Desarrollo de un sistema inmuno-diagnóstico multiplex...
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Desarrollo de un sistema inmuno-diagnóstico multiplex para enfermedades infecciosas en
ganado bovino en regiones tropicales
Dr. Juan Heberth Hernández-Medrano
Departamento de Reproducción
FMVZ-UNAM
4 de Junio de 2015
Resumen
• Introducción
– Ganadería en trópico
– Enfermedades
– Métodos de Dx
• Monoplex (simplex) o Multiplex
• Objetivo
• Avances (Resultados Preliminares)
• Conclusiones
Ganadería tropical en México
• Hato nacional (SIINIGA, 2014) ~ 30M de cabezas – ~55% en regiones
tropicales
• Principales sistemas: – Doble propósito y Carne
(engorda o cría) • Bos taurus indicus y cruzas
con Bos taurus taurus
• Estatus reproductivo (Gutiérrez, Lassala & González Padilla, 2012)
– ~500d int partos = 7m abiertos
– 2-4 partos = 8 años edad
% Vacas Gx % Vacas no Gx Días a Gx
33% 67.4% > 120 d
40% Ciclando + 27% Anestro
89% (>210 = 49%)
Enfermedades abortivas y/o desgastantes
• infertilidad: nacimientos, mortalidad embrionaria
• ~ 5% abortos – normal (?)
• De importancia:
– DVB, RIB, LEB, B abortus, Camp spp, Neospora caninum, PTb (Wheelhouse &
Dagleish, 2014; Correa-Segura, 2009)
• DP y carne – Poca información
– Banco de Sueros Bovinos • ~60k a nivel nacional
Fundamento técnica luminex
Regiones
InmunoensayoLectura
Agacoplado Aglibre
Acbio nilado
~100regiones
2lasersRojo–Región/esferaVerde–An cuerpo
Sistemas de Diagnóstico
Monoplex – (ELISA)
• 20-200ul de muestra
• Prueba única por enf
• Costo - $70-$200/muestra (IDEXX®)
• Kits comerciales = variedades Mex?
Multiplex – (LUMINEX®) • ELISA en esfera!
– Varias enfermedades en una muestra (100 analitos)
– 15 de muestra
• Costo - $50-100/muestra
• Tiempo 2h por ensayo
An geno
Acdesc
Acmarcado
Objetivo
Desarrollar y validar un sistema de inmunoensayo multiplex (Luminex) para determinar la exposición a DVB, RIB y LEB en
muestras de sueros de los estados de Chiapas, Guerrero, Tabasco, Tamaulipas y Veracruz.
Banco de Sueros Bovinos
Equipo Luminex
Resultados Preliminares
• IBR (virus) & BVD (ag rec)
1
10
100
1000
10000
NSB BLK Ctrl- Ctrl+
DVB IBR
LUMINEX – Prueba con controles (+) y (-)
Inte
nsi
dad
Med
ia d
e Fl
uo
resc
enci
a (L
og1
0)
Luminex - IBR
• Num de esferas: ~ 100
• Diferentes resultados entre Luminex y IDEXX
1
10
100
1000
NSB Ctrl- Ctrl+ Baja Media Alta
IBR600 IBR300 IBR100
Inte
nsi
dad
Med
ia d
e Fl
uo
resc
enci
a (L
og1
0)
Monitoreo Preliminar
• Total de 103 granjas
• Animales muestreados: NO VACUNADOS
• Pool de muestras por rancho
– 10-12 animales por rancho
• ELISA – IDEXX
– DVB, IBR y Leucosis
• 55% sero(+) a LEB
• 90% sero(+) a DVB y RIB – ~11% sero(+) a IBR o BVD
• Un solo rancho negativo a DVB, RIB y LEB
IBR&BVDpos IBRoBVDpos Pos>3 Neg>3
% 88.3 10.7 38.8 1.0
0
20
40
60
80
100
%delTotal
DatosCombinadosResumen
Monitoreo Preliminar
Conclusiones
• Potencial diagnóstico de Luminex, depende de antígenos disponibles (int o mex) – IBR puede ser adaptable - virus completo (?)
• Presencia de BVD e IBR en la mayoría de ranchos en estado piloto – Pools – identificar individuos
– Identificar positivos y negativos (muy importantes)
– Variedades mexicanas?
Agradecimientos
Depto Reproducción
• MC Ana Rodríguez
• Dr Carlos Gutiérrez
• pMVZ Héctor Nájera
• Dra Lucía Rangel
Depto Genética
• Dr Rogelio Alonso (antígenos)
Antígeno
Ac desc
Ac marcado
Sistemas de Diagnóstico • Monoplex – ELISA
– 20-200ul de mta – Prueba única por enf – Costo - $70-$200/mta (IDEXX®) – Kits comerciales = variedades Mex?
• Multiplex (xMAP Luminex®)
– ELISA en esfera! – Varias enfermedades en una muestra
(100 analitos) • 15-50ul de mta
– Costo - $50-100/mta – Tiempo 2h por ensayo
• No hay paneles dx para animales!
Antígeno acoplado
2º Anticuerpo biotinilado
Anticuerpo libre
Cortesía MC Ana D Rodríguez
• IDEXX Leucosis= ~55% (+) RIB & DVB = >90% (+)
Posi ve Nega ve
Leucosis 43.7 56.3
0
10
20
30
40
50
60
%degranjas
Leucosis
Nega vo Posi vo (?)
IBR 3.9 93.2 2.9
0
20
40
60
80
100
%degranjas
IBR
Nega vo Posi vo (?)
DVB 9.7 89.3 1.0
0
20
40
60
80
100
%degranjas
DVB
Fundamento técnica luminex
Regiones
Inmunoensayo Lectura
Ag acoplado Ag libre
Ac biotinilado
* Tomado de :http://ts2.mm.bing.net/th?id=H.4915664237298561&pid=1.7
~100 regiones
2 lasers Rojo – Región/esfera Verde – Anticuerpo
Estatus Reproductivo
• Muestreo (Gutierrez CG, Lassala A, Gonzalez Padilla E, 2012)
– 350K vacas en 8K ranchos
• 80% = 2-4 partos – Edad promedio: 8 años
• >90% empadre contínuo y MN • 33% Gx + 67% vacias – 40% ciclando! • Intervalo entre partos: 500d
– Días abiertos: 7m – Gx a > 120d pp
• Causas: – Nutrición – Macho – INFECCIOSAS – salud del hato?