Diagnóstico Molecular de Enfermedades Infecciosas · BUENA EVOLUCION CLINICA SIGUE CON ATB HASTA...
Transcript of Diagnóstico Molecular de Enfermedades Infecciosas · BUENA EVOLUCION CLINICA SIGUE CON ATB HASTA...
Diagnóstico Molecular en Enfermedades Infecciosas:
Una Mirada desde la Clínica
Dra. Natalia Conca M
Pediatra Infectolgo
Noviembre 2016
Conflictos de Interés
Remuneraciones por parte de laboratorios Roche y GSK
Asistencia a cursos y congresos invitada por otros laboratorios
Objetivos:
1. Conocer ventajas y desventajas de las técnicas de biología
molecular frente a técnicas convencionales
2. Comprender las posibles fallas de los test moleculares en cuanto a
la realización e interpretación
3. Conocer algunas situaciones reales donde la biología molecular
esta siendo de utilidad clínica (meningitis, virus respiratorios y
sepsis)
4. Comprender la relevancia clínica de las nuevas plataformas de
biología molecular
Generalidades
• Dg etiológico decisión clínica adecuada
uso racional antimicrobiano
• Avance tecnológico Persistencia de infecciones
• Infecciones emergentes
• Resistencia a antimicrobianos
Métodos Clásicos de Diagnóstico
Ampliamente usados y conocidos
Diversidad de medios y condiciones
Sensibilidad a antimicrobianos
Automatización
Limitaciones Métodos Clásicos
Bacterias y virus de difícil cultivo
No crecen al usar ATB o muestra escasa
Detección Ag (sensibilidad y especificidad variable)
Serología: inmunosuprimido, latencia
Microscopía: Baja sensibilidad y especificidad, operadordependiente
Replicación ADN
Denaturación ADN:
Enzimas
RNA polimerasa sintetizapequeño oligonucleótido en
sitio de inicio replicación
DNA polimerasa sintetiza hebracomplementaria
PCR
Denaturación ADN:
Altas temperaturas (94°)
Secuencias sintéticas (primers):
Se usan 2 primers paradelimitar amplificación
DNA polimerasa:
Taq polimerasa
British Medical Bulletin 2002; 61: 97-114
Diagnóstico molecular vs convencional
Cultivo IFI/IFD ELISA Sondas PCR
Rapidez + +++ +++ ++ ++/+++
Sensibilidad ++ / +++ ++ ++ ++ ++++
Especificidad +++ ++ ++ +++ ++++
Facilidad + + +++ + ++
Ventajas Diagnóstico Molecular
Resultados más rápidos
Técnicas estandarizadas, automatizadas
Microorganismos de difícil crecimiento
Mayor sensibilidad y especificidad
Investigación
Limitaciones Diagnóstico Molecular
Falsos (+): Contaminación
Falsos (-): Extracción ADN, inhibidores, partidores
Mayor costo (relativo)
Debe sospechar agente infeccioso
No informa sensibilidad antimicrobianos
¿Cuando elegir un método molecular?
1. Necesidad rápida de identificación
2. Identificación de microorganismos fastidiosos
3. Necesidad rápida de determinación de genes de resistencia
4. Identificación de agentes no cultivables
5. Virus en general
¿Dónde se hace una Reacción de Polimerasa en Cadena?
¿Qué tipos de RPC existen?
PCR
Cualitativa
Cuantitativa
Caso Clínico 1
• Embarazo normal , RNT, femenino, buen peso • Embarazo fisiológico, • Streptococcus agalactiae (+) en el tercer trimestre del embarazo.• 25 días de vida: movimientos mioclónicos del hemicuerpo izquierdo
estando en vigilia; somnolienta y disminución de la demanda por alimentos.
• SU: febril, en relativas buenas condiciones generales, sin movimientos anormales, fontanela con tensión normal, ausencia de lesiones en la piel y mucosas y su examen segmentario era normal.
• Evolución: respiración irregular, piel reticulada y movimientos mioclónicosen el hemicuerpo derecho que no cedían a la contención.
• RNM al 10 día con lesiones cerebrales compatibles con encefalitis
Manejo: tratamiento antimicrobiano empírico
Primera RPC para herpes simplex 1 y 2(-)
Persiste sintomática Se adiciona aciclovir2 muestra RPC para herpes simplex 1 y 2 (-)
Se toma 3era muestra LCR
Que salió mal?
• Mala muestra? – 1 causa – Tipo de muestra
• Presencia de inhibidores?• Inadecuado almacenamiento y refrigeración ?• Proceso de la muestra tardío ? • Bajo numero de copias bajo umbral de
detección?– Sensibilidad RPC en LCR para herpes 1 y 2 100%– Especificidad 97%
Que busca el clínico en examen de biología molecular
• Definir infecciones que amenacen la vida (MBA-HSV)
• Confirmar o excluir infecciones tratables
• Iniciar tratameinto atbadecuado
Conca y cols al, Rev Chil Pediatr. 2016; 87(1): 24-30
Sensibilidad de PCR pacientes diagnosticados clínicamente 93% vs 55% de cultivoCon uso de ATB: s pcr 89,4% vs 10,5%
Aporte:Mejor diagnosticoTerapia adecuada Duración de tratamiento adecuada
BacteriasEscherichia coli K1Haemophilus influenzaeListeria monocytogenesNeisseria meningitidisStreptococcus agalactiaeStreptococcus pneumoniae
VirusCytomegalovirus (CMV)EnterovirusHerpes virus simplex 1 (HSV-1)Herpes virus simplex 2 (HSV-2)Herpes virus simplex 3 (HSV-3)Parechovirus HumanoVirusVaricella zóster (VZV)
LevadurasCryptococcusneoformans/gattii
Aprobado por FDA 2012
Caso clínico
• Niño de 1 año 4 meses con cuadro de 2 días de tos, luego fiebre y evoluciona con dificultad respiratoria leve a moderada, polipnea y signología obstructiva. Saturación de O2 de 89%.
Rev Chil Infect 2003; 20 (Supl 1): S59 - S62
Infecciones Respiratorias en niños
SÍNDROME AGENTE ETIOLÓGICO
Bronquiolitis VRS, MPVh, VPI, ADV, Influenza, Rinovirus
Asma / Wheezing VRS, Rinovirus, MPVh
Croup Parainfluenza, Influenza
Neumonia Influenza, S pneumoniae, VRS, VPI, ADV, S pyogenes, Rinovirus
Clinical Infectious Diseases 2011; 52:S284-S289
IDSA recomienda fuertemente el desarrollo e implementación de técnicas de diagnostico molecular
para detección de virus respiratorios”
Inmunofluorescencia
Ventajas Desventajas
Bajo costo Operador entrenado
Procesa varias muestras a la vez
Controles adecuados
Simple de realizar Microscopia de fluorescencia
Técnicas por BM• Examen ideal :• Disponible 24/7, en pocas
horas • Idealmente realizado en el
lugar de atención• Precio razonable • Que reduzca el riesgo de
bacterias resistentes • Que sea capaz de diferenciar
entre colonización e infección (cuantitativo o semicuantitativo
CID 2011:53 (supl 4)
PACIENTE ONCOLOGICO CON NEUTROPENIA FEBRIL, SINTOMAS
RESPIRATORIOSCATEGORIZADO EN ALTO RIESGO
PACIENTE A ESQUEMA TRIASOCIADO Y
HEMOCULTIVOS + PVR
PACIENTE BESQUEMA TRIASOCIADO
HEMOCULTIVOS Y BM PARA VIRUS RESPIRATORIOS
BUENA EVOLUCION CLINICA
BUENA EVOLUCION CLINICA
SIGUE CON ATB HASTA AUMENTO DE RAN
CON HEMOCULTIVOS (-)SIN EVIDENCIA DE OTRO
AGENTE CAUSAL
INFLUENZA A (+) HC (-)SIN EVIDENCIA DE OTROS
PATOGENOS RESPIRATORIOSSE DEJA OSELTAMIVIR ORAL
SUSPENDE ATBALTA
Comparación de las técnicas de Pneumovir/PCR en tiempo real y BiofireFilmArray para la detección de patógenos respiratorios virales y bacterianos
Torres JP, Farfán M y cols. Sochinf 2014
Antimicrobial prescription after multiplex PCR (+)Children study (n=1707; retrospective, inpatients with ARI)
• 50% received ATB
• 47% RVP was performed 87% (+)
• Children tested received more often ATB (54 vs 46%)
• RVP (+): OR 0.53 (CI 0.34-0.81)
• RVP (+) for influenza : oseltamivir use OR 27.38 (CI 14-42)
McCulloh et al. J Ped Infect Dis Soc 2014;3:146-53
Variable RVP (+) n=703 RVP (-) n=106
Received ATB * 51 % 67 %
Stopped ATB 6 % 0
Started ATB afterresult *
11 % 100 %* p < 0.05
PCR sens esp
SGA 98,3% 94,2%
Influenza A 100% 96.8%
Influenza B 100% 94,1%
VRS
Cobas Liat PCR
Point of careRápido (20 min)No requiere operador expertoNo requiere extraccion de DNAFácil de usar Seguro para el operador
“Aumento del diagnóstico etiológico en lactantes
< 3 meses que se hospitalizan por síndrome
febril sin foco al incorporar detección molecular
para enterovirus y virus respiratorios”
Cecilia Piñera , Alejandra Vergara, Romina Valenzuela, Bernardita Coublé, Macarena Moya, Thelma Suau, Anita Fritis, Carolina Roa,
Maria Elena Santolaya, Juan Pablo Torres
Fondo de investigación Saval- Facultad de Medicina de Universidad de Chile
• Síndrome febril sin foco (SFSF):
Fiebre en ausencia de un foco aparente luego de una anamnesis y examen físico completo– 19 a 30% consultas ambulatorias
• Causas en < 3 meses:– Infecciones bacterianas: 10-27%
– Infecciones virales: %??
– Otros
Rol de la biología molecular en diagnóstico infecciones virales
Baraff LJ, Pediatr Ann. 2008 Oct;37(10):673-9.
Aumentar el diagnóstico etiológico de SFSF en niños < 3 meses al incorporar técnicas de detección
molecular para
• enterovirus (EV) en sangre y LCR
• virus respiratorios en hisopado nasofríngeo (HNF)
por sobre el diagnóstico microbiológico convencional
Objetivos del estudio
Confirmación etiológica de los diagnósticos de egreso con microbiología convencional
Diagnóstico clínico infecciones bacterianas: 38/101 niños
Confirmado microbiología
convencional: 31/38 82%– Hemocultivos (+) 7
• E coli: 3
• SBHGA: 2
• SBHGB: 2
– Urocultivo (+) 23• E coli: 20 / Klebsiella: 1 /
Enterococcus: 1/ Enterobactercloacae: 1
Diagnóstico clínico infecciónviral: 25/101 niños
Confirmado microbiología
convencional: 3/25 12%– Rotavirus: 3
Diagnósticos etiológicos confirmados
Infecciones Bacterianas
30%
21%
Infecciones virales
3%
32%
Coinfección Virus-Bacteria
1%
11%
Etiología (-)
66%
36%
Diagnóstico Microbiológico Convencional
Diagnóstico Microbiológico Convencional + Biología Molecular
Globalmente se aumentó diagnóstico etiológico de un 34 a 63% (p 0,0001)
Diagnósticos etiológicos confirmados
Infecciones Bacterianas
31%
21%
Infecciones virales
2%
32%
Coinfección Virus-Bacteria
1%
11%
Etiología (-)
66%
36%
Diagnóstico Microbiológico Convencional
Diagnóstico Microbiológico Convencional + Biología Molecular
Globalmente se aumentó diagnóstico etiológico de un 34 a 63% (p 0,0001)
Genómica yProteómicaHUMANA
INFECTOMA
Genómica yProteómicaPATÓGENO
FARMACOMA
Efecto DROGASGenómica yProteómicaHUMANA
Efecto DROGASGenómica yProteómicaPATÓGENO
HOSPEDERO MICROORGANISMO
Microarrays
• Pequeño vidrio o chip de 1-2 cm2
• Muestras de DNA ordenadas en el vidrio
• Detectan miles de secuencias de DNA o RNA
3357 transcritos diferentes entre los niños con infección bacteriana vs los controles
No supervisado
97%
BIOFIRMA de niños con y sin infección bacteriana
Conclusiones
• Nuevas técnicas diagnósticas acortan tiempo de respuesta, disminuyen complejidad, realizan test múltiples y optimizarían variables clínicas
• Incorporación en pacientes hospitalizados / inmunocomprometidos
• Datos apoyan la costo-efectividad del diagnóstico molecular de virus respiratorios en meningitis y en sepsis
• Importante considerar realidad nacional/local
• Falta conocer aún más el impacto en variables clínicas