UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

IZTAPALAPA i l - 9 T-

Desnaturalización de proteínas

inducida por temperatura y

desestabilizantes químicos

PROYECTO TERMINAL DE LA LIC. EN QUIMICA

POR:

MISAELA FRANCISCO MARQUE2

MAYO DEL 99

Este trabajo se realizó bajo la dirección de la Dra. Silvia Solís

Mendiola en el Area de Biofisicoquímica (R-209),

Departamento de Química, Universidad Autónoma

Metropolitana - Iztapalapa, División de CBI.

INDICE

INTRODUCCION

1. Proteínas

2. Caricaína, lisozima y tripsina

3. Dicroísmo Circular

4. Desnaturalización térmica

5. Desnaturalización por agentes orgánicos

6. Objetivos

7. Método experimental

8. Resultados y discusión

9. Conclusiones

1 O. Bibliografía

1

7

8

12

12

13

14

16

30

32

INTRODUCCION

l. Proteínas

Las proteínas son sustancias macromoleculares presentes en

todos los organismos vivos. Propiamente la palabra proteína deriva del

griego proteicos, que significa “primero”. Las proteínas son poliamidas,

las cuales por hidrólisis dan aminoácidos.

O O II 11 H20,H’

{-NHCHC-NHCHC-} + HNCHCOH + HNCHCOH etc. I I calor I I R R R R

Por lo común, sólo se encuentran veinte aminoácidos en las

proteínas en plantas y animales, sin embargo estos veinte aminoácidos

se pueden combinar en una gran variedad de formas, para originar

músculos, tendones, piel, uñas, plumas, seda, hemoglobina, enzimas,

anticuerpos y muchas hormonas.

Las masas moleculares de las proteínas van desde 10,000 hasta

más de 50 millones (I), se pueden clasificar de acuerdo al tipo de

función que desempeñan. Estas clases se resumen en la tabla 1. Las

I

función que desempeñan. Estas clases se resumen en la tabla 1. Las

proteínas fibrosas (llamadas también proteínas estructurales) están

compuestas por moléculas largas como hilo, que son resistentes e

insolubles.

Otro tipo de proteínas son las globulares. Estas son proteínas

pequeñas, algo esféricas a causa de plegarse las cadenas sobre sí

mismas. Las proteínas globulares son hidrosolubles y desempeñan

diversas funciones en el organismo. Por ejemplo, la hemoglobina

transporta oxígeno a las células, la insulina ayuda al metabolismo de

los hidratos de carbonos; los anticuerpos inactivan las proteínas

extrañas; el fibrinógeno (soluble) puede formar fibras insolubles, que

hacen que la sangre se coagule, y las hormonas llevan mensajes a

través de todo el cuerpo.

Las proteínas conjugadas, proteínas conectadas a una gran parte

no proteica tal como un azúcar, desempeñan diversas funciones en el

cuerpo. Un modo común de unión entre la proteína y la no proteica se

efectúa por medio de una función de la cadena lateral de la proteína

puede formar un éster con un grupo -OH de una molécula de azúcar.

2

TABLA 1 CLASES DE PROTEINAS

CLASE COMENTARIOS

Fibrosas o estructuras insolubles

Elastinas

Queratinas

Albúminas

Globulinas

Histonas

Protaminas

Forman tejido conectivo;

comprenden 30% de las proteínas

de los mamíferos; carecen de

cisteína y triptófano; ricas en

hidroxiprolina.

Forman tendones y arterias.

Forman pelo, pluma, uñas; ricas en

cisteína y cistina.

Ejemplos albúmina de huevo y

albúmina del suero.

Un ejemplo globulina del suero.

Se encuentran en los tejidos de las

glándulas y en los ácidos

nucleicos; ricas en lisina y argina.

Asociadas con ácidos nucleícos;

no contienen cisteína, metionina,

tirosina, triptófano, ricas en argina.

3

Los elementos presentes más abundantes en las proteínas son

carbono (50 a 55%), el hidrógeno (7%), el oxígeno (23%) y el nitrógeno

(16%). En la mayor parte de las proteínas se encuentra presente el

azufre, en una cantidad que va de 1 a 2%. El fósforo casi siempre esta

presente.

Los aminoácidos que se encuentran en las proteínas son ácidos

a-amino carboxílicos. La variación en las estructuras de estos

monómeros ocurre en la cadena lateral.

CO H I

H N-C-H l a R

El aminoácido más sencillo es el ácido aminoacético,

(H2NCH2C02H), llamado glicina, que no tiene cadena lateral y por

consiguiente no contiene carbono quiral.

Los aminoácidos se clasifican de acuerdo a su cadena lateral, los

que contienen grupos carboxílos se les llama aminoácidos ácidos y los

que tienen grupos amino, se clasifican como básicos. Estas cadenas

laterales ácidas y básicas ayudan a determinar la estructura y

reactividad de éstas. El resto se les conoce como neutros, algunas de

las cadenas contienen -OH, -SH u otros grupos polares, que pueden

aceptar enlaces de hidrógeno

4

A continuación se da la lista completa de los veinte aminoácidos,

en la tabla 2.

TABLA 2 AMINOACIDOS

Aminoácidos

Grupos R apolares alifáticos

Glicina Alanina Valina Leucina lsoleucina Prolina Grupos R aromáticos

Fenilalanina Tirosina Triptófano Grupos R polares sin carga

Serina Treonina Cisteína Metionina Asparagina Glutamina Grupos R cargados negativamente

Aspartato Glutamato Grupos R cargados positivamente

Lisina Arginina Histidina

Nombres abreviados

GlY G Ala A Val V Leu L Ile I P ro P

Phe F TYr Y T rp W

Ser S Thr T CYS C Met M Asn N Gln Q

ASP D Glu E

LYS K Arg R His H

5.97 6.01 5.97 5.98 6.02 6.48

5.48 5.66 5.89

5.68 5.87 5.07 5.74 5.41 5.65

2.77 3.22

9.74 10.76 7.59

5

La disposición o secuencia de los aminoácidos a lo largo de la

cadena determina la estructura primaria de una proteína y su identidad

única (1,2,3), esto se refiere al esqueleto covalente de la cadena

polipeptídica. Muchas de las propiedades se deben a la orientación de

la molécula como un todo, en la ordenación regular y periódica de una

dirección. La forma de hélice que adopta se le llama estructura

secundaria, la forma general de la proteína determinado por todos los pliegues, vueltas y bastón recibe el nombre de estructura terciaria. Se

podría suponer que una molécula de proteína larga y compleja, es

capaz de adoptar cualquier forma bajo una serie de condiciones

determinadas, pero este no es el caso. Algunos de los pliegues de la

cadena de la proteína dan lugar a disposiciones de energía más baja

(más estable) que otros patrones de plegamiento. La estructura

cuaternaria pone de manifiesto como se dispone en el espacio las

cadenas individuales polipeptídicas de una proteína que posee más de

una cadena.

La combinación de las estructuras, primarias, secundarias y

terciarias es la conformación de una proteína. Es la ordenación

espacial de los grupos sustituyentes que son libres de adoptar muchas

posiciones diferentes sin que se produzca ruptura de enlaces, debido a

la posibilidad de rotación alrededor de los enlaces simples de la

molécula

6

2. Caricaína, lisozima y tripsina

La caricaína, quimopapaína y papaína (4) se obtiene del látex de la

fruta de la papaya (Carica papaya), ha sido usado como fuente de las

proteinasas para uso industrial, por ejemplo, en la protección de

ablandadores de carne y prevención de la formación de turbidez en

bebidas. También, las proteinasas han sido de gran importancia

médica, por ejemplo en el tratamiento del prolapso de los discos

vertebrales.

La caricaína es el tercer constituyente proteolítico de látex de

papaya. Tiene 216 residuos de aminoácidos no contiene ningún

carbohidrato unido a su cadena polipeptídica y contiene 7 residuos de

cisteína de los cuales se forman 3 puentes disulfuro, (Cys-22-63, 56-95

y 153-204) y un residuo de cisteína libre (Cys-25) que es esencial para

la actividad cata1 ítica.

La lisozima provienen del huevo de gallina (lo), es una proteína

pequeña con 129 residuos de aminoácidos, la estructura se estabiliza

por cuatro puentes de disulfuro, éstos se mantienen durante la

desnaturalización, además esta proteína es reversible (1 O).

La tripsina es de origen animal (bovino) (1 9), esta proteína es

reversible a pH 3.0 y a temperaturas bajas, sin embargo a temperaturas

altas a un pH de 8.0 es irreversible, además pierde su actividad

enzimática a concentraciones altas de desnaturalizante tal como la

7

urea y clorhidrato de guanidina (GuHCI), se dice que alrededor de una

concentración de urea 4M retienen un 50% de su actividad. La tripsina

tiene 6 puentes de disulfuro (Cys-13-143; 31-47; 11 5-216; 122-1 89;

154-1 68 y 179-203) y tiene 229 residuos de aminoácidos.

TABLA 3 ALGUNAS PROPIEDADES DE LAS ENZIMAS

Muestra Referencia Coeficiente Punto Masa

1 molecular de extinción isoeléctrico

(Da) (E M) (PI)

caricaína

24,000 tripsina

(4Y 10) 2.65 11.0 14,300 lisozima (4) 1.85 11.0 24,000

(1 Y W 1.48 10.1

3. Dicroísmo Circular

Dicroísmo Circular (DC) es una técnica (4) que nos sirve para

observar los cambios físicos como la estructura secundaria y terciaria

de una macromolécula, por lo tanto este método espectroscópico

resulta apropiado para estudiar los cambios conformacionales que

ocurren durante la desnaturalización de una proteína.

En moléculas hay por lo menos tres clases de asimetría que pueden

producir actividad óptica (8):

1. La estructura primaria puede ser asimetría. Por ejemplo, las

transiciones de los electrones próximos a los carbonos a de

8

aminoácidos y polipétidos serán ópticamente activas a causa de la

asimetría inherente en este punto; los carbonos a de muchos

aminoácidos tienen cuatro sustituyentes diferentes.

2. Las estructuras secundarias de muchos biopolímeros son

helicoidales. Esto puede producir actividad óptica en las transiciones

electrónicas, tanto de la cadena como de los grupos laterales

dispuestos helicoidalmente.

3. Las estructuras terciarias de una macromolécula puede ser tal que

un grupo intrínsecamente simétrico esté situado en un entorno

asimétrico. Por ejemplo, las transiciones de los electrones del anillo

en la tirosina son normalmente poco activas ópticamente, pero en

algunas proteínas globulares los alrededores de una tirosina situada

en el interior son tales que pueden producir electrónicos asimétricos

alrededor del anillo. Estos pueden desviarse del desplazamiento del

electrón en transición hasta producir fuerte actividad óptica.

Hasta la fecha el tipo de asimetría que ha recibido mayor atención

es el segundo; la influencia de la estructura secundaria helicoidal en la

actividad óptica.

A continuación se muestra un diagrama esquemático de un

espectropolarímetro (5).

I F M C P M0 ' M O I

m== R

F fuente MC monocromador

P prisma M0 modular

I haz incidente M muestra

D detector R registrador

y SE sistema electrónico.

10

La radiación de una fuente muy estable y de gran intensidad (F)

pasa a través de un monocromador (MC) y es polarizada en un plano

por un prisma (P). A continuación, el modulador (MO) actúa como

retardador de la fase de uno de los componentes de la radiación, la

variación en la fase depende de la señal eléctrica de alta frecuencia

que el sistema electrónico (SE) del aparato emite y que es recibida por

el modulador. De esta forma, el haz incidente (I) está alternativamente

formado por luz circularmente polarizada a la derecha y a la izquierda.

El haz atraviesa la muestra (M) y al emerger es convertido en una señal

eléctrica por el detector (D). El sistema electrónico calcula la diferencia

entre la absorción de la radiación circularmente polarizada en ambos

sentidos, convirtiéndola en el valor numérico de la elipticidad y

graficándola contra la longitud de onda en el registro (R)

Para determinar la elipticidad por residuo medio, [e] se calculó

utilizando una masa molecular de 110 g mol-’ por residuo, determinada

por la secuencia de aminoácidos de acuerdo a la siguiente relación:

[O] = 8 X 100 / c X I (grados cm2decimol-’ )

donde

[e] = elipticidad molar por residuo

8 = elipticidad en grados

c = concentración molar de residuos

I = longitud de recorrido óptico, en cm.

11

4. Desnaturalización térmica

Muchas moléculas proteicas sólo retienen su actividad biológica

dentro de una fluctuación muy limitada de temperatura y de pH, a

temperaturas elevadas que consiste en el desplegamiento de la

estructura nativa, característica de cada cadena polipeptídica de las

moléculas. La consecuencia más significativa de la desnaturalización

es que las proteínas pierden su actividad enzimática y un cambio

conocido como desnaturalización, el efecto más visible consiste en un

descenso de la solubilidad, pues los grupos hidrofóbicos ubicados en el

interior de la molécula quedan expuesto al solvente acuoso puesto que

en los enlaces químicos covalentes del esqueleto peptídico de las

proteínas no se rompe durante este tratamiento relativamente suave,

se ha llegado a la conclusión que la estructura primaria permanece

intacta. La mayor parte de las proteínas globulares experimentan el

proceso de desnaturalización cuando se calienta arriba de 60 y 70 "C

(5Y 9).

5. Desnaturalización por agentes orgánicos

Soluciones orgánicas como la urea o el clorhidrato de guanidina

(GuHCI) (2,3,4), son agentes desnaturalizantes de la proteína, el

desplegamiento está acompañado por la interacción no covalente del

agente desnaturalizante con las moléculas de proteína.

12

La desnaturalización necesita una alta concentración de urea y

clorhidrato de guanidina (6 M de GuHCl y 8 M de urea), lo que indica

que las interacciones no pueden ser ni fuertes ni específicas. La

desnaturalización es entonces una consecuencia particular de un

fenómeno termodinámico general, la unión preferencial de los

componentes del solvente a la proteína, es decir, una solvatación

preferencial, que se une preferencialmente a la proteína. En

consecuencia la acción del agente se define exclusivamente por el

balance entre las afinidades de la proteína con los agentes

desnaturalizantes.

6. Objetivos

a). Aislar y purificar la caricaína

b). Realizar estudios de desnaturalización térmica por dicroísmo circular

de la caricaína, lisozima y tripsina.

c). Realizar estudios de desnaturalización con urea y clorhidrato de

guanidina (GuHCI) por dicroísmo circular de la caricaína, lisozima y

tripsina.

13

7. Método experimental

Para seguir la desnaturalización de la caricaína, lisozima y tripsina

se utilizó un espectropolarímetro JASCO J-500 A con celda de 1 mm de

trayectoria óptica, con chaqueta de circulación de agua conectada a un

baño de agua HAAKE NK-22. La temperatura se registró directamente

en la celda óptica con un termómetro digital COLE-PARMER 8402-20. .

Se utilizó quimopapaína parcialmente purificada.. Se aislaron por

cromatografía líquida de intercambio catiónico de alta resolución,

(HPLC) Varian 9012/9050, las muestras de quimopapaína y caricaína.

Después se dializó la caricaína, para eliminar todas las moléculas

pequeñas, una vez que quedó totalmente pura se midió la

concentración, con la ayuda de un espectrofotómetro, donde se midió la

absorbencia a 280 nm y el coeficiente de extinción A’” 1.85, para

determinar la concentración de la caricaína.

Se realizaron estudios de desnaturalización con. la caricaína a

diferentes valores de pH (2.0, 2.5, 3.0, 3.5, y 3.9). Se colocaron en la

celda óptica 0.87 ml de la muestra y 1.23 ml de regulador de glicina

0.05M, para obtener una concentración aproximada de 0.1 1 mg/ml. Se

hicieron barridos de 260 a 190 nm a temperatura ambiente y a 60 “C.

Posteriormente se prepararon muestras de lisozima y tripsina a

las mismas concentraciones, repitiendo los mismos experimentos a pH

constante de 2.5, sin embargo para la lisozima también se hicieron a-un

pH de 2.9.

14

Después se realizaron estudios con la caricaína en presencia de

agentes desnaturalizaste como la urea y clorhidrato de guanidina, de

acuerdo con la siguiente tabla:

TABLA 1

Muestra

I caricaína

pH (regulador glicina

0.05M)

I caricaína I 3.0 I 6 y 8 M I I caricaína I 3.9 I 6 y 8 M I

Los espectros de dicroísmo circulador se obtuvieron a

temperatura ambiente antes y después de agregar la urea.

Con la lisozima y tripsina se hizo el mismo tratamiento con el

mismo agente desnaturalizante a pH constante como se muestra en la

tabla 2.

TABLA 2

lisozima

pH (regulador glicina 0.05M)

U rea

I

2.5 6 y 8 M 2.5 6 y 8 M

I

1s

Para finalizar se hicieron estudios de desnaturalización de las

proteínas, en presencia del clorhidrato de guanidina (GuHCI) 6M de

acuerdo a la tabla 3.

TABLA 3

Muestra (GuHCI) pH (regulador glicina 0.05M)

caricaína

6M 2.5 tripsina

6M 2.5 lisozima

6M 3.9 caricaína

6M 3.0 caricaína

6M 2.5

8. Resultados y discusión

Se obtuvieron los espectros por dicroísmo circular a temperatura

ambiente y posteriormente a una temperatura aproximada de 60 OC, en

regulador de glicina 0.05 M a diferentes valores de pH: 2.0, 2.5, 3.0, 3.5

y 3.9, en el intervalo de 190 a 260 nm.

En la figura 1 se observan cinco pares de gráficas que tienen la

misma tendencia en el estado nativo y en estado desnaturalizado, a

pesar de la variación del pH, con esto podemos decir que el efecto de

la variación de pH no desestabiliza a la macromolécula.

16

A temperatura ambiente, todos los espectros tienen la forma y

magnitud característica de la conformación nativa de la enzima (2 y 9),

a temperatura alta en las curvas se observa un mínimo alrededor de los

200 nm que es característico de la aparición de estructuras

desordenadas.

La diferencia entre los dos espectros es que en estado nativo la

proteína tienen forma globular, donde posee todas sus propiedades

biológicas así como su estructura, sin embargo a medida que aumenta

la temperatura ésta se va abriendo poco a poco para adquirir una

conformación aleatoria. En el estado desnaturalizado, la proteína ha

perdido su estructura secundaria, terciaria y también su actividad, pero

su estructura primaria probablemente queda intacta por el tratamiento

térmico relativamente suave (3 y 9).

La figura 2 muestra los espectros de dicroísmo circular a

temperaturas de 25 y 60 O C , en regulador de glicina 0.05 M, a dos

valores de pH 2.5 y 2.9, si observamos éstas curvas podemos decir

que en los dos estados nativo y desnaturalizado siguen el mismo

comportamiento y nuevamente el efecto del pH no desestabiliza la

enzima.

A temperatura ambiente, todos los espectros tienen la forma y

magnitud característica de la conformación nativa de la proteína, a

temperatura alta, también se observa un mínimo alrededor de los 200

nm (12).

17

CARICAINA

3

c .d

m O a

b13 2

grafica 1

O

-2000

-4000

-m -8000

- l o o 0 0

-12000

-14000 O

-2000

-4000

-6000

-8Ooo

- l o o 0 0 O

-2000

-4000

-m

-8000

- l o o 0 0 O

-2000

-4000

-m

-8000

- l o o 0 0

O

-2000

-4000

-6Ooo

-8000

- l o o 0 0

-12000 1 ‘ 9 0 200 2 I O 220 230 240 250 260

LONGITUD DE ONDA (nm )

O

-2000

-4000

-6000

-8000

- 1 O000

- 12000 O

-2000

-4000

-6000

-8000

- 1 O000

- 12000

190 200 21 O 220 230 240 250 260

LONGITUD DE ONDA (nm)

Figura 2: Desnaturaiización térmica de la lisozima por dicroísmo circular, en regulador de glicina 0.05M a pH 2.5 (LN) lisozima nativa, (LD) lisozima desnaturalizada.

19

La figura 3 muestra los espectros de dicroísmo circular de la

caricaína, lisozima y tripsina, en regulador de glicina 0.05 M, a pH 2.5, a

temperatura ambiente y 60 'C. A temperatura ambiente los espectros

obtenidos en la región del UV lejano (1 90-260 nm) tienen la forma y

magnitud característica de la conformación nativa de cada una de las

enzimas (7, 12 y 14). Por otro lado, a temperaturas superiores la forma

de las curvas de elipticidad es semejante entre ellas, donde se observa

un mínimo alrededor de los 200 nm, el cual nos indica la aparición de

estructura desordenada en la cadena polipeptídica. Las curvas de

elipticidad son semejantes a la observada con otras proteínas

desnaturalizadas térmicamente (1 3 y 14).

A continuación tenemos la desnaturalización de la caricaína por

agentes químicos, como se muestra en las figuras 4 y 5, en regulador

de glicina 0.05 M a diferentes valores de pH 2.5, 3.0 y 3.9, a

temperatura ambiente, las desnaturalizaciones se hicieron con

desestabilizantes fuertes, urea 6 y 8 M y con GuHCl 6.

En la figura 4 se muestran los espectros de DC, a diferentes

valores de pH, donde la desnaturalización se llevó a cabo a dos

diferentes concentraciones de urea 6 y 8 M, como podemos obsenrar

en los espectros a medida que se aumenta la concentración de urea, la

desnaturalilzación también aumenta. En ambas concentraciones de

20

urea, las curvas tienen un mínimo alrededor de 210 nm, pero a la

concentración de 8 M disminuye la magnitud de los espectros, lo cual

nos indica la desnaturalización completa de la caricaína.

La figura 5 muestra los espectros de DC de la caricaína a

diferentes valores de pH, a temperatura ambiente, donde la

desnaturalización se realizó con clorhidrato de guanidina 6 M. En

presencia de GuHCl las curvas tienen un mínimo alrededor de 215 nm

y disminuye notablemente la magnitud de los espectros, lo cual nos

indican la desnaturalización de la caricaína a menor concentración (6

M) -

Las figuras 4 y 5 muestran los espectros de la caricaína que

llevan la misma tendencia en el estado nativo, en el estado

desnaturalizado existen diferencias en los espectros con presencia de

urea y con clorhidrato de guanidina, donde podemos observar el

distinto comportamiento de los desestabilizantes orgánicos, lo que nos

indica que la (GuHCI) tiene una capacidad desnaturalizante mayor a la

urea (18).

21

O

-2000

-4000

-6Ooo

-8000

- l o o 0 0

O

-2000

-4000

-m -8000

- l o o 0 0

-12000 O

-2000

-4000

-m

-8000

- l o o 0 0 190 200 210 220 230 240 250 260

LONGITUD DE ONDA ( nm )

Figura 3: Desnaturalización térmica de las tres proteínas, en regulador de glicina 0.05M a pH 2.5. (CN), caricaína nativa, (CD) caricaína desnaturalizada, (LN) lisozima nativa, (LN) lisozima desnaturalizada, (TN) tripsina nativa y (TD) tripsina desnaturalizada.

22

h, w

[O] grados cm* decirnol-*

I I I I I

# m"-- /--

YD

2000

O

-2000

-4000

-m -8000

- l o o 0 0 M

e I 2000

E O O .M

8 -2000

Td -4000

S O U

-2000

-4000

-6Ooo

-8000

- l o o 0 0

-12000

c 7.

I f pH 3.0

190 200 210 220 230 240 250 260

LONGITUD DE ONDA ( nm )

Figura 5: Desnaturalización de la caricaína con clorhidrato de guanidina (GuHCI) 6M, regulador de glicina 0.05M, a diferentes pH. (CN) caricaína nativa y (CD) caricaína desnaturalizada.

24

Las figuras 6 y 7 muestran los espectros de dicroísmo circular, en

regulador de glicina 0.05 M a pH 2.5, a temperatura ambiente, la

caricaína, lisozima y tripsina se desnaturalizaron con urea 6 y 8 M y con

clorhidrato de guanidina 6 M, respectivamente. Los espectros en el

estado nativo de las diferentes enzimas siguen el mismo

comportamiento de la conformación nativa de cada enzima.

En la figura 6 se muestran los espectros de dicroísmo circular de

la caricaína, lisozima y tripsina, donde la desnaturalización se llevó a

cabo a diferentes concentraciones de urea (6 y 8 M) para cada una de

las enzimas. Podemos observar en los espectros que conforme

aumenta la concentración de la urea disminuye la magnitud de cada

una de ellas, pero difieren en su forma, teniendo un mínimo alrededor

de 210, 205 y 21 5 nm, respectivamente para la caricaína, lisozima y

tripsina. En la figura 7 se muestran los espectros de DC de las mismas

enzimas, donde la desnaturalización se realizó con clorhidrato de

guanidina 6 M, si observamos los espectros desnaturalizados con

guanidina podemos decir que disminuye notablemente la magnitud de

25

estos y difieren en su forma pero todos tienen un mínimo alrededor de

215 nm.

Por último tenemos la figura 8, donde presentamos los resultados

de desnaturalización de la caricaína a diferentes velocidades de

calentamiento 0.1, 0.3, 0.5, 1 .O y 1.5 'C/min. Estos estudios se hicieron

en DC, con regulador de glicina 0.05 M a un pH de 2.5, midiendo de

manera continua la temperatura y manteniendo constante la elipticidad

a 220 nm. A partir de los valores de elipticidad, éstos fueron

transformados a fracción desnaturalizada de la caricaína. Esta gráfica

muestra la transición del estado nativo al estado desnaturalizado, lo

cual es fuertemente afectada por la velocidad de calentamiento, con lo

cual se comprobó que es un modelo de dos estados.

26

O

-2000

-4000

-m

-8000

-8000 o g -lm % -12000

-2000

-4000

-m I I I I I I

190 200 210 220 230 240 250 260

LONGITUD DE ONDA ( nm )

Figura 6: Desnaturalización de las tres proteínas a temperatura ambiente con urea 6 y 8M en regulador de glicina 0.05M a pH 2.5. (CN) caricaína nativa, (CD) caricaína desnaturalizada, (LN) lisozima nativa, (LD) lisozima desnaturalizada, (TN) tripsina nativa y (TD) tripsina desnaturalizada.

27

2000 II

-4ooo

-6ooo

-8000

l o o 0 0

2000 O

-2000 -4000 -m -8000

-loo00 -12000 - 14000

f ?

1 I-

U W

O

-2000

-4000

-m

1 9 0 200 210 220 230 240 250 260

LONGITUD DE ONDA ( nm )

Figura 7: Desnaturalización de las tres proteínas con (GuHCI) 6M, en regulador de glicina 0.05M a pH 2.5, A temperatura ambiente (CN) caricaína nativa, (CD) caricaína desnaturalizada), (LN) lisozima nativa, (LD) lisozima desnaturalizada, (TN) tripsina nativa y (TD) tripsina desnaturalizada.

28

a 1.0 n

a

a

n 0 0.2

a N 7 0.8

CT

t- 7

w

7

0.6

0.4

-

L

m

-

o o a 0.0 CT LL 1 I I I I I

30 40 50 60 70 80

TEMPERATURA ( O C )

Figura 8: Fracción de la proteína desnaturalizada en función de la

temperatura, con una dependencia de la elipticidad a 220 nm.

Caricaína en regulador de glicina 0.02M y pH 2.5, a diferentes

velocidades de calentamiento.

29

En los procesos de desnaturalización de la caricaína, lisozima y

tripsina, existen diferencias en los espectros cuandose aumenta la

temperatura y en los espectros donde se induce la desnaturalización

por agentes desnaturalizantes. Por lo tanto, las proteínas globulares

estudiados, tienden a desdoblarse de acuerdo a la capacidad

desnaturalizante del clorhidrato de guanidina, urea y altas

temperaturas, donde los agentes orgánicos son desestabilizantes

fuertes (GuHCI > urea) y las altas temperaturas son desestabilizantes

menos fuertes.

Debido a lo anterior, podemos concluir que en la desnaturalización

térmica y la inducida por agentes químicos se rompen enlaces no

covalentes pero en diferentes proporciones y en el caso de la presencia

de los agentes desnaturalizantes el desdoblamiento es completo (16 y

17), y probablemente se rompan puentes disulfuro, además existen

interacciones no covalente al desplegamiento de la proteína con éstos.

Para la urea a altas concentraciones se lleva a cabo la

desnaturalización completa, resultando similar al desdoblamiento del

clorhidrato de guanidina.

31

9. Conclusiones

La técnica de dicroísmo circular nos permite seguir físicamente la

desnaturalización térmica y la desnaturalización con agentes químicos

de la caricaína, lisozima y tripsina.

En el proceso de desdoblamiento térmico de la caricaína, lisozima y

tripsina, se observa un mínimo alrededor de los 200 nm que es

característico de la aparición de estructuras desordenadas.

En el estado nativo de la caricaína, lisozima y tripsina, todos los

espectros tienen la forma y magnitud característico de la conformación

nativa de cada enzima, a pesar de la variación del pH, con lo que

podemos concluir que el efecto del pH, en el intervalo estudiado, no

desestabiliza a la caricaína.

En el proceso de desdoblamiento de la caricaína, lisozima y tripsina,

inducido por agentes desnaturalizantes existen diferencias en los espectros con urea y con clorhidrato de guanidina, donde se puede

corroborar que la GuHCl tienen una capacidad desnaturalizante mayor

a la de la urea.

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