sensibilidad de detección por métodos no agresivos, una infección por Strongyloides stercoralis. Incidentalmente podrían recobrarse larvas de Necator americanus y Ancylostoma duodenale PERO EN MUESTRAS HECES VIEJAS O DE TIERRA. Entre las ventajas de este método están: mayor sensibilidad, adecuado en casos problema o en niños en quienes no puedan realizarse métodos más agresivos (aspirado duodenal, biopsia). Desventajas: Necesidad de más equipo de laboratorio, más tiempo para preparar el método, mayor tiempo de espera antes de ofrecer un resultado, menor cantidad de heces de donde se podrían extraer las larvas, necesidad de personal de laboratorio muy calificado, trabajo laborioso, impropio en lugares con una rutina voluminosa y pocos empleados poco calificados.La muestra no se debe refrigerar, ya que esto inmoviliza las larvas.

PROCEDIMIENTO:

1) Identificar la placa de agar con la muestra de heces a examinar. 2) Con la ayuda de baja-lenguas, colocar 1 g de heces en el centro de la placa. Si las heces

están duras o formadas, ablandar con unas gotas de agua destilada estéril. Tratar de que las heces queden extendidas lo más posible y en contacto con el medio de agar.

3) Tapar la placa. Incubar a 37° C por 24 horas. Pueden asimismo dejarse en un lugar protegido a temperatura ambiente, pero el tiempo de incubación se prolonga.

4) Antes de sacar las placas de la incubadora, ponerse los guantes. Sacar las placas y llevar a la mesa de trabajo.

5) Colocar una placa en el microscopio estereoscópico y sin destapar buscar caminos de larvas y/o larvas en la superficie del medio. Si se forma agua de condensación en la tapadera, limpiar ésta con papel absorbente y descartar en desinfectante. Volver a tapar y continuar.

6) Si no se observan caminos ni larvas, dejar en incubación otras 24 h. Al cabo de ese tiempo, volver a examinar en microscopio estereoscópico.

7) Verter formalina al l0% sobre la superficie del agar evitando el contacto con las heces. 8) Inclinar la placa y con una pipeta Pasteur aspirar la formalina y colocar en un tubo de ensayo

previamente identificado. 9) Centrifugar a 1,500 rpm durante 2 minutos. Decantar cuidadosamente el sobrenadante. 10) Recobrar el sedimento con otra pipeta y colocar en un porta-objetos, cubrir y observar al

microscopio óptico. 11) Identificar larvas presentes por morfología específica bajo objetivo 40X: cápsula bucal corta y

primordio genital grande para larvas rabdiformes; esófago largo y punta de la cola en forma de M para larvas filariformes de S. stercoralis.

El reporte no es cualitativo: deben recuperarse las larvas y diferenciarlas.

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MÉTODOS ESPECIALES PARA EL DIAGNÓSTICO DE LARVAS Y HUEVOS DE HELMINTOS

Aunque el examen microscópico de las heces es el método de diagnóstico mejor conocido para detectar parasitosis intestinales, las infecciones por nemátodos en las que se originan larvas que llegan al suelo a través de las heces pueden ser identificadas usando métodos de concentración o de cultivo. Los métodos de Baerman (usado en casos de estrongiloidiasis) y Harada-Mori y cultivo de nemátodos en placa para identificar uncinarias y Strongyloides se conocen y han sido usados desde hace tiempo. Las larvas de Strongyloides stercoralis son las más comunes en heces. Sin embargo,

dependiendo del tiempo del tránsito fecal a través del intestino y de la condición del paciente, larvas filariformes y rabditiformes también pueden estar presentes.La mayoría de laboratorios no tienen estas técnicas como de rutina pero a decir verdad, son relativamente baratas y simples de desarrollar. En general, los métodos de cultivo de larvas son útiles para revelar su presencia cuando están en bajo número, distinguir entre las infecciones por Strongyloides y las de uncinarias con base

en la morfología de la larva rabditoide y permitir el desarrollo de larvas filariformes para diferenciación posterior. Lo anterior aplica más cuando los huevos de las diferentes especies son idénticos y la separación específica depende de la morfología larval. En otras ocasiones, la biología del parásito es tan particular que se deben usar métodos diferentes a los comunes para tener mejor probabilidad de diagnosticar una parasitosis. Por ejemplo, la hembra adulta de Enterobius vermicularis (oxiuros) deposita sus huevos usualmente por la noche pero no en el lumen intestinal sino en el área perianal y debido a esto, los huevos rara vez se encuentran en las heces. Algunos de esos métodos son: Tamizado

Ocasionalmente es necesario examinar muestras de heces para buscar escólices y proglótides de céstodos o adultos de nemátodos y tremátodos para confirmar un diagnóstico, para diferenciar entre especies o para evaluar la efectividad del tratamiento. Con este fin se desarrolló el método de tamizado hace muchos años al cual se le considera un método mecánico de separación de partículas de regular tamaño que se encuentran en materias fecales, incluidos los estadíos y estructuras parasitarias arriba mencionados. En este método se utilizan tamices de diferente grosor que se colocan uno sobre otro en orden decreciente: el más grueso va arriba y el de menor grosor, abajo. Las heces se colocan en la parte superior y luego todo el sistema se coloca bajo el chorro de agua en el fregadero, deshaciendo las partes más gruesas con la ayuda de un bajalenguas. Cuando ya no quedan restos se revisa uno a uno cada tamiz y si en alguno de ellos se encuentran estructuras sospechosas, se toman con una pinza y se pasan a una caja de Petri con solución salina 0.85%. En ocasiones, especialmente cuando se trata de escólices, deberá usarse un microscopio estereoscópico para una adecuada revisión o aumentar el número de muestras examinadas por ejemplo en el caso de que la apólisis (desprendimiento de proglótides) no

suceda en el momento del examen. Una recomendación importante es el manejo adecuado de este material y el lavado escrupuloso de manos ya que se debe recordar que los huevos de Taenia solium y de Hymenolepis nana son infectivos y que existe el riesgo de cisticercosis. En todo caso, sería

mejor trabajar con heces preservadas previamente con formalina. La terapia con niclozamida o praziquantel frecuentemente deshace a los adultos por lo que los escólices y proglótides podrían ser difíciles de observar a menos que el paciente reciba un purgante salino inmediatamente después de la medicación. Aún con esto es comúnmente difícil

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identificar las estructuras sin tinción por lo que la identificación se puede hacer usando tinta china o la fluorescencia bajo la lámpara de Wood a 360 nm (esto si el paciente ha ingerido quinacrina) observándose los proglótides de color amarillo. Método de Graham.

Se basa en el raspado de la zona perianal con el fín de recuperar huevos de oxiuros (Enterobius vermicularis) y Taenia sp. principalmente, aunque presenta alguna efectividad también en la identificación de huevos de Ascaris, Trichuris e Hymenolepis.

Fue Heller en 1876 quien ideó el raspado anal para la obtención de huevos de oxiuros; más tarde en 1941 Graham introdujo su técnica de raspado con la cinta de celofán adhesivo. Mazzoti en 1946 recomendó esta técnica para la búsqueda de huevos de Taenia sp. La principal indicación que se da al paciente es que llegue temprano al laboratorio sin

haberse bañado ni defecado, con el fin de evitar el arrastre mecánico de los huevos y tener mayor probabilidad de encontrarlos. Se le coloca en posición genupectoral para exponer el ano y el periné y luego se hace un raspado suave de la zona con un bajalenguas al que se le ha adaptado un trozo de cinta adhesiva transparente . Finalmente la cinta se pega sobre una lámina portaobjeto y se observa al microscopio con objetivo 10x y 40x. Para aclarar la preparación se puede agregar xilol o tolueno a la lámina antes de pegar la cinta pero normalmente no es necesario ya que los huevos son hialinos y se observan muy bien. Se recomiendan por lo menos 4 exámenes seriados negativos consecutivos antes de considerar al paciente libre de infección. Estas preparaciones pueden guardarse en refrigeración por días o semanas, e incluso hasta por dos meses sin que sufran alteración. Método de Cultivo de Harada-Mori.

Este no es un método de cultivo con toda la extensión de la palabra. Es más bien un método a través del cual se verifica la evolución de los huevos o larvas de uncinarias, Strongyloides y Trichostrongylus en una pequeña cantidad de heces, con el fín de establecer diferencias entre especies. La técnica original de cultivo fue introducida por Harada y Mori en 1955 y después fue modificada por otros autores. La técnica requiere de una tira de papel filtro a la que se agrega material fecal y que luego se coloca dentro de un tubo de ensayo con una cierta cantidad de agua. La acción capilar del agua en el papel mantiene húmeda la preparación por lo que el nivel original debe ser repuesto constantemente si es necesario. La incubación en condiciones favorables (28ºC por 3-7 días en la oscuridad) favorece la eclosión de huevos y la evolución a larvas filariformes infectantes, con características propias de especies. Las muestras fecales para cultivo no deben refrigerarse ya que algunos parásitos como Necator americanus son

susceptibles al frío y podrían no llegar a desarrollarse. Una precaución importante que debe tomarse en cuenta es en el manejo de la tira de papel ya que las larvas infectivas de vida libre (filariformes) de Strongyloides pueden migrar tanto hacia abajo como hacia arriba en el papel.

Si las larvas son demasiado activas para observarlas al microscopio y no pueden distinguirse sus detalles morfológicos, se las puede matar en el tubo por aplicación de calor o usando unas gotas de solución de lugol o formalina. Las larvas infectantes pueden encontrarse en cualquier momento después del 4º día en una infección débil y aún, el día 1º si la infección es fuerte. Una desventaja de este método es que permite el desarrollo de larvas de nemátodos tanto parásitos como de vida libre por lo que NUNCA deben usarse heces contaminadas con agua o tierra. Si se tiene dudas acerca del origen de las larvas observadas en una prueba positiva, puede distinguirse entre unas y otras porque las parásitas son más resistentes a una acidez leve que las de vida libre. Para ello puede agregarse 0.3 ml de HCl concentrado por cada 10 ml de agua del tubo: las formas parásitas sobreviven por aproximadamente 24 horas mientras que las otras mueren instantaneamente.

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NOTA: cuando se busca específicamente Strongyloides stercoralis se recomienda incubar 8

días a 30ºC. Una técnica alternativa la constituye la modificación hecha por Little en 1966: se coloca material fecal en una tira de papel filtro del tamaño de una lámina portaobjetos estándar (1 x 3 plg), que se adhiere a una de ellas. La lámina se coloca inclinada en una caja de Petri con agua, de tal manera que un extremo quede sumergido y el otro no (esto se logra colocando un trozo de varilla de vidrio como soporte). El principio del método y los objetivos de realizarlos son los mismos que para el método original de Harada y Mori, pero la revisión de este sistema puede hacerse directamente con un microscopio de disección sin necesidad de hacer preparaciones o manipular la tira de papel. Método de cultivo en carbón granulado o de Loos. Es otra forma de cultivar larvas de uncinarias, Strongyloides y Trichostrongylus. La condiciones

de este método suministran a las larvas un medio ambiente óptimo para su desarrollo porque semeja las condiciones en la naturaleza. Sirve además para recolectar un número mayor de estadíos. Básicamente, la muestra debe cumplir los requisitos antes mencionados (fresca, sin contaminación, etc) y las precauciones mínimas deben ser observadas al realizar el proceso. Se hace una suspensión gruesa de heces que se mezcla con pedazos pequeños de carbón vegetal a manera de que queden cubiertos con la suspensión y no que se vaya hacia el fondo de la placa de Petri en que se coloca. Es mejor si a la placa se le coloca un círculo de papel filtro humedecido y si se incuba en la oscuridad a temperatura ambiente. Es necesario aplicar parafina en el borde de la caja para sellarla y evitar así que las larvas escapen del interior. A partir del 3º - 5º días ocurre la eclosión de los huevos. Las larvas se desplazan en todas direcciones en busca de humedad y es por eso que se acumulan en las gotas de condensación formadas en la tapa, siendo este el lugar de donde deben recogerse con pipetas Pasteur para observar al microscopio con objetivo 10x. Una variación del método anterior es el cultivo de Clemente-Pereira, en el cual se utiliza tierra vegetal en lugar de carbón. Se coloca una capa de tierra calentada a 60ºC y se agrega una suspensión gruesa de las heces de manera uniforme sobre ella. Puede usarse una segunda capa de tierra con el fín de retardar el crecimiento de hongos filamentosos. La caja se humedece si es necesario y se sella, se incuba y revisa de la misma manera que en el método de Loos. Método de Baermann y Morais.

La técnica de Baermann se basa en el principio de que las larvas activas, principalmente las de Strongyloides, se movilizan de la muestra de heces hacia el líquido que está a una mayor temperatura ( termotropismo positivo ). La principal diferencia entre este método y el de Harada-Mori y el de Little es la mayor cantidad de heces usada, mejorando sensiblemente la posibilidad de recuperar larvas en una infección leve, además de que también es aplicable a muestras de suelo y tejido macerado. Baermann diseñó este método en 1917 para recuperar larvas de uncinarias del suelo. En 1922, Cort et al. modificaron el método colocando una malla de alambre sobre el embudo y usaron

agua caliente en lugar de agua a temperatura ambiente que se describía en la técnica original. Se utiliza además en microbiología agrícola para obtener larvas de vida libre de plantas y en medicina se le puede usar también para aislar larvas de Trichinella spiralis después de la

digestión de músculo infectado. Podría ser necesario examinar más de una muestra en un período de 7 a 10 días en individuos con estrongiloidiasis latente. Debido a que las personas con enfermedades o tratamientos clínicos inmunodepresores tienen mayor riesgo de desarrollar autoinfección interna, también es de gran significado la detección de este síndrome.

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El medio líquido y el calor atraen a los parásitos en forma singular, sedimentándose la mayoría en el término aproximado de una hora. Basta retirar la primera porción abriendo la llave y recogiendo el líquido en un tubo cónico que luego puede centrifugarse para concentrar aún más las larvas. Es especialmente útil en casos donde hay sospecha de la enfermedad pero el examen directo y el concentrado han sido negativos. Todas las consideraciones ya mencionadas en los otros métodos para revisión y/o cuidados necesarios son aplicables a este, pero además se debe evitar el salpicar con el material que se recoge del tubo plástico. Para los objetivos que se ha destinado prácticamente no tiene limitaciones.

Método de Cultivo en Placa.

También se pueden usar placas de agar para intentar el aislamiento y diagnóstico y ha demostrado ser mucho más sensible que otros métodos en algunas ocasiones. La muestra se coloca directamente sobre el centro del agar, la placa se sella con parafina y se incuba 2 días a temperatura ambiente. Se da la peculiaridad de que las bacterias crecen sobre el agar y esto favorece el reconocimiento por los trazos que las larvas en movimiento dejan sobre él. Si la revisión permite sospechar la presencia de larvas, se puede lavar la superficie del agar con formalina 10% y observar este material bajo el microscopio en 10x. Existen varios tipos de agar que han demostrado ser útiles para este fín pero la fórmula más apropiada es la siguiente: agar 1.5%, extracto de carne 0.5%, peptona 1.0% y NaCl 0.5 %.

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PRÁCTICA № 18

MÉTODOS PARA LA ESTIMACIÓN DEL NÚMERO DE HUEVOS DE HELMINTOS.

OBJETIVOS

a) Interpretar el grado o intensidad de una infección parasitaria intestinal, por medio del conteo de huevos que son expulsados en las materias fecales.

b) Describir calcular el número aproximado de helmintos que alberga una persona, ya que esto tiene importancia para determinar la gravedad del proceso parasitario, así como establecer la eficacia de los medicamentos antihelmínticos.

MATERIALES TRAIDOS POR EL ESTUDIANTE: Muestras de heces positivas a huevos de geohelmintos (INDISPENSABLE) Guantes de látex: ACTIVIDAD #1: Método del frotis no estandarizado de Beaver o método directo en frotis de heces.

Esta técnica se basa en la observación de que las partículas, incluyendo los huevos de helmintos, se encuentran distribuidos en las heces de tal manera que una serie de preparaciones directas de igual densidad, contienen estadísticamente igual número de huevos. El procedimiento toma en cuenta la densidad de la preparación fecal, de tal manera que del número de huevos contados se pueda calcular el número por gramo de heces al multiplicarlo por un factor determinado. Se cree que en una preparación bien hecha, en el examen directo al fresco se toman 2 mg. de heces formadas, equivalentes a 1/500 de gramo o sea, un factor de 500.

Procedimiento: a) Identificar el portaobjeto con la muestra a examinar. b) Colocar 1 gota de solución salina en cada uno de los extremos de la lamina. c) Con un aplicador hacer preparaciones directas de heces como tradicionalmente lo hace. d) Cubrir con cubreobjeto. e) Observar en 10X y contar los huevos en cada preparación de cada helminto que observe y saque

la media. f) Multiplicar el número de huevos por 500 y reportar No. De huevos por gramo de heces.

Causas de Error:

Preparación muy gruesa o fina.

Observación no sistematica de la preparación.

Falta de práctica en ejecutar conteos.

Huevos no distribuidos al azar o aglomerados por la presencia de mucho moco.

Heces liquidas. ACTIVIDAD #2: Método de Conteo Directo de Kato.

Martin y Beaver (1968. Am J Trop Med Hyg, 17:382) aplicaron la técnica del frotis grueso de Kato al conteo de huevos de helmintos. Este método ofrece la oportunidad de detectar ciertas formas de parásitos cuando no se observan en el examen directo al fresco. Es una técnica indicada para examinar relativamente mayores cantidades de heces; es apropiada para detectar huevos de helmintos pero no para protozoarios o larvas de helmintos. Las heces deben estar libres de fibras o gas para que el método dé resultado.

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Procedimiento: 1. Colocar 50 a 60 mg de heces sobre un portaobjetos limpio de 3 x 2” y cubrir con un trozo de

papel celofán absorbente previamente humedecido en la solución de Kato. 2. Comprimir la preparación con un tapón de hule No. 4. 3. Dejar secar la muestra a temperatura ambiente por una hora o en una estufa a 40º C por 20 a 30

min. 4. Examinar al microscopio con el objetivo seco débil (10X) ; el objetivo 45X puede ser usado para

una mejor identificación de los huevos de helmintos.

NOTA: Conforme la preparación se seca, las heces se clarifican más rápidamente que los huevos, pero estos también se clarificarán; por lo tanto el tiempo de reposo debe regularse bajo diferentes condiciones y con la experiencia. En preparaciones demasiado secas se forman burbujas de aire en donde huevos delicados como los de uncinarias desaparecen fácilmente de la preparación. El número de huevos de cada helminto encontrado se multiplica por 20 para obtener el número total por gramo de heces (por haberse tomado aproximadamente 50 mg. de material fecal). De acuerdo con Martín y Beaver, el mismo resultado se obtiene con heces pesadas que con heces cuyo peso se haya estimado.

ACTIVIDAD #3: Método de KATO-KATZ (OVO-FEC).

Katz y col. ( J Rev Ins Med Trop Sao Paulo, 14:397, 1972), modificaron el método tradicional del frotis grueso de Kato para el conteo directo de huevos de helmintos. El método es cualitativo o semi cuantitativo más sensible que otros y es altamente reproducible porque se utiliza una placa perforada de plástico o cartón que permite que siempre sea examinada la misma cantidad de heces, sin necesidad de que, la cantidad de muestra se pese en una balanza ( 50 mg. aproximadamente).

Por medio de este método es posible el recuento o diagnóstico de huevos de los siguientes helmintos: Ascaris, uncinarias, Trichuris, Enterobius y Schistosoma. Los huevos de Taenia sp e Hymenolepis nana se informan sin contar.

VENTAJAS:

Las heces no se diluyen, se utiliza materiales baratos y accesibles, puede transportarse una vez preparado en el campo, puede guardarse varios meses para verificar resultados, puede estandarizarse para encuestas en diferentes regiones geográficas por diferentes investigadores. DESVENTAJAS:

Tiene varias limitantes: sólo puede utilizar heces frescas; no es adecuada para heces diarreicas, líquidas o mucoides; no se aplica para la detección de protozoos ni larvas de nemátodos; huevos frágiles como los de uncinaria y a menudo de Hymenolepis nana se vuelven irreconocibles en pocas horas; no es indicado para heces que contengan mucha fibra o grasa.

Procedimiento: 1. Colocar con la espátula de plástico o aplicador de madera la cantidad de heces equivalente al

tamaño de un frijol, sobre papel filtro o papel higiénico. 2. Depositar sobre las heces la tela de Nylon (filtro Fec) o metálica y presionarla con la espátula. 3. Con el extremo de la espátula, recoger las heces que pasaron a través de la malla de nylon. 4. Depositar las heces con la espátula en el orificio de una placa perforada de plástico (o de cartón)

que ya deberá estar sobre un portaobjeto de 3 x 1½” comprimiendo las heces en el orificio de la placa hasta llenarlo completamente.

5. Pasar el borde de la espátula sobre la placa perforada para retirar el exceso de heces. Descartar

la tela de Nylon, el papel filtro o higiénico y la espátula.

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6. Levantar un extremo de la placa perforada, retirarla cuidadosamente y descartarla; debe quedar un cilindro de heces sobre la lámina portaobjetos.

7. Colocar sobre el cilindro de heces una cinta de papel celofán de 25 x 30 mm. previamente

impregnada con reactivo de Kato. 8. Invertir la preparación sobre papel filtro o higiénico y comprimirla suavemente. 9. Nuevamente invertir la preparación y dejarla en reposo durante 1 hora a temperatura ambiente. 10. Contar al microscopio con objetivo 10X todos los huevos encontrados en la preparación (frotis

grueso) y multiplicar por 24(factor)para obtener el número de huevos por gramo de heces. ACTIVIDAD #4: Método por dilución de Stoll.

Este método permite obtener bastante aproximado el número de huevos de helmintos por gramo de materias fecales y por consiguiente el número de helmintos adultos, que alberga en el intestino una persona. En realidad los resultados obtenidos deben anotarse como huevos por ml y no por gramo; sin embargo resulta bastante exacto para fines prácticos.

Procedimiento: 1. Llenar el frasco de Stoll hasta la marca de 56 ml con hidróxido de sodio 0.1 N. 2. Agregar suficiente cantidad de heces para que el volumen llegue hasta la marca de 60 ml. 3. Se agregan de 6 a 8 perlas de vidrio y se tapa el frasco con tapón de hule No. 4. 4. Dejar reposar por unos minutos para que se reblandezcan las heces cuando están muy duras. 5. Agitar vigorosamente durante un minuto hasta obtener una suspensión homogénea. Debe

evitarse movimiento circular ya que esto podría concentrar los huevos en una región pequeña de la suspensión, falseando así los resultados. Rutinariamente es preferible llevar el procedimiento hasta este punto por la tarde y dejar en reposo el frasco hasta la mañana siguiente pues así se liberan de los restos fecales una mayor cantidad de huevos. Al siguiente día se agita nuevamente y se continúa con el procedimiento.

6. Inmediatamente después de agitarse deben tomarse 0.15 ml con una pipeta de Stoll provista de un bulbo de hule, pasando la totalidad del contenido de la pipeta a un portaobjeto de 3 x 1½” y se cubre con laminilla cubreobjeto 22 x 40 No. 2. Es fundamental que esta operación sea realizada rápidamente pues los huevos comienzan a sedimentarse inmediatamente después que se suspende la agitación. La punta de la pipeta debe llevarse al centro del frasco para evitar así el error debido a la precipitación.

7. Se cuentan todos los huevos presentes en la preparación utilizando el objetivo de bajo poder (10X) y moviendo el carro del microscopio en un orden sistemático de manera que se examine totalmente la preparación.

CALCULO: Se multiplica por 100 el número de huevos obtenido y se tendrá el número total por gramo de

heces sólidas. Para heces pastosas multiplicar el número de huevos obtenidos por el factor de corrección 2 y para heces líquidas por el factor 4, ya que es evidente que un cierto volumen de heces duras contiene mas material fecal y huevos que un volumen equivalente de heces blandas o líquidas , que representan muestras diluidas.

Ejemplo:

En una muestra de heces pastosas se verifica conteo de huevos de nemátodos por el método de Stoll, encontrándose 18 huevos de Necator americanus. Calcular el número total de gusanos adultos.

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Datos que se utilizan:

1. Factor de dilución del método de Stoll: 100. 2. Ovipostura diaria de Necator americanus (aproximadamente 9000 por hembra). 3. Evacuación de heces por el humano adulto en 24 horas: aproximadamente 200 gramos.

CALCULO:

1. Número de huevos contados (18) por el factor de dilución (100) = Número de huevos por gramo

de heces (sin corrección) 1800.

2. 1800x 2 (Factor de heces pastosas) = 3600 huevos por gramo de heces.

3. 3600x 200 (Evacuación diaria de heces en gramos por el humano adulto) = 720,000 huevos por día.

4. 720,000 (Numero de huevos por 24 horas) entre 9000 (Ovipostura diaria del parásito) = 80

gusanos hembras.

5. Se estima que por cada gusano hembra hay un macho, por lo que para obtener el numero total de gusanos adulto, basta multiplicar por 2 en número de gusanos hembras encontrados:

80 x 2 = 160 gusanos adultos.

MÉTODOS PARA EL RECUENTO DE HUEVOS DE HELMINTOS La carga de morbilidad causada por los helmintos transmitidos por contacto con el suelo o HTS (= geohelmintos) es enorme. Según la OMS, representan más del 40% de la carga mundial de todas las enfermedades tropicales, exceptuando la malaria. Las infecciones geohelmínticas y la esquistosomiasis causan morbilidad y a veces muerte al afectar el estado nutricional, afectar los procesos cognoscitivos, causar complicaciones que requieren cirugía e inducir reacciones en los tejidos de los individuos por lo que los países afectados y las organizaciones mundiales buscan y necesitan aplicar medidas de control. Para monitorear las actividades de control se deben calcular tanto la prevalencia (porcentaje de individuos infectados en una población de muestreo) como la intensidad de la infección en cada paciente por los geohelmintos conocidos, a saber: Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura y uncinarias (Necator americanus y Ancylostoma duodenale). Esto se logra debido a que los

huevos son emitidos en las heces de una manera más o menos constante. La aproximación que se obtiene permite entonces clasificar a las infecciones como leves, moderadas o severas.

Umbrales de intensidad para infecciones leves moderadas e intensas con Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura y uncinarias.

Helminto

Umbral de intensidad

Leve Moderada Intensa

Ascaris lumbricoides 1 – 4,999 hpg 5,000 – 49,999 hpg ≥ 50,000 hpg

Trichuris trichiura 1 – 999 hpg 1000 – 9,999 hpg ≥ 10,000 hpg

Uncinarias 1 – 1,999 hpg 2,000 – 3,999 hpg ≥ 4,000 hpg

[120]

Los momentos específicos en los cuales la información de la carga parasitaria es útil son: cuando se está determinando la intensidad de la infección, decidiendo una posible quimioterapia y cuando se evalúa el efecto de una droga ya administrada. Debido a la efectividad lograda por las actuales terapias, ya NO es tan relevante evaluar el número de adultos con base en el recuento de huevos, esto especialmente en países desarrollados. Sin embargo, en algunas zonas geográficamente aisladas y de bajo nivel socioeconómico, el uso de estos métodos puede aún ser necesario. Se debe hacer hincapié en que los recuentos de huevos son datos estimados y que siempre

se obtendrán variaciones en los resultados independientemente de cuan cuidadoso se haya sido en seguir el procedimiento. Si dos o más muestras están siendo comparadas es mejor que la técnica sea realizada por la misma persona y que se hagan recuentos múltiples ya que como se dijo, siempre están sujetos a error. Cualquier muestra de heces fresca y que no haya sido refrigerada puede ser usada. Como ya se dijo, es mejor que los recuentos sean hechos en la misma muestra y que es preferible que la terapia se base en una serie de ellos más que en uno solo aislado. Cuando no se recuperan huevos de nemátodos no puede exluirse la posibilidad de infección. Sin embargo la probabilidad de que esto ocurra es muy baja cuando los resultados son negativos. Método directo de Beaver

Es el más fácil de usar y es razonablemente preciso cuando lo realiza un técnico experimentado. En el método original, Beaver usó una celda fotoeléctrica calibrada para preparar un frotis de exactamente 2 mg. Con fines de rutina resultó ser impráctico y el método posteriormente se modificó preparándose un frotis con la cantidad de heces que puede recogerse con la punta de un aplicador de madera (aprox. 2mg). Se reporta el conteo de huevos por frotis y además se debe hacer el cálculo correspondiente para determinar el número de huevos por gramo de heces. Método de Stoll.

Es un método de dilución y probablemente el más usado para determinar la carga parasitaria. Ya que pesar una cantidad específica de heces es impráctico, esta técnica utiliza una muestra volumétrica, es decir, una cantidad de heces que en virtud de su peso desplaza un volumen de líquido fácilmente medible. Se usa hidróxido de sodio como diluente debido a que saponifica las grasas, libera los huevos atrapados en los detritos y vuelve la suspensión más clara de lo que la vuelve el agua . Se requiere del uso de frascos especiales que se encuentran en el mercado. Los frascos tienen un cuello largo con dos líneas que marcan los 56 y 60 ml, para facilitar el llenado apropiado con hidróxido de sodio 0.1 N y material fecal, respectivamente. Se agregan al frasco unas cuantas perlas de vidrio para facilitar la homogenización; si la muestra es dura, la mezcla debería ser colocada en el refrigerador toda la noche antes de mezclar para homogenizar la suspensión. Debe recomendarse que NUNCA se agite el frasco en forma circular ya que se pueden concentrar los huevos en un área pequeña, falseándose los resultados. Se toman 0.15 ml con una pipeta calibrada y se colocan en una lámina que NO se cubre con laminilla, y se cuentan todos los huevos. El número obtenido se multiplica por cien para obtener el número de huevos por gramo de heces. El estimado obtenido del número de huevos por gramo varía en función de la consistencia de las heces por lo que deben usarse siempre heces formadas o semiformadas, y en su defecto, se debe usar un factor de corrección. El conteo en muestras líquidas no es confiable debido a que se desconoce cuan diluido está el número real de huevos .

[121]

El método de Stoll no pretende dar el número exacto de vermes pero sí una aproximación que permita clasificar la intensidad de la infección en leve, moderada y severa. El método original recomendaba pesar la muestra pero esto se modificó porque se demostró que 1 cc de heces blandas pesa entre 1.03 y 1.04 gm y que 1cc de heces sólidas pesa de 1.05 a 1.07. Por esto puede estimarse el número de huevos por gramo de heces sin introducir un error apreciable. El cáculo se basa en que 4 cc de heces suspendidos en un volumen de 56 cc corresponden a una dilución 1:15 y si se toman 0.15 cc de la suspensión realmente se están tomando 0.01 cc de heces equivalentes a 0.01 gm de las mismas. Entonces para obtener el número de huevos por gm de materia fecal, se multiplica el recuento por 100 o por 200, si en lugar de tomar 0.15 se toman 0.075 cc de supensión. Por observaciones experimentales se han obtenido los siguientes factores de corrección según la consistencia de la muestra:

Heces duras : multiplicar el conteo por 1 Heces pastosas: “ “ 2 Heces líquidas : “ “ 3

Método de Kato-Katz.

Este es el método más recomendable en la actualidad y el que prefiere la OMS tanto en estudios diagnósticos individuales como para investigaciones epidemiológicas. Es sencillo, rápido, tiene bajo costo y funciona muy bien en las investigaciones de campo para detectar nemátodos transmitidos a través del suelo (geohelmintiasis). Las ventajas de este método sobre el examen coprológico corriente son que se examinan 50 mg de materia fecal y que es cuantitativo. Se recomienda que se haga de rutina en los laboratorios de diagnóstico de salud pública pues es tan efectivo como un método de concentración por la cantidad de material fecal examinada. Por otra parte las heces no se diluyen, utiliza materiales baratos y accesibles, puede transportarse para verificar resultados y también puede estandarizarse para obtener resultados comparables con muestras de diferentes regiones geográficas por diferentes investigadores. Sin embargo también adolesce de ciertas desventajas como: no es adecuado para muestras líquidas, blandas o mucoides, con fibra o grasa; no se aplica a la detección de protozoarios o larvas; debe trabajarse y revisarse rápido ya que los huevos frágiles como los de uncinarias se vuelven irreconocibles en pocas horas. La efectividad de la terapia antihelmíntica puede ser evaluada por este método como ya se dijo pero debido a que una carga excesiva de Ascaris lumbricoides generalmente requiere de

cirugía y no de fármacoterapia, es sólo para tricocéfalos y uncinarias que el recuento ayuda en dicha evaluación. Por ejemplo, 30.000 huevos de Trichuris trichiura por gm de heces indica la

presencia de algunos cientos de gusanos que definitivamente pueden causar síntomas y por otra parte, de 2.500 a 5.000 huevos por gm usualmente indica una infección clínicamente significativa por uncinarias

[122]

PRÁCTICA № 19

DIAGNOSTICO DE FILARIAS.

PRIMERA PARTE: ESTUDIO DE Wuchereria bancrofti y Onchocerca volvulus

OBJETIVOS

Al finalizar las actividades propuestas esperamos que usted podrá: a) Explicar la morfología de las microfilarias de estos dos parásitos y las formas adultas de

algunas filarias tanto macroscópicamente como en tejido. b) Reconocer oncocercomas obtenidos de tejido subcutáneo y a los insectos vectores.

ACTIVIDAD #1: Reconocimiento de microfilarias. Observe, dibuje y describa las microfilarias colocando el mayor número de diferencias morfológicas y biológicas que pueda. Compare el origen de la muestra en cada una y cómo debe hacerse el diagnóstico con las técnicas respectivas

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

a)____________________________________ a) ____________________________________ b)____________________________________ b) ____________________________________ c) ___________________________________ c) ____________________________________ d) ___________________________________ d) ____________________________________

Wuchereria bancrofti Onchocerca volvulus

[123]

ACTIVIDAD #2: Reconocimiento de oncocercomas. Revise las piezas histológicas de la mesa de demostración. Con esas muestras clínicas puede hacerse diagnóstico a través de:

__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ ACTIVIDAD #3: Observe y dibuje a los respectivos vectores de los agentes en estudio.

__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

Resuma las características morfológicas en que usted repara para tratar de identificar la especie cuando encuentra una microfilaria en sangre. ____________________________________________________________________________________

____________________________________________________________________________________

____________________________________________________________________________________

____________________________________________________________________________________

Frotis por aposición, Giemsa Corte histológico, HE

Vector de W. bancrofti Vector de O. volvulus

[124]

SEGUNDA PARTE: DIROFILARIA IMMITIS Y METODOS PARASITOLOGICOS PARA EL

DIAGNOSTICO DE LAS FILARIAS OBJETIVOS. Al final de las actividades propuestas, esperamos que usted podrá:

a) Explicar con ayuda del microscopio cortes transversales del parásito en tejidos. b) Explicar el fundamento del método de concentración de Knott para microfilarias.

ACTIVIDAD #1: Observación de adultos y larvas en los respectivos hospederos.

Esquematice y describa lo que se observa del parásito en el:.

Hospedero definitivo (perro)

Hospedero intermediario (humano)

____________________________________________________________________________________

____________________________________________________________________________________

____________________________________________________________________________________

ACTIVIDAD #2: Técnica de concentración de Knott para microfilarias.

Esta técnica es adecuada para demostrar la presencia de microfilarias cuando se encuentran en un pequeño número y es recomendable para efectuar encuestas sobre filariasis. La microfilaria por este método se fija y por lo tanto se puede efectuar su estudio en cualquier momento posterior.

Se utilizada sangre venosa citratada, heparinizada o EDTA. Técnica:

1. Obtenga 1 ml de sangre por punción venosa o utilice la sangre de perro que se le ha proporcionado.

2. Mezcle con 9 ml de solución acuosa de formalina al 2% en un tubo de ensayo para iniciar la hemólisis.

3. Agitar y centrifugar por 2 a 5 minutos a 1500 r.p.m. 4. Descarte el sobrenadante sin perturbar el sedimento. 5. Usando una pipeta Pasteur transfiera una porción del sedimento a una lámina limpia.

Colocar cubreobjeto y examinar al microscopio con objetivo 10X. Esta muestra puede ser observada directamente al microscopio con alguna de los colorantes intravitales, o bien pueden dejarse secar al aire y fijarla con alcohol-éter, para luego colorear con Giemsa. Se puede colocar en un portaobjetos 0.1 ml del sedimento para obtener el número de microfilaria por centímetro cúbico.

[125]

Morfología de una microfilaria

Características de la microfilarias humanas. A Wuchereria bancrofti. B: Brugia malayi. C: Onchocerca volvulus. D: Loa loa. E Mansonella perstans. F: Mansonella streptocerca. G: Manzonella ozzardi.

[126]

PRÁCTICA № 20

DIAGNOSTICO DE CÉSTODOS.

OBJETIVOS.

a) Interpretar las características morfológicas de las diferentes especies de cestodos en base al estudio comparativo de los estadíos proporcionados: adultos, huevos y larvas (cuando aplique)

MATERIALES TRAIDOS POR EL ESTUDIANTE. Muestras de heces (humanas o de animales) positivas a huevos de helmintos de preferencia cestodos Guantes de látex ACTIVIDAD #1: Identificación de Hymenolepis nana e Hymenolepis diminuta.

Observación de escólices. Su instructor le entregará escólices en láminas permanentes coloreadas con carmín clorhídrico. Identifique la presencia de ganchos, que es una de las características que permiten distinguir entre las especies del género.

H. nana H. diminuta

Observación de los huevecillos. A partir de las muestras de heces preservadas realice preparaciones y obsérvelas al microscopio. Observe el color, forma, embrión hexacanto, presencia de filamentos polares y las proyecciones que presenta la capa interna de los huevecillos según la especie.

H. nana H. diminuta

[127]

Escriba géneros de vectores para cada una de las especies anteriores ______________________

_______________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________

ACTIVIDAD #2: Identificación de Taenia saginata y Taenia solium

Observe las preparaciones permanentes de escólices teñidas con Carmín (demostración). Identifique las estructuras principales e identifíquelas con el nombre correcto. Haga un dibujo.y anote diferencias.

T. solium T. saginata

a)__________________________________ a)_________________________________

b)___________________________________ b)_________________________________

c)___________________________________ c)_________________________________

Realice lo anterior con los proglótidos grávidos. Obsérvelos al microscopio con objetivos de 4X. Identifique tamaño, número de ramificaciones uterinas y posición del poro genital. Anote diferencias.

T. solium T. saginata

a)__________________________________ a)_________________________________

b)___________________________________ b)_________________________________

c)___________________________________ c)_________________________________

Revise los cisticercos de T.solium tanto los preservados en formalina como las preparaciones teñidas en carmín clorhídrico.Descríbalos e identifique las estructuras internas del cisticerco y haga mención de cómo se reconoce la especie.

[128]

Cisticerco al fresco Cisticerco teñido, Carmín clorhídrico

a)__________________________________ a)_________________________________

b)___________________________________ b)_________________________________

c)___________________________________ c)_________________________________

Realice preparaciones a partir de las muestras de heces con huevecillos.

______________________________________

______________________________________

______________________________________

______________________________________

Al ver este huevo su reporte final es_____________

___________________________________________

___________________________________________

ACTIVIDAD #3: Identificación de Dipylidium caninum y Echinococcus granulosus

Observe las preparaciones permanentes de escólices teñidas. Identifique las estructuras principales e identifíquelas con el nombre correcto. Haga un dibujo.y anote diferencias.

D. caninum E. granulosus

[129]

a)__________________________________ a)_________________________________

b)___________________________________ b)_________________________________

c)___________________________________ c)_________________________________

Indique si el humano es hospedero definitivo y/o intermediario de los agentes anteriores y porqué _____ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ Qué característica notable del adulto de Echinococcus utilizaría para diferenciarlo de cualquier otro cestodo? ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ Realice lo anterior con las preparaciones al fresco de heces. Obsérvelas al microscopio con objetivos de 4X, 10X y 40X. Identifique tamaño y otras características diferenciales. Anótelas.

D. caninum E. granulosus

a)__________________________________ a)_________________________________

b)___________________________________ b)_________________________________

c)___________________________________ c)_________________________________

Observe en las láminas permanentes la morfología del quiste hidatídico que producen Echinococcus spp. Dibuje y describa sus componentes

____________________________________

____________________________________

____________________________________

____________________________________

______________________________________

______________________________________

____________________________________

[130]

ACTIVIDAD #4: Identificación de Inermicapsifer madagascariensis

Observe las preparaciones al fresco de estadios preservados en formalina. Identifique las estructuras principales e identifíquelas con el nombre correcto. Haga un dibujo.y anote diferencias.

Proglótidos Cápsula ovígera

a)__________________________________ a)_________________________________

b)___________________________________ b)_________________________________

c)___________________________________ c)_________________________________

TAREA: Esquematice el ciclo vital de Taenia solium y de Hymenolepis diminuta LECTURAS RECOMENDADAS: Parasitología clínica / Beaver cap 29.; Atlas de parasitología humana /Ash. Pags 334 – 371, Microbiol y Parasitol Médicas III, cap 119 (ed. Cubana).

[131]

PRÁCTICA № 21

DIAGNÓSTICO DE TREMÁTODOS

OBJETIVO: Explicar la morfología externa e interna de algunos tremátodos digeneos de interés humano, haciendo énfasis en los estadíos y técnicas de diagnóstico. ACTIVIDAD #1: Estudio de Schistosoma mansoni. Estudie la preparación con adultos de S. mansoni. Identifique la hembra y el macho y señale solo lo que usted realmente identifica, haciendo hincapié en sus diferencias. Recuerde anotar los tamaños aproximados

Hembra Macho

a)__________________________________ a)_________________________________

b)___________________________________ b)_________________________________

c)___________________________________ c)_________________________________

Observe las preparaciones de huevecillos de S. mansoni en formalina con los objetivos de 10x y 40x. Identifique además la morfología y reacción inflamatoria que estos presentan en cortes histológicos teñidos. Haga la descripción correspondiente.

10x 40x Corte histológico

[132]

a)__________________________________ a)_________________________________

b)___________________________________ b)_________________________________

c)___________________________________ c)_________________________________

d)___________________________________ d)_________________________________

Observe el corte histológico de hígado de ratón con adultos de S. mansoni y dibuje esquemáticamente las principales estructuras identificadas.

_____________________________________

_____________________________________

_____________________________________

________________________________ ____

______________________________________

______________________________________

____________________________________

ACTIVIDAD #2: Estudio de Fasciola hepatica. Dibuje y describa el ejemplar adulto de Fasciola hepatica preservado en formalina,y teñido con carmín. haciendo referencia a la forma, tamaño y posición de las ventosas. En el ejemplar teñido observe los ciegos intestinales, los genitales femeninos, el aparato excretor y las glándulas vitelinas.

Formalina Teñido

a)__________________________________ a)_________________________________

b)___________________________________ b)_________________________________

c)__________________________________ c) ________________________________

[133]

Observe las preparaciones permanentes de huevecillos de Fasciola hepatica y haga las descripciones correspondientes

_____________________________________

_____________________________________

_____________________________________

________________________________ ____

______________________________________

______________________________________

____________________________________

TAREA: Esquematice el ciclo de vida de Fasciola hepatica nombrando sus estadios y hospederos

[134]

ACTIVIDAD #3: Estudio de Clonorchis sinensis. Observe y dibuje esquemáticamente, sólo lo que Ud. realmente observa y describa con sus términos lo que corresponde al ejemplar adulto de Clonorchis sinensis.

__________________________________

__________________________________

__________________________________

__________________________________

__________________________________

__________________________________

__________________________________

__________________________________

Su instructor le entregará una muestra de heces preservada con huevecillos de C. sinensis. Dibújelos con menor y mayor aumento haciendo notar sus detalles más característicos.

10X 40X

________________________________________ __________________________________________

________________________________________ __________________________________________

ACTIVIDAD #4: Estudio de Paragonimus mexicanus. Dibuje al adulto teñido de P. mexicanus y los correspondientes huevecillos en esputo o aspirado bronquial.

Adulto Huevecillos

[135]

a)__________________________________ a)_________________________________

b)___________________________________ b)_________________________________

c)___________________________________ c)_________________________________

Su instructor le entregara cortes histológicos. Describa al parásito y la reacción inflamatoria producida.

____________________________________

____________________________________

____________________________________

____________________________________

______________________________________

____________________________________

TAREA: Esquematice el ciclo de vida de Paragonimus mexicanus. LECTURA RECOMENDADA: Parasitología Clínica / Beaver cap 26.

[136]

PRÁCTICA № 22

MÉTODOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE HELMINTOS.

MÉTODOS DE FIJACIÓN, CLARIFICACION Y TINCIÓN DE HELMINTOS.

Para la identificación y estudio de los helmintos parásitos se han ideado algunos métodos, con el fin de colectarlos de sus huéspedes. Entre los más importantes podemos citar:

1. Eliminación debida a la administración de un helminticida. 2. Por biopsia de órganos parasitados. 3. Por medio de la extirpación quirúrgica como en los casos de cisticercosis, oncocercosis e

hidatidosis. 4. Por necropsia, que es talvez el más útil, porque permite obtener el parásito intacto.

OBJETIVO: Al finalizar el estudiante será capaz de: Explicar los procedimientos que se utilizan para el diagnóstico de especímenes adultos y estadios de nematodos para que basados en la morfología de estos, pueda identificarlos adecuadamente.

DESARROLLO A. Búsqueda de cisticercos en carnes infectadas.

Buscar cuidadosamente cisticercos haciendo pequeños cortes con un bisturí en músculos y vísceras frescas, ayudándose para ello de una pinza. Los cisticercos aparecen como pequeñas vesículas llenas de líquido blanquecino que sobresalen del tejido muscular. Tómelos suavemente con la pinza sin garra y colóquelos en una base de caja de Petri con solución salina 0.85%, permita la relajación de los cisticercos y déjelos en el fijador por 2 a 3 días antes de colorear.

B. Recuperación de proglótidos y escólices de tenia en heces.

Este procedimiento también puede ser aplicado para la separación de pequeños nemátodos y tremátodos. Procedimiento:

1. Mezcle una muestra de heces de 24 horas (frescas o preservadas con formalina al 10%) con

agua hasta obtener una suspensión homogénea.

2. Filtrar pequeños volúmenes de la suspensión a través de una malla o gasa doblada en dos.

3. Agregar agua sobre la gasa en que se hizo el filtrado para eliminar pequeños detritos.

4. Examine los detritos contenidos en la gasa con una lupa para la búsqueda de escólices y

proglótidos.

5. Repetir los pasos 2 a 4 hasta terminar con toda la suspensión de heces.

6. Los proglótidos recuperados se pueden colocar en solución salina 0.85%.

C. Examen de proglótidos al fresco.

1. Coloque un proglótido en una lámina 3x1 ½”. Coloque cuidadosamente otro portaobjetos

sobre el especimen.

[137]

2. Sujete las láminas con dos bandas de hule en sus extremos.

3. Examínelo con lupa o microscopio estereoscópico y determine el número de ramificaciones

uterinas y poro genital. Si se trata de un escólex observe la presencia de rostelo y ventosas.

D. Método de clarificación de helmintos

Mediante este proceso, se estudian rápidamente las estructuras externas e internas de los nemátodos. Los aclaradores más usados son: ácido acético glacial y glicerina pura. No es conveniente realizar la aclaración si el parásito se quiere teñir.

Procedimiento:

1. Colocar los pequeños helmintos entre porta y cubreobjetos (fijados o no).

2. Agregar una gota de ácido acético glacial por uno de los bordes del cubreobjetos.

3. Secar el exceso de ácido de los bordes con papel filtro.

4. Observar al microscopio moviendo el cubreobjetos para hacer girar el helminto en la posición

deseada. NOTA: Cuando la clarificación no es suficiente, puede repetirse la operación utilizando fenol puro o lactofenol en vez de ácido acético.

E. Coloración de proglótidos y cisticercos.

Las formas o estadíos de helmintos obtenidos de las cuatro formas que se explican al inicio de la práctica, se colocan en solución salina 0.85% para la relajación (la concentración varía según el animal de origen del parásito). Se pueden hacer varios lavados con solución salina 0.85%. El primer paso en la preparación de especimenes de helmintos es la fijación. Los helmintos una vez lavados se colocan en diferentes líquidos conservadores y según la coloración a seguir y del parásito del que se trate, existen diferentes técnicas de fijación.

a) Técnica para la fijación de helmintos.

1. Para nemátodos.

i) Sustituir la solución salina por líquido fijador caliente a 70ºC.

ii) Dejar enfriar y mantener el nemátodo en esta solución por 24 horas.

iii) Pasar los ejemplares a un medio conservador.

Nota: Pocas veces se necesita comprimir el nemátodo entre lámina y laminilla. Solamente en casos especiales como cuando se pretende identificar la bolsa copulatriz, boca o extremidad caudal del macho y de la hembra.

2. Tremátodos pequeños y formas larvales

i) Colocar el ejemplar con la ayuda de un pincel en el portaobjeto.

ii) Poner un cubreobjetos y agregar el fijador por una hora.

iii) La simple presión entre lámina y laminilla es suficiente.

[138]

3. Tremátodos grandes

i) Pasarlos de solución salina 0.85% a agua destilada.

ii) Colocar el ejemplar sobre un portaobjeto, hacer presión con ayuda de otro, o sujetar

y comprimir las láminas con bandas de hule y agregar el fijador por 24 horas.

iii) Quitar las bandas de hule y colocar el parásito en fijador por 12 horas.

iv) Pasarlos por alcohol al 70% con gránulos de carbonato de litio (si se usa Bouin) para

eliminar el fijador.

v) Separar y colocar los ejemplares en alcohol al 70% hasta efectuar su coloración.

4. Céstodos.

i) Colocar el parásito en un erlenmeyer, tapar la boca con una gasa sujetada con una

banda de hule.

ii) Poner el erlenmeyer en un chorro fino de agua del tubo y dejar así por lo menos 2

horas.

iii) Fijar el céstodo en sentido dorsoventral igual que en los tremátodos.

b) Coloracion de carmín

Tremátodos y céstodos.

1. Los ejemplares deben estar previamente fijados y colocados en alcohol al 70%.

2. Colocar el helminto en una placa de Petri con la solución colorante por un minuto cuando

son especies muy pequeñas y 15 minutos para las formas medianas y grandes.

3. Lavar en agua destilada.

4. Pasar en alcohol al 70% rápidamente para eliminar el exceso del colorante.

5. Diferenciar en alcohol clorhídrico (100 ml de alcohol de 70% y 0.5 a 1 ml de HCl

concentrado) hasta que se obtenga un contraste adecuado de las diferentes estructuras.

Esto puede durar entre 15 y 20 minutos.

6. Deshidratar durante 20 minutos en alcoholes de 70 a 95% y alcohol absoluto.

7. Diafanizar durante 20 minutos en cada uno de los siguientes pasos:

a) Tres partes de alcohol absoluto y 1 de salicilato de metilo b) 2 partes de alcohol absoluto y 2 de salicilato de metilo c) 1 parte de alcohol absoluto y 3 de salicilato de metilo, y d) Salicilato de metilo puro.

8. Montar en Bálsamo de Canadá, Permount o cualquier otra resina.

NOTA: Debido a la presencia de corpúsculos calcáreos, se recomienda pasar los céstodos previamente por ácido acético puro por 5 minutos y lavar en agua destilada antes de colorearlos.

Nemátodos.

1. Fijar en solución de Travassos o formalina caliente (70ºC).

[139]

2. Pasar directamente el ejemplar al ácido acético puro, previamente fijado o procedente del

líquido conservador.

3. Teñir con Carmín acético de Semichón concentrado durante 3 a 5 minutos para

nemátodos grandes.

4. Decolorar con ácido acético concentrado hasta que la cutícula sea transparente.

5. Neutralizar con alcohol de 70%, hacer varios cambios en este alcohol. El ejemplar debe

tener un color rosado.

6. Deshidratar 20 minutos en alcoholes de 70% - 95% y alcohol absoluto.

7. Diafanizar durante 20 minutos en cada uno de los siguientes pasos:

a) Tres partes de alcohol absoluto y 1 de salicilato de metilo b) 2 partes de alcohol absoluto y 2 de salicilato de metilo c) 1 parte de alcohol absoluto y 3 de salicilato de metilo, y d) Salicilato de metilo puro.

8. Montar en Balsamo de Canadá, Permount o cualquier otra resina.

MÉTODOS PARA LA FIJACIÓN Y TINCIÓN DE HELMINTOS La fijación adecuada de los helmintos es importante no sólo como procedimiento para un buen diagnóstico sino también como un medio de preservación de material para el entrenamiento de personal. Los parásitos que se encuentran en las heces pueden ser preservados con una de dos formas. Una de ellas involucra la mezcla de heces directamente en el fijador pudiéndose almacenar a temperatura ambiente sin ningún proceso adicional pero tiene algunas desventajas tales como:

1- Algunos organismos grandes no se preservan bien o completamente por lo que se desintegran durante el almacenaje.

2- Una alícuota al azar de una muestra con pocos parásitos podría no revelarlos. 3- Cuando se trabaja con gran volumen de material la proporción adecuada de fijador

puede perderse y no ser la adecuada. La otra forma consiste en limpiar y separar los organismos de las heces y concentrarlos para la fijación y o tinción. Los helmintos al fresco (obtenidos talvez por el método de tamizaje) y luego de lavarlos en solución salina fisiológica deben ser fijados por diferentes métodos de acuerdo al grupo al que pertenecen: nemátodos, céstodos o tremátodos. El fijador debe estar a una temperatura de entre 60 y 63ºC para que la sustancia penetre más rápidamente y detenga cualquier desarrollo de los huevos particularmente los de Ascaris y Trichuris. La principal desventaja de este

método es la de que hay aquí un lavado intensivo además del manipuleo y de que se podría conducir a la deformidad e incluso a la destrucción antes de la fijación.

Relajación. La mayoría de formas adultas de tremátodos y céstodos necesitan ser relajadas después del lavado ya que exhiben gran actividad y en esa condición no deben ser fijadas porque se contraen y enrrollan cuando entran en contacto con el fijador, impidiendo la observación de algunas de sus características morfológicas. Se recomienda pasarlos por agua destilada más que por solución salina, para que por la hipotonicidad se produzca una ovipostura masiva que limpie el útero para que la coloración posterior quede mejor. En el medio hipotónico a 4ºC por

[140]

2-4 horas, el parásito sufre relajamiento muscular y disminuye su movilidad. Es en este punto donde ya pueden colocarse dentro de una solución fijadora.

Fijación. La formalina generalmente no se recomienda debido a que endurece mucho los tejidos y altera la cutícula. Los nemátodos pueden ser transferidos a alcohol-glicerina caliente o a alcohol-formalina-ácido acético (AFA). El primero es un excelente fijador y el espécimen puede estar allí indefinidamente ya que la glicerina lo protege de la evaporación alcohólica. En todo caso, la evaporación del fijador es la principal razón de que se deban revisar las muestras aproximadamente cada seis meses. La solución AFA puede usarse para los tres grupos de helmintos y también debería usarse caliente. Otros fijadores útiles son el ácido acético glacial sin diluir (que también sirve de aclarador pero sólo en nemátodos pequeños), fijador de Travassos y la formalina diluida al 1% (usada especialmente para matar adultos de Ascaris lumbricoides). Esta última no debe ser usada a

concentraciones mayores debido a que la presión osmótica rompe al helminto; después de 24 horas y cuando todos están muertos pueden entonces ser pasados a formalina 10% para un almacenaje a largo plazo. NOTA: Se debe recordar que los huevos de Ascaris continúan su desarrollo en formalina si la

concentración es menor al 10% y permanecerán infectivos por algunos meses si las condiciones de almacenaje no varían. Todos los tremátodos son muy musculares por lo que se contraen mucho. Los especímenes vivos se deben colocar en solución salina fisiológica por 30 minutos o algunas horas dependiendo del tamaño. Antes de fijar deben colocarse entre dos portaobjetos para comprimirlos pero sin aplicar presión ya que podrían distorsionarse los órganos internos e incluso romperse. Se colocan en fijador de Bouin o AFA calientes y pueden conservarse en esa solución o en etanol al 70%. Los fijadores ácidos disuelven los corpúsculos calcáreos característicos de los céstodos y debido a que ellos son útiles para el diagnóstico del helminto, no se recomiendan esas sustancias para la fijación. En sustitución y con el mismo fin puede usarse formalina amortiguada caliente o Bouin y conservar en alcohol etílico al 70%.

Aclaración. Este proceso es importante para estudiar las estructuras externas e internas de los nemátodos principalmente los pequeños. Los aclaradores más usados son: ácido acético glacial, glicerina pura y lactofenol. Se colocan en contacto con la solución por algún tiempo y luego de hacer la revisión se pueden devolver al líquido fijador. La razón de esto es que la cutícula de nemátodos impide la penetración del colorante y la opción que queda es la de volverlos transparentes para observar el tracto digestivo, cutícula y estructuras reproductivas, que son las que más información brindan para establecer una identificación. Los medios de montaje estándar contienen resinas y agentes deshidratantes que generalmente no dan resultados satisfactorios porque el nemátodo colapsa y se distorsiona. Para evitar esto se pueden hacer montajes con glicerina gelificada o glicerina líquida pura y lactofenol.

Tinción. Es mucho más común estudiar las estructuras de tremátodos en montajes teñidos y los colorantes más recomendados son el carmín y la hematoxilina. Cabe mencionar que de ambas se encuentran muchas modificaciones en la literatura y la mayoría dan excelentes resultados: carmín clorhídrico de Langeron, carmín clorhídrico de Semichon, hematoxilina de Delafield,

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hematoxilina de Erlich, hematoxilina de Vancleave (que es una combinación de las dos últimas), etc. Los céstodos también pueden ser examinados teñidos en montajes permanentes con las coloraciones ya mencionadas o en montajes temporales preparados con tinta china. Un proglótido grávido presenta ramificaciones uterinas completamente desarrolladas y llenas de huevos y el número de ellas es característico de especie. Usando una jeringa de 1 ml y aguja #25 se inyecta la tinta a través del poro uterino hasta llenar las ramas , se enjuaga en solución salina , se presiona entre dos láminas y se examina directamente al microscopio. Después de la revisión se pueden deshidratar a través de cambios en etanol de diferente concentración (50, 70, 90 y 100%), aclarados en dos cambios de xilol y montados en Permount para un registro permanente. Existen otras sustancias fijadoras que a la vez, aclaran las estructuras pero su uso ha sido orientado hacia el estudio de pequeños helmintos, proglótides, cisticercos, etc. y

no precisamente al de heces fecales. Los aclaradores, si se usan solos, pueden ayudar a hacer una correcta identificación de las estructuras mencionadas pero no pueden ser mantenidas o preservadas por un tiempo largo en ellos. Por eso deben ser pasados a líquidos fijadores para conservación. A continuación se presentan algunos de ellos:

a- Fijador de Bouin b- Fijador de Railliet-Henry c- Fijador de Travassos d- Fijador de Zenker (Mantener a 5ºC y al momento de usar agregar ácido acético glacial a una concentración final de

4%.)

e – Aclarador alcohol-glicerol f- Aclarador ácido acético g- Lactofenol

[142]

PRÁCTICA № 23

OTROS ARTROPODOS DE IMPORTANCIA MÉDICA. DIAGNOSTICO DE LA ESCABIOSIS.

OBJETIVO: Que el estudiante se capaz de: Explicar las técnicas de montaje de artrópodos de importancia en salud pública necesarias para su diagnostico. A. Colecta del material.

El alumno se encargará de recolectar artrópodos ectoparásitos en humanos, mascotas u otro tipo de animales. También se pueden atrapar insectos para su estudio posterior. Para colectar artrópodos ectoparásitos se puede requerir de:

a. Un peine fino. b. Pinzas extrafinas c. Microagujas. d. Pincel fino. e. Bandeja con agua.

Dependiendo del tamaño del parásito, su velocidad de desplazamiento y de su ubicación, se debe decidir cual de los instrumentos antes mencionados es el más adecuado.

B. Fijación de artrópodos ectoparásitos. La mayoría de los artrópodos pueden ser fijados adecuadamente en alcohol de 75 a 85%.

1. Clarificación de artrópodos. Los ejemplares más opacos requieren de un proceso de aclaramiento de sus estructuras, de manera que permita observar los detalles para su identificación. Algunos artrópodos deben ser clarificados previamente al montaje y un método simple muy recomendado es el siguiente:

i) Clarificar el artrópodo en solución fría de KOH al 10% por varias horas o toda la noche. ii) Lavar con agua de chorro por 10 a 15 minutos. iii) Pasar por: iv)

a. Ácido acético glacial por 10 minutos.

b. Ácido acético glacial y aceite de oliva (a partes iguales) por 10 minutos.

c. Ácido acético glacial una parte y aceite de oliva dos partes, por 10 minutos. Otra técnica mucho más sencilla es la siguiente:

i) En una tapadera de vidrio o vidrio de reloj sumerja los ejemplares en lactofenol. ii) Debe revisarse el material a intervalos de 5 minutos para determinar si los ejemplares se

han aclarado. iii) Retire en el momento oportuno los ejemplares para ser montados.

C. Montaje de los ejemplares.

i) Poner una gota del reactivo de Doetschmann o medio de montaje de Hoyer en un portaobjeto de 3 x 1”.

[143]

ii) Colocar el artrópodo en la gota del fijador. Cuando se dispone de más de un mismo tipo de artrópodo, se acostumbra colocar uno en posición dorsal y otro en posición ventral en la misma lámina.

iii) Coloque el portaobjetos con los ejemplares dentro de una caja y en una estufa a 37ºC por un período de 4 días para secado.

iv) Coloque un cubreobjeto sobre una superficie plana y coloque en el centro una gota del medio de montaje.

v) Tome la lámina con el ejemplar previamente secado, acérquela cuidadosamente hasta llegar a tocar la gota fresca del medio, la cual de inmediato se distribuye en todo el cubreobjeto. Rápida y cuidadosamente invierta la lámina de manera que el ejemplar quede colocado hacia arriba. No incline la lámina para evitar el desplazamiento del cubreobjetos.

vi) Dejar secar a 37º C por 8 días. D. Anillado.

El Hoyer y Reactivo de Doetschmann son medios semipermanentes, por lo que se hace necesario proteger el ejemplar montado, Con este fin se acostumbra anillar el cubreobjeto, utilizando para ello esmalte de uñas, incoloro, que se aplica en una banda de contacto que cubra 2 mm el borde del cubreobjeto y 2 mm el portaobjeto, hecho de esta manera se deja secar.

i) Etiquetado y rotulado. Se deben colocar dos etiquetas adhesivas en cada extremo del portaobjeto. La información que se debe colocar es la siguiente:

Etiqueta izquierda Etiqueta derecha. Departamento Categoría taxonómica (Phylum, clase , orden) Municipio sexo, estadío. Localidad Fecha de montaje. Colector Medio de montaje. ii) Observación de preparaciones permanentes de Cimex lectularius.

Observe las características morfológicas de esta especie en particular. Ayúdese de las figuras del manual para identificar algunas estructuras principales.

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

iii) Estudio de la morfología y caracteres diferenciales de las principales especies de pulgas. Observe las preparaciones permanentes de adultos de Pulex irritans. Esta pulga se caracteriza por no presentar ctenidios, como tampoco los presenta Xenopsylla cheopis de la cual debe diferenciarse P. irritans presenta la cerca ocular hacia abajo del ojo en cuanto que X. cheopis la presenta adelante del ojo. Trate de realizar un dibujo original de los aspectos anteriores.

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Observe los adultos de Ctenocephalides felis y Ctenocephalides canis. De acuerdo a sus clases

teóricas ¿Cuál es la diferencia entre las dos especies?____________________________________

_______________________________________________________________________________

iv) Morfología de los insectos del orden Anoplura. Se le entregarán preparaciones permanentes con adultos y huevos de Pediculus humanus y Phthirus pubis. Estudie su morfología y compare las figuras incluidas en el manual con lo que observa.

a)__________________________________ a)_________________________________

b)___________________________________ b)_________________________________

c)___________________________________ c)_________________________________

d)___________________________________ d)_________________________________

Observaciones_________________________ Observaciones_______________________

Diagnóstico de la escabiosis. El más importante de los artrópodos de la clase arácnida que puede parasitar la piel del humano, donde la hembra produce túneles para depositar los huevecillos, es Sarcoptes scabiei. Los sitios usuales donde se encuentra son los espacios submamarios e interdigitales de pies y manos, axilas, ingles, pene, etc. El diagnóstico puede ser confirmado por la demostración de los ácaros adultos, los huevos o cíbalos (acúmulos de heces). PROCEDIMIENTO 1. Coloque una gota de aceite mineral en el borde de una hoja de bisturí. 2. Haga contacto con la hoja del bisturí y las lesiones. Permita que estas últimas se humedezcan un

poco. 3. Raspe vigorosamente seis o siete veces hasta que se desprenda suficiente material córneo. 4. Transfiera el material obtenido a una lámina portaobjeto. 5. Agregue una gota extra de aceite mineral y mezcle con la punta del bisturí o con un aplicador de

madera. 6. Cubra con una laminilla 22X40 mm y examine inmediatamente con objetivo de bajo poder. 7. Revise buscando ácaros, huevos o restos de heces de color amarillo-café. Revise las láminas preparadas según el método anterior que le proporcionará su instructor. Describa

y dibuje lo que observa

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a)________________________________

b)________________________________

c)________________________________

d)________________________________

ARTRÓPODOS DE IMPORTANCIA MÉDICA

Los organismos incluidos en el phyllum Arthropoda representan al mayor y más diverso número de especies del reino animal y su importancia médica radica no tanto en el número de especies parásitas que pueden transmitir, sino en la gran morbimortalidad y amplia distribución geográfica de las enfermedades que esos agentes producen. Además, pueden provocar enfermedad debido a reacciones alérgicas o traumatismos producida luego de su contacto y/o ataque. La palabra artrópodo se deriva de los vocablos arthron-articulación y pous-pié. Pueden transmitir al hombre muchos microorganismos incluidos protozoarios, helmintos, virus, bacterias y ricketsias, además de producir (como ya se dijo) daño por envenenamiento, producción de toxinas, hipersensibilidad o alergias, etc. Generalmente, este daño es de carácter accidental y es mayor o menor según si en la transmisión de agentes el artrópodo funciona como vector biológico o mecánico, respectivamente. El phyllum se divide en cinco clases a saber: Onycophora, Myriapoda, Crustacea, Insecta y Arachnida. Los de mayor importancia para el humano pertenecen a las dos últimas aunque en las otras pueden encontrarse especies que sirven como hospederos intermediarios de organismos que parasitan al hombre. Dentro de la clase insecta a su vez, las especies de mayor interés pertenecen a 4 órdenes: siphonaptera (pulgas), anoplura (piojos), hemiptera (chinches) y diptera (moscas y mosquitos). Otros de menor importancia y que participan indirectamente en los ciclos se agrupan en los órdenes coleoptera (escarabajos), lepidoptera (mariposas) y orthoptera (cucarachas). Todos los insectos se desarrollan a partir de huevos formados en los ovarios de las hembras, pero el crecimiento después que salen de ellos se acompaña por cambios más o menos marcados en su forma (metamorfosis) caracterizados por el fenómeno de ecdisis o muda, el cual varía grandemente en el número e intervalos en que ocurre, según la especie. Para facilidad de su estudio se consideran 3 tipos de metamorfosis a saber: 1- Ametábola: o desarrollo sin metamorfosis; casi no se presentan cambios externos en forma

excepto en tamaño, siendo el adulto sólo más grande que en las etapas anteriores. Todos los estadíos ingieren el mismo alimento y se desarrollan en el mismo medio ambiente.

2- Hemimetábola: o incompleta; en este tipo el insecto joven se parece al adulto en la forma

general y en la ecología. Sin embargo, se presentan cambios graduales en la forma apareciendo poco a poco las alas y los apéndices genitales, los cuales sólo se encuentran

[146]

desarrollados en el adulto. Se caracteriza por la presencia de tres etapas fundamentales: huevo, ninfa e imago (adulto); el insecto se desarrolla a través de varios estadíos ninfales sucesivos con su respectiva muda por lo que no se trata de un crecimiento incompleto sino más bien de una forma diferente de llegar a la fase final.

3- Holometábola: o completa; en este grupo se colocan los insectos en los cuales las formas

más jóvenes no tienen ningún parecido con sus padres, así como cambian sus hábitos alimenticios y ecología. Los insectos con metamorfósis completas pasan por las fases de huevo, larva, pupa y adulto. La mayoría de artrópodos de importancia médica pertenecen a los dos últimos grupos.

Recolección. Los insectos se encuentran en hábitats muy diversos especialmente en el suelo

entre el material orgánico en descomposición, en estanques, en agujeros de árboles, bajo piedras, en campos cultivados, etc. Las técnicas de recolección de artrópodos varía según el grupo o la especie de que se trate o según su ecología; pueden usarse con este fín la red entomológica (para especies voladoras y acuáticas), el succionador en combinación con un tamiz para materia orgánica (para las que viven bajo la superficie del suelo), las trampas de luz cómo el embudo de Berlese, frascos semienterrados en la arena, bolsas o cajas (para organismos de poca movilidad), etc. Los insectos más grandes pueden colocarse en un recipiente seco sin ningún problema. Otros más pequeños como piojos, mosquitos y pulgas pueden recolectarse con pinzas y ser puestos en frascos con etanol 70% y mantenerlos allí indefinidamente. Los huevos de piojos (liendres) fluorescen bajo luz ultravioleta o lámpara de Wood. Esta característica es útil pata detectar infestación especialmente cuando se investiga gran número de personas a la vez que facilita su recuperación. Al recolectarlos se anota en una viñeta adecuada el sitio, ubicación geográfica y la fecha en que fue encontrado el espécimen. Luego deben ser pinchados y montados en el insectario de acuerdo con las normas establecidas. En cambio, si el material proviene de muestras médicas conviene agregar a la lesión aceite mineral para que se adhieran mejor las estructuras a la cuchilla con la que ha de hacerse el raspado. Las larvas extraidas de las lesiones humanas o recogidas en las excretas se pueden fijar en una mezcla caliente de etanol 70% más glicerina en proporción 10:1. Los artrópodos más grandes de exoesqueleto duro pueden matarse en cámaras letales de vapores tóxicos como cianuro o cloroformo, pero es menos peligroso hacerlo en tubos de ensayo con tapón de algodón empapados en acetato de etilo y se conservan en alcohol etílico 70%. Otras formas pueden ser el frío (refrigeración) y la inyección con aguja hipodérmica de 2 ó 3 gotas de tetracloruro de carbono ya sea en el tórax o el abdomen. Para matar larvas se las puede sumergir en en agua caliente (60-63ºC). Aclaración.Algunos artrópodos pequeños o estadíos jóvenes de los grandes son lo

suficientemente transparentes como para montarlos después de un tratamiento leve de deshidratación y aclaramiento. Otros que tienen tejidos muy densos se sumergen 24 horas en solución de KOH 10%. El proceso puede acortarse si la solución se calienta por unos minutos procurando no desintegrar el material. Luego se lavan en agua de chorro por 15 minutos para colocarlos en ácido acético glacial más aceite de oliva. Finalmente se monta el material en lámina portaobjetos con el reactivo de Doetschman. Montaje.El medio de montaje con hidrato de cloral de Berlese es probablemente el proceso

más sencillo y práctico para matar, fijar, deshidratar, teñir, aclarar y montar pequeños artrópodos. El medio de Hoyer es una variante también muy usada.

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Preservación.Cabe aclarar que como resultado de las encuestas entomológicas es necesario

mantener un registro permanente de la población muestreada; esto constituye el insectario y no las muestras médicas que mas bien pueden mantenerse en preparaciones en lámina. Para que el insecto quede protegido de la humedad y los hongos se recomienda secarlos por medio de calor antes de guardar el insectario. Se los puede colocar al sol por 2 horas durante 3 días. Tambien pueden secarse mediante el calor de un bombillo en el interior de una caja por un tiempo no tan prolongado (1 hora parece ser conveniente). Siempre deben guardarse porque

pueden ser devorados por otros insectos como cucarachas u hormigas.

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