Determinacion de bacillus cereus en alimentos
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DETERMINACION DE BACILLUS CEREUS EN AVENA
Técnica de Recuento en Placa
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INTRODUCCIÓN:
BAM: Manual Analítico Bacteriológico de la FDA (Agencia de alimentos y medicamentos)La técnica a seguir para la determinación de Bacillus Cereus es la de Recuento en placa que se encuentra en la 8va Edición del BAM de acuerdo al Método de sedimentación en agar.
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EQUIPOS Y MATERIALES
Placas de Petri (15 x 100 mm)
MicroscopioBastidor de tubos
Tubos de ensayoPipetas 1 ml
estériles
Asas de siembra
Matraces Erlenmeyer
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Estufa Vortex mezcladorIncubadora
(30 ± 2 ° C y 35 ± 2 ° C)
Contador de colonias Quemador BunsenHomogeneizador
Autoclave
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MEDIO DE CULTIVOAgar manitol yema de huevo con polimixina( Mannitol - Egg – Yolk –Polymyxine AGAR: MYP)
Emulsión estéril de yema de huevo
COMPOSICION
CONCENTRACION DEL MEDIO
Peptona
10g/L
Extracto de carne 1g/L
D-manitol
10g/L
Cloruro sódico
10g/L
Rojo fenol
0,025g/L
Agar
15g/L
1 vial de Polimixina B
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Preparación del Agar MYP
Pesar 21,5 g de Agar MYP
Agitar hasta ebullición
Disolver el Agar con 450ml de agua destilada
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Calentar el agar
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Distribuir la mezcla en un matraz y taponear con algodón
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Esterilizar en autoclave a 121 ºC (15 psi) por 15 min
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Agregar 50 ml de la emulsión estéril de yema de huevo y el contenido de 1 vial de Polimixina B
Verter 15 – 20ml en placas estériles y dejar solidificar
Enfriar a 45 – 50ºC en una cubeta
Almacenar las placas en bolsas de plástico a 2-8ºC
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Preparación del diluyente buffer fosfato Butterfield( solución stock BPW)
1. Disolver 34 g de KH2PO4 en 500 mL de agua destilada
2. Ajustar el pH a 7.2 con NaOH 1N3. Llevar al volumen de 1 L con agua destilada
4. Esterilizar por 15 minutos a 121°C
5. Almacenar en refrigeración
6. Tomar 1.25 mL de esta solución y llevar a 1 litro con agua destilada
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PREPARACION DE LA MUESTRA
10 g de avena en 90 ml de buffer fosfato de Butterfield (dilución 1/10)
Homogeneizar diluyente por 2 min a 2500 rpm
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Realizar diluciones sucesivas tomando 1 ml de la dilución 1/10 y descargándolo en un tubo que contenga 9 ml de diluyente, hasta la dilución 10 - 6
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Mezclar cada dilución en agitador
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TÉCNICA DE RECUENTO EN PLACA
Sembrar 0,1 ml de cada dilución por duplicado en la superficie de
placas de agar MYP
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Incubar a 30°C por 24 h
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Diseminar el inoculo con una asa formando estrías
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Formación de colonias rosadas rodeadas de una zona de precipitación (producción de lecitinasa)
Seleccionar las placas que contienen entre 15 - 150 colonias típicas rosadas con producción de lecitinasa
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Picar 5 ó más de las colonias típicas aisladas y transferir a una estría de agar nutritivo para confirmación. Incubar 30 °C por 24h
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EJEMPLO Teniendo en cuenta que debes seleccionar las placas que contienes entre 15 – 150 colonias .Supongamos:
En la dilución 10-4 se encontraron placas de 100 y 80 colonias, las cuales están en el rango. Luego se hace un promedio entre las colonias de ambas placas obteniendo como resultado 90 colonias.
UFC/alicuota = 90 UFC/ 0.1mL = 900 UFC/ mL UFC*(inversa del factor de dilución) = 900 * 104 = 9*106 UFC/mL de la muestra