Diagnóstico molecular de

tuberculosis

Santiago Atehortúa Muñoz

MD Microbiólogo

Hospital Universitario de San Vicente Fundación.

www.sanvicentefundacion.com

Amplificación y detección de Ácidos nucleicos

Es la amplificación de ADN por PCR

una solución para el diagnóstico de

tuberculosis?

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

› Replicación de ácidos nucleicos basados en cambios de

temperatura mediados por una enzima.

› Consiste en tres pasos: Extracción – Amplificación - Detección

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PCR convencional

Hibridación Tiempo Real

Ventajas de los métodos moleculares

› Pruebas rápidas a partir de muestras clínicas.

› Diferencian e identifican microorganismos.

› Detectan microorganismos viables y no viables.

› Alta sensibilidad y especificidad.

› Detección de genes implicados en resistencia.

IDENTIFICACIÓN Y DETECCIÓN

GENES DE RESISTENCIA

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• 511.000 casos de TB-MDR (Resistencia INH – RIF).

290 .000 nuevos casos

221 .000 casos previamente tratados para TB

Epidemiología de la resistencia

• De acuerdo a la resistencia a los medicamentos

antituberculosos M. tuberculosis puede ser:

MDR XDR

Resistente al menos a

Isoniazida y Rifampicina

MDR con resistencia una

Quinolona ( Ofloxacina,

Levofloxacina) y algunos de los

medicamentos inyectables:

Kanamicina, Amikacina o

Capreomicina

TB monorresistente:

Resistente a un

solo fármaco.

Bases genéticas de la resistencia en M. tuberculosis

› Resistencia fenotípica = explicada por mutaciones en genes

específicos.

› La mayoría son cambios en un solo nucleótido (mutaciones

puntuales).

› > 95% de la resistencia a RIF tienen un único punto de mutación en

el gen rpoB

› 70 – 90 % de cepas resistentes a INH se detectan con la

secuenciación de la región promotora inhA, el gen inhA y el gen

katG.

www.cdc.gov

MTBDR Plus – Detección de genes de resistencia

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Rifampicina

Isoniazida

Ventajas de la detección rápida de resistencia

› Iniciar un tratamiento eficaz desde el principio.

› Reducir los periodos de contagio en los casos MDR hasta por 8

semanas

› Mejorar la respuesta clínica en los pacientes

› En EEUU se estima que la prevención de un solo caso de TB MDR le

ahorra al sistema mas de $ 250.000

www.cdc.gov

Pruebas de biología molecular para diagnóstico de

tuberculosis y detección de genes de resistencia

disponibles

› Muestras Pulmonares

› GeneXpert MTB/RIF

› Anyplex II

› MTB DR plus

› Muestras Extrapulmonares*

› GeneXpert MTB/RIF

10*Excepto sangre

Muestras baciloscopia negativas

GeneXpert MTB/RIF

1. Licuefacción del

esputo

2. 2ml

muestra al

cartucho.

3.Cartucho se

inserta dentro

plataforma

4. Muestra

automáticamente

es lavada y filtrada

5. Lisis por ultrasonido

filtro-captura

organismos para

liberar el ADN

6. amplificacióny detección en

tiempo real

7. Impresión de

resultados

PRUEBA genexpert MTB/rif

Tiempo del resultado, 1 hora y 45min

September 1, 2010, at NEJM.org. (10.1056/NEJMoa0907847)

M. tuberculosis positivo

mutaciones gen rpoB detectado resistente

Desempeño PCR-TR (Genexpert MTB/RIF)

Principio de la prueba MTBDRplus

Resultados MTBDRplus

S

E

N

S

I

B

L

E

R

E

S

I

S

T

E

N

T

E

Oscar Iván Quirós Gómez, Santiago Atehortúa Muñoz, Gloria Elena Durango,

Ana Milena Herrera, Sigifredo Ospina Ospina.

HUSVP – CES 2010

Utilidad de una técnica de biología molecular para el

diagnóstico de tuberculosis pulmonar. Hospital Universitario

San Vicente de Paúl 2010

Pruebas de sensibilidad

determinadas por PCRn %

Sensible 10 50

Resistente RIF + INH 3 15

Indeterminada 7 35

Total 20 100

Sensibilidad: 86.7 %

Especificidad: 93.7 %

VPP: 72.2%

VPN: 97.4%

sensibilidad en muestras con baciloscopia

positiva fue 100% y de 60% en muestras

con baciloscopia negativa

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Anyplex™ II MTB / MDR / XDR Detection

TOCE ™ es una nueva tecnología de lectura en tiempo real que se

basa en el análisis de temperatura de fusión.

PCR en tiempo real múltiplex

Anyplex™ II MTB / MDR / XDR Detection

› Permite la amplificación simultánea y la

detección de secuencias diana de M.

tuberculosis y genes de resistencia.

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19

Anyplex MTBDRplus Xpert

Principio PCR TR multiplex de

dos pasos.

Hibridación inversa PCR en Tiempo real

Resultado final MTBC, RIF, INH,

Quinolonas, Aminogl

MTBC, RIF, INH MTBC, RIF

Tiempo 3.5 h 5.35 h 2 h

Infraestructura

requerida

Sistema abierto (3 áreas

separadas)

Sistema abierto (3 áreas

separadas)

Sistema cerrado (área

control temperatura)

Sensibilidad global

(cultivo positivo MTB)

65.5% 70.9% 89.1%

Baciloscopia

Positiva

91.3% 100% 100%

Baciloscopia

Negativa

46.2% 46.2% 80.8%

Xpert: Fue superior en muestras BK negativas.

Correlación de sensibilidad a antiTB fue similar en las tres pruebas.

Interpretación pruebas moleculares M. tuberculosis

› CDC (Centros de Control y Prevención de Enfermedades):

Directo positivo

Prueba molecular positiva

Diagnóstico confirmado

TB pulmonar.

Directo positivo

Prueba molecular negativa

Buscar inhibidores,

otras Mycobacterias

Directo negativo

Alta sospecha clínica

Prueba molecular

(dxpresuntivo)

Directo negativo

Baja sospecha clínica

Prueba molecular no recomendada

Interpretación pruebas moleculares M. tuberculosis

Limitaciones de las pruebas moleculares

› Falsos Positivos:

› Contaminación de la muestra.

› Mal diseño de primers.

› Dx antiguo de Tb tratados

› Falsos negativos:

› Degradación del material genético.

› Mala preparación, transporte y almacenamiento de la

muestra.

› Problemas con los reactivos.

› Carga bacilar baja, elección inadecuada de la técnica.

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Discrepancias en las pruebas moleculares comparada

con pruebas convencionales de susceptibilidad

Prueba molecular

Sensible

Resistente

Prueba convencional

Resistente

Sensible

Interpretación

- Mutaciones codificadas por fuera región evaluada.

- Otros mecanismos de resistencia.

- Bajo nivel de resistencia.

- Poblaciones mixtas.

En quiénes pueden estar indicadas las pruebas?

› Paciente con HIV ó SIDA.

› Inmunosuprimidos (Esteroides, anti TNF)

› Sospecha de fracaso, recaída o reingreso por abandono.

› Sospecha de Tuberculosis extrapulmonar

› Contacto de paciente con multi-resistencia

› Pacientes pediátricos

› Personas privada de la libertad, indigentes y personal de la salud.

› PACIENTES CON ALTA SOSPECHA CLÍNICA Y SIN CONFIRMACIÓN

MICROBIOLÓGICA.

› La biología molecular es una buena herramienta en el apoyo

diagnóstico de la Tuberculosis.

› Gran impacto para el control de la tuberculosis en especial la MDR.

› Los resultados deben interpretarse siempre en conjunto con las

características clínicas, epidemiológicas y de laboratorio.

Conclusiones

OPS/OMS hace especial énfasis en que NINGUNO de estos

métodos reemplaza los que hasta el día de hoy son considerados

de referencia (BK, cultivo, PSF convencionales)

SON COMPLEMENTARIOS

GRACIAS.

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