Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa ...
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Diagnóstico en microbiología de los alimentos:
de la placa de cultivo a la era
genómica
Dr. David Rodríguez Lázaro Grupo de Investigación en Seguridad Alimentaria
SEGURIDAD ALIMENTARIA: VIEJOS PATOGENOS, NUEVOS RETOS
Murcia 29 Enero de 2014
?
¿Seguridad Alimentaria? ¿Qué y por qué?
Scallan et al. (2011). Emerg Inf Dis 17: 7-15
USA
9,388,075 casos
• Coste anual en EE.UU. de casos agudos de gastroenteritis asociados a alimentos (47.780.779): 77.700 M$
Scharff, 2012
81% 77.700 M$ ≈ 59.759 M€
243% 74.284 M€ 24.598 M€ (Investigación)
Gran impacto económico
Epidemiología
Control del riesgo
Análisis del riesgo
Exposición
Comunicación del riesgo
Barreras colectivas Barreras individuales
Gestión del riesgo
SEGURIDAD ALIMENTARIA
Epidemiología
Control del riesgo
Análisis del riesgo
Exposición
Comunicación del riesgo
Barreras colectivas Barreras individuales
Gestión del riesgo
SEGURIDAD ALIMENTARIA
1. Paso final de aislamiento en medio sólido (agar)
2. Este medio será selectivo o diferencial (favorece el crecimiento y/o diferenciará las bacterias bajo estudio según éstas empleen fuentes de energía)
3. Siempre será un resultado presuntivo (NO DEFINITIVO), es necesario confirmación mediante pruebas extras para la correcta identificación
TIEMPO
= $$$$$ Reducción de tiempo de personal
Movilización rápida de los lotes (Reducción tiempo en almacén)
Capacidad discriminatoria • Origen de contaminación
• Detección de formas re-emergentes
Ausencia de métodos de referencia o adecuados • Microorganismos patógenos emergentes: p.ej. Cronobacter • Microorganismos alterantes específicos.
• A nivel mundial: 750 millones análisis anuales • Industria alimentaria: 420 millones • Análisis de rutina (viables totales): 360 millones
• Dos ideas importantes: Las compañías diagnósticas preparan tests diagnósticos antes de los requerimientos normativos Las empresas de alimentos no quieren realizar los análisis microbiológicos in situ, prefieren enviarlos a laboratorios alimentarios o centros de investigación
Tom Wesler. Strategic Consulting Inc. USA
• Análisis microbiológico:
56 % alimentos
30 % farmacia
10 % agua ambiental
4 % agua de consumo
37,2 % aerobios mesófilos
30,8 % E. coli (coliformes)
15,7 % mohos y levaduras
16,3 % patógenos
El coste es igual a la suma del resto
+ Más rápida
+ Más sencilla
+ Más sensible
+ Más específica
+ permite CUANTIFICACIÓN
Organización Internacional para la Estandarización
CEN/TC 275– Food analysis – Horizontal methods WG 6 – Microbial contamination
COMITÉ EUROPEO PARA LA NORMALIZACIÓN
La PCR diagnóstica tendrá el mismo estatus que las técnicas de cultivo bacteriológico convencionales para el año 2010.
La PCR diagnóstica tendrá el mismo estatus que las técnicas de cultivo bacteriológico convencionales para el año 2010 2020.
MÉTODOS MOLECULARES DE DETECCIÓN
Concentration/pre-enrichmentPrecipitation (PEG), ultra-filtration-centrifugation
immunoconcentration, cationic separation TYPING
DETECTION
CultureCell cultureMicroscopy
SAMPLING1. Representativeness 2. sample characteristics 3. time of conservation4. conditions of storage
Molecularmethods
Immunologicalmethods
Nuclec acidpurification
Amplification Reactione.g. PCR, real- time PCR, RT-PCR, NASBA, LAMP, EMA-PCR
e.g.Plaque assayTCDI50
e.g.EIARIAELISA
e.g.SequencingMultiplex PCRserology
ExtractionSwabbing, rinsing, homogenization, gland. extraction
Rodríguez-Lázaro et al. FEMS Microbiol Rev. 2012
MÉTODOS MOLECULARES DE DETECCIÓN
MENSAJE:
Deben ser: 1. Armonizados: definición y uso de PNTs 2. Controlados: uso de controles 3. Validados: empleo de ensayos de validación
(“ring trials )
?
USO de CONTROLES
PARA EVALUAR LOS RESULTADOS
MÉTODOS MOLECULARES DE DETECCIÓN
Concentration/pre-enrichmentPrecipitation (PEG), ultra-filtration-centrifugation
immunoconcentration, cationic separation TYPING
DETECTION
CultureCell cultureMicroscopy
SAMPLING1. Representativeness 2. sample characteristics 3. time of conservation4. conditions of storage
Molecularmethods
Immunologicalmethods
Nuclec acidpurification
Amplification Reactione.g. PCR, real- time PCR, RT-PCR, NASBA, LAMP, EMA-PCR
e.g.Plaque assayTCDI50
e.g.EIARIAELISA
e.g.SequencingMultiplex PCRserology
ExtractionSwabbing, rinsing, homogenization, gland. extraction
Rodríguez-Lázaro et al. FEMS Microbiol Rev. 2012
• Control del procesado de la muestra • Control negativo del procesado de la muestra • Control ambiental • Control negativo de extracción
• Control positivo de amplificación • Control negativo de amplificación • Control estándar (sólo para cuantificación) • Control de amplificación
PREPARACIÓN
DETECCIÓN
ISO 22174:2005 Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens -- General requirements and definitions
adenovirus humano(virus diana)
norovirus murino(virus control SPC)
11 laboratorios a nivel europeo
• El y puede interferir con los resultados finales
• La definición y discusión de los es
• El para evitar problemas
• Los evaluados son para la detección de
Selection and improving of fit-for-purpose sampling procedures for specific foods and
risks
(www.baselineeurope.eu)
Coordinator – Prof. Gerardo Mamfreda UNIBO (IT)
Aproximación: Usar los mismos medios de enriquecimiento (Half-Fraser para L. monocytogenes)
Evaluar alternativas para reducir el tiempo para resultados finales
Reducir los tiempos de incubación
Usar una protocolos de extracción de ADN sencillos y fáciles
Usar un método de PCR a tiempo real
Evaluar alternativas para reducir el coste del análisis
Usar rango de diluciones más bajo (1:3 y 1:5)
Parámetros a evaluar: Tamaño de la muestra (25 g o 50 g)
Dilución de la muestra (1:3, 1:5 o 1:10)
Tiempos de incubación (8, 18 or 24 horas de enriquecimiento)
Protocolo de extracción de ADN (calentamiento, resina Chelex, o kit de columna)
Comparación métodos alternativos vs ISO standards
L. monoctyogenes 1-10 ufc
10-100 ufc 100-1000 ufc
25 g 50 g
ISO Diluciones: 1:3 1:5 1:10
Incubación: 8 h 18 h 24 h Extracción ADN:
Calentamiento Chelex columna
Dilution Incubation times ISO
Baseline QIAGEN
Baseline CHELEX
Baseline BOILING
1 cfu / sample
1:3
8 h 3/3 0/3 0/3 0/3
18 h 3/3 0/3 0/3 0/3
24 h 3/3 1/3 0/3 0/3
1:5
8 h 3/3 0/3 0/3 0/3
18 h 3/3 0/3 0/3 0/3
24 h 3/3 2/3 1/3 0/3
1:10
8 h 3/3 0/3 0/3 0/3
18 h 3/3 0/3 0/3 0/3
24 h 3/3 3/3 1/3 0/3 ✔
50 muestras naturales:
25 contaminadas: 25/25 25/25
25 no-contaminadas: 25/25 25/25
ISO BASELINE
Listeria monoctyogenes
Dilución 1:10 Half Fraser (ISO)
Incubación 24 h
Extracción ADN: Columnas de QIAGEN
PCR a tiempo real Rodríguez Lázaro et al (2004) Appl. Environ. Microbiol.
7 Países 13 Institutos
Grupo de Investigación en Seguridad Alimentaria
Investigadores principales: Dr. David Rodríguez Lázaro Dra. Marta Hernández Pérez
Becarios: Jaime Ariza Miguel Eva Antolín Simón
Técnicos Superiores de Inv: Patricia González García Lorena López Enríquez
Antiguos miembros: Dra. Marta Diez (Univ. Burgos, ES) Dra. Lucía González (ITACyL, ES) Dra. Katarina Kovac (Biosistemika Inc., SL) Dra. Mónica Martínez (ICP-CSIC, ES) Dra. Katarina Oravcova (Univ. St. Andrews, UK) Diana Bezos (Univ. Valladolid, ES) Raquel Campo (Univ. Valladolid, ES) Sonia Ramos (Univ. Burgos, ES)