DETERMINACIÓN DE LA ADULTERACIÓN DEL ACEITE DE OLIVA …
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- 1 - TESIS QUE PARA OBTENER EL TITULO DE INGENIERO BIOQUIMICO P R E S E N T A BAUTISTA VELÁZQUEZ VÍCTOR HUGO ASESOR: DRA. TZAYHRI GALLARDO VELÁZQUEZ COASESOR: DR. GUILLERMO OSORIO REVILLA MEXICO, D. F. Enero 2010 DETERMINACIÓN DE LA ADULTERACIÓN DEL ACEITE DE OLIVA POR UN MÉTODO QUIMIOMÉTRICO BASADO EN ESPECTROSCOPIA INFRARROJA POR TRANSFORMADA DE FOURIER INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
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MEXICO, D. F. Enero 2010
DETERMINACIÓN DE LA ADULTERACIÓN DEL ACEITE DE OLIVA POR UN MÉTODO QUIMIOMÉTRICO BASADO EN ESPECTROSCOPIA INFRARROJA POR TRANSFORMADA DE FOURIER
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
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Este Trabajo Fue Realizado En El Laboratorio De Investigación Central De Instrumentación Del Departamento De Biofísica De La Escuela Nacional De Ciencias Biológicas Del IPN, Bajo La Asesoria De La Dr. Tzayhri Gallardo Velázquez Y Co-asesoria Del Dr. Guillermo Osorio Revilla con el financiamiento del proyecto SIP-20080866
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ÍNDICE I. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………. 5
1.1 Generalidades………………………………………………………………. 7
1.1.1 Clasificación de los aceites de oliva…………………………………. 7
1.1.2 Composición y propiedades del aceite de oliva……………………. 8
1.1.3 El aceite de olivo en México y el mundo…………………………….. 11
1.2 Adulteración del aceite de oliva…………………………………………… 12
1.2.1 Características de identidad………………………………………….. 13
1.3 Fundamentos De La Espectroscopia Infrarroja Por Transformada De
Fourier (FTIR) utilizando Reflectancia Total Atenuada (ATR)………………. 15
1.3.1 Espectroscopia Infrarroja……………………………………………… 15
1.3.2 Espectrofotómetro Infrarrojo por Transformada de Fourier (FTIR). 18
1.3.3 Funcionamiento del espectrofotómetro (FTIR)…………………….. 18
1.3.4 Reflectancia Total Atenuada (ATR)………………………………….. 19
1.4 Quimiometría………………………………………………………………... 21
1.4.1 Calibración Multivariante……………………………………………… 22
1.4.2 El Programa Quant+…………………………………………………… 23
1.4.3. Calibración Multivariante, mediante el Programa QUANT+……… 24
1.4.4 Validación del modelo quimiométrico………………………………... 26
1.4.5 Modelo SIMCA (Soft Independent Modeling Class Analogy)……... 26
II. ANTECEDENTES…………………………………………………………….. 28
III. JUSTIFICACIÓN……………………………………………………………… 29
IV. OBJETIVOS…………………………………………………………………... 31
4.1 Objetivo General……………………………………………………………. 31
4.2 Objetivos Específicos………………………………………………………. 31
V. MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………………… 32
5.1 Materia Prima……………………………………………………………….. 32
5.2 Reactivos……………………………………………………………………. 32
5.3 Equipo……………………………………………………………………….. 32
VI. DESARROLLO EXPERIMENTAL…………………………………………. 33
6.1 Métodos Analíticos…………………………………………………………. 34
6.1.1 Densidad Relativa (NMX-F-075-1987)………………………………. 35
6.1.2 Índice de acidez en aceites (NMX-F-101)…………………………… 35
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6.1.3 Índice de saponificación (NMX-F-174-S)……………………………. 36
6.2 Criterios para la selección de los estándares………………………….... 37
6.3 Preparación de los estándares……………………………………………. 38
6.4 Método espectrofotométrico FTIR-HATR………………………………... 40
6.4.1 Obtención de los espectros…………………………………………… 40
6.4.2 Calibración de la información espectral por el programa Quant+… 42
6.4.3 Optimación de los modelos quimiométricos………………………… 42
6.4.5 Validación del método quimiométrico………………………………... 43
6.5 Desarrollo del modelo SIMCA ………………………………………….. 45
6.5.1 Optimación del modelo SIMCA………………………………………. 45
6.5.2 Validación del modelo SIMCA………………………………………... 46
VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………………………………………... 47
7.1 Características fisicoquímicas del aceite de oliva………………………. 47
7.2 Interpretación de los espectros FTIR-HATR…………………………… 48
7.3 Desarrollo de los modelos quimiométricos para identificar
adulteraciones……………………………………………………………………... 53
7.4 Validación de modelos quimiométricos…………………………………… 63
7.5 Desarrollo del modelo SIMCA……………………………………………... 67
7.6 Validación del modelo SIMCA……………………………………………... 70
VII. CONCLUSIONES……………………………………………………………. 74
IX BIBLIOGRAFIA……………………………………………………………….. 75
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I. INTRODUCCIÓN
La adulteración de productos alimenticios, implica el reemplazo de ingredientes
de alto costo por algunos sustitutos mas baratos y de menor calidad, lo cual
puede ser atractivo y lucrativo (Tay et al., 2002).
La adulteración de productos alimenticios no solamente representa un enorme
fraude económico, sino también puede tener importantes implicaciones para la
salud de los consumidores; por ejemplo, en la década de 1980`s, 200 muertes
y 20,000 personas mas enfermaron en la zona centro y noroeste de España
debido al consumo de aceite adulterado, el cual causo una enfermedad que fue
conocida como “Síndrome del Aceite Tóxico Español” (Jimeno, 1982). Es por
ello que la detección de cualquier tipo de adulteración es de gran importancia.
La producción de aceite de oliva es un gran negocio sujeto a serios intentos de
venta fraudulenta de aceites de oliva de menor calidad o que se encuentran
adulterados por la sustitución con otros tipos de aceite. Existen varios métodos
para la extracción del aceite de oliva, lo que origina aceites de distintos grados
de calidad, así pues el aceite de oliva extra virgen es obtenido del fruto del olivo
Olea europae sativa únicamente por métodos mecánicos, mientras que los
aceites de otros grados de calidad se obtienen también con ayuda de
extracción con solventes, tratamientos térmicos, esterificación o refinación
según sea el caso.
La composición de los aceites de los distintos grados de calidad esta basada
en la presencia de ácidos grasos en las moléculas de triglicéridos y su
localización en la estructura del glicerol. Esta composición varia no solamente
con el tipo de aceite y método de extracción, también lo hace a causa del
origen geográfico del fruto y el clima durante el cultivo y cosecha de los olivos,
estas variaciones pueden ser utilizadas para autentificar los aceites y detectar
adulteraciones en los mismos.
Se han utilizado varios métodos físicos y químicos para establecer la
autenticidad del aceite de oliva y detectar diferentes cantidades de adulterantes
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en este producto. La espectroscopia ultravioleta ha sido ampliamente utilizada
para detectar la adulteración de aceite virgen adulterado con aceites de oliva
refinados (Passaloglou-Emmanouillidou, 1990). Se ha reportado el uso de la
cromatografía de gases para realizar el análisis del perfil de ácidos grasos ha
sido reportado para cuantificar la adulteración de aceite de oliva con aceites de
semillas. (Morchio et al., 1989; Lanzon et al., 1989). El análisis de la
composición de ácidos grasos y triglicéridos se ha realizado por varias técnicas
analíticas como son la cromatografia de gases de alta resolución (HPLC)
(Sanchis y Rodríguez, 1991), resonancia magnética nuclear (NMR) (Sacchi et
al., 1990) y un método espectrofluorométrico (Marini et al., 1990).
Sin embargo los métodos convencionales para el análisis de los aceites de
oliva, son destructivos y toman mucho tiempo, involucrando el producto de la
hidrólisis de los ácidos grasos, lo que puede provocar pérdida de información
asociada con la localización de estos ácidos grasos en la estructura original del
glicerol (Tay et al., 2002). La autentificación de productos alimenticios y sus
constituyentes, es un enorme reto y de suma importancia en el análisis de
alimentos y generalmente para este tipo de análisis es necesario llevar a cabo
un complejo, tardado y tedioso tratamiento químico de las muestras antes de
aplicar alguna metodología.
En este sentido, la Espectroscopia Infrarroja por Transformadas de Fourier
(FTIR) en la actualidad esta demostrando ser una opción atractiva para el
análisis cualitativo y cuantitativo de los alimentos, ya que es utilizada como una
herramienta rápida, no destructiva de la muestra y precisa para autentificar
diversos tipos de alimentos como por ejemplo, adulteración de puré de fresa
(Holland et al., 1998), y jarabe de Maple (Paradkar e Irudayaraj, 2002), la
autenticidad de productos cárnicos (Arvanitoyannis et al., 2001), clasificación y
caracterización de vinos (Palma y Barroso, 2002).
Dada la probada utilidad de espectroscopia infrarroja aunada al análisis
multivariable en la detección de adulteraciones y autenticidad de los alimentos,
en este trabajo se estudia la factibilidad de utilizar esta metodología para la
detección de la adulteración del aceite de oliva con otros aceites.
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1.1 Generalidades
El aceite de oliva es el zumo o jugo oleoso extraído por prensado en frío de la
aceituna, fruto del olivo; es de color dorado o verdoso, denso y de aroma
perfumado. La palabra aceite deriva del nombre árabe az-zait, que significa
‘jugo de oliva’ (Bernardini E., 1981).
1.1.1 Clasificación de los aceites de oliva
En México la clasificación del aceite de oliva se establece en la norma NMX-F-
109-SCFI-2006. En la cual se encuentra la siguiente definición y clasificación.
Se entiende por aceite de oliva, el producto obtenido por medios mecánicos u
otros medios físicos en condiciones especialmente térmicas, de los frutos
maduros y sanos del olivo, Olea Europaea L., o el obtenido por extracción con
solventes de los orujos de los mismos frutos. Estos aceites son sometidos a
diversos y adecuados procesos de purificación.
Según la norma NMX-F-109-SCFI-2006, el aceite de oliva, (producto que es
objeto de esta) se clasifica en tres tipos según su composición y origen:
Tipo I Aceites de oliva vírgenes. Son los obtenidos exclusivamente por
procedimientos mecánicos y en condiciones especialmente térmicas de las
aceitunas, sin mezcla de ningún otro aceite de distinta procedencia.
Tipo II Aceites de oliva refinados. Son los obtenidos por procedimientos
mecánicos de las aceitunas, o de su orujo por extracción con solventes y que
son sometidos a un proceso de refinación.
Tipo III Aceites de oliva preparados a base de mezclas. Son los aceites
preparados a base de aceites de oliva vírgenes con uno de los refinados.
Dentro de esta clasificación el denominado “aceite de oliva” al que se refiere el
tipo III es el de mayor consumo tanto en México como en la Comunidad
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Europea, por lo que es este el producto al que se refiere este trabajo, el cual se
analizó. Por lo tanto el aceite de oliva que se utilizó se define de la siguiente
manera: aceite constituido por una mezcla de aceite de oliva refinado y de
aceites de oliva vírgenes aptos para el consumo en la forma en que se
obtienen. Su acidez libre expresada en ácido oleico es como máximo de 1 g
por 100 g.
1.1.2 Composición y propiedades del aceite de oliva
Se pueden considerar tres grandes grupos de sustancias en la composición del
aceite de oliva:
Fracción saponificable: comprende el 98-99 % en el total de su peso. Está
formada por los triglicéridos, ácidos grasos libres y fosfolípidos. Esta fracción
está formada por un 75.5 % de ácido oleico (C18:1), un 11.5 % de ácido
palmítico (C16:0) y por un 7.5 % de ácido linoleico (C18:2), además de otros
ácidos grasos en concentración de trazas.
Las grasas y el colesterol, para ser transportadas por la sangre, se asocian con
proteínas formando lipoproteínas: la proteína de baja densidad LDL (o
colesterol malo) y las proteínas de alta densidad HDL (o colesterol bueno). El
ácido oleico aumenta el colesterol bueno (HDL), que ejerce un papel protector,
ya que transporta el colesterol malo depositado en las arterias hasta el hígado
para su eliminación, reduciendo los riesgos de trombosis arterial y de infarto.
El colesterol malo (LDL) se deposita en las paredes internas de las arterias en
forma de placas de ateroma, estrechándolas, siendo el factor causante de la
ateroesclerosis, con el peligro que esto conlleva para las enfermedades
cardiovasculares (FAO, 1980).
Fracción insaponificable: constituye el 1.5 % en el total de su peso. Incluye
lípidos de origen natural tales como los esteroles, alcoholes alifáticos
superiores, hidrocarburos, etc. Se define como el conjunto de productos
presentes en la sustancia analizada que, después de una saponificación con
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hidróxido alcalino y de la extracción por un determinado disolvente, quedan
como no volátiles (Boskou, 1998).
Hidrocarburos.- en el aceite de oliva hay presentes dos hidrocarburos en
cantidades considerables: escualeno y β-caroteno, este ultimo de importancia
relevante como pigmento. Por su parte el escualeno es un precursor
bioquímico de la biosíntesis del esterol, es el principal constituyente de la
materia insaponificable (hasta el 40% del peso total).
Tocoferoles.- los tocoferoles son constituyentes de gran importancia ya que
contribuyen de forma importante a dar estabilidad al aceite de oliva, y tienen un
papel biológico como antioxidantes. Los beneficios que derivan del consumo en
la dieta del aceite de oliva, se deben parcialmente a su composición en ácidos
grasos y a la presencia de antioxidantes naturales. En la actualidad todos los
expertos están de acuerdo que el daño causado por los radicales libres esta
relacionado con los cambios celulares y extracelulares que ocurren con el
tiempo en el proceso de envejecimiento, en las enfermedades crónicas y en las
coronarias. Se ha sugerido también que la vitamina E puede ser adecuada para
reducir los riesgos coronarios (Boskou, 1998).
El principal homólogo de las formas de vitamina E presente en el aceite de
oliva, es el α-tocoferol que representa el 95% del total de tocoferoles, sin
embargo el contenido de estos depende mucho de la variedad de aceituna
utilizada, en los aceites de buena calidad las concentraciones de estos
compuestos están entre 100 y 300 ppm, aunque en aceites con alta acidez se
obtienen concentraciones de hasta 5 ppm.
Alcoholes grasos.- Estos son unos constituyentes menores pero importantes en
el aceite ya que pueden ser utilizados para diferenciar los tipos de aceites, los
principales alcoholes lineales presentes son: docosanol, tetracosanol,
hexacosanol y octacosanol.
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Esteroles.- son importantes constituyentes no glicéricos ya que están
relacionados con la calidad del aceite de oliva y son utilizados para comprobar
su autenticidad.
Pigmentos.- el aceite de oliva tiene un color que va desde el verde-amarillo
hasta el dorado, dependiendo de la variedad y del estado de madurez del fruto.
La composición y el contenido total de pigmentos presentes en forma natural
son importantes parámetros para la determinación de la calidad del aceite de
oliva, además de que estos pigmentos están involucrados en mecanismos de
autoxidación y fotoxidación (Boskou, 1998).
En el aceite de oliva las Clorofilas a y b y las feofitinas a y b, a las cuales son
convertidas por oxidación son las responsables del color, el contenido de estas
varia entre 1 y 20 ppm donde predomina la feofitina a con una concentración de
70 -80 %del total. El contenido de clorofilas depende en cierto grado del
sistema empleado en la extracción del aceite, así como de la variedad de
aceituna utilizada.
Los principales Carotenoides presentes en el aceite de oliva son: luteína, β-
Caroteno, violaxantina y neoxantina. El principal componente de la fracción
carotenoide del aceite de oliva es la luteína, seguida del β-Caroteno con
concentraciones de 0.5 a 4 ppm.
Compuestos Fenólicos.- el aceite de oliva contiene sustancias fenólicas que
afectan a su estabilidad, sabor y aroma. Los componentes fenólicos principales
son: oleoeupeina, ácido cafeico, ácido vinílico, siríngico, ácido p-cumárico,
protocatéquico, etc.
Los compuestos fenólicos le confieren al aceite estabilidad frente a la
autoxidación, además de que están relacionados con el sabor del aceite de
oliva, aunque su relación no esta muy clara todavía, debido a que la variedad y
naturaleza de los componentes minoritarios es imposible de conocer
exactamente (Boskou, 1998).
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1.1.3 El aceite de olivo en México y el mundo
El olivo (Olea europaea) es una especie típicamente mediterránea, por eso es
frecuentemente cultivada en condiciones limitadas, con diferentes niveles de
crecimiento y productividad (ASERCA, 2001).
A nivel mundial, el principal productor y consumidor es la Comunidad Europea
que según el Consejo Oleico Internacional produjo el 75 % del total de la
campaña 2005-2006, siendo los principales productores España, seguido de
Italia y Grecia con el 97% de la producción de este bloque de naciones (COI,
2006).
Figura 1.1. Estadísticas del Aceite de Oliva en México
0123456789
10111213
1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006Año
100
0 t
on
ela
da
s
Consumo
Importaciones
Exportaciones
Fuente: COI, 2008
Por lo que toca al aceite de oliva en México, de 1997 a 2006 el consumo de
este producto (Figura 1.1), mantuvieron una posición a la alza; no obstante las
importaciones son muy superiores a las exportaciones, pues hablamos en
miles de toneladas de las primeras, contra escasamente más de un centenar
de las segundas como se puede apreciar en la Figura 1.1.
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En cuanto a la producción de aceite, el futuro de nuestro país está en la venta a
Estados Unidos, pues el informe del Consejo Oleico Internacional indicó que la
Unión Europea produjo 1 928 500 toneladas en 2006 y su consumo fue de 1
9180 000 toneladas, es decir, casi todo es para autoconsumo, por lo que el
mercado estadounidense está libre de proveedores y tiene un consumo
creciente pues en diez años (de 1996 a 2006) a aumentado su consumo en
220% (COI, 2006).
Por otra parte, se sabe que la industria mexicana del aceite se ve afectada por
la venta de aceite adulterado, que representa alrededor de 20% de lo que
produce la industria legalmente, como resultado de los costos y precios
(ASERCA, 2001).
1.2 Adulteración del aceite de oliva
El aceite de oliva tiene una posición privilegiada entre los aceites comestibles,
por su delicado sabor, estabilidad y beneficios para la salud. Se produce en
áreas restringidas (principalmente en países mediterráneos), y se consume
directamente sin purificación. Por ello es caro y siempre se ha tratado de
adulterar mezclándolo con aceites vegetales y de orujo, más baratos. Una
investigación realizada en Estados Unidos en el año de 1982, demostró que
muchos aceites de oliva, tanto de importación como producidos localmente,
contenían una gran cantidad no declarada de aceite de orujo, aceites
esterificados y aceites de semillas. Estos hechos condujeron a la FDE a
establecer un programa de regulación para controlar el mercado.
Los adulterantes del aceite de oliva pueden incluir: aceites de semillas, aceite
de orujo de oliva, productos sintéticos que se preparan a partir de ácidos
grasos procedentes del propio aceite de oliva, que se recuperan de
subproductos del proceso de refinación, aceites ácidos de alto contenido en
oleico (de avellanas, de girasol, de palma), que se desesterolizan por refinación
fuerte. (Boskou, 1998).
Otros adulterantes potenciales son:
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� Aceites de oliva de menor calidad, cuyos ácidos grasos libres son
eliminados por medios simples tales como el “lavado” con agua alcalina.
� Aceites tratados con dienofilas, para reducir el aumento de absorciones
a 232 y 270 nm.
� Aceites deodorizados “suavemente” (la deodorización suave del aceite
de oliva esta prohibida)
� Aceite de orujo tratado con dicromato (este tratamiento oxida los
dialcoholes triterpénicos).
1.2.1 Características de identidad
Las características de identidad para los diversos tipos de aceites de oliva,
vienen dadas por las regulaciones del Codex Alimentarius y las normas
comerciales basadas en el COI.
Las normas del Codex Alimentarius contienen límites basados en pruebas
tradicionales, tales como la determinación del índice de yodo, índice de
refracción, índice de saponificación y materias insaponificables. Estas
constantes físicas y químicas, no están en la regulación de la Comunidad
Económica Europea, debido a que se obtiene una información mas definida
mediante la determinación del esterol total, alcoholes ácidos y contenido de
ceras, así como la composición de ácidos grasos, esteroles y triglicéridos
(Boskou, 1998).
La determinación de las constantes físicas y químicas con análisis tradicionales
tiene un valor muy limitado ya que actualmente es muy fácil preparar mezclas
fraudulentas que tienen características idénticas al aceite de oliva. Sin embargo
algunas pruebas tradicionales pueden ser útiles en el caso de adulteraciones
simples, como ejemplo, si se añade un aceite de semillas al de oliva aumentan
los índices de refracción y de yodo. Si se añade un aceite de semillas rico en
ácidos grasos de alto peso molecular, el índice de Bellver (medida del
contenido en ácidos araquídico, behénico y lignocérico) aumenta.
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El análisis de los esteroles es un medio efectivo para la detección de la
adulteración con aceites de semillas, especialmente con los que tienen un alto
contenido de ácido oleico. El valor mínimo adoptado por organizaciones
oficiales para el contenido de esterol total en el aceite de oliva es de 1000 ppm.
Esto es necesario para la detección de aceites “desesterolizados”. Los
porcentajes de β-sitosterol y Estigmasterol son tambien importantes para la
detección de aceites de semillas con una composición similar de ácidos grasos.
El aceite de oliva tiene un porcentaje de β -sitosterol mayor del 90 % y un
porcentaje de Estigmasterol que no excede de 0.5 %. Sin embargo se han
detectado aceites de oliva genuinos con valores ligeramente mas altos a los
limites, pero es un problema que la COI debe enfrentar en esta determinación
(Boskou, 1998).
Otros métodos utilizados para la detección de adulteraciones de aceite de oliva
con alguno de otra semilla, son basados prácticamente en reacciones con
formación de color, de hecho la norma mexicana NMX-F-109-1982 que regula
el aceite de oliva en nuestro país se basaba en este tipo de métodos para la
detección de estas adulteraciones hasta que fue sustituida en el 2006 por
NMX-F-109-SCFI-2006, la cual ya no considera estos parámetros y en su lugar
presenta las especificaciones de composición de ácidos grasos en el aceite, los
cuales se determinan por cromatografía de gases; sin embargo tiene la
desventaja de ser una técnica laboriosa y que requiere un tiempo de análisis
largo, para conocer si el aceite se encuentra adulterado. Es por esto que en los
últimos años se han buscado nuevas metodologías analíticas para acelerar el
tiempo de diagnóstico. La espectroscopia FTIR en conjunto con el análisis
multivariables es una posible opción para la detección de la adulteración del
aceite de oliva.
1.3 Fundamentos De La Espectroscopia Infrarroja Por Transformada De
Fourier (FTIR) utilizando Reflectancia Total Atenuada (ATR)
La Espectroscopía Infrarroja que antes era primordialmente un método
cualitativo se ha convertido en una técnica analítica cuantitativa, gracias al
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desarrollo de nuevas tecnologías en la detección (FTIR) como en el manejo de
muestras (ATR) todo esto acoplado al procesamiento estadístico, casi
inmediato, de la información espectral por medio de los programas
computacionales quimiométricos. Esto ha dado pauta a querer establecer
métodos analíticos quimiométricos por infrarrojo para el control de calidad de
varios tipos de muestras sin tener que llevar a cabo un largo pretratamiento de
la muestra (Perkin Elmer, 1990).
En años recientes el empleo de este análisis como método cuantitativo ha
tenido un gran auge, debido a la selectividad que se tiene en una mezcla
compleja, sin que se lleve a cabo un excesivo trabajo previo de separación y al
uso de la quimiometría (Perkin Elmer, 1993). A continuación se hace una breve
descripción de las tendencias de la espectroscopia infrarroja y quimiometría.
1.3.1 Espectroscopia Infrarroja
Espectroscopía infrarroja (Espectroscopía IR) es la rama de la espectroscopía
que trata con la parte infrarroja del espectro electromagnético. La porción
infrarroja del espectro electromagnético se divide en tres regiones; el infrarrojo
cercano, medio y lejano, así nombrados por su relación con el espectro visible.
TABLA 1.1. Clasificación del Infrarrojo
Infrarrojo Cercano 14286 a 4000cm -1
Infrarrojo Medio 4000 a 200cm -1
Infrarrojo Lejano 200 a 20cm -1
La radiación electromagnética infrarroja tiene una energía que no es suficiente
para producir transiciones electrónicas; sin embargo, su energía es similar a las
pequeñas diferencias energéticas entre los distintos estados vibracionales y
rotacionales existentes en la mayoría de las moléculas (Macho, 2002).
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La espectroscopía de absorción en el infrarrojo tiene su origen en las
vibraciones moleculares. El espectro de infrarrojo de una molécula se obtiene
como resultado de medir la intensidad de una radiación exterior absorbida, para
cada longitud de onda, que hace posible la transición entre dos niveles de
energía vibracional diferentes. Cada una de estas absorciones características
de energía se corresponde con un movimiento vibracional de los átomos en la
molécula (Macho, 2002).
En moléculas sencillas es posible definir el tipo de vibraciones que tienen lugar
entre los distintos átomos enlazados e identificar la radiación electromagnética
que es absorbida para modificar su estado vibracional. En moléculas complejas
esta posibilidad es más difícil tanto por el elevado número de vibraciones como
por las interacciones entre los distintos centros vibracionales que se producen.
La radiación infrarroja absorbida por las moléculas, ocasiona una modificación
en los niveles de energía vibracional que permite identificar grupos funcionales
(átomos enlazados) en la molécula y la identificación de la misma (Macho,
2002).
Los modos vibracionales de las moléculas (figura 1.2), debido a la absorción de
la radiación infrarroja, pueden ser:
1. De tensión (stretching). Este tipo de vibración supone un cambio continuo en
la distancia interatómica a lo largo del eje de enlace de dos átomos.
a) Simétrica. En grupos simétricos el estiramiento no conlleva a un cambio en
el momento dipolar, y por lo tanto la vibración no se detecta en el infrarrojo.
b) Asimétrica. En el estiramiento asimétrico, sí se presenta un cambio en el
momento dipolar, por lo que la vibración sí es detectada en el infrarrojo.
2. De flexión (bending). Se caracteriza por un cambio en el ángulo de dos
enlaces (la posición de los átomos varía en relación al eje de enlace original).
a) De tijera. Dos átomos unidos un átomo común se mueven acercándose y
alejándose uno del otro.
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b) De oscilación o balanceo. Los átomos unidos al átomo común se mueven
alternativamente de un lado hacia el otro en el plano de simetría de la
molécula.
c) De sacudida o aleteo. Los átomos unidos al átomo de carbono se mueven
alternativamente de un lado hacia otro en un plano de simetría de la molécula.
d) De torsión. Los átomos unidos al átomo común se mueven alternativamente
en dos direcciones alrededor del plano de simetría de la molécula (Perkin
Elmer, 1990).
Figura 1.2 Vibraciones moleculares
Los equipos más modernos utilizados en la actualidad, son los
Espectrofotómetros Infrarrojos por Transformada de Fourier (FTIR). Estos
ofrecen un gran avance en la alta sensibilidad, resolución y rapidez de
adquisición de los espectros, lo cual consiguen con instrumentos acoplados a
una computadora para decodificar la salida de datos y transformarlos en el
espectro IR de la muestra (Skoog y col. 1992).
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1.3.2 Espectrofotómetro Infrarrojo por Transformada de Fourier (FTIR)
El espectrofotómetro infrarrojo por transformada de Fourier (figura 1.3) es
denominado así porque en lugar de dispersar la luz, utiliza un interferómetro del
que se obtiene una señal llamada interferograma (Perkin Elmer, 1993).
El FTIR utiliza un interferómetro de Michelson de barrido, para obtener una
señal en el detector que es muestreada a intervalos precisos controlados
mediante una señal de referencia incidente en el detector y que se produce por
la modulación del rayo láser de helio – neón (Willard y col. 1991).
La señal resultante en el detector (interferograma), se almacena en la memoria
del equipo y contiene toda la información requerida para construir el espectro
por medio de un procedimiento matemático conocido como Transformada de
Fourier que se lleva a cabo automáticamente por la computadora del equipo, la
cual finalmente envía el espectro al monitor de la computadora (Willard y col.
1991).
El uso de láser helio-neón como referencia, trae como consecuencia una mayor
resolución del espectro con una exactitud de número de onda menor a 0.01
cm-1, en el intervalo de 4800 a 400 cm-1. Ya que en el FTIR, todas las
longitudes de onda se detectan simultáneamente durante el barrido, el
interferómetro mejora la relación espectral señal-ruido que un
espectrofotómetro dispersivo, resultando un espectro IR más definido (Willard y
col. 1991).
1.3.3 Funcionamiento del espectrofotómetro (FTIR)
En la figura 1.3 se muestra un esquema óptico de un espectrofotómetro basado
en la transformada de Fourier en la cual se observa que el rayo infrarrojo es
generado en la fuente (A) y, posteriormente, colimado y dirigido hacia el
interferómetro (C) por medio de un espejo fijo toroidal (B). El rayo del láser de
Helio-Neón sigue a la radiación infrarroja a través del interferómetro con objeto
de determinar el desplazamiento del espejo móvil y para conocer la longitud de
onda a la que se produce la absorción de radiación. A la izquierda del
- 19 -
compartimento de la muestra se encuentra un espejo toroidal ajustable (D) que
conduce el rayo procedente del interferómetro a la muestra. Desde el
compartimento de la muestra el rayo llega, a través de una rendija, a un
detector térmicamente estable de tantalato de litio (Perkin Elmer, 1996).
Figura 1.3 Espectrofotómetro Infrarrojo de Transformada de Fourier
1.3.4 Reflectancia Total Atenuada (ATR)
El uso de la Reflectancia Total Atenuada en la Espectroscopia Infrarroja, facilita
el análisis de líquidos, pastas, geles, semi – sólidos y polvos, el cual es un
cristal (selenuro de zinc) que transmite el rayo infrarrojo y que tiene un alto
índice de refracción y los espectros de dichas muestras se pueden obtener con
un mínimo de pretratamiento.
En la técnica de ATR acoplada a FTIR, un rayo infrarrojo penetra en el cristal,
la reflexión interna del rayo en este material genera una onda que se va
disipando. A cada reflexión la onda viaja más allá de la superficie del cristal y
penetra en la muestra que se mantiene en íntimo contacto con el cristal. La
profundidad de penetración del rayo es básicamente del orden de unos pocos
micrones, por lo que pueden ser analizados materiales muy espesos y con muy
poca cantidad de muestra (Perkin Elemer, 2003).
- 20 -
En el accesorio de Reflectancia Total Atenuada Horizontal (HATR) el cual es el
más utilizado, la muestra se aplica sobre el cristal en forma horizontal, lo cual
permite analizar todo tipo de materiales (Fig. 1.4).
Figura. 1.4 Óptica del accesorio de Reflectancia Total Atenuada
En el dispositivo HATR La radiación infrarroja proveniente del
espectrofotómetro es dirigida a la cara interior biselada del cristal de ATR (Fig.
1.5). El rayo se refleja por el cristal y durante cada reflexión a los largo de la
superficie del cristal, una cantidad finita de radiación pasa hacia la muestra. A
la salida del cristal, el rayo se desvía hacia un espejo y regresa a la trayectoria
normal del espectrofotómetro (Perkin Elemer, 2003).
Figura 1.5 Incidencia Del Rayo En La Muestra
- 21 -
1.4 Quimiometría
En 1972, Svante Wold introduce por vez primera el término Quimiometría,
término que fue rápidamente aceptado por quienes trabajaban en la aplicación
de las Matemáticas a la Química. En colaboración con Bruce Kowalski funda, la
Chemometrics Society, y en 1975 se alcanza un conceso para definir la
Quimiometría como la disciplina que utiliza métodos y técnicas matemáticas,
estadísticas y de lógica formal para: a) diseñar y seleccionar procedimientos
experimentales óptimos y b) extraer la máxima información relevante a partir
del análisis de datos (Morer, 2003).
La Quimiometría ha sido aplicada exitosamente en la Espectroscopia Infrarroja
Media (MID – IR), en sus modalidades de absorción, reflexión emisión y de
Reflectancia Total Atenuada (ATR). También se han desarrollado aplicaciones
en la Espectroscopía UV, Resonancia Magnética Nuclear, Espectroscoía de
Masas, Espectroscopía Acústica, Electroforesis y Cromatografía.
Así el objetivo de la quimiometría es desarrollar una técnica práctica para la
resolución de problemas analíticos utilizando una gran variedad de
herramientas matemáticas y estadísticas, La calibración y predicción
multivariante son una de estas herramientas matemáticas, la cual es la más
utilizada en la quimiometría aplicada a los alimentos (Beebe y col., 1998)
Los métodos generalmente utilizados en la quimiometría son la calibración
multivariante y el diseño experimental estadístico. Dentro de estas técnicas
matemáticas se encuentran:
1.- La regresión Lineal Múltiple (MLR=Multiple Linear Regession)
2.- La Regresión de Mínimos Cuadrados Parciales (PLS=Partial Least Squares
Regression).
3.- La Regresión por Componentes Principales (PCR= Principal Components
Regression).
- 22 -
Así como en el análisis cuantitativo tradicional, en el análisis quimiométrico
ocurre que, tras establecer una serie de condiciones para el análisis se
prepararan disoluciones patrón cuya composición en general es similar a las
muestras reales y abarcan cierto intervalo de concentraciones para la especie,
o especies a determinar. Las medidas de absorbancia o unidades
proporcionales de concentración se realizan con los instrumentos adecuados y
se obtienen los espectros correspondientes.
Al efectuar la calibración, el analista especifica el número de componentes y
sus respectivas concentraciones en cada uno de los espectros, selecciona la
región del espectro que proporcione más datos sobre el comportamiento del
sistema y a partir de esta información, plantea la matriz de calibración que le
servirá para “predecir” la concentración de los componentes en cada muestra
real que analice bajo la misma metodología (Haaland D., Thomas, 1988).
1.4.1 Calibración Multivariante
Dentro de la quimiometría la calibración multivariante es el método
generalmente mas utilizado para los estudios, la principal ventaja de la
calibración multivariante frente a la univariante es que no requiere medidas
instrumentales selectivas. La muestra puede contener, junto con el analito,
otros componentes que contribuyen a la señal de forma no constante. Otra
ventaja es que la señal multivariante permite detectar muestras discrepantes en
predicción (outliers). Esto no es posible en calibración unívariante (Joan Ferré,
2004).
La calibración es el proceso de construir un modelo matemático para relacionar
la lectura de un instrumento (por ejemplo un espectro FTIR) con las
propiedades de la muestra (concentración de un constituyente de la muestra,
de un adulterante, propiedad física, etc. La predicción por otro lado es el
proceso de utilizar ese modelo para predecir las mismas propiedades de un
muestra, dada la lectura del instrumento. De esta manera la calibración
multivariante es el proceso de relacionar múltiples respuestas de un
instrumento a una o varias propiedades de una muestra (Beebe y col., 1998).
- 23 -
1.4.2 El Programa Quant+
Este es un programa computacional de análisis quimiométrico cuantitativo apto
para el análisis espectroscópico de multicomponentes. El programa se puede
dividir en siete etapas para la alimentación y corrimiento efectivo del programa:
Fase 1. Descripción.
En esta fase se indica el título del trabajo y el nombre del analista.
Fase 2. Determinación de Parámetros.
En este punto se establecen los parámetros con los cuales se regirá el método,
como son:
>Límites de longitud de onda en el cual se trabajará
>Se indica el poder de resolución
>Se establecen los intervalos de los blancos del medio ambiente (CO2 y Agua)
para omitirlos y evitar interferencias.
>Se indica el número de barridos por cada muestra (1, 4, 16, 32 y 80)
Fase 3. Tabla de Estándares.
Se vierten las concentraciones de cada uno de los componentes y se toma el
modelo de Validación (Full Cross o Independiente)
Fase 4. Configuración
Establece el Método espectrofotométrico (UV, IR y NIR) acoplado al programa.
Establece el Método de Calibración Multivariante a utilizar: regresión por
componentes principales (PCR) y Regresión por Mínimos Cuadrados Parciales
(PLS1 y PLS2)
Se indican los directorios de archivos de los espectros de los estándares y
archivos de trabajo.
Fase 5. Opciones del Reporte de Resultados.
Se elige el método estadístico para el manejo de resultados.
- 24 -
Fase 6. Calibración
Se elige entre dos opciones: manual o asistente experto automático (este
último es el que generalmente se utiliza).
Fase 7. Predicción
Se elige del archivo de espectros problema el correspondiente para llevar a
cabo la predicción de las concentraciones porcentuales de los componentes de
la muestra, utilizando la curva tipo ya calibrada resultante de las fases
anteriores.
Fase 8. Resultados.
En esta fase aparece automáticamente en pantalla, la tabla de resultados de la
predicción realizada en la fase 7, donde se reporta:
a) Concentración porcentual del o los componentes de la muestra
b) Parámetros de Confiabilidad.
-Relación Residual Total para PCR.
-Distancia de Mahalanobis Total para cada Componente en PLS.
-Distancia de Mahalanobis Total para cada Componente en PLS.
-Relación Residual de cada Componente en PLS.
(Perkin Elmer, 1991)
1.4.3. Calibración Multivariante, mediante el Programa QUANT+
El programa quimiométrico Quant+ descompone la información alimentada a la
computadora en forma de espectros IR y de las concentraciones de los
estándares en la señal y ruido, generando modelos matemáticos del tipo:
X = TP’ + E
Y = TQ’ + F
- 25 -
Donde:
X, Y = Son dos propiedades de la muestra
T = Matriz de concentraciones especificadas (Vectores score)
P’ = Matriz inversa de la información espectral correspondiente a la propiedad X.
Q’ = Matriz inversa de la información espectral correspondiente a la propiedad Y.
E, F = Variabilidad alrededor del modelo para las propiedades X y Y, respectivamente.
A la variabilidad alrededor del modelo (E, F) se le conoce como residuales. A
menudo se presentan como varianza residual o como RMSEP (Root Mean
Square Error Prediction (Tryggvasons, 1996).
El objetivo de la calibración es obtener parámetros de regresión que permitan
calcular la concentración de futuras muestras de forma que, para cada muestra
i y analito j, y el residual de la concentración, fj, que se espera sea el menor
posible.
Se desea minimizar algún tipo de error de predicción medio para la población a
la que se aplicará la calibración. Para evaluar esa capacidad predictiva, se
suele usar el sumatorio del cuadrado de los residuales,
denominado habitualmente PRESS (Predicted Residual Error Sum of Squares)
(Porcel, 2001).
El cálculo de la concentración utilizando el modelo construido se denomina
“predicción”. Así se puede calcular el valor medio del PRESS: MSE (Mean
Squared Error) de la predicción (MSEP), También se suele usar la raíz
cuadrada de este valor (RMSEP, Root Mean Square Error Prediction) que
también se conoce simplemente como SEP.
El SEP (Standar Error of Prediction, Error Estándar de Predicción) puede
definirse como el error promedio entre los valores especificados y los
estimados de la propiedad, de las nuestras no usadas en la calibración (Porcel,
2001) ( )
p
m
i
ijij
m
yy
SEPRMSEP
p
∑−
−== 1
2ˆ
- 26 -
1.4.4 Validación del modelo quimiométrico
La validación es el proceso de verificar qué tan bien trabaja el modelo en la
predicción. Consiste en construir el modelo con una serie de muestras de
calibración y aplicarlo en otra serie de muestras de validación, que no
pertenece al modelo pero que se encuentra dentro del intervalo del primero. Se
comparan los valores calculados de una cierta propiedad con los valores
conocidos de esa misma propiedad en la serie de validación y se calcula el
valor promedio de predicción (Beebe et. al., 1998).
El RMSECV (Root Mean Squared Error of Prediction by Cross Validation),
también conocido como SEE (Standar Error of Estimate, Error Estándar de
Calibración) es el error promedio de los valores especificados para una
propiedad y los valores estimados de los estándares calibrados de un modelo
determinado.
( )p
m
i
ijij
m
yy
SEERMSECV
p
∑−
−== 1
2ˆ
Para obtener un método quimiométrico robusto y confiable, es necesario tener
en cuenta que tanto el SEE como el SEP deben ser lo más bajos posibles, es
decir, que presenten la mínima diferencia entre la medida de los valores
estimados o predichos por el modelo (Porcel, 2001).
1.4.5 Modelo SIMCA (Soft Independent Modeling Class Analogy)
Con el uso de la quimiometría se producen diversos patrones de
reconocimiento con el modelo Soft Independent Modeling Class Analogy
(SIMCA) que permite clasificar materiales semejantes en grupos definidos y
además tiene el poder de discriminar muestras desconocidas (Beebe et al.,
1998).
El modelo quimométrico SIMCA se basa en el Análisis de Componentes
Principales (PCA) que analizan la variaciones ocurridas con el sistema de
- 27 -
datos, es decir, es una técnica que al reducir la dimensionalidad de los datos,
permite su visualización reteniendo tanto como sea posible información
presente en los datos originales, de esta manera PCA transforma las variables
originales en nuevas variables llamadas componentes principales y cada uno
de estos de estos es una combinación lineal de las variables originales
(Berrueta et al., 2007)
- 28 -
II. ANTECEDENTES
La potencialidad de las técnicas de vibración tales como la espectroscopia
infrarrojos por transformadas de Fourier, en combinación con el Análisis de
Componente Principal, ha sido recientemente estudiada y reflejada en un
trabajo por Lay y sus colaboradores. El espectro infrarrojo medio de la mayor
parte de los aceites vegetales es básicamente similar y esta dominado por las
vibraciones C-H y C-O. Sin embargo pueden existir diferencias sutiles entre los
espectros debidos a pequeñas diferencias de las cadenas de polietileno. Estas
últimas son una fuente de información que se puede explotar (Boskou, 1998).
La Espectroscopia (FTIR-ATR) ha sido utilizada para la autentificación del
aceite de olivo y su adulteración con otros aceites refinados de oliva y de orujo
con resultados variables pero satisfactorios según los autores de los mismos
principalmente por la facilidad de manejo de muestra y la versatilidad de las
determinaciones comparadas con otras tecnologías relativamente nuevas que
se aplican a estos análisis, como son: el análisis de perfiles de ácidos grasos
después de una mutilación usando cromatografía de gas el cual ha sido
reportado para la cuantificación de aceites de semillas en el aceite de
olivo(Kapoulas y Passaloglou-Emmanouillidou, 1981), así como la detección de
adulteración del aceite de oliva mediante el análisis HPLC de la composición de
ácidos grasos y triglicéridos (Sanchez y Rodríguez, 1991), entre otros, los
cuales presentan sus ventajas y desventajas.
Uno de los trabajos mas recientes presentado sobre este tema es un estudio
realizado sobre la adulteración del aceite de oliva con aceite de girasol, en el
cual se estudian varias muestras adulteradas con Aceite de girasol creando un
modelo que les permitiera predecir la adulteración del aceite de oliva extra
virgen con aceite de girasol a partir de un Método quimiométrico y utilizando la
espectroscopía Infrarroja. Además se realizó la validación del método dando
buenos resultados y obteniendo un modelo confiable para la determinación de
esta adulteración (Tay y col. 2002).
- 29 -
III. JUSTIFICACIÓN
El aceite de oliva tiene por supuesto una posición privilegiada entre los aceites
comestibles, debido a las propiedades sensoriales y agradables al paladar y los
beneficios para la salud que ofrecen las propiedades de sus principales
componentes, así como por ser la base de una dieta que cada vez toma mayor
consideración e importancia a nivel mundial como lo es la dieta Mediterránea.
También todo esto ha provocado que el aceite de oliva vaya incrementando
cada vez más su valor en el mercado así como su consumo y por supuesto el
hecho de que el cultivo del olivo se de en zonas restringidas del mundo debido
a las condiciones climáticas hacen que el precio de este producto sea elevado,
convirtiéndolo en un blanco frecuente para delincuentes que buscan realizar un
fraude mediante su adulteración con productos mas baratos, como los son
otros aceites comestibles.
En México el mercado del aceite de olivo tiene futuro con la exportación a
países como Estados Unidos y algunos europeos que consumen prácticamente
toda su producción, sin embargo las investigaciones realizadas por el vecino
país del norte has demostrado que las adulteraciones en el aceite de oliva es
muy frecuente, lo cual ha afectado de manera significativa el desarrollo de este
mercado en nuestro país.
La importancia del aceite de oliva en el mundo es innegable, principalmente en
la Unión europea, de la misma manera que se sabe que las adulteraciones en
este producto son muy lucrativas y frecuentes, por lo que se requiere de
métodos de análisis que permitan detectar estos fraudes a tiempo y de manera
practica.
En cuanto a este producto, se han tenido diversas complicaciones en cuanto a
metodología de análisis se refiere, pues los métodos hasta ahora utilizados
carecen muchos de ellos de una confiabilidad absoluta debido principalmente a
la naturaleza, diversidad y concentraciones que presentan los diferentes
componentes del aceite de oliva.
- 30 -
Por otro lado la Espectroscopía infrarroja con reflectancia total atenuada por
transformadas de fourier (FTIR-ATR) ha sido utilizada ampliamente y en los
últimos años con grandes resultados en varios análisis de adulteraciones
además de contar la ventaja de la versatilidad y facilidad de la determinación,
considerando que los análisis tradicionales realizados al aceite de oliva son en
la mayoría destructivos y además con una eficiencia y confiabilidad enjuiciables
en muchos aspectos.
Por ello el presente trabajo estudió la factibilidad de desarrollar un método
analítico que sea capaz no solo de detectar la adulteración del aceite de oliva
con otros aceites de manera simultanea, sino que sea también capaz de
cuantificar tal adulteración y de una forma sencilla, practica y confiable,
basándose en la Espectroscopia Infrarroja por Transformadas de Fourier con
Reflectancia Total Atenuada, asi como el apoyo de un programa estadístico
multidimensional comercial llamado QUANT+, generando de esta manera un
método quimiométrico.
- 31 -
IV. OBJETIVOS
4.1 Objetivo General
Detectar y determinar la adulteración del aceite de oliva con tres aceites
comerciales utilizados como adulterantes (girasol, soya y canola), mediante la
Espectroscopía Infrarroja por Transformada de Fourier y la técnica de
Reflectancia Total Atenuada así como el uso de un programa de análisis
estadístico multidimensional.
4.2 Objetivos Específicos
� Elaborar una matriz de calibración multivariante para la determinación de
la adulteración de aceite de olivo de manera porcentual con 3 diferentes
aceites comestibles y obtener los espectros infrarrojos correspondientes.
� Llevar a cabo el análisis multivariante utilizando el algoritmo PCR, PLS1
y PLS2 para elegir el método quimiométrico mas adecuado para la
cuantificación del adulterante.
� Validar el modelo multivariante prediciendo la concentración de los
adulterantes (aceites de girasol, soya y canola) presentes en muestras
de concentraciones conocidas, con la finalidad de establecer la
confiabilidad de los resultados.
� Predecir la adulteración con los aceites analizados como adulterantes de
algunas muestras de aceite de oliva comercial.
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V. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 Materia Prima
Se utilizaron en este estudio muestras de los siguientes aceites comestibles
comerciales: aceite de canola, aceite de girasol y aceite de soya. Todos fueron
adquiridos en un supermercado de la ciudad de México en 2008. El aceite de
oliva de grado virgen de la marca Caripelli fue elegido ya que en una
investigación llevada a cabo por la PROFECO (PROFECO, 2008) se determinó
como el aceite de oliva de este grado con mejor calidad en el mercado
mexicano y que no se encontraba adulterado.
5.2 Reactivos
Se utilizó agua destilada y una solución de detergente comercial lavatrastos al
10% y Hexano (Merck) para los lavados del accesorio HTR. También se
utilizaron acido clorhídrico 0.5N, alcohol etílico, hidróxido de potasio (Merck),
solución indicadora de fenolftaleina (Merck).
5.3 Equipo
• Espectrofotómetro MID-FTIR 1600 PerkinElmer
• Accesorio de Reflectancia Total Atenuada con celda horizontal de ZnSe.
• Material de uso común en laboratorio
• Programas de computación:
o Spectrum Quant+ versión 4.51.02 (PerkinElmer, 1991)
o AssureID Method 3.0.0.132 (PerkinElmer, 2005)
o PE GRAMS Analyst 1600 3.0.0.32 (Galactic Industries Corp,1994)
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Materia Prima
Preparación de Muestras
Adulteradas
Obtención de Espectros FTIR-HATR de muestras
Adulteradas.
DESARROLLO DE MODELOS
QUIMIOMÉTRICOS
Alimentación de los espectros
FTIR-HATR junto con sus porcentajes de adulteración
al programa QUANT+
Calibración (PCR, PLS1, PLS2)
Optimización (PCR, PLS1, PLS2)
Validación (PCR, PLS1, PLS2)
DESARROLLO DEL
MODELO SIMCA
Predicción con el modelo optimizado
VI. DESARROLLO EXPERIMENTAL
Los pasos realizados para la obtención del modelo quimiométrico se
pueden resumir en el siguiente diagrama, donde se observa que la primera
parte del desarrollo consiste en la obtención de los espectros, para su posterior
utilización en el programa QUANT+.
Figura 4.1 Metodología Experimental
- 34 -
6.1 Métodos Analíticos
Se determinaron algunos parámetros fisicoquímicos del aceite de oliva
utilizado en esta investigación con la finalidad de comparar estas
características con las determinadas por la norma mexicana NMX-F-109-1982.
6.1.1 Densidad Relativa (NMX-F-075-1987).
El método consiste en determinar la masa a volúmenes iguales de agua y de
aceite o grasa vegetal o animal que se utilizaron para calcular la relación entre
ambos valores.
Procedimiento
Se determina la masa del picnómetro completo, limpio y seco con la precisión
de 0.1 mg; se llena con agua destilada evitando la formación de burbujas de
aire se coloca el termómetro, se enrasa la rama capilar del picnómetro con
agua destilada a la misma y se tapa; se extrae del baño, se limpia, se seca
exteriormente y se determina su masa con la precisión de 0.1 mg. El
picnómetro se vacía y luego se lava. Se seca interiormente y exteriormente con
un paño seco. Se llena el picnómetro con el aceite o grasa vegetal o animal
homogeneizado, evitando la formación de burbujas de aire; se enrasa la rama
del capilar del picnómetro con el aceite y se tapa, después se procede como se
detalla para el agua destilada.
La densidad relativa se calcula con las siguientes expresiones:
G1 = M1 - M
G2 = M2 - M 2
1
G
G=δ
Donde:
M1 = Masa del picnómetro con muestra.
M2 = Masa del picnómetro con agua,
M = Masa del picnómetro vacío.
- 35 -
G1 = Masa neta del aceite o grasa.
G2 = Masa neta del agua.
d= Densidad relativa del aceite o grasa a temperatura
6.1.2 Índice de acidez en aceites (NMX-F-101).
Este método se basa en la titulación de los ácidos grasos libres, con un álcali.
El índice de acidez es la cantidad en miligramos de hidróxido de potasio
necesaria para neutralizar los ácidos grasos libres en 1.0 g de aceites o grasa.
Procedimiento
A una muestra de 3.5 gramos, contenida en un matraz Erlenmeyer de 300 cm3,
se le agregan 100 centímetros cúbicos de alcohol etílico como lo indica la tabla
anterior, previamente neutralizado; calentando suavemente el matraz en baño
de agua hasta disolución completa, y después se agrega 1 cm3 de fenolftaleina;
se titula la mezcla con la solución de hidróxido de potasio valorada, agitando
frecuentemente hasta que una coloración rosada persista durante 30
segundos.
Se debe expresar como por ciento de ácido oleico, palmítico o láurico aplicando
la siguiente expresión, utilizando el meq del ácido graso de referencia:
% Ácidos grasos libres = 100282.0 ×××
P
VN
En donde:
meq = miliequivalente químico del ácido graso de referencia
N = normalidad de la solución de hidróxido de potasio.
V = cm3 de solución valorada de hidróxido de potasio gastados en la titulación
de la muestra.
P = peso de la muestra en gramos.
- 36 -
6.1.3 Índice de saponificación (NMX-F-174-S).
El índice de saponificación: Es la cantidad de hidróxido de potasio expresado
en miligramos, necesario para saponificar un gramo de aceite o grasa. Este
método se basa en la reacción química de los ácidos grasos con un álcali,
formándose la sal del ácido.
Procedimiento
Se coloca la muestra en el matraz Erlenmeyer, se le agregan 50 cm3 de
hidróxido de potasio en solución alcohólica exactamente medida con pipeta
volumétrica en un tiempo definido.
Al matraz se le adapta el refrigerante de reflujo y se coloca en un baño María
hirviente durante 30 minutos, agitándolo frecuentemente. La saponificación se
prolonga de 30 a 60 minutos para que sea completa. Una vez terminada la
saponificación de 60 minutos se le agrega 1 cm3 de solución indicadora de
fenoltaleína al 1.0 % titulándose en frío, con ácido clorhídrico 0.5 N; para
observar con claridad y precisión el punto final, considerándose como tal
cuando después de transcurrir medio minuto de que se agrega la última gota
del ácido clorhídrico 0.5 N se produce la decoloración.
Se hace una prueba testigo usando la misma cantidad de reactivo.
Para obtener el índice de saponificación se aplica la siguiente expresión:
I. S. = 05.281 ×−P
VV
I.S. = Índice de saponificación
V1 = Centímetros cúbicos de solución de ácido clorhídrico 0.5 N empleados en la
titulación del testigo.
V = Centímetros cúbicos de ácido clorhídrico 0.5 N empleados en la titulación de la
muestra.
P = Masa de la muestra en gramos
28.05 = Miligramos de hidróxido de potasio equivalente a 1 cm3 de ácido clorhídrico
0.5 N
- 37 -
6.2 Criterios para la selección de los estándares
Se han reportado en la literatura una gran diversidad de adulterantes del aceite
de oliva, entre ellos una amplia variedad de aceites vegetales así como de
semillas (Boskou, 1998), de los cuales se han realizado estudios de algunos de
estos anteriormente, se selecciono entonces un grupo de tres adulterantes,
aceites de soya, girasol y de canola, los últimos dos debido a las semejanzas
en su composición de ácidos grasos saturados, mono-insaturados y poli-
insaturados con respecto a la composición de estos mismos en el aceite de
oliva, por lo que podría ser difícil su determinación con los métodos
tradicionales.
El aceite de soya por otra parte, es en el mercado uno de los aceites
comestibles con menor precio, lo cual es atractivo para utilizarlo como
adulterante del aceite de oliva.
Se seleccionó un intervalo del 2 al 50% debido a que en la mayoría de los
métodos para la detección de adulterantes son más difíciles de detectar o
cuantificar en menores concentraciones del adulterante, por ejemplo en los
métodos mencionados en la norma de aceite de oliva (NMX-F-109-SCFI-2006).
NMX-F-050-SCFI-2006
NMX-F-265-SCFI-2005
NMX-F-109-SCFI-2006.
NMX-F-475-SCFI-2005
Figura 6.1. Composición promedio del aceite de oliva y aceites utilizados como adulterantes.
0% 20% 40% 60% 80% 100%
Oliva
Canola
Soya
Alto Oléico
Monoinsaturada Saturada Poliinsaturada
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6.3 Preparación de los estándares
Se prepararon muestras de 10 ml de mezclas de aceite de oliva con aceite de
soya, canola y girasol con concentraciones conocidas de los tres adulterantes
utilizados respectivamente, estas concentraciones iban del 2 al 50% con
aumentos de 2% en cada una de las series de estándares. Estas se prepararon
en tubos de ensaye en los cuales se homogenizó la mezcla utilizando un
agitador de vidrio mezclando constantemente durante dos minutos cada una
con la finalidad de obtener mezclas completamente homogéneas y con las
mismas características de preparación. Se prepararon en total 25 muestras con
cada adulterante respectivamente para ser utilizados como estándares de la
matriz de calibración. En la tabla 6.1 se muestran las diferentes
concentraciones de adulterante utilizadas en cada serie.
- 39 -
Tabla 6.1. Composición de los estándares
MUESTRA
Volumen
Aceite de
Oliva (ml)
*Volumen Aceite
Adulterante (ml)
*Concentración
Adulterante
(% v/v)
1 0.2 9.8 2
2 0.4 9.6 4
3 0.6 9.4 6
4 0.8 9.2 8
5 1 9.0 10
6 1.2 8.8 12
7 1.4 8.6 14
8 1.6 8.4 16
9 1.8 8.2 18
10 2.0 8.0 20
11 2.2 7.8 22
12 2.4 7.6 24
13 2.6 7.4 26
14 2.8 7.2 28
15 3.0 7.0 30
16 3.2 6.8 32
17 3.4 6.6 34
18 3.6 6.4 36
19 3.8 6.2 38
20 4.0 6.0 40
21 4.2 5.8 42
22 4.4 5.6 44
23 4.6 5.4 46
24 4.8 5.2 48
25 5.0 5.0 50
*El adulterantes corresponde tanto al aceite de girasol, como al de soya ó el de
canola.
- 40 -
6.4 Método espectrofotométrico FTIR-HATR
6.4.1 Obtención de los espectros
Para poder utilizar el Espectrofotómetro FTIR 1600 Perkin Elmer y obtener los
espectros de cada muestra se encendió el aparato y se comenzó a utilizar
hasta que la energía del láser fuera mayor al 95%. A través del programa
computacional PE GRAMS Analyst 1600 se registraron y almacenaron los
espectros en la computadora, para ello se eligieron como condiciones un
intervalo de número de onda de 4000 a 550 cm-1, además de una resolución
de 4 cm-1, realizándose 64 barridos (scans), lo cual permite obtener una
lectura de cada espectro con buena resolución de los picos de absorbancia (Al-
Jowder et al., 2002). Para obtener los espectros se utilizó el accesorio de
Reflectancia Total Atenuada (HATR) con cristal de seleniuro de Zinc (ZnSe).
Los espectros fueron obtenidos en unidades de absorbancia.
Se obtuvo un espectro del ambiente o de fondo (“background”) contra aire,
haciendo una lectura con el cristal de HATR vacío, el espectro es almacenado
en la computadora y tomado como blanco de referencia, esta lectura se realizó
utilizando las mismas condiciones que las muestras (Al-Jowder et al., 2002).
Una vez preparados las muestras de las mezclas de aceites, cada una de ellos
se colocó en el accesorio HATR con pipetas pasteur colocando
aproximadamente 3 ml de muestra, hasta cubrir por completo el cristal del
accesorio HATR y cuidando que no se formaran burbujas de aire que pudieran
interferir en las lecturas efectuadas. Después de cada lectura se lavó el cristal
de ZnSe utilizando una solución de detergente comercial al 10% en agua
destilada, además de un lavado con hexano para asegurar la remoción
completa del materia graso y evitar errores en las posteriores lecturas,
posteriormente el cristal fue enjuagado con agua destilada y secado con
pañuelos desechables y aire comprimido.
- 41 -
Figura 6.2. Metodología para la obtención de los espectros.
Establecer las condiciones de Medición: •64 barridos (scans) •4 cm-1 de resolución •Intervalo de la región MID-IR: 4000-550 cm-1
Establecer las condiciones de Medición: •64 barrdidos (scans) •4 cm-1 de resolución •Intervalo de la región MID-IR: 4000-550 cm-1
Con el cristal de ZnSe vacío, tomar un espectro de referencia (background)
Colocar el accesorio HATR en el Espectrofotómetro MID-FTIR
Colocar la muestra de aceite homogéneamente sobre el cristal de ZnSe del HATR en el Espectrofotómetro MID-FTIR.
Limpiar el cristal de ZnSe de la siguiente manera:
•Lavado con solución al 10% de detergente. •Lavado con Agua destilada. •Lavado con Hexano. •Lavado con Agua destilada. •Secado con pañuelo desechable.
Tomar el espectro de la muestra de aceite
- 42 -
6.4.2 Calibración de la información espectral por el programa Quant+
Una vez obtenidos los espectros correspondientes a cada estándar, estos
fueron alimentados al programa QUANT+, junto con sus correspondientes
porcentajes de adulteración, con el fin de llevar a cabo la calibración de los
métodos.
Para obtener la matriz de calibración una vez que se cuenta con la información
anterior, se manejan ciertas variables como son el intervalo o región del
espectro que se va utilizar, en la construcción del modelo quimiométrico, este
es uno de los parámetros importantes a establecer ya que si bien hay regiones
en donde los picos de absorción son muy intensas, estas no son lineales con
respecto a la ley de Lambert-Beer, por lo que muchas veces no es adecuado
utilizarlas (Sivakesava e Irudayaraj, 2001). Se seleccionaron por lo tanto
aquellas regiones donde el método de calibración mostrara una buena
correlación. Otros parámetros que se deben establecer son el limite superior e
inferior de absorbancia a considerar, el numero de factores y por su puesto el
uso o no de métodos de optimización de los espectros como es la aplicación de
suavizado, de derivadas o corrección de la línea base.
Se evaluaron siempre los tres tipos de algoritmos matemáticos con que cuenta
el programa QUANT+, que son PLS1 (Mínimos Cuadrados Parciales sin
interacción de variables), PLS2 (Mínimos Cuadrados Parciales con interacción
de variables) y PCR (Regresión de Componentes Principales), que nos
permiten determinar el comportamiento de cada modelo gracias a las gráficas y
datos estadísticos y en base a ello decidir cual algoritmo presenta una mejor
correlación de la información de la adulteración.
6.4.3 Optimación de los modelos quimiométricos
La optimización de un modelo consiste en obtener a través del manejo de las
distintas herramientas o parámetros con los que cuenta el programa QUANT+
datos estadísticos óptimos para cada uno de los modelos que creamos.
- 43 -
Para conseguir esto se analizaron las graficas que nos muestra el programa y
nos indica el comportamiento del modelo, por ejemplo la gráfica del grado de
influencia variable de las bandas del espectro, ya que nos brinda información
importante sobre que regiones del espectro tienen mayor importancia o
influencia en la construcción del modelo, la grafica de estándares rechazados
(“outliers”) entre otras, además de modificar el numero de factores tantas veces
como fue necesario, variar el intervalo del espectro que se utilizó e incluso
eliminando bandas espectrales dentro de la región utilizada y el ruido
electrónico que puede interferir en la construcción de los modelos.
Otra herramienta utilizada durante la optimización fue el uso de un suavizado
(smooth) que nos permite eliminar el ruido que acompaña a la señal analítica y
que no esta relacionada con la propiedad de interés, el cual es recomendable
utilizar entre 5 y 13 puntos, ya que con puntajes mas altos, si bien el ruido
disminuye, algunos picos del espectro pueden desaparecer (Macho, 2002).
De la manera antes descrita se obtuvieron una diversidad de modelos los
cuales fueron evaluados a través de los parámetros estadísticos como son el
coeficiente de correlación (R2) y los errores estándares de calibración y de
predicción (SEC y SEP respectivamente) los cuales deben ser lo más bajos
posibles (PerkinElmer, 1991) aunque un modelo es aceptable siempre y
cuando estos errores tengan valores menores de 3, sin embargo errores más
bajos significan que el modelo muestra una mejor correlación y ajuste a los
datos.
Entonces con base a estos parámetros estadísticos se seleccionó el mejor
modelo de calibración, es decir el modelo óptimo que se encontró.
6.4.5 Validación del método quimiométrico
Una vez seleccionado el modelo de calibración más adecuada, debemos
asegurarnos que esta responda correctamente al análisis de las muestras
deseadas, para ello se realizó una validación, en la cual se obtuvieron los
espectros de una nueva serie de muestras adulteradas con una concentración
- 44 -
conocida de aceites adulterantes, pero que no se encuentren dentro de la
matriz de calibración del modelo quimiométrico seleccionado.
Cuando se realizó la validación se desplegaron para cada una de las muestras
la información de los valores predichos quimiométricamente además de
información estadística importante como lo es el Error Estándar de Predicción
(SEP) el cual debe ser lo más bajo posible, el Error Residual, que se refiere a
la relación del promedio de la varianza residual de muestras distintas a los
estándares de calibración (ruido) (Beebe et al., 1998), el cual deber ser menor
a 3 (PerkinELmer, 1991). Finalmente esta información también incluye la
Distancia de Mahalanobis, la cual nos permite determinar la similitud de los
espectros entre la muestra que se está analizando y el grupo de estándares
utilizados para generar el modelo quimiométrico (De Maesschalck, 2000) y
cuyo valor debe ser menor a 1.
En el siguiente cuadro se muestran las concentraciones de adulteración
utilizados para cada uno de los sistemas que se estudiaron.
% Peso de adulterante que corresponde a cada
sistema
Problema Aceite de Canola Aceite de Girasol Aceite de Soya
P1 7 7 5
P2 10 11 11
P3 21 13 13
P4 35 25 23
P5 43 45 41
Tabla 6.2 Problemas utilizados para la validación del modelo quimiométrico
- 45 -
6.5 Desarrollo del modelo SIMCA (Soft Independent Modeling Class
Analogy)
Un modelo SIMCA nos permite definir un conjunto de muestras en diferentes
clases o grupos a partir de las características o de la información de su
espectro, por lo cual se requiere de una base de datos que contenga los
espectros de las diferentes clases de muestras.
Para este estudio se adquirieron en supermercados de la Ciudad de México,
muestras comerciales diferentes de cada aceite (oliva, canola, soya, girasol),
los cuales fueron utilizados como estándares para generar este modelo y de las
cuales se obtuvieron sus espectros FTIR-HATR. De estas muestras se
obtuvieron en total 80 espectros de las diferentes muestras bajo las mismas
condiciones descritas anteriormente.
Para generar el modelo se utilizaron 60 para la construcción del modelo SIMCA
mientras que 12 fueron utilizados para llevar a cabo la validación, además de
15 espectros de cada sistema de adulteración, es decir 45 espectros de
muestras adulteradas también fueron usados para construir el modelo y 9 más
para la validación del mismo.
Así que los estándares totales que se utilizaron para elaborar este modelo
fueron los aceites de oliva, canola, girasol y soya, además de los aceites
adulterados oliva-canola, oliva-soya y oliva-girasol. Los espectros FTIR-HATR
de cada uno de los estándares mencionados fueron alimentados al programa
computacional AsseureID, generando el modelo.
6.5.1 Optimación del modelo SIMCA
El programa de manera similar al QUANT+ cuenta con ciertos parámetros y
herramientas que nos permiten generar tantos modelos diferentes como sean
necesarios hasta encontrar el óptimo, para ello se puede variar la región del
espectro a analizar, así como eliminar el ruido electrónico y los ruidos causados
por las bandas de CO2 y agua al aplicar filtros ambientales, además es posible
aplicar suavizado (smooth) a los espectros FTIR-HATR.
- 46 -
De igual manera para elegir el modelo óptimo se decide a través de parámetros
estadísticos que en este programa computacional son los siguientes: a) obtener
un modelo que no presente muestras extremas, ni traslapadas, b) distancia
interclase (la que existe entre cada clase), c) porcentajes de reconocimiento y
rechazo interclase e intraclase (PerkinElmer, 2005).
6.5.2 Validación del modelo SIMCA
Se realizó la validación del modelo optimado generado para comprobar que
este se comporta de manera precisa, para ello se utilizaron 3 espectros FTIR-
HATR de cada estándar tanto no adulterado como adulterado y que no fueron
utilizados para construir el modelo pero que si pertenecían a cada una de
clases o grupos analizados.
La información que despliega el programa sobre cada muestra utilizada para la
validación es el material identificado, el cual indica a que grupo o clase
pertenece la muestra, indica el resultado, es decir si la muestra fue identificada
dentro de alguna clase o no (rechazada). Otros parámetros importantes como
son la distancia total, la cual debe ser menor a 1 para que una muestra sea
clasificada, también se presenta la distancia límite la cual debe ser igual a 1,
indicando que el espectro validado pertenece a una población especifica.
Además de estos parámetros también se muestra la distancia del modelo, la
cual es la diferencia de la distancia del espectro que se esta validando con
respecto a los espectros utilizados en el modelo, su valor debe ser igual a 0, ya
que una distancia mayor de 0.0 indica que la muestra queda fuera de la
variación descrita por el modelo.
Por ultimo también muestra la distancia residual, este parámetro es utilizado
por el programa SIMCA para decidir si el material es aceptado o no, esta
distancia debe tener valores menores a 3, ya que valores mayores indican que
la muestra contiene una fuente de variación que no se ha encontrado
previamente.
- 47 -
VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
7.1 Características fisicoquímicas del aceite de oliva.
Se determinaron solamente algunas características fisicoquímicas del aceite de
oliva marca Carapelli y cuyos resultados se muestran en la tabla 7.1. El
resultado se muestra como un promedio de 3 muestras en cada caso y con la
desviación estándar de cada serie, análisis estadísticos que se llevo a cabo con
la hoja de cálculo Excel 2003.
Tabla 7.1. Características fisicoquímicas determinadas para el aceite de oliva
en comparación con la norma NMX-F-109-SCFI-2006.
Parámetro Determinado Especificado en norma
Acidez (%) 0.8833 (± 0.351) Max. 1.0
I. de Saponificación mg KOH/g 188.33 (± 1.527) 184 – 196
Densidad Relativa 0.9136 (± 0.0006) 0.910 - 0.916
Hay que destacar que estas determinaciones solo se realizaron como
referencia para considerar que el aceite de oliva marca Carapelli utilizado en
este estudio no se encontraba adulterado, los resultados presentados se
encuentran dentro de los permitidos en la norma.
Estos resultados son apoyados por la investigación llevada a cabo por la
Procuraduría General del Consumidor (PROFECO) cuyos resultados aparecen
en la edición de Mayo de la Revista del Consumidor y donde presentan esta
marca y presentación de aceite de oliva como autentico a través de la
determinación de la composición de ácidos grasos, índice de acidez y de
saponificación y lo consideran dentro del grupo de aceites de oliva de la mejor
calidad presentes en el mercado nacional (PROFECO, 2008).
- 48 -
7.2 Interpretación de los espectros FTIR-HATR.
La figura 7.1 muestra los espectros FTIR-HATR de los aceites de oliva, soya,
canola y girasol, los cuales fueron utilizados para preparar las muestras
adulteradas usadas como estándares para los modelos quimiométricos, estos
se muestran, en la región completa del infrarrojo medio que va de los 4000 a
los 550 cm-1 y es en esta región donde se encuentran señales de las
vibraciones de los enlaces moleculares, precisando así la composición química
de las muestras, ya que las bandas de absorción que se muestran en los
diferentes espectros están asociadas con los grupos funcionales de las
moléculas de la sustancia analizada, por ejemplo los ácidos grasos que
componen a los aceites comestibles.
Figura 7.1. Espectros de los aceites de oliva, soya, canola y girasol en la
región del espectro infrarrojo medio (4000 – 550cm-1)
Se puede observar claramente en estos espectros FTIR-HATR la presencia de
ciertas bandas de absorción muy marcadas, por ejemplo un par de picos en la
región de 2800-3100 cm-1, los cuales son debidos a los movimiento de tensión
(stretching) de las vibraciones del los enlaces C-H de las moléculas lipídicas.
También se presentan bandas de absorción debidas a las vibraciones de
Aceite de Oliva Aceite de Soya Aceite de Canola
cm-1
Abso
rban
cia
- 49 -
tensión de los enlaces C=O las cuales se pueden apreciar en la región de
1700-1800 cm-1 (Tay et al., 2001).
En la región de 1400 – 900 cm-1 se presentan también bandas de absorción
las cuales se atribuyen a las vibraciones de tensión de los enlaces C=O de los
ésteres, las cuales se presentan entre 1485 – 1380 cm-1 y 1250 – 1100 cm-1
(PerkinElmer, 2006). Finalmente dentro de esta región, alrededor de 950 - 1000
cm-1 aparece una serie de picos que se han asociado con las vibraciones de
flexión de grupos dienos conjugados C=C-H trans-trans (t-t) y cis-trans (c-t) de
los lípidos (Guillén et al., 2005).
Estos espectros FTIR-HATR son sumamente semejantes comparados entre si,
a menos que uno los observe de manera muy cercana, esto es debido
obviamente a que la composición química de cada uno de ellos es muy similar
y es por esto que se requiere de realizar un análisis quimiométrico que permita
identificar esas pequeñas variaciones en determinadas regiones del espectro
infrarrojo medio y que a simple vista simplemente no se pueden apreciar.
Figura 7.2 Espectros FTIR-HATR de los aceites de oliva, canola, soya y
girasol en la región de la huella (700-1400 cm-1).
Es muy importante también considerar que la información que nos brinda un
espectro infrarroja es sumamente completa y compleja, por lo que no
solamente debemos tomar en cuenta las bandas de absorción que se
presentan, sino la ausencia de otras bandas importantes, lo cual puede
ayudarnos a interpretarlo mejor y de esta manera poder utilizar el espectro
800 – 1000 cm-1
1300 – 1450 cm-1
Abso
rban
cia
cm-1
- 50 -
infrarrojo como una huella digital. De hecho la región del espectro más
comúnmente utilizada en este tipo de análisis se encuentra entre 1800 y 900
cm-1 ya que esta contiene información espectral muy especifica de cada
sustancia, que es muy útil para realizar un análisis quimiométrico y es conocida
como “región de la huella”.
También se puede apreciar en la figura 7.2 que las variaciones mas notables
entre los espectros FTIR-HATR del aceite de oliva y los demás aceites se
presentan dentro de esta región de la huella principalmente entre los números
de onda 800 – 1000cm-1 y en 1300 – 1450cm-1.
En cuanto a los espectros obtenidos de las muestras adulteradas de aceite de
oliva podemos observar en las figuras 7.3, 7.4, 7.5 las variaciones que
presentan estos espectros de acuerdo al porcentaje de adulteración para cada
uno de los sistemas estudiados (oliva-canola, oliva-soya, oliva-girasol) en el
intervalo de 1600 – 800 cm-1, el cual fue elegido para la construcción del
modelo.
Se observa claramente en estos espectros que las bandas de absorción que
presentan las muestras de aceite de oliva adulterado con los otros aceites son
las mismas que las encontradas en los espectros FTIR-HATR de los aceites
puros, pero además también se pueden apreciar los cambios en la absorbancia
de cada espectro según varia el porcentaje de adulteración en la muestra de
aceite de oliva.
- 51 -
Figura 7.3 Espectros FTIR-HATR de los estándares correspondientes al
sistema Aceite de oliva-canola (5, 10, 20, 25, 30, 40%) en la región de la huella.
Figura 7.4 Espectros FTIR-HATR de los estándares correspondientes al
sistema Aceite de oliva-canola (5, 10, 20, 25, 30, 40%) en la región de la huella.
Figura 7.5 Espectros FTIR-HATR de los estándares correspondientes al
sistema Aceite de oliva-canola (5, 10, 20, 25, 30, 40%) en la región de la huella.
Incremento
% adulterante
cm-1
Abso
rban
cia
cm-1
Abso
rban
cia
cm-1
Abso
rban
cia
Incremento
% adulterante
Incremento
% adulterante
- 52 -
Como ya se había discutido en un principio, esta zona donde se muestra la
relación entre la intensidad de absorbancia del espectro FTIR-HATR y el
aumento en el porcentaje de adulterante en el sistema oliva-soya, corresponde
a vibraciones de flexión de grupos dienos conjugados C=C-H trans-trans (t-t) y
cis-trans (c-t) de los lípidos (Guillén et al., 2005).
Por otra parte, es importante resaltar que existen regiones del espectro
infrarrojo en las cuales a simple vista en las imágenes comparativas de los
diferentes espectros no se aprecian variaciones de absorbancia relacionados
con el porcentaje del adulterante en las regiones antes mencionadas del
espectro infrarrojo, sin embargo a través del análisis quimiométrico se puede
observar una buena correlación, es el caso de la region entre 1400 cm-1 y 1800
cm-1. En particular esto puede deberse a que en esta región se muestran
bandas de absorbancia relacionadas con los enlaces de tipo ester C=O y sus
vibraciones de tensión (PerkinElmer, 2006).
Los constituyentes químicos del aceite de oliva son los responsables del
espectro FTIR-HATR que se obtiene, si asumimos que las proporciones de
estos constituyentes son componentes constantes en el aceite, entonces la
adición de cualquier otra sustancia distintita a este aceite modificará las
proporciones originales de estos componentes y por lo tanto se obtendrá un
espectro FTIR-HATR distinto del original; aunque como ya se discutió no es
posible siempre a través de una simple inspección visual de estos espectros
detectar las diferencias entre ellos y por tanto las muestras adulteradas de las
no adulteradas, y es por ello que nos apoyamos en análisis por métodos
multivariantes de la información que nos proporcionan los espectros para
desarrollar modelos que nos permitan predecir y discriminar estos problemas.
- 53 -
7.3 Desarrollo de los modelos quimiométricos para identificar
adulteraciones.
El primer parámetro que se debe considerar y con suma importancia para
comenzar a desarrollar una calibración de modelos quimiométricos, es la región
del espectro que se analizará. Este parámetro es de suma importancia, ya que
si se eligen picos muy altos de absorción, los factores de análisis PCR, PLS1 y
PLS2, no pueden corregir sobreabsorbancias (A>2.0) (Sivakesava e Irudayaraj,
2001a). Además si todos los números de onda fueran utilizados se corre el
riesgo de que los picos espectrales de mayor importancia o correlación se
hagan menos visibles a los algoritmos y junto con esto incorporar ruido en el
modelo de calibración (Soriano et al., 2007).
Se partió de un primer modelo desarrollado para el cual fue utilizada toda la
región del espectro, posteriormente se fue discriminando ciertos intervalo y
bandas de absorción de acuerdo a la correlación mostrada, por ejemplo en la
figura 7.6 se señalan la bandas de absorción de humedad (3400-3200cm-1) y
CO2 (2380-2066cm-1), los cuales son constituyentes ambientales y por lo tanto
son susceptibles de variaciones que no están relacionadas a la composición de
las muestras analizadas y con ello representan un riesgo posible de errores en
una calibración si son consideradas. De igual manera se señala un intervalo al
principio de la región del infrarrojo medio que se debe al ruido electrónico que
es generado por el propio equipo al realizar los análisis y cuyas variaciones
también son ajenas a la composición de las muestras.
Figura 7.6 Espectros FTIR-HATR de los estándares del sistema aceite de oliva-
canola.
Humedad
(3400-3200cm-1)
CO2
(2380-2066cm-1)
Ruido
electrónico
cm-1
Abso
rban
cia
- 54 -
De esta manera la selección del intervalo espectral se realizó a través de una
serie de modificaciones de este parámetro, analizando en cada intento la
correlación que mostraba el nuevo intervalo con el porcentaje de adulteración y
con respecto al intervalo utilizado anteriormente, el objetivo era encontrar un
intervalo del espectro que mostrara la mejor correlación con los porcentajes de
adulteración de cada estándar utilizado.
Durante el desarrollo de los modelos de calibración multivariante para cada uno
de los sistemas estudiados (oliva-canola, oliva-soya y oliva-girasol) se utilizaron
los tres algoritmos con los que cuenta el programa QUANT+ que son PCR,
PLS1 y PLS2, los cuales son los responsables de establecer una correlación
entre la información contenida en el espectro y la concentración de adulterante
presente en los estándares utilizados cada modelo de calibración.
El programa también cuenta con ciertas herramientas como son una serie de
gráficas y datos estadísticos que brindan información importante sobre el
comportamiento del modelo durante la construcción de cada una de las
calibraciones de los distintos sistemas estudiados, las cuales nos auxilian para
elegir el mejor modelo de calibración.
Dentro de los datos estadístico que brinda el programa, los más importantes
para analizar son el número de factores, el error estándar de calibración (SEC)
y el coeficiente de correlación (R2), además de variar otros parámetros del
modelo como son la utilización del suavizado, agregar regiones blanco y el
intervalo del espectro y número de factores como ya se mencionó.
En la tabla 7.1 se presentan los datos de los modelos quimiométricos
optimados, es decir después de analizar y modificar los parámetros ya
mencionados, correspondiendo entonces los mejores modelos de calibración
que se desarrollaron.
- 55 -
Tabla 7.1. Datos de calibración de los modelos desarrollados para predecir la
adulteración del aceite de oliva con los algoritmos PLS1, PLS2 y PCR.
En esta tabla podemos comparar los tres algoritmos (PLS1, PLS2 y PCR) para
cada uno de los sistemas de calibración, podemos observar que cada uno de
ellos presenta un valor de R2 sumamente cercano a 1, lo cual indica que todos
estos modelos quimiométricos son confiables, ya que un valor de R2 mayor de
0.91 indica que la información cuantitativa es “excelente”, valores que se
encuentren entre 0.7 y 0.9 se considera como “bueno”, pero valores entre 0.5 y
0.7 indican que hay poca separación de muestras y por tanto la calibración solo
puede usarse con propósitos preliminares (Shenk y Westerhaus, 1996).
Por otro lado también contamos con los valores del error de calibración (SEC)
cuyo valor máximo permitido para que un modelo quimiométrico sea
considerado confiable es de 3, en el caso de cada uno de los algoritmos,
podemos observar que cumplen con esta característica por lo que todos estos
modelos presentados para los diferentes sistemas son confiables para predecir
las concentraciones de adulteración en muestras problema.
Así mismo, la selección del mejor modelo de calibración de entre estos que se
presentan en la tabla 7.1 se realizó a partir de aquel que tuvieran valores del
coeficiente de correlación R2 mas cercano a 1 y el Error estándar de
Sistema de
Adulteración
Intervalo
Espectral Algoritmo
Número de
Factores R2 SEC
PLS1 8 0.9971 0.9322
PLS2 8 0.9955 1.1691 Oliva-canola 1690-1240
cm-1 PCR 16 0.9975 0.8288
PLS1 9 0.9994 0.4390
PLS2 9 0.9996 0.3579 Oliva-soya 1690-1290
cm-1 PCR 16 0.9992 0.5284
PLS1 9 0.9882 1.753
PLS2 9 0.9974 0.8713 Oliva-girasol 1690- 1290
cm-1 PCR 16 0.9735 2.524
- 56 -
Calibración (SEC) más bajo, los cuales son presentados en letra negrita y
cursiva en la tabla anterior. De esta manera, PLS2 fue el algoritmo que mostró
la mejor correlación entre la adulteración y la información espectral para el caso
de los sistemas de adulteración de aceite de oliva-soya y aceite de oliva-
girasol; mientras que en el caso del sistema aceite de oliva-canola, el algoritmo
que mejores resultados mostró fue PCR, ya que obtuvo un valor de R2 mayor y
un valor de SEC menor en comparación con el otro par de algoritmos.
En la literatura se reporta el uso de PLS que por lo general da resultados
predictivos mejores que PCR, ya que PLS es una técnica cuantitativa de
descomposición espectral capaz de correlacionar los cambios en las
concentraciones de un componente de interés con los cambios en los
espectros, lo que provoca que los espectros de las muestras con
concentraciones mas altas, tengan mayor influencia que aquellas con
concentraciones mas bajas y cuyo objetivo es construir un modelo lineal para la
predicción de las características que deseamos. Por ello PLS es el algoritmo
mas frecuentemente utilizado para realizar correlaciones información espectral
con datos químicos o físicos (Defernez y Kemsley, 1997).
Por otra parte PCR no considera los valores de referencia para construir los
componentes espectrales, como lo hace el algoritmo PLS (Sivaskesava e
Irudayaraj, 2001), lo cual podría explicar porque PLS generalmente desarrolla
mejores modelos que PCR, sin embargo solo los hechos prácticos pueden
determinar el mejor modelo para cada sistema especifico que se este
estudiando.
Se presentan a continuación las principales gráficas que brinda el programa
QUANT+ para conocer el comportamiento y hacer un diagnóstico de los
modelos quimiométricos desarrollados, así pues la figura 7.7 presenta las
gráficas de diagnostico para el sistema de adulteración oliva-soya con el
algoritmo elegido PLS2, la figura 7.8 muestra las mismas gráficas para el
sistema oliva-girasol con PLS2 y finalmente las gráficas correspondientes al
sistema oliva-canola con PCR en la figura 7.9.
- 57 -
Figura. 7.7 Gráficas de Diagnóstico del modelo quimiométrico desarrollado con el algoritmo PLS2 para el sistema Aceite de oliva – soya.
a) Valores Estimados contra valores especificados.
b) Numero de factores contra SEP estimado.
c) Residuales en función de la muestra en el modelo.
d) Influencia respecto a la Distancia de Mahalanobis
e)
2.0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 54.8
-1.0
10
20
30
40
50
57.7
SpecifiedEstimated
xx
xx
xx
xx
xx
xx
xx
x
x
xx
xx
x
xx
x
x
Especificado
Estimado
0.0 1 2 3 4 5 6 7 8 9.0
0.5
2
4
6
8
10
12
14.4
PCs in model
SEP Estimate
Factores
SEP Estimado
0.00 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.88
0.00
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
3.91
Leverage
Residual
x so32
x so34x so36
x so38
x so40
x so42
x so44
x so46
x so48
x so50x soya10
x soya12
x soya14
x soya16
x soya18
x soya2x soya20
x soya22a
x soya24x soya26
x soya28 x soya4x soya6
x soya8
x soya30
Influencia
Residuales
a)
b)
c)
0.00 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.88
0.00
0.5
1.0
1.5
2.0
2.19
Leverage
Distance
x so32x so34x so36x so38x so40
x so42x so44x so46
x so48
x so50
x soya10x soya12
x soya14x soya16x soya18
x soya2
x soya20x soya22ax soya24x soya26x soya28
x soya4
x soya6
x soya8
x soya30
Influencia
Distancia
d)
R2=0.9996
- 58 -
0.00 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.72
0.00
0.5
1.0
1.5
2.0
2.19
Leverage
Distance
x ole12 x ole14x ole16x ole18 x ole20x ole23x ole24x ole26
x ole28x ole30
x ole32
x ole34x ole36x ole38x ole40x ole42 x ole44x ole46x ole48x ole4ax ole6a
x ole8ax ole3ax ole31
x ole15
Influencia
Distancia
0.0 1 2 3 4 5 6 7 8 9.0
1.12
4
6
8
10
12
13.8
PCs in model
SEP Estimate
Factores
SEP Estimado
Figura. 7.8 Gráficas de Diagnostico del modelo quimiométrico desarrollado con el algoritmo PLS2 para el sistema Aceite de oliva – girasol.
a) Valores Estimados contra valores especificados.
b) Numero de factores contra SEP estimado.
c) Residuales en función de la muestra en el modelo.
d) Influencia respecto a la Distancia de Mahalanobis
0.00 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.72
0.00
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
3.87
Leverage
Residual
x ole12
x ole14x ole16
x ole18
x ole20
x ole23
x ole24
x ole26
x ole28
x ole30
x ole32
x ole34
x ole36
x ole38
x ole40x ole42
x ole44
x ole46x ole48
x ole4ax ole6a
x ole8a
x ole3a
x ole31
x ole15
Influencia
Residuales
a)
b)
c) d)
R2=0.9974
- 59 -
Figura. 7.9 Gráficas de Diagnostico del modelo quimiométrico desarrollado con el algoritmo PCR para el sistema Aceite de oliva – canola.
a) Valores Estimados contra valores especificados.
b) Numero de factores contra SEP estimado.
c) Residuales en función de la muestra en el modelo.
d) Influencia respecto a la Distancia de Mahalanobis
0.00 0.2 0.4 0.56
0.00
0.5
1.0
1.5
2.0
2.26
Distance
xx xx x xxxx
xxx xxx
x
xx
x
x
x
xx can6
x can30
Influencia
Distancia
0.00 0.2 0.4 0.56
0.0
2
3.8
Residual
x
x
xx x x
x
x
x
x
xx
xx
x
x
xx
x
x
x
x
x can6
x can30
Influencia
Residuales
0.0 5 10 15.0
0.92
4
6
8
10
12
14.6
PCs in model
SEP Estimate
Factores
SEP estimado
2.0 20 40 54.8
-0.4
10
20
30
40
50
57.6
Speci fied
Estimated
x xx
xx
x xx
x x
x
x
x xx
x
xx
x
x xx
x x
Especificado
Estimado
b)
c)
d)
a)
R2=0.9975
- 60 -
Las primeras graficas de diagnostico de cada sistema que se presentan son las
que corresponden a la correlación entre los valores especificados, es decir la
concentración real del adulterante en cada muestra y los valores estimados,
que son las concentraciones del adulterante predichas por el modelo que se ha
desarrollado. Es así como las figuras 7.7.a, 7.8.a y 7.9.a muestran la
correlación obtenida de estos valores para los tres sistemas estudiados, oliva-
canola con el algoritmo PCR, oliva-soya y oliva girasol con los algoritmos PLS2,
ya que estos fueron los modelos seleccionados como óptimos para las
predicciones de los adulterantes correspondientes. En estas figuras podemos
observar que la mayoría de las muestras caen sobre la línea de 45º.
Además de esto, se presentan los valores de los coeficientes de correlación R2,
lo cual es una de las formas en que podemos evaluar la capacidad de
predicción de los modelos calibrados, y se puede observar que estos valores
son muy cercanos a 1 para los tres sistemas, oliva-canola (R2= 0.9975), oliva-
soya (R2= 0.9996) y oliva-girasol (R2= 0.9974). Estos valores, entonces nos
indican que existe una muy buena correlación entre las concentraciones
especificadas y las estimadas por el modelo y por lo tanto establece la
precisión que tiene la calibración de nuestro modelo quimiométrico, pues como
ya se mencionó valores de R2 mayores que 0.91 se consideran excelentes
(Shenk y Westerhaus, 1996).
Por otra parte se cuenta con otras gráficas de diagnóstico como son la
referente al Número de factores contra el Error Estándar de Predicción (SEP),
que son las graficas mostradas con los números 7.7.b, 7.8.b y 7.9.b, en las que
se muestran los números óptimos de factores para la construcción del modelo,
los cuales corresponden al número de factores que al ser utilizados en el
desarrollo de un modelo corresponden al valor mínimo en el Error Estándar de
Predicción (SEP). Los factores son el resultado de la transformación de la
matriz de datos y cada uno de ellos representa una fuente individual de
variación en los datos de los espectros. De esta manera entonces tenemos que
en los modelos quimiométricos desarrollados el número de factores óptimo fue
de 9, 16 y 9 para los sistemas de adulteración oliva-soya, oliva-canola y oliva-
girasol respectivamente y es en el caso de la adulteración oliva-soya con un
- 61 -
número de factores óptimo de 9 donde se tiene el menor SEP estimado de los
tres casos: 0.3579 (oliva-soya), 0.8288 (oliva-canola), 0.8713 (oliva-girasol).
Se puede observar también en estas graficas antes mencionadas que
generalmente pero no en todos los casos al aumentar el número de factores
disminuye el SEP estimado, por ejemplo en la grafica 7.8.b correspondiente al
sistema oliva-girasol, al pasar de 0 a 1 en el número de factores el SEP
estimado aumenta, lo mismo sucede auque de manera mas ligera en la gráfica
7.7.b del sistema oliva-soya, este aumento en el SEP puede ser debido a que
se esta incluyendo ruido espectral; sin embargo cuando se disminuye el
número de factores el modelo calibrado puede estar dejando información
espectral sin modelar (Li et al., 1196).
También se presentan las gráficas de la concentración residual, en función de
la influencia, estás nos permiten identificar muestras sospechosas, conocidas
como “outliers” y que son muestras aisladas que poseen características
distintas a las de la población en general y por lo tanto no pertenecen a ella. El
programa QUANT+ divide, de manera predeterminada, esta gráfica en cuatro
cuadrantes de tal manera que las muestras que caen dentro del tercero están
perfectamente representadas y modeladas por el método quimiométrico
desarrollado, mientras que las muestras que se presentan en el cuarto
cuadrante es porque poseen algo distinto a la de la población en general pero
que tienen una gran influencia en la construcción del modelo y por lo tanto
estas características diferentes pueden estar afectando de manera positiva a la
construcción del modelo. Por lo general en este cuadrante caen las muestras
de menor y mayor concentración, por lo que no es recomendable descartarlas
del modelo si es que se desea que el método tenga la capacidad de cuantificar
muestras problemas de concentración baja o alta y por ello es necesario
incluirlas en el modelo; como se puede observar en la figura 7.8.c que
corresponde al sistema oliva-girasol, este es el caso de los dos estándares que
caen en el cuarto cuadrante y por ello es que son consideradas dentro de la
construcción del modelo.
- 62 -
Por otra parte, las muestras que caen dentro del primer y segundo cuadrante
son aquellas que no pertenecen a la población por sus características distintas
al resto de las muestras de estándares y estas deben ser eliminadas. Es muy
importante la detección de las muestras sospechosas “outliers” en esta etapa,
ya que la inclusión de estas muestras discrepante en el modelo, degrada su
capacidad predictiva (Macho, 2002). En este caso, ninguno de los modelos
desarrollados para los tres sistemas de adulteración mostró muestras
sospechosas que cayeran en el primer o segundo cuadrante “outliers” y esto se
observa en las figuras 7.7.c, 7.8.c y 7.9.c.
Finalmente tenemos las gráficas que corresponden a la influencia con respecto
a la Distancia de Mahalanobis, la cual debe ser menor de 1 y que es un
parámetro que nos indica la similitud que hay entre las muestras, de esta
manera, un mayor valor de la distancia significa que las muestras son distintas
a la población y que sus características espectrales de esta muestra no están
reflejadas en el grupo de estándares que se utilizó para construir el modelo de
calibración.
En las figuras 7.7.d, 7.8.d y 7.9.d se muestran estas gráficas correspondientes
a los modelos desarrollados y donde se observa que ninguna de las muestras
de los estándares esta alejada del resto de la población ya que ninguna de
estas muestras tiene un valor de la distancia mayor de 1, por lo que todas son
confiables y fueron utilizadas en el desarrollo de los modelos quimiométricos
correspondientes. Esto es importante señalar que en el caso de la muestra que
aparece en el cuarto cuadrante de la gráfica de influencia contra Error Residual
del sistema oliva-girasol (figura 7.8.c), esta fue incluida en el modelo a pesar de
pertencer al cuarto cuadrante debido a que presenta una distancia de
Mahalanobis menor de 1 (figura 7.8.d), lo que demuestra que es una muestra
confiable y que pertenece a la población, por tanto fue considerada, ya que las
pequeñas diferencias espectrales que presenta esta muestra son importantes
para la construcción del modelo.
- 63 -
7.4 Validación de modelos quimiométricos
Como ya se había mencionado, es necesario realizar un validación externa del
modelo quimiométrico, que nos permita asegurar que este se comportara de
manera adecuada en un sistema real, además nos ayuda a corroborar la
precisión de sus predicciones. Para realizar esta validación se prepararon un
conjunto de 5 muestras de concentración conocida del adulterante pero que no
formaban parte de la población utilizada para la construcción del modelo,
aunque si se encontraban dentro del intervalo de concentración para el que fue
construido este modelo quimiométrico.
En las siguientes tablas se presentan los valores reales y los predichos de la
concentración del adulterante en cada una de las muestras utilizadas dentro de
la serie de validación de cada uno de los tres sistemas de adulteración: oliva-
canola con el algoritmo PCR (Tabla 7.4), oliva-soya (tabla 7.2) y oliva-girasol
(tabla 7.3) con el algoritmo PLS2.
También se presentan en estas tablas los valores de la Distancia de
Mahalanobis, la cual debe ser menor de 1 y el Error Residual, cuyo valor debe
ser menor de 3, los cuales son parámetros estadísticos que nos ayudan a
definir la certeza de las predicciones, ya que la Distancia de Mahalanobis nos
indica la similitud que hay entre las muestras analizadas en la validación y las
utilizadas para construir la matriz de calibración, de esta manera las muestras
utilizadas como problema que no son representativas de la matriz de
calibración utilizada son detectadas a través de una Distancia de Mahalanobis
mayor a 1.
- 64 -
Tabla 7.2. Datos de la serie de validación para la detección de adulteración del
modelo quimiométrico oliva-soya con el algoritmo PLS2.
Parámetros estadísticos calculados
quilométricamente.
Problema Concentración
Real (%)
Concentración
Predicha (%)
Distancia de
Mahalanobis
Error residual
P1 5 5.04 0.3564 1.699
P2 11 12.07 0.529 0.7917
P3 13 13.61 0.7742 0.8051
P4 23 22.45 0.3132 0.9497
P5 41 40.39 0.929 1.695
Tabla 7.3. Datos de la serie de validación para la detección de adulteración del
modelo quimiométrico oliva-girasol con el algoritmo PLS2.
Parámetros estadísticos calculados
quilométricamente.
Problema Concentración
Real (%)
Concentración
Predicha (%)
Distancia de
Mahalanobis
Error residual
P1 7 6.228 0.4966 1.365
P2 11 11.35 0.2334 1.597
P3 13 13.94 0.5139 0.9386
P4 25 25.32 0.4388 1.226
P5 45 45.53 0.5375 2.192
- 65 -
Tabla 7.4. Datos de la serie de validación para la detección de adulteración del
modelo quimiométrico oliva-canola con el algoritmo PCR.
Parámetros estadísticos calculados
quilométricamente.
Problema Concentración
Real (%)
Concentración
Predicha (%)
Distancia de
Mahalanobis
Error residual
P1 7 7.17 0.5922 0.3041
P2 10 10.33 0.432 0.824
P3 21 21.52 0.4484 0.7302
P4 35 35.26 0.6882 1.013
P5 43 42.94 0.4949 1.508
Así, entonces podemos determinar con estos resultados que las series
de validación son confiables ya que en ninguno de los tres modelos
quimiométricos hay predicciones con valores de errores residuales mayores
que 3 ni Distancias de Mahalanobis mayores a 1.
Finalmente con los datos obtenidos en estas series de validación y con
la ayuda de la hoja de cálculo Excel 2003 se determinó el coeficiente de
correlación R2 y el Error Estándar de Predicción de cada uno de los modelos
quimiométricos oliva canola con el algoritmo PCR, oliva-soya y oliva girasol con
el algoritmo PLS2, y cuyos resultados se muestran en la tabla 7.5. A partir de
estos parámetros se evaluó la precisión de las predicciones que los modelos
quimiométricos seleccionados, recordando que el coeficiente R2 que nos
permite saber la correlación que existe entre los valores de las concentraciones
reales y los que el modelo predice debe ser lo mas cercano a 1, mientras que
el Error estándar de Predicción (SEP) debe ser lo mas bajo posible, pero
siempre con un valor menor a 3.
- 66 -
Tabla 7.5. Coeficiente de correlación (R2) y Error Estándar de Predicción (SEP)
de adulteración de las series de validación para los tres diferentes modelos.
Sistema de
adulteración Algoritmo R2 SEP
Oliva-canola PCR 0.9989 0.3098
Oliva-soya PLS2 0.9985 0.6623
Oliva-girasol PLS2 0.9986 0.6301
Se observa entonces que los tres sistemas de adulteración presentan
excelentes coeficientes de correlación de acuerdo con Shenk y Westerhaus
pues son valores sumamente cercanos a la unidad, además de que el error
estándar de Predicción (SEP), en todos los casos presenta valores aceptables
pues resulta ser menor de 3.
En conjunto con los resultados discutidos anteriormente podemos
determinar que la validación realizada nos confirma el buen comportamiento de
los tres modelos quimiométricos y la buena precisión de sus capacidades de
predicción, pues como observamos las concentraciones predichas de
adulterante fueron muy similares a los valores reales de esta, mostrando una
excelente correlación entre estos valores con coeficientes muy cercanos a 1 y
valores del Error Estándar de predicción menores de 3, lo que indica una buena
precisión de las predicciones y junto con los valores obtenidos de la Distancia
de Mahalanobis y los errores residuales antes discutidos, los cuales muestran
que las predicciones son confiables, podemos determinar que los modelos
quimiométricos que se han desarrollado pueden ser aplicados a sistemas
reales de adulteración con predicciones que serán sin duda precisas y
confiables.
- 67 -
7.5 Desarrollo del modelo SIMCA
Como ya se explicó en la sección de métodos se desarrolló el modelo SIMCA
con ayuda del programa AsseureID utilizando 15 espectros FTIR-HATR de los
estándares de aceite de oliva, soya, canola y girasol sin adulterar, además 15
espectros FTIR-HATR de los utilizados para desarrollar el modelo
quimiométrico de cada uno de los tres sistemas de adulteración.
Se generó un primer modelo SIMCA a partir del cual se modificaron ciertas
condiciones como el intervalo a utilizar, usando o no un suavizado, agregando
filtros de ruido, entre otros, hasta obtener un modelo óptimo, el cual fue
evaluado en base a ciertas graficas de diagnostico que el programa nos
presenta para determinar el comportamiento del modelo, como es la distancia
residual, si existen o no muestras traslapadas o no entre dos o mas
poblaciones, la distribución espacial de estas poblaciones, además de
parámetros como las distancia interclase entre poblaciones y el porcentaje de
reconocimiento y rechazo interclase e intraclase.
Se presentan entonces a continuación los resultados obtenidos para el modelo
optimado y las discusiones correspondientes a cada uno de ellos y los
parámetros antes mencionados.
Las condiciones finales que corresponden al modelo SIMCA optimizado que se
obtuvo fueron utilizando el intervalo espectral de 1690 a 1290 cm-1 (región de la
huella), un suavizado de 9 puntos, aplicando un filtro para eliminar el ruido
causado por el CO2 y H2O, los cuales son factores ambientales, además del
ruido electrónico.
Este modelo no presentó ninguna muestra designada como extrema, es decir
muestras que se alejen de la población a la que pertenecen; así mismo
tampoco se presentaron muestras que se traslapen entre poblaciones. De esta
manera, se presenta en la figura 7.10 la distribución espacial de las
poblaciones analizadas y aunque se puede apreciar que algunas poblaciones
se encuentran cercanas entre si, este modelo permite separarlas en grupos
- 68 -
que se encuentran bien definidos sin que se traslapen ni se confundan, lo que
indica que este modelo es capaz de identificar y clasificar las muestras de
acuerdo a su origen.
Figura 7.10. Distribución espacial de las poblaciones obtenidas con el modelo
SIMCA optimado
Tabla 7.6. Distancias Interclase de las poblaciones analizadas SIMCA optimado
Girasol Canola Soya
Oliva 10.3 20.3 34.3
Girasol -- 15.2 30.6
Canola -- -- 17.9
Oliva-girasol Oliva-canola Oliva-soya
Oliva 13.4 8.19 10.2
Girasol 14.3 8.01 10.2
Canola 21.1 11.19 10.9
Soya 29.2 18.8 14.5
Oliva-girasol -- 7.23 8.52
Oliva-canola -- -- 6.21
Oliva-soya -- -- --
- 69 -
En la tabla 7.6 mostrada anteriormente se presentan las distancias interclase
de cada una de las poblaciones analizadas, es decir las distancias que hay
entre cada clase y que son obtenidas por el modelo optimado fueron. Estos
valores son un indicador de la similitud que se puede presentar entre los
grupos o poblaciones de muestras, de esta manera a mayor distancia, se
presenta una mejor separación y por lo tanto menor similitud entre poblaciones,
estos valores entonces deben ser lo mas grandes posibles y por ser el modelo
optimado, fueron los valores mas alto que se obtuvieron al desarrollar el
modelo.
Las población con mayor distancia interclase o mayor separación como se
puede observar (tabla 7.6) es la población de soya, ya que se encuentra mas
alejada del resto de los grupos por su diferencia en composición química
(distancia soya-oliva= 34.3), por otra parte, la menor distancia interclase se
presenta entre las poblaciones de los sistemas de adulteración y entre las
poblaciones de aceites sin adulterar la menor distancia interclase se presenta
entre las poblaciones de oliva y girasol (distancia= 10.3), lo cual refleja que de
entre los tres aceites utilizados como adulterante en este estudio es el de
girasol es el que posee una composición química mas parecida al de oliva. Sin
embargo estas distancias son suficientes para permitirle al modelo separar
estos grupos e identificar las muestras de cada uno de ellos.
Finalmente en la tabla 7.7 se presenta el porcentaje de reconocimiento
interclase y rechazo intraclase para cada una de las poblaciones. Esto muestra
que el modelo presentó un 100% de reconocimiento entre los estándares de
una población, es decir que de las 15 muestras utilizadas para formar una
población del modelo, este reconoció las quince, sin excluir alguna y el mismo
resultado se mostró en cada una de las poblaciones.
En esta misma tabla se muestra el porcentaje de rechazo que en todos
los casos fue del 100%, mientras que la relación que se presenta en paréntesis
indica la correlación de las muestras rechazadas con respecto al número total
- 70 -
de muestras sin contar con la que se compara, por ejemplo, el modelo fue
generado utilizando 15 estándares de aceite de oliva sin adulterar y 90
estándares de los diferentes tipos de aceites utilizados como adulterantes,
entonces estos 90 estándares distintos al aceite de oliva fueron todos
rechazados (100%), este procedimiento es igual para el resto de las
poblaciones.
Tabla 7.7. Porcentaje de reconocimiento y rechazo de las poblaciones
analizadas del modelo SIMCA optimado.
Clase % Reconocimiento % Rechazo
Oliva 100 (15/15) 100 (90/90)
Girasol 100 (15/15) 100 (90/90)
Canola 100 (15/15) 100 (90/90)
Soya 100 (15/15) 100 (90/90)
Oliva-girasol 100 (15/15) 100 (90/90)
Oliva-canola 100 (15/15) 100 (90/90)
Oliva-soya 100 (15/15) 100 (90/90)
Los resultados mostrados sobre el modelo SIMCA que se desarrolló permite
identificar y clasificar un conjunto de muestras en diferentes clases o
poblaciones, sin traslapar alguna y con una separación entre ellas que permite
dar un 100% de reconocimiento entre los estándares y el 100% de rechazo con
respecto al resto de las clases.
7.6 Validación del modelo SIMCA
También se realizó una validación del modelo SIMCA obtenido para corroborar
el buen comportamiento y la precisión de sus resultados en un sistema real de
la misma manera que se hizo con el modelo quimiométrico y con ello demostrar
que el modelo SIMCA es bueno para realizar una clasificación de muestras
desconocidas.
- 71 -
Se realizó entonces la validación utilizando 3 espectros FTIR-HATR de 3
muestras correspondientes a cada una de las poblaciones pero que fueran
distintas a las utilizadas para la generación del modelo SIMCA. Los resultados
obtenidos de esta validación se muestran en la tabla 7.8 donde se presenta la
muestra que se analizó, el material que fue identificado por el modelo durante
la validación, el resultado que determina si la muestra fue aceptada o
rechazada, es decir que no pertenezca al modelo, también se muestra la
distancia total, la cual debe ser menor a 1 para indicar que esta clasificada
dentro de alguna de las clases, la distancia límite que indica que el espectro
validado pertenece a la clase especificada si el valor es igual a la unidad;
finalmente la distancia residual que debe ser menor a 3, pues de lo contrario
esto significaría que la muestra contiene una fuente de variación que no se ha
encontrado previamente, y la distancia del modelo, la cual es la diferencia de la
distancia del espectro validado con respecto a la de los espectros del modelo y
debe ser igual a 0, pues un valor mayor indica que la muestra esta fuera de la
variación descrita por el modelo.
Como se puede observar en la tabla 7.8 las 21 muestras utilizadas en la series
de validación del modelo SIMCA fueron correctamente reconocidas e
identificadas y ya que las distancias totales son aceptables pues fueron
menores a 1, así como las distancias residuales que fueron menores a 3
podemos afirmar que el modelo SIMCA generado es confiable y muy útil para
separar en diferentes grupos el conjunto de muestras analizadas, además de
identificar de manera correcta cada muestra problema analizada de acuerdo a
la clase a la que pertenece.
- 72 -
Tabla 7.8. Resultados de las muestras de validación del modelo SIMCA
generado.
Muestra Material
Identificado Resultado
Distancia
Total
Distancia
Límite
Distancia
del modelo
Distancia
residual
Canola Canola Identificada 0.4709 1.0 0.0 0.7177
Canola Canola Identificada 0.6441 1.0 0.0 0.9815
Canola Canola Identificada 0.7620 1.0 0.0 1.1612
Girasol Girasol Identificada 0.6224 1.0 0.0 0.9900
Girasol Girasol Identificada 0.5277 1.0 0.0 0.8393
Oliva Oliva Identificada 0.7169 1.0 0.0 1.1146
Oliva Oliva Identificada 0.5493 1.0 0.0 0.8540
Soya Soya Identificada 0.6204 1.0 0.0 0.9645
Soya Soya Identificada 0.5527 1.0 0.0 0.8592
Oliva canola Oliva canola Identificada 0.5115 1.0 0.0 0.8135
Oliva canola Oliva canola Identificada 0.5744 1.0 0.0 0.9135
Oliva canola Oliva canola Identificada 0.5250 1.0 0.0 0.8350
Oliva girasol Oliva girasol Identificada 0.5124 1.0 0.0 0.8653
Oliva girasol Oliva girasol Identificada 0.9649 1.0 0.0 1.6294
Oliva girasol Oliva girasol Identificada 0.5114 1.0 0.0 0.8637
Oliva soya Oliva soya Identificada 0.6839 1.0 0.0 1.1173
Oliva soya Oliva soya Identificada 0.3666 1.0 0.0 0.5989
- 73 -
Finalmente el conjunto de los resultados obtenidos en este estudio tanto en el
modelo quimiométrico desarrollado, como en el modelo SIMCA demuestra que
la espectroscopía FTIR-HATR es una técnica rápida, no destructiva de la
muestra y capaz de analizar un componente como es la concentración de
adulterantes en el aceite de oliva con la confianza de obtener valores precisos
y muy similares a los reales sin la necesidad de tener que aplicar toda una
serie de análisis tradicionales como son los índices de peroxido, acidez,
saponificación, el perfil de ácidos grasos por cromatografía, entre muchos
otros, para conocer si un aceite de oliva se encuentra o no adulterado con otros
aceites comestibles, por lo tanto utilizar la espectroscopía FTIR-HATR de
manera mas sencilla, rápida y con una mucho menor manipulación de las
muestras en comparación con los análisis tradicionales.
Además el aplicar el modelo SIMCA se puede distinguir entre las diferentes
poblaciones de muestras tanto de aceite de oliva sin adulterar, así como de
cada aceite utilizado como adulterante y muestras que se encuentren
adulteradas, aun cuando algunos tengan una composición química tan similar
como es el caso del aceite de oliva y el aceite de girasol.
De esta manera el potencial que tienen los modelos quimiométricos
desarrollados en este trabajo junto con el modelo SIMCA es de un gran
alcance, ya que al utilizarlos en conjunto se puede obtener un análisis de
adulteración del aceite bastante preciso y rápido, así por ejemplo al tener una
muestra de aceite de oliva de la que se quiere determinar su autenticidad, se
toma solo una muestra de aproximadamente 3 ml, se obtiene su espectro
FTIR-HATR que tarda aproximadamente 4 minutos se alimenta este espectro al
modelo SIMCA desarrollado y este identificará si esta o no adulterada la
muestra con alguno de estos aceites comestibles y si es así, indicará con cual
de ellos. Finalmente en el caso de que sea un resultado positivo, al alimentar el
mismo espectro en el modelo QUANT+ desarrollado este dará con precisión el
porcentaje de adulterante que se encuentra en la muestra de aceite adulterado,
proceso que no duraría mas de 10 minutos.
- 74 -
VII. CONCLUSIONES
Se desarrollaron tres modelos quimiométricos optimados, para determinar la
adulteración del aceite de oliva con aceite de soya, canola y girasol, los
algoritmos que mostraron mejor correlación y precisión en la determinación fue
el de PLS2 para los sistemas oliva-soya y oliva-girasol y PCR para el sistema
oliva-canola, en base a que presentaron el menor Error Estándar de
Calibración (SEC) y los mas altos coeficientes de correlación R2.
Cada modelo presentó una muy buena precisión de predicción que fue
evaluada a partir del coeficiente de correlación R2 de las muestras de
validación y el Error Estándar de Predicción el cual fue menor que 1 cuando se
considera aceptable valores menores que 3, por lo que son modelos confiables
y precisos.
El modelo SIMCA que se desarrollo logro identificar y clasificar las muestras en
sus diferentes poblaciones o clases y con ayuda de la serie de validación
demostró ser un modelo preciso y confiable a partir de parámetros estadísticos
como la Distancia de Mahalanobis y la identificación correcta de cada muestra.
Se demostró que los modelos quimiométricos y el modelo SIMCA que se han
desarrollado en este trabajo son de gran utilidad para la determinación de
adulteraciones de aceite de oliva, permitiendo realizar un análisis más rápido,
sencillo, práctico y no destructivo con las muestras que los análisis
tradicionales.
- 75 -
IX BIBLIOGRAFIA
Aparicio, R. Manual del aceite de oliva. Editorial Mundi-Prensa. Madrid 2003.
pp. 614.
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