DIFERENCIACIÓN GENÉTICA DE LAS...
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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA FACULTAD DE CIENCIAS MARINAS DIFERENCIACIÓN GENÉTICA DE LAS AGREGACIONES INVERNANTES DEL PLAYERITO OCCIDENTAL EN MÉXICO TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS EN ECOLOGÍA MOLECULAR Y BIOTECNOLOGÍA PRESENTA ANA RUTH ÁLVAREZ SÁNCHEZ Ensenada, Baja California Julio 2011
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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA FACULTAD DE CIENCIAS MARINAS
DIFERENCIACIÓN GENÉTICA DE LAS AGREGACIONES INVERNANTES DEL PLAYERITO OCCIDENTAL EN
MÉXICO
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS EN ECOLOGÍA MOLECULAR Y
BIOTECNOLOGÍA
PRESENTA ANA RUTH ÁLVAREZ SÁNCHEZ
Ensenada, Baja California Julio 2011
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA FACULTAD DE CIENCIAS MARINAS
POSGRADO EN ECOLOGÍA MOLECULAR Y BIOTECNOLOGÍA
DIFERENCIACIÓN GENÉTICA DE LAS AGREGACIONES INVERNANTES DEL PLAYERITO OCCIDENTAL EN MÉXICO
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRO EN CIENCIAS
PRESENTA
ANA RUTH ÁLVAREZ SÁNCHEZ
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Chiste Un conejo estaba sentado delante de una cueva escribiendo, cuando aparece un zorro. ‐ Hola, conejo, que haces? ‐ Estoy escribiendo una tesis doctoral sobre como los conejos comen zorros. ‐ Ja, ja, pero que dices? ‐ No te lo crees? Anda, ven conmigo dentro de la cueva... Total, que los dos entran y al cabo de un ratito sale el conejo con la calavera del zorro y se pone a escribir. Al cabo de un rato llega un lobo. ‐ Hola, conejo, que haces? ‐ Estoy escribiendo mi tesis doctoral sobre como los conejos comen zorros y lobos. ‐ Ja, ja, que bueno, que chiste más divertido! ‐ Que no te lo crees? Anda, ven dentro de la cueva, que te voy a enseñar algo! Al cabo de un rato sale el conejo con una calavera de lobo y empieza otra vez a escribir. Después llega un oso. ‐ Hola, conejo, que haces? ‐ Estoy acabando de escribir mi tesis doctoral sobre como los conejos comen zorros, lobos y osos. ‐ No te lo crees ni tú. ‐ Bueno, a que no te metes en la cueva conmigo? De nuevo se meten los dos en la cueva y como era de esperar, un león enorme se tira encima del oso y se lo come. El conejo recoge la calavera del oso, sale fuera y acaba su tesis.
Moraleja: Lo importante no es el contenido de tu tesis, sino quien es tu asesor.
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DEDICATORIA
A mi Novio
Lot Gilberto Resendiz Velarde por que en todo momento estuvo conmigo
brindándome todo su amor y cariño dándome fuerzas día a día motivándome para
seguir adelante “Gracias por estos ocho años de felicidad Grandote Te Amo”.
A mi madre
Magdalena Sánchez quien me dio la vida, la educación y me enseñó los valores y
principios que hoy conozco y ejerzo. A pesar de ser madre soltera nos supo guiar a mis
hermanos y a mí por un buen camino formando en mí una profesionista con su ejemplo
y su amor saldré adelante en esta vida. Por eso mamá estoy infinitamente agradecida.
A mis hermanos
Miriam Berenice, Ramón Alberto, Josué Erik y Nereida Dorleyn, que de alguna u otra
forma siempre me ayudaron brindándome su amor y cariño.
A mi Abuela
Ignacia Sánchez Meléndrez que con su amor y cariño siempre me dio los consejos
apropiados para salir adelante en esta vida.
A todos muchas gracias “Los amo”
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AGRADECIMIENTOS
A Dios padre le agradezco el haberme prestado mi vida para concluir este trabajo y
darme la bendición de tener una maravillosa familia.
A la Universidad Autónoma de Baja California, la Facultad de Ciencias Marinas y a la
Maestría en Ecología Molecular y Biotecnología, por el apoyo brindado durante mi
periodo de estudio
Al Consejo Nacional de Ciencias y Tecnología (CONACYT), por el otorgamiento de la
beca para realizar esta maestría y con el cual se logro cumplir con el periodo de
estudios de posgrado.
A mi director de tesis el Dr. Luis Manuel Enríquez Paredes por haber sido un sol en
medio de la oscuridad y brindarme la oportunidad de elaborar este trabajo. Por el
estimulo, confianza y sobre todo la paciencia que me brindó al explicarme en todo
momento hasta el más mínimo detalle y agradezco su ayuda ya que sin ella no hubiera
concluido este posgrado.
Al Dr. Guillermo J. Fernández Aceves quien sin conocerme me aceptó en su proyecto y
con paciencia me brindo los consejos, ayuda y experiencia en todo momento.
A la Dra. Ivone Giffard Mena por aceptar ser parte de este proyecto, por haberme
mostrado el camino correcto cuando me sentía sola y perdida en este posgrado.
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A Nelva Victoria por todo el tiempo que me dedicó en la realización de esta tesis. Por
haber sido más que una compañera una “Gran Maestra”.
A mis compañeros y amigos de maestría Cynthia López, Adriana Romero, Michelle
Valdez, Sandra Moreno y Renne Cazares por brindarme su amistad incondicional y
hacerme esta estancia más amena.
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RESUMEN
El playerito occidental Calidris mauri es un ave playera migratoria que se reproduce durante el verano en la tundra Siberiana Oriental y las costas de Alaska. La mayoría de los individuos de esta especie migran a lo largo del Corredor Migratorio del Pacífico para pasar el invierno en latitudes templado‐tropicales, pero algunos individuos utilizan el Corredor Migratorio del Atlántico. Cerca del 30% de la población mundial del playerito occidental pasa el inverno en el noroeste de México. Para entender su dinámica poblacional se requiere de un conocimiento detallado de los individuos que ocupan esta zona. Los marcadores genéticos han sido usados para determinar la conectividad migratoria, identificar el origen geográfico de los migrantes y estimar de forma indirecta la importancia relativa de los sitios de invernación. El objetivo del presente estudio fue el de establecer la identidad y la estructura genética del playerito occidental en algunas de las agregaciones no reproductivas más importantes de México. Para ello se identificó el genotipo de 168 individuos adultos en 7 agregaciones invernales situadas en la Península de Baja California, la costa de Sinaloa y la Península de Yucatán, empleando 10 marcadores nucleares microsatélites. Aunque la diversidad genética resultó moderadamente alta (Ho=0.713, Na=14 y Ne=5.1), la distribución de los alelos fue homogénea entre las localidades. En consecuencia, el análisis de estructura poblacional resultó no significativo para los distintos estimadores de diferenciación genética empleados (FST = ‐0.0008, RST= 0.004, DST= ‐0.002). Las estimaciones fueron similares al considerar por separado a los machos y las hembras Estos resultados son congruentes con el obtenido a través de una aproximación Bayesiana (STRUCTURE k=1), lo que sugiere que los individuos que invernan en México pertenecen al mismo grupo reproductivo y sustentan el carácter monotípico de Calidris mauri. Estudios previos basados en marcadores RAPDs y secuencias de DNAmt han evidenciado diferencias sutiles entre los individuos de los corredores migratorios del Pacífico y del Atlántico. A pesar de que nuestros resultados indican la ausencia de diferenciación, la divergencia más alta se observó entre la Península de Yucatán (en la costa del Atlántico) y Bahía Santa María (en el Pacífico); lo que hace necesario el incorporar muestras de las zonas de reproducción para aclarar si existe cierto nivel de segregación genética entre esta especie.
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ABSTRACT The Western Sandpiper Calidris mauri is a migratory shorebird that breeds during the summer in the East Siberian tundra and the coast of Alaska. Most individuals of this species migrates along the Pacific Flyway to spend the winter in temperate and tropical latitudes, some use the Atlantic Flyway. Near 30% of the western Sandpiper global population spend their winter in the northwest of Mexico. In order to understand this population dynamics, a detailed knowledge of the individuals that occupy this zone is required. Genetic markers have been used to determine the migratory connectivity, to identify the migrant geographic origin and to indirectly consider the relative importance of the wintering sites. The objective of the present study was to establish the identity and the genetic structure of the western Sandpiper in some of the most important nonbreeding aggregations of Mexico. To achieve this goal, genotypes of 168 adult individuals were identified using 10 nuclear markers microsatellites in 7 winter aggregations located in the Peninsula of Baja California, Sinaloa and the Yucatan Peninsula, coasts (México). Although the genetic diversity was moderately high (Ho=0.713, Na=14 and Ne=5.1), the alleles distribution was homogenous between localities. Consequently, structure population analysis was similar for the different estimators of genetic differentiation used (FST = ‐0.0008, RST= 0.004, DST= ‐0.002). The estimations were also similar when considering separately males and females. These results were congruent with those obtained through a Bayesiana approach (STRUCTURE k=1). Our data suggest that individuals wintering in México belong to the same reproductive group, sustaining the monotypical character of Calidris mauri. Previous studies based on RAPDs markers and mtDNA sequences have demonstrated subtle differences when comparing the individuals from the migratory Pacific Flyway and those from the Atlantic. Although our results indicate a lack of differentiation, the highest divergence was observed between the Yucatan Peninsula (in the Atlantic coast) and Santa Maria Bay (in the Pacific); therefore to incorporate samples from reproduction zones to clarify if it exists certain level of genetic segregation whiting this specie.
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Índice Pág.
DEDICATORIA .....................................................................................................................II
AGRADECIMIENTOS ......................................................................................................... IV
RESUMEN ......................................................................................................................... VI
ABSTRACT......................................................................................................................... VI
GLOSARIO........................................................................................................................XIII
1 INTRODUCCIÓN ..........................................................................................................1
2 ANTECEDENTES...........................................................................................................5
2.1 TAXONOMÍA ........................................................................................................5
2.2 ESTIMACIÓN Y TENDENCIA DE LA POBLACIÓN ...................................................6
2.3 MIGRACIÓN .........................................................................................................7
2.4 TASAS DE SUPERVIVENCIA ..................................................................................8
2.5 UTILIZACIÓN DE LOS MICROSATÉLITES EN AVES PLAYERAS. ..............................9
2.6 USO DE MARCADORES MOLECULARES EN CALIDRIS MAURI............................10
3 JUSTIFICACIÓN ..........................................................................................................12
4 HIPÓTESIS..................................................................................................................13
5 OBJETIVOS.................................................................................................................14
5.1 OBJETIVOS PARTICULARES ................................................................................14
6 MATERIAL Y MÉTODOS.............................................................................................15
6.1 TRABAJO DE CAMPO .........................................................................................15
6.1.1 CAPTURA DE LOS INDIVIDUOS ...................................................................15
6.1.2 RECOLECTA DE TEJIDOS .............................................................................17
6.2 TRABAJO DE LABORATORIO ..............................................................................18
6.2.1 SELECCIÓN DE LOS INDIVIDUOS.................................................................18
6.2.2 EXTRACCIÓN Y ESTIMACIÓN DE LA CALIDAD Y CANTIDAD DEL ADN ........19
6.2.3 OPTIMIZACIÓN Y CONTROL DE CALIDAD DE LA AMPLIFICACIÓN DE LOS MICROSATÉLITES.......................................................................................................19
6.2.4 CONTROL DE CALIDAD DEL GENOTIPADO .................................................22
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6.3 TRABAJO DE GABINETE......................................................................................25
6.3.1 GENOTIPADO..............................................................................................25
6.4 ANÁLISIS ESTADÍSTICOS.....................................................................................27
6.4.1 DIVERSIDAD GENÉTICA ..............................................................................27
6.4.2 ESTRUCTURA POBLACIONAL......................................................................27
7 RESULTADOS.............................................................................................................29
7.1 TASA DE ERROR EN EL GENOTIPADO ................................................................29
7.2 DESEQUILIBRIO EN EL LIGAMIENTO..................................................................29
7.3 EQUILIBRIO DE HARDY‐WEINBERG ...................................................................30
7.4 PROBABILIDAD DE IDENTIDAD ..........................................................................32
7.5 DIVERSIDAD GENÉTICA......................................................................................33
7.5.1 ANÁLISIS GLOBAL Y POR LOCALIDAD.........................................................34
7.6 ESTRUCTURA POBLACIONAL .............................................................................37
7.6.1 ANALISIS POR LOCALIDAD..........................................................................37
7.6.2 ANÁLISIS POR SEXOS ..................................................................................38
7.6.3 ANALISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES ...............................................38
7.6.4 ANALISIS DE ASIGNACION POBLACIONAL BAYESIANO ..............................39
7.7 CONECTIVIDAD MIGRATORIA............................................................................40
8 DISCUSIÓN ................................................................................................................42
8.1 ASPECTOS METODOLÓGICOS............................................................................42
8.2 IDENTIDAD Y DIVERSIDAD GENÉTICA................................................................45
8.3 ESTRUCTURA GENÉTICA Y CONECTIVIDAD MIGRATORIA .................................51
9 CONCLUSIONES.........................................................................................................59
10 BIBLIOGRAFÍA........................................................................................................61
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LISTA DE TABLAS Tabla 1. Esfuerzo de captura de Calidris mauri en las siete localidades de muestreo en México.
En paréntesis se indica el número de muestras utilizadas para este trabajo................. 17 Tabla 2. Condiciones optimizadas para la amplificación de los microsatélites empleados en el
presente estudio. Se indican el perfil de amplificación (ver Apéndice 4) y el fluorocromo seleccionado para cada locus. *, Microsatelites usados en PCR múltiple. 22
Tabla 3 Control de calidad genética realizada con los niveles de diversidad genética en términos de número de alelos, rango de número de alelos, el poder informativo (I) Y la heterocigosidad observada (Ho) en los distintos programás empleados (MSTOOLS, GenALEX y ARLEQUIN). * indica los valores de heterocigosidad que resultarón significativamente distintos a los esperados bajo el equilibrio de Hardy‐Weinberg. La flecha señala al microsatelite CME 08 que no cumplió con el control de calidad durante la elaboracion de este trabajo por lo que fue eliminado................................................ 31
Tabla 4. Probabilidad de identidad de organismos con el programa GIMLET. Microsatélites (Locus), número de individuos (N), número de alelos (Na), Probabilidad de identidad (PI), Probabilidad de identidad entre individuos no emparentados por locus (PIU locus), Probabilidad de identidad entre hermanos por locus (acumulativa) (PIU acum) y Probabilidad de identidad entre hermanos por locus (acumulativa) esto es usando solo el locus 1, luego el 1 y el 2, luego el 1, 2 y 3 etc. (PIS acum). ......................................... 33
Tabla 5 Diversidad genética en nueve loci de microsatélites en siete localidades en México. No. de alelos (Na), No. efectivo alelos (Ne), heterocigosidad observada (Ho) e Índice de información (I). Entre paréntesis se indica el número de individuos analizados por localidad. ......................................................................................................................... 35
Tabla 6 Diversidad genética y Equilibrio de Hardy‐Weinberg (P) en machos. ............................. 35 Tabla 7 Diversidad genética y desequilibrio de Hardy‐Weinberg (P) en hembras.....……35 Tabla 8. Diversidad genética generada con el programa SMOGD. Ñ = media armónica de los
tamaños de población, HS_est= estimador casi insesgado de heterocigosis dentro de la subpoblación (Nei 1983), HTest = estimador casi insesgado del total de heterocigosis (Nei 1983), GST_est estimador casi insesgado de heterocigosidad entre la subpoblación (Nei 1983), G'ST_est = medida estandarizada de la diferenciación genética (Hedrick 2005), Dest = estimador de la diferenciación real y E= estimador genético insesgado de diferenciación alélica (Jost 2008).................................................................................... 37
Tabla 9 Comparación del tamaño y rango alélico de los microsatélites empleados. En gris se indica el microsatelite con mayor número de alelos. ..................................................... 47
Tabla 10 Diversidad genética de especies de Calidris. ................................................................. 49
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Sitios de muestreo de Calidris mauri: Complejo Lagunar Ojo de Liebre (GN) y La Paz (LP) en Baja California Sur; el Delta del Río Colorado (AG) de Baja California/Sonora; la Bahía Santa Maria (SM), Ensenada Pabellones (EP) y Huizache‐Caimanero (HZ) en la costa de Sinaloa y Yucatán (PY)........................ 17
Figura 2. Mezclas de los productos de PCR empleadas para el análisis de fragmentos automatizado de los 10 microsatélites seleccionados. En el eje de las X se observa el alelo correspondiente y en el eje de las Y se encuentra los tamaños de cada pico......................................................................................................... 24
Figura 3. Análisis de componentes principales con base de las distancias genéticas pareadas (distancia genética de Nei no estandarizada) entre los individuos de todas las localidades. Los códigos de las localidades corresponden a los que se describen en la Tabla 1........................................................................................ 39
Figura 4. Distribución homogénea de las frecuencias alélicas entre las agregaciones invernantes del Playerito Occidental con el programa STRUCTURE................... 40
Figura 5. Arboles de distancia genética basados en los coeficientes de diferenciación FST (A) y RST (B) entre localidades.............................................................................. 41
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LISTA DE APÉNDICE
APÉNDICE 1. Organismos seleccionados para este trabajo…………….……………………………72
APÉNDICE 2. Protocolo de extracción de DNA .......................................................................... 75
APÉNDICE 3. Optimización y evaluación de la reproducibilidad de los loci microsatélites empleados para el genotipado del playerito occidental………………….……..75
APÉNDICE 4. Programás de PCR empleados para la amplificación de microsatélites…..77
APÉNDICE 5. Frecuencias alélicas de cada locus por población…………………………………..80
APÉNDICE 6. MICROCHECKER (Frecuencia de Homocigotos) .........................................88
APÉNDICE 7. Diferencias en la frecuencia .......................................................................91
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GLOSARIO
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism): fragmento amplificado de longitud polimórfica. Es un tipo de marcador molecular que involucra la amplificación de un conjunto específico de fragmentos de restricción mediante PCR utilizando un precursor marcado. Alelo: formas alternativas de un gen en un mismo locus. El término de alelo ó alelomorfo fue acuñado por William Bateson; literalmente significa "forma alternativa".
Alelo nulo: es aquel alelo que carece de un producto genético a nivel fenotípico. El fundamento molecular de dicha incapacidad de generar el fenotipo ya sea por la falta de expresión génica de ese alelo o por alguna mutación en su secuencia que lo incapacite para desempeñar su función biológica. Agregación invernal: estrategia de migración en la cual los individuos se segregan durante el invierno, se suelen observar grupos compuestos por individuos de la misma edad y sexo. Amplificación diferencial de los alelos (Allelic Dropout): cuando uno de los dos alelos puede ser indetectable lo que pudiera deberse a que un heterocigoto pareciera un homocigoto. Causado por un déficit parcial de amplificación con la PCR.
Aves playeras: grupo de aves heterogéneo que pertenece al suborden Charadrii; éstas comparten características morfológicas y comportamentales, particularmente en alimentación. Normalmente se encuentran en playas y planicies lodosas costeras o de aguas interiores.
Codominancia: condición en la cual el heterocigoto exhibe el fenotipo de ambos homocigotos. Ambos alelos producen efectos detectables en condición heterocigota.
Conectividad migratoria: relación existente de las poblaciones y ubicaciones geográficas en diferente época del año.
Corredor migratorio: ruta que utilizan las aves para viajar entre sus sitios de reproducción e invernación.
Culmen o pico: estructura característica de las aves que le sirve para alimentarse y defenderse. Es una escama epidérmica modificada que cubre el maxilar de las aves.
DNA: Acido desoxirribonucleico. Polímero formado por la unión covalente de nucleótidos. Un nucleótido = base (Adenina, Timina, Guanina, Citosina) + azúcar (2' deoxiribosa) + fosfato. Moléculas de DNA eucariontes y procariontes son de doble cadena. Ambas hebras están unidas por enlaces de tipo no covalente: efecto
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hidrofóbico y puentes de H. El DNA es el material genético de células procariotas, eucariotas y virus de DNA. La información genética está contenida en la secuencia de bases de una de las hebras de la molécula dúplex.
Dominancia: se refiere a la relación entre un par de alelos. El alelo dominante es aquel cuyo fenotipo se expresa en los heterocigotos. El alelo recesivo es aquel cuya expresión se enmascara en el heterocigoto.
Edad: se utilizó como variable binominal, cada ave puede ser joven o adulta.
Efecto Deleterio: efecto de reduccion en cuanto al número de individuos que tienden a concentrarse en un lugar determinado.
Efecto Whalund: exceso de homocigotos en poblaciones subdivididas o subestructuradas.
Electroforesis: técnica para separar moléculas de diferentes tamaños y cargas, típicamente DNA ó proteínas.
Electroferograma: es un gráfico realizado con los resultados de un análisis por electroforesis e indica el rastreo de absorbancia de cada fracción de proteína en función de su tiempo de migración.
Equilibrio de Hardy‐Weinberg: principio que sostiene que las frecuencias de alelos y de genotipos permanecerán en equilibrio en una población infinitamente grande, donde los individuos se crucen al azar y en ausencia de mutación, migración y selección.
Genotipo: es el contenido genoma específico de un individuo, en forma de ADN.1 Junto con la variación ambiental que influye sobre el individuo, codifica su fenotipo.
Homoplacia: es el cambio evolutivo paralelo que hace que dos organismos presenten un mismo carácter adquirido independientemente. Bajo este término se reúnen los conceptos de paralelismo y de convergencia.
Humedales: extensiones de marismás, pantanos, estancadas o corrientes, dulces, salobres o saladas incluyendo las extensiones de agua marina cuya profundidad no exceda los seis metros.
Isótopos: átomos de un mismo elemento con diferente masa, que poseen el mismo número de protones y electrones, pero difieren en el número de neutrones. En isótopos inestables ocurre una transición a formas más estables y se libera radioactividad.
Limo o légamo: es un material suelto con una granulometría comprendida entre la arena fina y la arcilla. Es un sedimento clástico incoherente transportado en suspensión
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por los ríos y por el viento, que se deposita en el lecho de los cursos de agua o sobre los terrenos que han sido inundados. Microsatélite: son segmentos cortos de ADN de 1 a 6 pares de bases, los cuales se repiten en tándem y de forma aleatoria en el genoma de los seres vivos. Migración: movimientos estacionales de los individuos entre el área de reproducción y la de invierno. Por lo general existe una relación directa entre la latitud de reproducción y lo largo de la migración.
Monotipico: todos los miembros de la especie son tan similares que no pueden dividirse sensiblemente en subcategorías biológicamente significativas como el caso de Calidris mauri donde no se conocen subespecies.
Panmixia: Sistema de apareamiento en el que la elección de pareja se realiza al azar.
Población: conjunto de individuos de la misma especie que comparten el mismo acervo genético.
Polimorfismo: es una variación en la secuencia de un lugar determinado del ADN entre los individuos de una población.
PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa): es un método in vitro para la amplificación enzimática de secuencias específicas de DNA. Utiliza iniciadores y la DNA polimerasa Taq. La amplificación ocurre a través de ciclos de desnaturalización, anillado con primer y extensión con DNA pol. La secuencia de DNA se amplifica 106 veces.
Playerito Occidental (Calidris mauri): ave de talla pequeña (17 cm), caracteristico de humedales costeros de América donde es muy abundante. Se caracteriza por presentar tarsos y pico negros con decurvado en el extremo.
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA): es un tipo de marcador molecular que involucra la visualización de fragmentos de DNA de diferentes tamaños generados por PCR utilizando partidores de secuencia arbitraria y electroforesis. Ventaja; bajo costo. Desventaja; baja reproducibilidad.
Red de niebla: red de hilo de nylon, muy delgada que se instala en medio de dos tubos. Es ampliamente utilizada en la captura de aves pequeñas como Calidris mauri.
Región Neártica: es una de las ocho regiónes biogeográficas. Abarca la porción Norte del Continente Américano. Su fauna típica incluye bisontes, coyotes y berrendos entre otros.
xvi
RFLP: fragmentos de restricción polimórficos.
Tartamudeo de polimerasa (stutter peaks): se le considere stutter peaks cuando en la replicación del ADN se elimina o se agrega unidades a la cadena.
1
1 INTRODUCCIÓN
Las aves playeras (Charadrii) son componentes importantes de la biodiversidad de los
humedales costeros y juegan un papel esencial en los flujos de masa y energía de las
redes tróficas estuarinas (Moreira 1997, Stroud et al. 2004). Muchas de las aves
playeras son especies migratorias Neárticas‐Neotropicales, que realizan movimientos
estacionales entre sus zonas de reproducción e invernación. En primavera vuelan
rumbo al norte a las áreas de reproducción en los hábitats del Ártico (Brown et al.
2001), mientras que durante el otoño se dirigen al sur a las áreas de invernación en
México, Centro y Sudamérica (Delgado‐Butler 1993, Fernández et al. 2001). La
migración de las aves ocurre por tres corredores principales, el Corredor Migratorio del
Pacífico, el del Atlántico y el Central (Myers et al. 1987). Por el número de aves que lo
utilizan, el más relevante es el Corredor Migratorio del Pacífico.
Durante la migración las aves playeras utilizan una serie de sitios eslabonados para
realizar paradas de descanso y recuperación de energía (Myers et al. 1987). El acceso a
zonas de refugio y de reabastecimiento de alta calidad es esencial para culminar
exitosamente la migración, misma que se refleja en sus probabilidades de éxito
reproductivo (Morrison 1984, Skagen y Knopf 1993, Farmer y Parent 1997).
2
La degradación o pérdida de los hábitats es uno de los grandes problemas que
enfrentan las aves playeras (Piersma y Baker 2000). Por ejemplo, el hecho de que
utilicen humedales costeros impactados por actividades humanas (Bildstein et al. 1991)
y la tendencia a concentrarse en un número limitado de sitios durante la época no
reproductora, las hace susceptibles a efectos deletéreos que pueden afectar una
proporción importante de su población (Myers et al. 1987); por otro lado su éxito
reproductivo relativamente bajo, aunado con una alta longevidad sugieren una
capacidad de recuperación lenta después de una disminución en el tamaño poblacional
(Hitchcock y Gratto‐Trevor 1997).
El tamaño poblacional de varias especies de aves playeras ha disminuido de manera
significativa en Norteamérica (Bart et al. 2007). Es posible que múltiples factores
intervengan en la disminución del tamaño poblacional de este grupo de aves (Thomas
et al. 2006), ya que pueden ser afectadas por eventos durante su reproducción,
migración, invernación, o bien por la interacción de factores en diferentes etapas
(Sillett et al. 2000, Norris et al. 2004).
Debido a la naturaleza migratoria de las aves playeras, para entender las causas de las
fluctuaciones del tamaño de sus poblaciones, se requiere conocer detalladamente su
biología, para poder determinar dónde, cuándo y cómo las poblaciones pueden ser
reguladas (Skagen 2006).
3
En el Noroeste de México se localizan las principales áreas de invernada de diversas
especies de aves playeras que se reproducen en el Neártico. Probablemente esta
región alberga más de la mitad de aves playeras que migran o invernan en el Corredor
Migratorio del Pacífico (Morrison et al. 1994, Mellink et al. 1997, Page et al. 1997,
Engilis et al. 1998). A pesar de que esta región es clave para la conservación de los
playeros neárticos, la información publicada sobre aspectos clave de su biología en
dichas zonas es parcial y exigua (Castillo‐Guerrero et al. 2009, Fernández et al. 2001,
2003, Fernández y Lank 2006, 2008, 2010).
Desafortunadamente, durante los últimos 20 años ha existido una pérdida y alteración
de hábitat en los humedales costeros de la región por actividades antropogénicas (Ruiz‐
Luna y Berlanga‐Robles 1999, Hernández‐Cornejo y Ruiz‐Luna 2000). Estas actividades
han modificado los humedales costeros, alterando el paisaje y su productividad natural.
Se desconoce cuál ha sido el efecto de estos cambios en el tamaño y supervivencia de
las poblaciones de aves playeras que invernan en la región.
Debido a la naturaleza migratoria de las aves, dar seguimiento a los grupos de
reproducción o invernación a lo largo de un ciclo anual es extremadamente difícil. El
uso de marcadores moleculares surge como técnica alternativa para estudiar la
conectividad migratoria en aves (Wennerberg 2001). Además, los marcadores
4
moleculares son una herramienta utilizada para obtener información sobre los niveles
de diversidad genética, comportamiento reproductivo, migración, demografía y
estructura poblacional (Hoezel 1992). Uno de los marcadores moleculares más
utilizados en la genética poblacional son los microsatélites (Arangure et al. 2005)
porque son polimórficos, presentan herencia mendeliana simple, son codominates
(pudiéndose diferenciar los individuos homocigotos de los heterocigotos), son fáciles
de medir y analizar, fiables, reproducibles, automatizables y con un poder resolutivo a
nivel individual que resulta ideal para estudios genéticos poblacionales (Goldstein y
Schlötterer, 1999).
El objetivo principal de este trabajo fue determinar la diversidad y estructura genética
de las poblaciones invernantes de Calidris mauri en siete localidades de México con el
uso de marcadores nucleares (Microsatélites) y determinar la relación entre los grupos
invernantes de la región.
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2 ANTECEDENTES
La especie de interés en este estudio es Calidris mauri conocida como Playerito
Occidental (Orden Charadriiformes, Familia Scolopacidae). El Playerito Occidental se
reproduce en las costas de Alaska y Noroeste de Siberia (Wilson 1994). Durante el
invierno, la especie se distribuye en las costas del Pacífico principalmente desde el Sur
de Canadá hasta Perú, y en las costas del Atlántico desde Nueva Jersey hasta Surinam
(Wilson 1994). La principal ruta migratoria del Playerito Occidental es el Corredor
Migratorio del Pacífico (Senner et al. 1981; Morrison 1984; Paulson 1993).
El Playerito Occidental es un ave pequeña (14 a 17 cm de envergadura, 35 a 37 cm de
longitud total y 22 a 35 g). El pico es de color negro y ligeramente curvado en la punta
y con un marcado dimorfismo sexual (Jehl y Murray 1983), los machos son 10% más
ligeros y 15% más pequeños que las hembras (Page y Fearis 1971, Pulson 1993).
2.1 TAXONOMÍA
El Playerito Occidental es una especie monotípica (Wilson 1994). Aunque no se
reconocen razas o poblaciones de crianza discretas, han evidenciado ciertas diferencias
genéticas basadas en el análisis DNA polimórficos amplificados al azar (RAPDs) entre los
grupos de invernación en la Bahía de Humboldt en California y la isla del Sur en
Carolina del Sur (Haig et al. 1997). Vilanova (2006) en Bahía Santa María encontró la
presencia de dos grupos fenotípicamente similares pero filogenéticamente
distinguibles que a nivel local presentaron un patrón de segregación espacial y
6
temporal. Estos estudios indican que en el Playerito Occidental presenta cierto grado
de estructura poblacional. De manera interesante la distribución limitada durante la
época de reproducción de esta especie no sugiere que esto debiera ocurrir. Por otro
lado, se desconoce si existe una diferenciación genética entre los individuos que se
reproducen en la Península de Chukotski en Siberia y los individuos de Norteamérica lo
que podría estar influyendo en la selectividad de sitios de invernación.
2.2 ESTIMACIÓN Y TENDENCIA DE LA POBLACIÓN
El Playerito Occidental es una de las especie de aves playeras más comunes de la zona
costera de Norteamérica. El último esfuerzo para determinar el tamaño poblacional
realizado de manera sistemática entre 1992 y 1995 estimó 3.5 millones de individuos
(Bishop et al. 2000, Morrison et al. 2001). De los trabajos de monitoreo realizados en el
Suroeste de Columbia Británica durante la migración al sur (Brown et al. 2001; Butler y
Lemon 2001) se ha considerado que probablemente esté ocurriendo una disminución
en la poblacion de esta especie, dicha reducción se ha detectado también en otros sitos
durante la migración (Herman y Bulger 1981, Buchanan 2005). Sin embargo, es posible
que no exista un cambio real en la tendencia poblacional a la baja de la especie debido
a que los individuos usan por menos tiempo los sitios durante su migración (Ydenberg
et al. 2004).
7
2.3 MIGRACIÓN
Durante la migración, el Playerito Occidental se agrega en grandes parvadas (Wilson
1994). La especie tiene una migración diferencial por sexo, edad y tamaño. Existe una
mayor proporción de machos en la porción norte y hembras en la porción sur de su
distribución geográfica durante la época no reproductiva (Page y Fearris 1971,
Harrington y Haase 1994, Buenrostro et al. 1999). En cuanto a los grupos de edad
exhiben una distribución en forma de “U”, con una mayor proporción de subadultos en
los extremos y adultos en el centro (Nebel et al. 2002). Además, dentro de cada sexo y
grupo de edad, los individuos que migran más al sur tienen culmen y cuerda alar más
grandes (O’Hara et al. 2006), pero tienen el tarso más pequeño (Stein et al. 2008).
Recientemente, se descubrió una diferencia en las estrategias de historia de vida
(Fernández et al. 2004 y O’Hara et al. 2005). Todos los individuos en el noroeste de
México se preparan para la migración al norte, incrementando la masa corporal y
mudando a plumaje reproductivo. En Panamá, mientras que la mayoría de los adultos
se preparan para la migración al norte, los subadultos pasan su primer verano con
plumaje básico en los sitios no‐reproductivos. Para los subadultos que invernan en la
parte norte se reproducen en su primer verano reduciendo así el desgaste de las
plumas por la luz ultravioleta (Nebel et al 2002).
8
La migración hacia los sitios de invernación empieza a mediados de junio y se prolonga
hasta noviembre (migración de otoño). Se caracteriza por que los adultos anteceden a
los subadultos dentro de cada grupo de edad, las hembras son el primer grupo que
parte de las zonas de reproducción (Butler et al. 1987, Ydenberg et al. 2005). La
migración hacia los sitios de reproducción (migración de primavera), puede comenzar
desde febrero (Delgado y Butler 1993, Fernández et al. 2001). Los machos
generalmente llegan primero a los sitios de reproducción que las hembras (Senner
1979 y Butler et al. 1987).
2.4 TASAS DE SUPERVIVENCIA
Se ha registrado que los sexos del Playerito Occidental tienen una supervivencia local
diferente en las zonas de reproducción, siendo los machos más longevos que las
hembras (0.57 – 0.62 vs. 0.55 – 0.59, Sandercock et al. 2000). En los sitios de invernada,
los valores son variables con 0.47 en Punta Banda, México (Fernández et al. 2003) y
0.62 en Panamá (O´Hara 2002). Estos estudios han puesto de manifiesto además que la
especie presenta una alta fidelidad a sus zonas de reproducción e invernación (Smith y
Styles 1979, Warnock y Takekawa 1996, Fernández et al. 2003).
9
2.5 UTILIZACIÓN DE LOS MICROSATÉLITES EN AVES PLAYERAS.
Los microsatélites han sido utilizados en aves playeras migratorias. Por ejemplo, en el
Combatiente (Philomachus pugnax) se aislaron y caracterizaron nueve microsatélites
polimórficos con la finalidad de identificar la familia y determinar el éxito reproductivo
de los machos (Thuman et al. 2002).
Asimismo, para el Playerito Pectoral (Calidris melanotos) se aislaron once microsatélites
polimórficos para determinar la paternidad y sistema de apareamiento (Carter y
Kempenaers, 2007). Además, en la misma publicación los autores divulgan la
amplificación cruzada de estos microsatélites para Calidris pusilla (Carter y
Kempenaers, 2007).
En el Playerito Común (Calidris alpina) se han utilizado marcadores mitocondriales y
nucleares para tratar de explicar el origen filogeográfico y la diversidad genética de
una población en Svalbard, Noruega (Gunnhild et al. 2008). Los haplotipos de DNAmt
encontrados indican una semejanza cercana a las poblaciones de Groenlandia e Islandia
del este mientras que los microsatélites apoyaron un origen Occidental para la
población de Svalbard (Gunnhild et al. 2008).
En el Correlimo de Temminckii (Calidris temminckii) se determinó la estructura y
variabilidad genética con los marcadores genéticos de DNAmt y microsatélites con 127
10
organismos de tres poblaciones de Fennoscandia al este de Siberia (Antti et al. 2008).
Aunque la variabilidad del mtDNA y la estructuración fueron muy bajos, se encontró
una diferenciación más alta con el uso de seis microsatélites polimórficos en 25
organismos (Antti et al. 2008).
En el Chorlito Nevado (Charadrius alexandrinus) se utilizaron 26 microsatélites y una
parte del gen CHD y dos marcadores mitocondriales (ND3 y ATPasa 6/8) para investigar
la divergencia entre las poblaciones de América y de Eurasia en características
genéticas y fenotípicas de las subespecies C. alexandrinus nivosus (que se encuentra en
América) y C. alexandrinus (que se encuentra en Eurasia). Los análisis genéticos
indicaron que las poblaciones de América y Eurasia son marcadamente diferentes y que
las poblaciones de Eurasia están más relacionadas con Calidris marginatus. Dentro las
subespecies, las poblaciones investigadas que estaban separadas por distancias
grandes no estuvieron diferenciadas genéticamente (todos los valores de Fst ≤ 0.01 y de
Φst ≤ 0.06), lo que sugiere que existe panmixia (Küpper et al. 2010).
2.6 USO DE MARCADORES MOLECULARES EN CALIDRIS MAURI.
Solo existen tres trabajos realizados con marcadores genéticos (ADNmt y RAPD) en el
Playerito Occidental.
11
En un primer trabajo fue realizado por Haig et al. (1997) con marcadores genéticos de
ADN polimórficos amplificados al azar (RAPDs), otro trabajo fue el de Vilanova (2006)
en el cual se utilizó ADNmt y el más reciente el realizado por Enríquez y Fernández
(2010) con ADNmt en una muestra del Noroeste de México, se observó una
diferenciación genética relativamente pequeña y la ausencia de estructura poblacional.
12
3 JUSTIFICACIÓN
Uno de los principales desafíos para entender la ecología y evolución de las aves
migratorias es el determinar cómo los periodos reproductivos y no reproductivos están
geográficamente relacionados (Webster et al. 2002). La determinación de la
conectividad migratoria es fundamental para entender los factores que delimitan el
tamaño de las poblaciones animales (Webster y Marra 2005) y para desarrollar
modelos que de manera exitosa permitan realizar predicciones sobre las tendencias
demográficas a futuro (Marra et al. 2006).
El Playerito Occidental es una de las especies de aves playeras más abundantes en
Norteamérica y puede ser considerado un bioindicador de la calidad del hábitat. Sin
embargo, se desconoce la conectividad migratoria entre los sitios de reproducción y de
invernación. Sumado a esto se desconoce los niveles de variabilidad y la estructura
genética de Calidris mauri en México. El contar con este tipo de información es
fundamental para la conservación de la especie. Los microsatélites son un excelente
marcador molecular para detectar diferencias en la estructura genética de las
poblaciones debido a que revelan altos niveles de polimorfismo que técnicas previas no
lograban. Hasta donde se sabe, no existen trabajos con microsatélites en estudios de
genética poblacional de Calidris mauri en el mundo.
13
4 HIPÓTESIS
Con base a trabajos previos con marcadores moleculares se han encontrado algunas
evidencias que sugieren cierto nivel de estructura genética para Calidris mauri asociada
a los Corredores Migratorios del Pacífico y Atlántico (Haig et al. 1997, Vilanova 2006,
Enríquez y Fernández 2010). Además se tienen evidencias que la especie presenta una
alta fidelidad a sus zonas de invernación (Smith y Styles 1979, Warnock y Takekawa
1996, Fernández et al. 2003). Por lo anterior, se espera encontrar una clara
diferenciación entre las localidades del Pacífico con respecto a las del Atlántico.
En base a la migración diferencial que tiene el Playerito Occidental por sexo, se espera
encontrar una clara diferenciación entre machos y hembras.
14
5 OBJETIVOS
Analizar la estructura genética de las poblaciones invernantes del Playerito Occidental
Calidris mauri en siete localidades de México con el uso de marcadores nucleares
(microsatélites).
5.1 OBJETIVOS PARTICULARES
1. Optimizar las condiciones de amplificación y evaluar los niveles de polimorfismo de
16 marcadores microsatélites específicos para Calidris melanotos y Philomachus
pugnax en Calidris mauri.
2. Identificar los loci más informativos para el análisis de identidad y estructura
genética.
3. Determinar los niveles de variabilidad genética de las agregaciones invernantes de
Calidris mauri en México.
4. Determinar el nivel de diferenciación genética (estructura genética) de las
agregaciones invernantes de Calidris mauri en México.
15
6 MATERIAL Y MÉTODOS
El presente trabajo forma parte del proyecto “Caracterización Isotópica, genética y
morfológica de Calidris mauri en el Noroeste de México” coordinado por el Dr.
Guillermo Fernández Aceves. Uno de los objetivos principales de dicho proyecto es el
de evaluar distintos marcadores moleculares que permitan dar un seguimiento más
detallado de estas aves a través de su ciclo anual.
6.1 TRABAJO DE CAMPO 6.1.1 CAPTURA DE LOS INDIVIDUOS
Se capturaron especímenes del Playerito Occidental en siete localidades del noroeste y
en una localidad del sureste de México. La captura se realizó con redes de niebla entre
los meses de diciembre y enero durante la temporada invernal 2008‐2009. Los sitios de
captura fueron: Complejo Lagunar Ojo de Liebre (27°40' N, 114°15' O) y Ensenada de La
Paz (25°06' N, 110°24' O) en Baja California Sur; Cienega de Santa Clara en el Delta del
Río Colorado (31°50' N, 114°59' O) entre los estados de Sonora y Baja California; Bahía
de Santa María (25°29'N, 108°18'O), Ensenada Pabellones(24°26' N, 107°33' O) y
Huizache Caimanero (22°50’ N, 105°55’ O) en la costa de Sinaloa y la reserva de la
Biosfera Lagartos (entre los 21°24’ y 21°38’N, 87°30’ y 88°15’O ) en el estado de
Yucatán (Figura 1).
16
En la Península de Baja California, los sitios de concentración de las aves playeras
presentan un clima árido, con lluvias de invierno que no rebasan los 100 mm anuales, y
con amplias planicies intermareales, marismas y salitrales; se estima que más de
250,000 individuos de 30 especies de aves playeras pueden ser observados en estas
localidades durante el invierno (Page et al. 1997). La Ciénaga de Santa Clara se
caracteriza por ser un humedal costero con diferentes tipos de hábitat, que incluyen
planicies intermareales, marismas, salitrales y tulares, con más de 100,000 individuos
de 20 especies de aves playeras (Mellink et al. 1997). En Sinaloa los sitios de muestreo
son humedales costeros compuestos por un mosaico de tipos de hábitat, que incluyen
el cuerpo de agua de la bahía, planicies intermareales, manglares, planicies lodosas,
marismas, salitrales y tulares, con más de 800,000 individuos de 27 especies de aves
playeras (Engilis et al. 1998).
Las aves capturadas fueron medidas, pesadas y se les determino la edad y sexo. La
edad de cada ave fue determinada como adulto o subadulto en base a la coloración del
plumaje, presencia de muda o estado de las plumas primarias (Page et al. 1972, Prater
et al. 1977, O´Hara et al. 2002). El sexo de los individuos fue determinado con base a la
longitud del culmen (Page y Fearis 1971).
17
Figura 1. Sitios de muestreo de Calidris mauri: Complejo Lagunar Ojo de Liebre (GN) y La Paz (LP) en Baja
California Sur; el Delta del Río Colorado (AG) de Baja California/Sonora; la Bahía Santa Maria (SM), Ensenada Pabellones (EP) y Huizache‐Caimanero (HZ) en la costa de Sinaloa y Yucatán (PY).
6.1.2 RECOLECTA DE TEJIDOS
Para los análisis moleculares se recolectaron muestras de sangre de un total de 415
individuos. La sangre se obtuvo por de la vena branquial (100 µL) y se diluyó en 0.5 mL
de anticoagulante "Queen's Lysis Buffer" (0.01 M Tris, 0.01 M NaCl, 0.01 M EDTA, 1% N‐
laurilsarcosina con un pH 7.5). Las muestras de sangre se etiquetaron de acuerdo al
código de identificación del anillo metálico que se colocó en cada animal y se registró
el sexo y grupo de edad (Tabla 1).
18
Tabla 1. Esfuerzo de captura de Calidris mauri en las siete localidades de muestreo en México. En paréntesis se indica el número de muestras seleccionadas para efectuar el genotipado en el presente trabajo.
Localidad Machos Adultos
Hembras Adultas
Machos Jóvenes
Hembras Jóvenes Indeterminado Total
Golfo de Santa Clara (AG) 13 (12) 17 (11) 14 (0) 9 (1) 1 (0) 54 (24)
Guerrero Negro (GN) 23 (12) 14 (10) 21 (0) 10 (2) 0 (0) 68 (24)
La Paz (LP) 15 (7) 13 (7) 29 (5) 6 (5) 4 (0) 67 (24)
Bahía de Santa María (SM) 16 (12) 13 (11) 16 (0) 11 (1) 2 (0) 58 (24)
Ensenada Pabellones (EP) 16 (7) 6 (4) 11 (5) 18 (8) 4 (0) 55 (24)
Huizache‐Caimanero (HZ) 9 (8) 23 (12) 14 (4) 18 (0) 2 (0) 66 (24) Reserva de la Biosfera Las Coloradas Ría Lagartos, Yucatán (PY) 18 (12) 20 (12) 0 (0) 7 (0) 2 (0) 47 (24)
Total 70 67 14 17 0 415 (168)
6.2 TRABAJO DE LABORATORIO
6.2.1 SELECCIÓN DE LOS INDIVIDUOS
Los individuos para el análisis genético se seleccionaron en función de la disponibilidad
de las muestras para cada categoría de edad y sexo (Tabla 1). En el presente estudio se
analizaron un total de 168 individuos: 24 individuos adultos por localidad (12 machos y
12 hembras). En el Apéndice 1 se detallan los códigos de identificación individual, el
sexo y la edad de los individuos analizados.
19
6.2.2 EXTRACCIÓN Y ESTIMACIÓN DE LA CALIDAD Y CANTIDAD DEL ADN
El DNA genómico se obtuvo a partir de 250 µL de la mezcla de sangre‐anticoagulante
siguiendo el protocolo para la extracción y purificación de ADN a partir de tejido
epidérmico (plumas) descrito por Vilanova (2006) y que se detalla en el Apéndice 2.
La calidad y la cantidad de ADN fueron evaluadas mediante geles horizontales de
agarosa al 0.8% y teñidos con bromuro de etidio (0.5 µg/mL). La integridad y la
concentración del material genético se determinaron usando como referencia un
marcador de peso molecular de concentración conocida (100 pb DNA size standard,
Invitrogen™). Cada muestra fue clasificada en función de la intensidad (cantidad) y el
barrido (calidad) de la banda que aparece en el gel al visualizarlo bajo luz ultravioleta
(ver Hoezel 1992). Con base en esta evaluación, se procedió a realizar diluciones para
homogenizar las muestras y prepararlas a una concentración de entre 15 y 25 ng/ µL.
6.2.3 OPTIMIZACIÓN Y CONTROL DE CALIDAD DE LA AMPLIFICACIÓN DE
LOS MICROSATÉLITES
Se seleccionó un conjunto de 16 microsatélites diseñados para especies
taxonómicamente cercanas a Calidris mauri (Apéndice 3). Con base en los niveles de
polimorfismo reportados en la literatura, se seleccionaron 16 loci altamente
polimórficos de Calidris melanotos (Carter y Kempenaers 2007), Philomachus pugnax
(Thuman et al. 2002) y Calidris canutus (Buehler y Baker, datos no publicados 1). Todos
20
estos microsatélites fueron probados en muestras de Calidris mauri con el objeto de
optimizar las condiciones de amplificación y evaluar los niveles de polimorfismo en esta
especie.
Después de probar diferentes temperaturas, concentraciones de cloruro de magnesio y
concentraciones de cebadores, se seleccionaron aquellos microsatélites para los que se
obtuvieron productos de PCR claramente definidos y con una intensidad adecuada
(cantidad de producto) al ser evaluados por electroforesis en geles de agarosa.
Posteriormente los productos de PCR fueron secuenciados para confirmar la presencia
del microsatélite (unidades repetitivas) y la ausencia de artefactos de PCR (productos
accesorios de tamaño diferente al fragmento esperado). De igual forma, se enviaron los
controles negativos de amplificación de cada microsatélite para evaluar la presencia de
dímeros de primers que pudieran ser confundidos con alelos durante el genotipado.
Seis de los 16 microsatélites evaluados no amplificaron o presentaron baja
reproducibilidad en su amplificación, por lo que fueron excluidos del análisis (Apéndice
3). El conjunto de microsatélites seleccionados para el presente estudio y las
condiciones optimizadas para su amplificación se detallan en la Tabla 2.
Todas las amplificaciones se efectuaron a partir de 15‐30 ng/µL de ADN en un volumen
de 15 µL de una mezcla de reacción con una concentración final de 21 mM de Tris (pH
21
8.4), 52 mM de KCl, 1.4 mM de MgCl2, 220 µM de dNTP´s y 1 U de Taq DNA polimerasa
recombinante (InvitrogenTM) y las concentraciones optimizadas de cada cebador.
Los cebadores empleados para la amplificación fueron modificados para seguir el
protocolo de etiquetado universal fluorescente (ver Schuelke 2000, Shimizu et al.
2002). El cebador “forward” de cada locus fue etiquetado en el extremo 5’ con una
secuencia universal (M13), lo que permitió al cebador “reverse” generar en el amplicon
la cadena complementaria a la de un segundo cebador “forward” (5’‐
TGTAAAACGACGGCCAGT‐3’) marcado con un fluorocromo específico (6‐FAM®, VIC®,
PET® o NED®, Applied Biosystems). De esta forma, los amplicones pueden ser marcados
con el fluorocromo seleccionado para su posterior detección en un secuenciador
automático.
La proporción de los cebadores empleada para todas las amplificaciones fue de 1:2:2,
correspondiente al cebador “forward” con etiqueta universal (0.086 µM), cebador
“reverse” (0.172 µM) y cebador “forward” marcado con el fluorocromo (0.172 µM),
respectivamente.
Para la amplificación de los 10 microsatélites se utilizaron cuatro distintos perfiles de
temperatura (MicroCCM, MicroCM7, MicroICM y MicroFCM) que se detallan en el
Apéndice 4.
22
Tabla 2. Condiciones optimizadas para la amplificación de los microsatélites empleados en el presente
estudio. Se indican el perfil de amplificación (ver Apéndice 4) y el fluorocromo seleccionado para cada locus. *, Microsatelites usados en PCR múltiple.
6.2.4 CONTROL DE CALIDAD DEL GENOTIPADO
Para garantizar que las condiciones de amplificación de los microsatélites fueran
homogéneas, se preparó la mezcla de reacción de cada microsatélite para todas las
muestras y se usaron placas de PCR de 96 pozos. En cada placa se incluyeron, además
de las muestras, un control negativo (sin DNA) y un grupo de muestras testigo (réplicas)
que permitieron evaluar la presencia de problemas asociados con la contaminación
cruzada y la reproducibilidad en la amplificación y el genotipado, respectivamente.
El éxito de la amplificación de cada placa se evaluó mediante la electroforesis de la
mitad del volumen de reacción (7μL) en geles de agarosa al 2%. En función de la
intensidad de los productos de PCR marcados con fluorocromo, estos fueron diluidos
Microsatélite PERFIL DE
AMPLIFICACIÓN Fluorocromo T°C1 T°C2
Cme01 MicroCCM VIC 54 53
Cme05* MicroCCM NED 54 53
Cme06* MicroCCM NED 54 53
Cme10 MicroCCM VIC 54 53
Ruff01 MicroCCM FAM 54 53
Cme03 MicroCM7 VIC 51.3 53
Cme07 MicroCM7 PET 51.3 53
Cme08 MicroICM VIC 52 51
Cme02 MicroICM NED 52 51
Cme09 MicroFCM VIC 54 53
23
buscando homogenizar la intensidad de la señal fluorescente durante el análisis
automatizado de fragmentos posterior.
Finalmente, los productos de PCR marcados con diferentes fluorocromos fueron
mezclados y enviados a un laboratorio comercial, donde se realizó el análisis de los
fragmentos, separando los productos de PCR con base en su peso molecular mediante
una electroforesis capilar en un secuenciador automático ABI Prism® 3100 (Applied
Biosystems). El tamaño de los alelos se estimó usando como referencia un marcador de
peso molecular que se agregó a cada muestra durante la electroforesis capilar
(GeneScanTM 600® LIZ, Applied Biosystems).
Para el análisis en el secuenciador automático se emplearon dos mezclas de productos
de PCR. Los microsatelites para la muestra se escogieron de acuerdo a su tamaño. Una
primera mezcla incluyó a los microsatélites Cme01, Cm03, Cme05, Cme06, Cme07,
Cme10 y Ruff 01, mientras que Cme02, Cme08 y Cme09 se incorporaron en una
segunda mezcla (Fig. 2).
24
Figura 2. Mezclas de los productos de PCR empleadas para el análisis de fragmentos automatizado de los 10 microsatélites seleccionados. En el eje de las X se observa el alelo correspondiente y en el eje de las Y se encuentra los tamaños de cada pico.
25
6.3 TRABAJO DE GABINETE 6.3.1 GENOTIPADO
El genotipado de las muestras se efectuó a través del programa GeneMarker V1.85
(SoftGenetics LLC), con el que se determinó el tamaño de los alelos a partir de los
archivos digitales de los electroferogramas (ver Fig. 2). El registro del tamaño de los
alelos fue realizado por tres personas de forma independiente, comparando
posteriormente los registros para evaluar la consistencia en la asignación de los alelos.
Como primera fase del control de calidad del genotipado, se evaluó la ausencia de
señal en los controles negativos, así como la consistencia en el tamaño de los alelos
para las muestras testigo y entre los registros de los observadores independientes.
Una segunda fase de control de calidad consistió en el análisis de los genotipos
multilocus a través de los programas MICRO‐CHECKER v2.2.3 (Van Oosterhout et al.
2004), GIMLET v1.3.3 (Valiére 2002), MSTOOLS v3.1.1 (Park 2001) y ARLEQUIN v3.1
(Excoffier et al. 2005); todo ello con el objeto de hacer una estricta selección de los
microsatélites con el mejor desempeño y evitar así introducir un sesgo en los análisis
subsecuentes.
El programa MICRO‐CHECKER permite la identificación de errores en el genotipado
debido a alelos no amplificados (alelos nulos), amplificación diferencial de los alelos
(allelic dropout), tartamudeo de polimerasa (stutter peaks) o errores tipográficos.
26
Por su parte, el programa GIMLET calcula, con base en las frecuencias de los alelos, la
probabilidad de que dos individuos exhiban el mismo genotipo multilocus. La
probabilidad de identidad es reflejo del poder informativo de cada uno de los
microsatélites y permite evaluar la posible presencia de muestras duplicadas.
El programa MSTOOLS (Park, 2001) detecta la presencia de muestras con genotipos
incompletos o alelos raros, así como aquellos genotipos idénticos o casi idénticos que
pudieran estar asociados con problemas en la calidad y la reproducibilidad del
genotipado.
En el programa ARLEQUIN se analizó el desequilibrio en el ligamiento entre los
microsatélites (Pairwise linkage disequilibrium). Esto es, si dos loci se encuentran
ligados, no pueden ser considerados como marcadores con segregación independiente,
por lo que cuando existen evidencias de desequilibrio uno de los microsatélites de cada
par ligado, ese microsatélite debe ser excluido del análisis, evitando con ello la
introducción de sesgo en los estimadores de diversidad genética (ver Guo y Thompson
1992).
27
6.4 ANÁLISIS ESTADÍSTICOS 6.4.1 DIVERSIDAD GENÉTICA
Los análisis de los niveles de diversidad de los microsatélites se realizaron con los
programas ARLEQUIN v3.1 (Excoffier et al. 2005), GenALEx v6.3 (Peakall y Smouse
2006) y MSTOOLS v3.1.1 (Park 2001). Todos estos programas calculan, con base en las
frecuencias alélicas, la heterocigosidad (Ho) observada y la esperada (He) bajo las
condiciones de equilibrio de Hardy–Weinberg para cada locus. Una diferencia
significativa entre Ho y He puede ser reflejo de errores de genotipado asociados a la
presencia de alelos nulos o a cierto nivel de subdivisión poblacional (efecto Whalund).
6.4.2 ESTRUCTURA POBLACIONAL
Se seleccionaron diferentes criterios para agrupar las muestras con la finalidad de
evaluar el nivel de estructura genética poblacional. El primer criterio empleado fue la
escala geográfica, agrupando las muestras por localidad o agregación invernal. Como
segundo criterio se considero el sexo de los individuos, para evaluar el efecto de la
migración diferencial de los machos y las hembras en la distribución de la variabilidad
genética en las zonas de invernación.
Para ambos criterios los niveles de estructura poblacional fueron evaluados con los
estimadores genéticos FST (número de alelos distintos) y RST (distancia genética entre
28
los alelos con base en el tamaño alélico) mediante un análisis de varianza molecular
(AMOVA) a través del programa ARLEQUIN ver.3.1.
Debido a la polémica planteada por Jost (2008) sobre los índices de diversidad genética
comúnmente empleados para los microsatélites (GST y sus relativos), se usó el
programa SMOGD (Crawford 2010) para obtener el estimador de diferenciación real
Dest y el programa SPADE (Chao y Shen 2010) para calcular el intervalo de confianza de
dicho estimador.
Como una aproximación alternativa, se incorporó el análisis de estructura poblacional
Bayesiano usando el programa STRUCTURE (Pritchard et al. 2010) para analizar de
forma global el nivel de diferenciación genética entre las agregaciones invernantes del
Playerito Occidental en México. Este programa estima la probabilidad de asignación de
individuos a cierta población e identifica con base en las frecuencias de los alelos el
número más probable de poblaciones incluidas en la muestra.
Finalmente, con ayuda del programa MEGA (Tamura et al. 2007), se construyeron los
árboles filogenéticos a partir de las matrices de diferencias pareadas de los índices FST y
RST para establecer así los niveles de similitud o conectividad entre las agregaciones
invernantes.
29
7 RESULTADOS
Con el conjunto de 10 microsatélites optimizados para Playerito Occidental, se
analizaron los electroferogramas y se obtuvieron los genotipos multilocus. Con dichos
genotipos se procedió a contrastar las lecturas de los electroferogramas de cada
observador para evaluar las tasas de error durante el genotipado.
7.1 TASA DE ERROR EN EL GENOTIPADO
Los controles negativos no exhibieron productos de amplificación y los tamaños de los
alelos fueron asignados congruentemente para las réplicas dentro y entre las lecturas
independientes de los observadores. Con base en lo anterior, la tasa de error asociada
al genotipado fue de cero, lo que indicó reproducibilidad y una alta confiabilidad del
genotipado para los 10 microsatélites utilizados en el presente estudio. Los genotipos
multilocus fueron empleados para calcular las frecuencias de los alelos de cada
microsatélite (Apéndice 5) y realizar la fase final del control de calidad de los datos
como se detalla a continuación.
7.2 DESEQUILIBRIO EN EL LIGAMIENTO
Al realizar los análisis del desequilibrio en el ligamiento con el programa ARLEQUIN, en
ninguna de las comparaciones pareadas entre los 10 loci microsatélites optimizados se
observaron valores significativos (p‹ 0.05). Por lo tanto, no se encontró evidencia de
30
segregación no independiente de algún par de microsatélites, se incluyeron todos los
loci en las siguientes evaluaciones.
7.3 EQUILIBRIO DE HARDY‐WEINBERG
Los resultados de los programas MSTOOLS, MICRO‐CHECKER, GenALEX y ARLEQUIN
para los 10 microsatélites optimizados indicaron consistentemente que, con excepción
del microsatélite Cme 08, todos los loci se encontraban en equilibrio de Hardy‐
Weinberg (Tabla 3).
Pese a que la tasa de error en la asignación de los alelos del genotipo multilocus fue
cero, el análisis en el programa MICRO‐CHECKER indicó para el microsatélite Cme 08 un
exceso de homocigotos que pudiera estar asociado con la presencia de alelos nulos.
Por lo anterior se consideró tomar con reserva este loci, evaluando simultáneamente
su inclusión y su exclusión en los análisis subsecuentes.
31
Tabla 3. Niveles de diversidad genética en términos de número de alelos, el rango alélico, el poder informativo (I) y la heterocigosidad observada (Ho). Los valores en negrillas indican diferencias significativas a las condiciones de equilibrio de Hardy‐Weinberg.
Locus No. Alelos
Rango alelos
I MSTOOLS Ho
GENALEX Ho
ARLEQUIN Ho
CME 01 16 32 2.30 0.89 0.90 0.89 CME 02 14 23 1.67 0.80 0.80 0.80 CME 03 13 26 1.63 0.75 0.89 0.75 CME 05 6 10 0.80 0.43 0.43 0.38 CME 06 17 34 2.30 0.88 0.88 0.88 CME 07 10 20 1.42 0.69 0.69 0.69 CME 08 16 28 1.47 0.34 0.34 0.34 CME 09 9 16 1.65 0.77 0.77 0.77 CME 10 14 18 2.01 0.83 0.83 0.83 RUFF 01 25 43 2.05 0.80 0.80 0.80 Global 14 25 1.73 0.72 0.73 0.71
El número de alelos por locus varió entre 6 y 25, mientras que los valores de
heterocigosidad fluctuaron entre 0.34 y 0.89.
A pesar de que el microsatélite con mayor número de alelos fue Ruff01, la frecuencia
de muchos de sus alelos resultó ser muy baja (ver Apéndice 5), por lo que los
microsatélites más informativos resultaron ser Cme01 y Cme06. Por otra parte, se
excluyó al microsatélite Cme08 que presentó claras evidencias de desequilibrio de
Hardy‐Weinberg. El locus menos informativo resultó ser Cme05, el cual presentó el
menor número de alelos y la menor heterocigosidad (ver Tabla 3).
32
7.4 PROBABILIDAD DE IDENTIDAD
Con el programa MsTools se encontró que cuatro muestras empleadas en el análisis
compartían una similitud del 100% en sus 20 alelos. Las muestras idénticas fueron de
dos machos, uno del Alto Golfo (2461/00132) y otro de Guerrero Negro (1971/10440).
Las otras muestras fueron de dos hembras, una de Santa María (1401/64197) y otra de
Guerrero Negro (1971/10436). Con base en los resultados del programa GIMLET, se
obtuvo la probabilidad de que dos individuos exhibieran genotipos idénticos aunque no
tuvieran relación de parentesco sería de 1 en 10,000 millones, mientras que la
probabilidad de que dos hermanos completos tuvieran el mismo genotipo sería de 1 en
6,150 (ver Tabla 4).
Aun que la probabilidad de identidad resultó ser tan baja, se decidió remplazar las
muestras idénticas (ver abajo) para evitar introducir un sesgo al incluir en el análisis
muestras individuos que aparentemente podrían haber sido muestreados en dos
localidades. Aunque los individuos fueron anillados y es poco probable que esto haya
ocurrido, cabe la posibilidad de que se hubiera cometido algún error al etiquetar las
muestras en el campo o en el laboratorio. Para asegurar que este potencial error no se
introdujera al momento de estimar los niveles de diversidad, una de las muestras de
cada par idéntico fue reemplazada (macho de Guerrero Negro No. 1971/10440 fue
remplazado por No. 1971/10461 y la hembra de Santa María 1401/64197 se remplazó
por 1401/64176). Ambos eran individuos nuevos seleccionados del banco de muestras
33
original. Las muestras que no pudieron ser reemplazadas por las de otros individuos
fueron excluidas del resto de los análisis (ver Apéndice 1).
Tabla 4. Probabilidad de identidad obtenida con la adición de los diferentes locus empleados. Se indica el número de individuos (N), el número de alelos (Na), la probabilidad de identidad (PI), la probabilidad de identidad entre individuos no emparentados por locus (PIU locus) y las probabilidades acumulativas multilocus entre individuos no emparentados (PIU acum) y entre hermanos completos (PIS acum).
7.5 DIVERSIDAD GENÉTICA
Como se mencionó con anterioridad, el microsatélite Cme08 presentó algunos
problemas durante la evaluación de la calidad del genotipado. Debido a que en un
análisis preliminar no se observó ningún cambio significativo en los resultados al excluir
dicho locus, se decidió eliminarlo definitivamente como última etapa de control de
calidad de los datos. Por lo anterior, las evaluaciones de diversidad y estructura
genética del Playerito Occidental en las diferentes agregaciones invernales de México
se realizaron solo con nueve loci microsatélites.
PIU PIU PIS
Locus N Na Rango Alélico
Genalex PI locus acum acum
Cme01 166 16 095‐127 2.30 1.78E‐02 1.78E‐02 3.07E‐01
Cme02 166 14 155‐178 1.67 8.50E‐02 1.52E‐03 1.22E‐01
Cme03 166 13 159‐185 1.63 7.87E‐02 1.19E‐04 4.67E‐02
Cme05 166 6 203‐213 0.80 3.49E‐01 4.17E‐05 2.90E‐02
Cme06 166 17 140‐174 2.30 1.66E‐02 6.93E‐07 8.82E‐03
Cme07 166 10 089‐109 1.42 1.30E‐01 9.04E‐08 3.80E‐03
Cme08 166 16 199‐227 1.47 1.11E‐01 1.00E‐08 1.57E‐03
Cme09 166 9 144‐160 1.65 7.20E‐02 7.22E‐10 5.84E‐04
Cme10 166 14 199‐217 2.01 3.99E‐02 2.88E‐11 1.99E‐04
Ruff01 166 25 180‐223 2.05 3.85E‐02 1.11E‐12 6.75E‐05
34
7.5.1 ANÁLISIS GLOBAL Y POR LOCALIDAD
El número promedio de alelos por locus considerando todas las poblaciones fue de 14
alelos, mientras que el promedio del número efectivo de alelos fue de 5.22. Por otra
parte, la heterocigosidad observada promedio fue de 0.71 (Tabla 4).
Todos los microsatélites resultaron polimórficos en todas las localidades (Tabla 5,
Apéndice5) y los valores de diversidad genética fueron similares y moderadamente
altos en todas ellas.
Aunque los niveles de heterocigocidad observada fueron de entre 0.76 y 0.80, La Paz, el
Alto Golfo y la Península de Yucatán presentaron en promedio mayor de número de
alelos (9.2). La Paz presentó el promedio más alto de alelos efectivos (5.6), mientras
que la Bahía de Santa María y Ensenada Pabellones fueron las que presentaron menor
número de alelos efectivos (4.9). Considerando que las diferencias entre localidades
son mínimas, las localidades con menor diversidad genética fueron Bahía de Santa
María (Na= 8.56, Ne= 4.91) y Ensenada Pabellones (Na= 9.00, Ne= 4.91), mientras que
la localidad con mayor diversidad genética fue La Paz (Na= 9.22, Ne= 5.65).
35
Tabla 5. Diversidad genética de las siete localidades muestreadas en México. Se indica el número de alelos (Na), el número efectivo de alelos (Ne), la heterocigosidad observada (Ho) y el índice de información (I). Entre paréntesis se indica el número de individuos analizados por localidad.
Localidad Datos Cme 01
Cme 02
Cme 03
Cme 05
Cme 06
Cme 07
Cme 09
Cme 10
Ruff 01 Global
GN Na 11.00 9.00 5.00 5.00 14.00 8.00 7.00 11.00 12.00 9.11
(23) Ne 9.53 3.32 3.74 2.10 8.53 3.74 4.34 4.64 6.65 5.19
Ho 0.96 0.78 0.96 0.39 0.87 0.65 0.74 0.78 0.74 0.76
I 2.31 1.52 1.44 1.01 2.34 1.55 1.61 1.93 2.14 1.76
LP Na 12.00 10.00 9.00 4.00 13.00 7.00 5.00 11.00 12.00 9.22
(24) Ne 9.29 3.20 3.91 1.70 9.93 3.68 4.61 7.11 7.43 5.65
Ho 0.92 0.71 0.88 0.42 0.79 0.67 0.83 0.83 0.83 0.76
I 2.33 1.61 1.64 0.79 2.41 1.54 1.56 2.13 2.19 1.80
SM Na 14.00 9.00 7.00 3.00 10.00 7.00 7.00 11.00 9.00 8.56
(24) Ne 9.14 3.50 4.45 1.88 7.53 3.78 4.50 5.68 3.74 4.91
Ho 0.96 0.79 0.83 0.50 0.88 0.75 0.75 0.88 0.67 0.78
I 2.41 1.62 1.65 0.80 2.12 1.54 1.65 2.00 1.62 1.72
HZ Na 13.00 10.00 10.00 3.00 11.00 6.00 7. 00 9.00 13.00 9.11
(24) Ne 7.68 4.78 5.12 1.59 7.34 2.85 4.47 5.00 6.33 5.06
Ho 0.86 0.79 0.92 0.42 0.79 0.75 0.79 0.75 0.92 0.78
I 2.25 1.85 1.90 0.65 2.15 1.28 1.62 1.82 2.15 1.74
EP Na 12.00 12.00 7.00 4.00 11.00 8.00 6.00 10.00 11.00 9.00
(24) Ne 7.89 4.63 3.52 1.48 8.66 3.32 4.61 5.12 4.97 4.91
Ho 0.92 0.92 0.88 0.38 0.96 0.71 0.67 0.83 0.63 0.76
I 2.25 1.90 1.54 0.64 2.24 1.45 1.62 1.92 1.86 1.71
AG Na 13.00 7.00 7.00 5.00 13.00 7.00 7.00 11.00 13.00 9.20
(23) Ne 8.01 3.28 4.10 2.20 8.80 3.10 4.90 6.30 7.30 5.30
Ho 0.91 0.78 0.80 0.60 1.00 0.50 0.80 0.80 0.90 0.80
I 2.29 1.48 1.60 1.10 2.30 1.40 1.70 2.10 2.20 1.80
PY Na 12.00 10.00 7.00 4.00 14.00 6.00 8.00 10.00 12.00 9.20
(24) Ne 7.58 4.41 4.50 1.60 9.70 2.80 5.00 6.40 6.40 5.40
Ho 0.79 0.79 1.00 0.30 0.90 0.80 0.80 0.90 0.90 0.80
I 2.21 2.21 1.60 0.70 2.40 1.20 1.80 2.00 2.10 1.80
36
Al analizar la diversidad genética por separado para los machos y hembras, los valores
fueron similares a los del análisis de la población global (Tablas 6 y 7). Sin embargo, el
número promedio de alelos por locus y la heterocigosidad promedio resultaron
ligeramente menores en los machos.
Tabla 6. Diversidad genética y significancia de la prueba de equilibrio de Hardy‐Weinberg (p) en machos.
Tabla 7. Diversidad genética y significancia de la prueba de equilibrio de Hardy‐Weinberg (p) en hembras.
Localidad No. de alelos Ho p
GN 7.78 0.70 0.34
LP 7.22 0.72 0.38
SM 7.44 0.81 0.65
HZ 7.00 0.80 0.45
EP 7.22 0.71 0.56
AG 7.33 0.72 0.33
PY 6.78 0.76 0.49
Total 7.25 0.75 0.46
Localidad No. de alelos Ho p GN 6.78 0.78 0.69
LP 8.22 0.79 0.50 SM 6.79 0.75 0.58 HZ 7.00 0.71 0.55 EP 7.67 0.78 0.66 AG 7.78 0.79 0.56 PY 7.56 0.78 0.71
Total 7.40 0.77 0.61
37
7.6 ESTRUCTURA POBLACIONAL 7.6.1 ANALISIS POR LOCALIDAD
Los niveles de diversidad genética observados se distribuyeron de forma homogénea
entre las localidades (Fig. 3), por lo que el análisis de estructura poblacional (AMOVA)
resultó no significativo, tanto para el índice de diferenciación basado en las frecuencias
alélicas (FST = ‐ 0.0008; p= 1.000), como para el índice de diferenciación basado en la
distancia molecular (RST=0.00438; p= 0.919). De igual forma, el estimador de
diferenciación real (Dest=‐0.0018), sugirió la ausencia de diferencias genéticas
significativas entre los grupos invernantes de Calidris mauri en México (Tabla 8). La
significancia del estimador de diferenciación real se obtuvo mediante 1000 réplicas por
bootstrap del estimador genético insesgado de diferenciación alélica (E= ‐0.017, I.C.95%
= 0.000, 0.005), que indicó diferencias no significativas con respecto a cero.
Tabla 8. Diversidad genética generada con el programa SMOGD. Ñ = media armónica de los tamaños de población, HS_est= estimador casi insesgado de heterocigosis dentro de la subpoblación (Nei 1983), HTest = estimador casi insesgado del total de heterocigosis (Nei 1983), GST_est estimador casi insesgado de heterocigosidad entre la subpoblación (Nei 1983), G'ST_est = medida estandarizada de la diferenciación genética (Hedrick 2005), Dest = estimador de la diferenciación real.
Locus ID Ñ HS_est HT_est GST_est G'ST_est Dest Cme01 23.71 0.8996 0.8985 ‐0.0012 ‐0.0140 ‐0.0128 Cme02 23.71 0.7489 0.7493 0.0005 0.0024 0.0019 Cme03 23.71 0.7782 0.7794 0.0016 0.0079 0.0063 Cme05 23.71 0.4323 0.4341 0.0041 0.0077 0.0037 Cme06 23.71 0.9029 0.9036 0.0008 0.0095 0.0088 Cme07 23.71 0.7083 0.7082 ‐0.0001 ‐0.0005 ‐0.0004 Cme09 23.71 0.8017 0.7965 ‐0.0066 ‐0.0375 ‐0.0307 Cme10 23.71 0.8433 0.8432 ‐0.0002 ‐0.0013 ‐0.0011 Ruff01 23.71 0.8453 0.8464 0.0013 0.0092 0.0080 Ñ of loci ‐0.0018
38
7.6.2 ANÁLISIS POR SEXOS
Análisis similares a los anteriores se realizaron para cada sexo para evaluar por
separado como se encontraban estructurados los machos y las hembras. Sin embargo,
se encontró que ni en machos (FST = ‐ 0.0045; p= 1.000 y RST = ‐ 0.0037; p= 0.9990), ni en
hembras (FST = 0.0067; p= 1.000 y RST = ‐ 0.0009; p= 0.992) se observó algún grado de
estructura. Resultados similares se obtuvieron comparando ambos sexos al no
encontrar diferencias significativas que demuestren una estructuración por sexo. FST:
0.00002 P= 1.00000 Y RST: 0.00609 P=0.17595.
7.6.3 ANALISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES
En la Figura 3 se resume de manera gráfica, a través de un análisis de componentes
principales, la distancia genética de cada individuo con el resto de los individuos. De
dicho análisis resulta evidente que los individuos tienen distancias genéticas similares,
tanto con los otros individuos de su localidad, como con los de las otras localidades;
por tanto, hay ausencia de estructura genética.
39
Figura 3. Análisis de componentes principales con base de las distancias genéticas pareadas (distancia genética de Nei no estandarizada) entre los individuos de todas las localidades. Los códigos de las localidades corresponden a los que se describen en la Tabla 1.
7.6.4 ANALISIS DE ASIGNACION POBLACIONAL BAYESIANO
En concordancia con los resultados anteriores, ningún individuo fue asignado
preferentemente a alguna localidad en particular. Debido a que las frecuencias alélicas
resultaron similares para todas las agregaciones, la distribución de probabilidades de
que un individuo pertenezca a alguna de ellas, presentó una distribución equifrecuente
(Figura 5). Ante la ausencia de una asignación con mayor verosimilutud a determinada
localidad, el análisis indicó que los individuos pertenecen a la misma población (K=1).
40
Figura 4. Distribución homogénea de las frecuencias alélicas entre las agregaciones invernantes del Playerito Occidental con el programa STRUCTURE.
7.7 CONECTIVIDAD MIGRATORIA
A pesar de no haber encontrado estructuración en las agregaciones invernantes del
Playerito Occidental en México, los estimadores de diferenciación genética entre cada
par de agregaciones indicó que las agregaciones más divergentes fueron aquellas de la
Península de Yucatán y de Bahía Santa María, Sinaloa (Fig. 5).
41
A)
B)
Figura 5. Arboles de distancia genética basados en los coeficientes de diferenciación FST (A) y RST (B) entre
localidades.
42
8 DISCUSIÓN 8.1 ASPECTOS METODOLÓGICOS
Debido a que no se han desarrollado marcadores microsatélites específicos para
Calidris mauri, se seleccionaron microsatélites diseñados y evaluados en Calidris
melanotos (Carter y Kempenaers 2007), Calidris canutus (Buehler y Baker, datos no
publicados1 y Philomachus pugnax (Thuman et al. 2002).
Una de las grandes ventajas de los microsatélites es que a pesar de ser altamente
polimórficos, estos se encuentran entre regiones relativamente conservadas del
genoma, y son compartidos por otras especies del mismo género e incluso de la misma
familia (Chambers y MacAvoy 2000). En este sentido, aunque la selección de
marcadores diseñados para Calidris melanotos y Calidris alpina pudiera parecer más
adecuada al ser especies filogenéticamente más cercanas a Calidris mauri que
Philomachus pugnax o Calidris canutus (Thomas et al. 2004), la selección de los
marcadores empleados en este trabajo estuvo orientada a obtener la mayor resolución
posible, por lo que se optó por utilizar loci con evidencias de mayor polimorfismo en
otras especies del género, independientemente de sus relaciones filogenéticas.
43
No obstante, y en congruencia con lo anterior, la mayor parte de los microsatélites
previamente evaluados en Calidris melanotos amplificaron en Calidris mauri, aunque
con un número de alelos menor al reportado en la primera especie (ver Blomqvist y
Pauliny 2007). Por su parte, aquellos reportados para Philomachus pugnax y Calidris
canutus tuvieron menor éxito de amplificación. Estas diferencias se deben a que el
grado de amplificación varía no sólo entre grupos taxonómicos, sino también entre los
distintos loci microsatélites, lo que sugiere que algunos de ellos son más conservados
que otros. En función de que tan conservadas sean las regiones flanqueantes de un
microsatélite, este puede ser amplificado en especies filogenéticamente más lejanas,
mientras que otros serán útiles en un grupo taxonómico más estrecho (Küpper et al.
2008).
A pesar de que solo se logró optimizar la amplificación de 10 de los 16 marcadores
evaluados en Calidris mauri (Ver Anexo 3), todos ellos resultaron polimórficos e
informativos, es decir que el alelo más común de cada loci presentó una frecuencia
menor al 99% en la población (Aranguren‐Méndez et al. 2005). De acuerdo con algunos
autores, 10 o más microsatélites polimórficos son necesarios para realizar estudios
poblacionales o de pedigree (Jarne y Pierre 1996, Wink 2006). Para el presente estudio,
el número de alelos por locus fue suficiente para identificar a nivel individual a los
especímenes analizados (ver Tabla 4), por lo que tal nivel de resolución sugiere no solo
que el número de marcadores empleados fue adecuado, sino que el tamaño de
44
muestra fue suficientemente grande. Tanto el número de muestras como el de
microsatélites resultó similar al que se ha empleado en otros estudios poblacionales del
género Calidris (Carter y Kempenaers 2007, Gunnhild et al. 2007, Antti et al. 2008,
Wennerberg et al. 2008).
El estricto control de calidad que se aplicó durante la amplificación y el genotipado, en
conjunto con el alto nivel de resolución antes mencionado, aportaron evidencia sólida
de que al menos 9 de los 10 marcadores empleados son reproducibles y que la tasa de
error en el genotipado fue nula. Aunque el microsatélite Cme08 presentó evidencias de
sesgo por la posible presencia de alelos nulos, limitando nuestra habilidad para
distinguir entre individuos heterocigóticos con un alelo nulo de los homocigóticos, o
bien de diferenciar alelos nulos que dan lugar a un mismo fenotipo (Bowers et al. 1996,
Crespan et al. 1999, Sánchez‐Escribano et al. 1999, Regner et al. 2000), la exclusión
definitiva de este locus del conjunto de datos no redujo de manera importante el nivel
de resolución obtenido, pero si garantizó que los resultados generados con estos 9
microsatélites fueran confiables.
Finalmente, aunque en estudios de estructura poblacional los análisis del estadístico F
de Fisher han mostrado ser una herramienta útil para estimar los patrones y extraer la
variación genética entre y dentro de las poblaciones (Weir y Basten 1990, Aranguren‐
Méndez et al. 2002), el uso de otros estadísticos ha sido recomendado por el hecho de
45
que este puede llevar a conclusiones erróneas cuando los niveles de diversidad
genética son altos (Jost 2008, Kronholm et al. 2010). Si bien existe una fuerte
controversia con respecto al uso de FST y sus derivados en comparación con el índice
DST (Neigel 2002, Jost 2009, Holsinger y Weir 2009, Ryman y Leimar 2009, Kronholm et
al. 2010), el objetivo del presente estudio no era el de resolver la polémica sobre la
resolución y lo obsoleto de las distintas aproximaciones empleadas para medir la
diferenciación genética entre poblaciones. Por ello, se decidió emplear ambos índices,
además de aproximaciones multidimensionales y bayesianas para evaluar su
congruencia y tener mayor certeza en la interpretación de los resultados.
8.2 IDENTIDAD Y DIVERSIDAD GENÉTICA
Como se mencionó en la sección anterior, la mayor parte de los microsatélites
empleados en el presente estudio fueron aislados del genoma de Calidris melanotos
por Carter y Kempenaers (2007), pero además habían sido probados exitosamente en
Calidris pusilla (Carter y Kempenaers, op. cit). El hecho de que estos microsatélites
amplificaran eficientemente para Calidris mauri, sugiere que estos son altamente
conservados y, en consecuencia, relaciones filogenéticas cercanas entre estas especies.
Tanto el tamaño como el rango alélico de estas tres especies fue muy similar (Tabla 9)
para la mayoría de los loci. A excepción del locus Cme06, el resto de los microsatélites
46
empleados no parecen tener la resolución adecuada para caracterizar la identidad
genética a nivel de especie.
El locus Cme06 exhibió un rango alélico similar entre especies pero el tamaño de sus
alelos fue al menos 25 pares de bases menor en Calidris mauri, lo que sugiere que
Calidris melanotos y Calidris pusilla son filogenéticamente más cercanas. Lo anterior
concuerda con el análisis filogenético de Thomas et al. (2004) en el que se combinó la
información de las secuencias del gen nuclear RAG‐I, el gen mitocondrial Citocromo‐b y
el intron II de la mioglobina; análisis que indica una relación más estrecha entre Calidris
melanotos y Calidris. pusilla, y una posición más basal en el árbol para Calidris mauri.
47
Tabla 9. Comparación del tamaño y rango alélico de los microsatélites empleados. En gris se indica el microsatélite con mayor número de alelos.
*Nota: El tamaño de los alelos fue ajustado restando los 18 pares de bases correspondientes a la etiqueta universal empleada para la detección fluorescente.
Calidris mauri
(N= 168) Calidris melanotos
(N= 149) Calidris pusilla
(N= 178)
Locus Rango Alélico Rango Alélico* Alelos Rango Alélico Alelos Rango Alélico Alelos
Cme01 095‐127 077‐109 16 076‐102 14 076‐100 11 Cme02 155‐178 137‐160 14 135‐171 17 142‐166 11 Cme03 159‐185 141‐167 13 144‐182 14 139‐162 12 Cme05 203‐213 185‐195 6 192‐210 10 188‐200 6 Cme06 140‐174 122‐156 17 183‐225 23 186‐214 15 Cme07 089‐109 071‐091 10 070‐098 14 067‐085 7 Cme08 199‐227 181‐209 16 182‐208 13 176‐208 12 Cme09 144‐160 126‐142 9 113‐155 19 124‐150 12 Cme10 199‐217 181‐199 14 180‐218 19 182‐196 8 Total 115 143 94
48
La diversidad genética es la variación en la composición de la información genética o
unidades hereditarias (genes) contenida en todas las especies vivientes, encontradas
en un área específica y que pueden reproducirse entre sí a través del tiempo (CONABIO
1998). Esta es clave para la supervivencia de los individuos y la salud genética de sus
poblaciones; una alta diversidad genética le confiere a una especie una mayor
probabilidad para sobrevivir ante cambios en el ambiente, mientras que aquellas con
baja diversidad genética tienen una menor capacidad de respuesta debido a la
endogamia.
Los niveles de diversidad genética son también reflejo de la historia evolutiva y
demográfica de las poblaciones; una alta diversidad comúnmente se encuentra
asociada a poblaciones grandes con una larga historia evolutiva o con una marcada
estructura poblacional, mientras que una baja diversidad es consecuencia de una
reducción en el tamaño poblacional o un colapso en su distribución geográfica. Al
respecto, Bazin et al. (2006) argumentan que la diversidad nuclear, a diferencia de la
diversidad mitocondrial, es la única que refleja el tamaño de una población.
Si bien no es posible hacer una comparación directa de los resultados de diversidad
genética nuclear cuando no se ha usado el mismo conjunto de microsatélites en cada
una de las especies, el nivel de diversidad genética nuclear de Calidris mauri estimada
con base en los nueve microsatélites empleados en este trabajo, resultó
49
moderadamente alto al contrastarlo con los de otras especies del género Calidris.
Como puede apreciarse en la Tabla 9, existe una relación directa entre el número de
loci, el número de alelos y los valores de heterocigosidad observada, lo que dificulta las
comparaciones a nivel demográfico. Por ejemplo, los altos niveles de diversidad
reportados en Calidris melanotos aparentemente son más un reflejo del uso de un
mayor número de loci y del hecho de que los cebadores fueron específicamente
diseñados para la especie (Carter y Kempenaers 2007), pero no de los niveles de
abundancia poblacional, ya que el tamaño poblacional de esta última especie es mucho
menor al de las poblaciones de Calidris alpina y Calidris mauri.
Tabla 10. Diversidad genética de especies de Calidris. Se indica el tamaño de la muestra (N), el número de loci empleados (No. Loci), el número de alelos (No. Alelos), la heterocigosidad observada (Ho), el número de haplotipos y la diversidad nucleotídica (πn).
Raönkä et al. 2008; b Wenink y Baker 1996; c Este trabajo y Vilanova 2007; d Carter y Kempenaers 2007
Dejando a un lado a Calidris melanotos, la menor heterocigosidad corresponde a
Calidris temmickii y la mayor a Calidris mauri, mientras que Calidris aplina presenta
valores intermedios. Estos valores sugerirían entonces que Calidris mauri sería la más
abundante de estas especies, lo que contrasta con los censos más recientes donde se
Abundanciamundial N
No. Loci
No. Alelos Ho N
No. Haplotipos πn
Calidris temminckiia 80,000 125 6 5 0.46 121 7 0.002Calidris aplinab 4,500,000 287 7 11 0.6 208 53 0.016Calidris mauric 3,500,000 168 9 14 0.71 343 68 0.003Calidris melanotosd 500,000 149 11 15 0.88
50
observa que Calidris mauri es la especie con mayor número de individuos (Morrison et
al. 2006).
Para el caso de estas tres especies, existe además información sobre su diversidad
genética a nivel de la región control mitocondrial, lo que permite una comparación
directa entre especies al tratarse de una secuencia homóloga y al cuantificar la
diversidad a través de un índice relativo al tamaño de la secuencia. De esta
comparación puede apreciarse como los niveles de diversidad nuclear
(heterocigosidad) están correlacionados no sólo con el número de loci y el número
promedio de alelos por locus, sino también al número de haplotipos mitocondriales
presentes en cada especie (Tabla 10). También es evidente una cierta relación entre la
diversidad nucleotídica mitocondrial y los niveles de abundancia.
No obstante es importante resaltar que, particularmente para el caso de Calidris alpina,
no se evidencia una clara relación entre la diversidad nucleotídica mitocondrial, la
heterocigosidad y los niveles de abundancia poblacional; esta especie tiene la mayor
diversidad nucleotídica mitocondrial y la mayor abundancia, pero es la que presenta la
menor heterocigosidad. En otras palabras, mientras los microsatélites apuntan a
Calidris mauri como la población más abundante del género Calidris, la diversidad
mitocondrial indica que la más abundante es Calidris alpina.
51
Calidris alpina tiene una historia evolutiva más antigua, en la que la población quedó
subdividida en varias subpoblaciones con un restringido flujo génico desde hace cerca
de 200,000 años (Wenink y Baker 1996, Bueheler y Baker 2005). En contraste, Calidris
mauri es una especie monotípica con una historia de reciente expansión demográfica,
que aparentemente ocurrió hace unos 18,000 años durante la última glaciación
(Vilanova 2006). El hecho de que la población mundial de Calidris alpina este
conformada por al menos 3 y hasta 5 subpoblaciones o subespecies, explica claramente
el por qué su heterocigosidad es menor y su diversidad mitocondrial es mayor que en
Calidris mauri. En consecuencia, con base en los niveles de heterocigosidad, se apoya la
idea de que Calidris mauri representa la población más abundante dentro de los
Calidridos al ser la especie con el mayor número de haplotipos mitocondriales
(Enríquez y Fernández, 2010).
8.3 ESTRUCTURA GENÉTICA Y CONECTIVIDAD MIGRATORIA
Aunque todas las localidades muestreadas representan sitios de invernación para
Calidris mauri y otras especies de aves playeras, su importancia relativa varía
considerablemente en función de las características del hábitat costero y su superficie.
La Ciénega de Santa Clara, en la región del Alto Golfo de California, concentra cerca de
100,000 aves playeras durante el invierno (Mellink et al. 1997). El complejo lagunar
Guerrero Negro ‐ Ojo de Liebre es uno de los humedales costeros más importantes de
52
la Península de Baja California y alberga también cerca de 250,000 individuos de varias
especies (Page et al. 1997, Danemann et al. 2002, Carmona et al. 2011). En la Ensenada
de La Paz, al extremo sur de la Península de Baja California, pueden encontrarse
aproximadamente 20,000 aves playeras a lo largo del año; de las que entre un 20‐50 %
corresponden a Calidris mauri (Carmona 2007).
A lo largo de la costa de Sinaloa, Bahía Santa María, Ensenada Pabellones y Huizache
Caimanero, albergan respectivamente 500,000, 300,000 y 200,000 aves playeras
durante el invierno (Nebel et al. 2002, Carrera y De la Fuente 2003). Bahía Santa María
es reconocido como el sitio de invernación de mayor importancia para Calidris mauri en
México, en donde se concentran cerca 350,000 individuos de esta especie (10% de la
población mundial ver Engilis et al. 1998).
Finalmente, la Península de Yucatán representa el segundo sitio de importancia para
las aves playeras del Golfo de México y en sus costas pueden encontrarse cerca de
81,000 individuos de varias especies (Morrison et al. 2003, Correa y Contreras 2008).
Del análisis de diversidad genética por localidad se evidenció que todas las
agregaciones invernantes exhibieron una alta variabilidad genética y un polimorfismo
del 100%. Aunque los valores fueron muy similares entre localidades (Tabla 5), las
agregaciones invernantes con mayor diversidad genética fueron la Península de
53
Yucatán y la región del Alto Golfo de California, mientras que Bahía de Santa María fue
la agregación invernal con menor diversidad genética. En otras palabras, la diversidad
genética fue ligeramente más alta en los sitios de invernación de menor importancia y
un poco menor en la localidad con las mayores densidades invernales para la especie.
Estas pequeñas diferencias podrían ser explicadas por las altas tasas de retorno que se
han reportado para los sitios de invernación (Holmes 1972, Fernández et al. 2001,
Carmona 2007). Considerando que Bahía Santa María es el sitio de mayor importancia,
quizá la competencia entre los individuos por los recursos disponibles podría estar
promoviendo que cierto grupo con alta fidelidad ocupe la zona (preferencias de hábitat
invernal) y que el resto de los individuos busquen sitios alternos donde haya recursos
disponibles (Warnock y Takekawa 1996, Fernández y Lank 2006). Si un grupo de
individuos exhibe tal fidelidad por un sitio, exhibiría una diversidad genética menor con
respecto a otros sitios con menores tasas de retorno.
Por otro lado, no se puede descartar la posibilidad de que las diferencias en los niveles
de diversidad sean producto de un tamaño de muestra poco representativo. Aunque
para este trabajo se utilizó el mismo número de individuos por localidad, el número de
individuos que invernan en cada localidad es considerablemente distinto, lo que podría
introducir cierto sesgo en los estimadores de diversidad (distintas probabilidades de
muestrear a todas las variantes en cada localidad).
54
De acuerdo con Holmes (1972) la especie muestra una fuerte fidelidad a los sitios de
reproducción y filopatría natal, lo que podría reflejarse en cierto nivel de diferenciación
poblacional. Aunque, estudios previos realizados con RAPDs (Haig et al. 1997) y con
secuencias de DNA mitocondrial (Vilanova 2006, Enríquez y Fernández 2010) han
evidenciado cierto nivel de diferenciación entre y dentro de las agregaciones
invernales, particularmente entre aquellas de la costa del Pacífico y la costa del
Atlántico. Si bien el análisis de los microsatélites analizados en el presente trabajo
indicaron una mayor divergencia entre Bahía Santa María; la mayor concentración
invernal de la especie en el Pacífico Mexicano, y la Península de Yucatán; que
representa unos de sus principales sitos de invernación en la costa del Golfo de México
(ver Figura 5), dicha divergencia resultó no significativa.
A pesar de que los microsatélites son considerados una de las herramientas más
poderosas en estudios de genética poblacional (Selkoe y Toonen et al. 2006),
superando en resolución tanto a los RAPDs como a las secuencias mitocondriales
(Arangure et al. 2005), tanto los análisis de varianza molecular, el análisis
multidimensional y la aproximación bayesiana coincidieron al indicar la ausencia de
estructura poblacional a nivel espacial (Tablas 5 y 8 y Figuras 3 y 4).
55
En comparación a otras especies de Calidris que sus análisis de varianza molecular (Fst,
Rst, etc.) son significativos por lo tanto pertenecen a poblaciones estructuradas como
Calidris canutus (Niles et al. 2008) y Calidris alpina (Haig et al. 1997, Gunnhild et al.
2007). Lo cual demuestra que en la población del Playerito Occidental existe un flujo
genético importante y, por lo tanto, no presenta tendencia a la endogamia.
Algunas de las interrogantes que surgen al comprar los resultados obtenidos con
diferentes marcadores moleculares son: ¿Cuál de los marcadores refleja más
confiablemente los niveles de diferenciación genética?, ¿Porqué a pesar de que los
microsatélites tienen un mayor polimorfismo y poder resolutivo, no concuerdan con los
otros marcadores?
Los RAPDs son marcadores dominantes que no permiten distinguir homocigotos de
heterocigotos, lo que reduce significativamente su poder de resolución. Presentan
además problemas asociados con la identificación de fragmentos homólogos,
homoplasia, baja reproducibilidad y dificultades en la interpretación de los resultados.
Es por ello que se consideran poco confiables (Levin et al. 1994). Por otra parte, los
resultados obtenidos por Haig y colaboradores (1997) parecen incongruentes al indicar
que la agregación reproductiva de Nome, Alaska, contiene alelos que no se presentan
en ninguna de los sitios de invernación que analizaron. Esto sugeriría de primera mano
que los individuos de Calidris mauri que se reproducen en Nome, Alaska, no utilizan los
56
corredores migratorios del Pacífico o del Atlántico. Considerando que la especie tiene
un limitado rango de distribución durante la temporada reproductiva, los resultados de
estos autores además de resultar inesperados contrastan con los resultados de
diversos estudios de marcaje‐recaptura (anillamiento) y telemetría (Fernández et al.
2001).
El DNA mitocondrial se hereda exclusivamente vía materna (Klinbunga et al. 2001) y
aunque tiene una buena resolución, la interpretación de los resultados se limita a la
información de uno de los progenitores, lo que puede conducir a confusiones
interpretativas en especies con patrones de segregación o dispersión diferencial de los
sexos. Calidris mauri presenta una clara segregación diferencial por sexos y edades
durante el periodo invernal, en el que las hembras migran más al sur que los machos
(Nebel et al. 2002). Aunque este patrón podría explicar las diferencias entre los
resultados obtenidos con DNA mitocondrial y microsatélites en la especie, en el
presente trabajo no se encontró evidencia de diferenciación poblacional asociada al
sexo de los individuos.
Por otra parte, el DNA mitocondrial tiene un tamaño efectivo menor que el DNA
nuclear; por cada copia del DNA mitocondrial de un individuo existen dos copias de un
gen nuclear (la paterna y la materna). Esto trae como consecuencia que las variantes
mitocondriales se fijen más rápidamente por efecto de la deriva génica que las
57
variantes nucleares. Por ende el DNA mitocondrial refleja eventos históricos más
antiguos que el DNA nuclear. Es posible entonces que las diferencias observadas entre
estos marcadores en Calidris mauri pudieran estar asociadas a que durante su historia
evolutiva, existieran distintas rutas migratorias desde las zonas de reproducción y que
la expansión demográfica que aparentemente sufrió la especie luego de la última
glaciación (Vilanova 2006, Enríquez et al. 2007) propiciara un mayor flujo de genes. Sin
embargo, para probar esta hipótesis será necesario el análisis de los niveles de
diversidad genética nuclear y mitocondrial de las zonas de reproducción.
Es importante considerar además que, pese a que el conjunto de microsatélites
empleado tuvo una elevada resolución para distinguir a Calidris mauri a nivel
individual, el rango alélico que exhibió la especie resultó ser prácticamente el mismo
que en otras especies del género (Tabla 9). Como se comentó anteriormente, es
probable que al ser locis muy conservados a nivel de especie, su potencial para el
análisis a nivel intraespecífico no sea tan elevado.
Por último, a pesar de que la diversidad genética entre las distintas localidades no
resultó significativa, limitando la posibilidad de establecer con certeza la conectividad
entre las distintas agregaciones de invernación en México, el hecho de que la mayor
divergencia a nivel de microsatélites ocurriera entre Bahía Santa María y la Península
de Yucatán pudiera estar asociada con las rutas migratorias que sigue la especie.
58
Carmona (2007) sugiere, con base en la cronología migratoria y las abundancias
relativas de la especie a lo largo de la Península de Baja California, que durante su
migración al sur Calidris mauri puede seguir dos rutas hacia las agregaciones
invernales: A lo largo de la costa occidental de Península de Baja California, o bien, a lo
largo de la franja costera de Sonora y Sinaloa. Este patrón es similar al encontrado por
Enríquez y Fernández (2010) a nivel del DNA mitocondrial, quienes reportan una
marcada diferencia entre las agregaciones del Pacífico y la de Yúcatan, además de una
mayor similitud entre el Alto Golfo y la costa de Sinaloa por una parte y entre las
agregaciones de la Península de Baja California por la otra.
El análisis de las agregaciones invernales en las costas de Sudamérica y de las
agregaciones reproductivas en Alaska y Siberia, así como la adición de otros locis
microsatélites, serán claves para evaluar con mayor detalle si los sutiles niveles de
diferenciación están asociados con el origen reproductivo de las agregaciones
invernales, así como la conectividad migratoria a lo largo de la distribución de la
especie.
59
9 CONCLUSIONES
1. Los microsatelites Cme 01, Cme 02, Cme 03, Cme 05, Cme 06, Cme 07, Cme 09 y
Cme 10 para Calidris melanotos y el microsatelite Ruff 01 de Philomachus pugnax
amplificaron exitosamente en Calidris mauri. Su nivel de resolución permitió identificar
a los especímenes a nivel individual. Sin embargo, el tamaño alélico de este conjunto
de marcadores se traslapa significativamente, por lo que ofrecen poca resolución para
caracterizar la identidad genética a nivel de especie, lo que podría traducirse en una
baja resolución a nivel poblacional.
2. El locus Cme06 fue el microsatélite más informativo además de ser el único que
permite identificar a Calidris mauri de las demás especie
3. La variabilidad genética de las agregaciones invernantes del Playerito Occidental
en México analizada con microsatélites fue relativamente alta, característica que
denota una buena salud genética y bajo riesgo de depresión endogámica.
4. No se encontró evidencia de diferenciación genética entre localidades o entre
sexos, lo cual indica que la población del Playerito Occidental no se encuentra
estructurada y que los individuos de la especie que se distribuyen en territorio
mexicano pertenecen a un mismo grupo reproductivo
60
En conjunto, los resultados confirman el carácter monotípico de la especie y apoyan el
planteamiento de que Calidris mauri tiene la población con mayor abundancia dentro
de los calidridos.
61
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72
APÉNDICE 1
ORGANISMOS SELECCIONADOS PARA ESTE TRABAJO
En la tabla se muestra a los organismos empleado para este estudio en las localidades de Bahía de Santa María (BSM), Ensenada Pabellones (EP) y Guerrero Negro Ojo de Liebre(GNOL). Agrupados por sexos; machos(M) y hembras (H) y por edad; adulto (A) y juvenil (J).
Número Muestra Localidad Sexo Edad Número Muestra Localidad Sexo Edad
1 1401/64162 BSM H A 32 2461/00107 EP H J
2 1401/64061 BSM H A 33 2461/00108 EP H J
3 1401/64062 BSM H A 34 2461/00111 EP H J
4 1401/64068 BSM H A 35 2461/00112 EP H J
5 1401/64081 BSM H A 36 2461/00113 EP H J
6 1401/64072 BSM H J 37 2461/00121 EP M J
7 1401/64182 BSM H A 38 2461/00122 EP M J
8 1401/64197 BSM H A 39 2461/00132 EP M J
9 1401/64199 BSM H A 40 2461/00139 EP M A
10 1401/64202 BSM H A 41 2461/00131 EP M A
11 1401/64216 BSM H A 42 2461/00133 EP M A
12 1401/64218 BSM H A 43 2461/00124 EP M J
13 1401/64074 BSM M A 44 2461/00152 EP M A
14 1401/64075 BSM M A 45 2461/00161 EP M A
15 1401/64077 BSM M A 46 2461/00116 EP M J
16 1401/64079 BSM M A 47 2461/00153 EP M A
17 1401/64080 BSM M A 48 2461/00155 EP M A
18 1401/64091 BSM M A 49 1971/10433 GNOL H A
19 1401/64092 BSM M A 50 1971/10424 GNOL H A
20 1401/64093 BSM M A 51 1971/10426 GNOL H A
21 1401/64097 BSM M A 52 1971/10427 GNOL H A
22 1401/64205 BSM M A 53 1971/10428 GNOL H A
23 1401/64200 BSM M A 54 1971/10431 GNOL H A
24 1401/64204 BSM M A 55 1971/10436 GNOL H J
25 2461/00110 EP H A 56 1971/10435 GNOL H A
26 2461/00115 EP H A 57 1971/10452 GNOL H J
27 2461/00139 EP H A 58 1971/10485 GNOL H A
28 2461/00144 EP H A 59 1971/10488 GNOL H A
29 2461/00101 EP H J 60 1971/10507 GNOL H A
30 2461/00102 EP H J 61 1971/10422 GNOL M A
31 2461/00150 EP H J 62 1971/10425 GNOL M A
73
APÉNDICE 1 (CONTINUACIÓN)
ORGANISMOS SELECCIONADOS PARA ESTE TRABAJO
En la tabla se muestra a los organismos empleado para este estudio en las localidades de Bahía de Santa María (BSM), Ensenada Pabellones (EP) y Guerrero Negro Ojo de Liebre(GNOL). Agrupados por sexos; machos(M) y hembras (H) y por edad; adulto (A) y juvenil (J).
Número Muestra Localidad Sexo Edad Número Muestra Localidad Sexo Edad
63 1971/10432 GNOL M A 94 1401/64131 GSC M A
64 1971/10437 GNOL M A 95 1401/64144 GSC M A
65 1971/10439 GNOL M A 96 1401/64056 GSC M A
66 1971/10440 GNOL M A 97 1401/64146 GSC M A
67 1971/10441 GNOL M A 98 1401/64257 HZC H A
68 1971/10442 GNOL M A 99 1401/64260 HZC H A
69 1971/10446 GNOL M A 100 1401/64261 HZC H A
70 1971/10448 GNOL M A 101 1401/64264 HZC H A
71 1971/10449 GNOL M A 102 1401/64265 HZC H A
72 1971/10459 GNOL M A 103 1401/64267 HZC H A
73 1971/10693 GSC H A 104 1401/64279 HZC H A
74 1971/10695 GSC H A 105 1401/64284 HZC H A
75 1971/10700 GSC H A 106 1401/64285 HZC H A
76 1401/64007 GSC H A 107 1401/64287 HZC H A
77 1401/64119 GSC H A 108 1401/64288 HZC H A
78 1401/64132 GSC H A 109 1401/64290 HZC H A
79 1401/64135 GSC H A 110 1401/64268 HZC M A
80 1401/64136 GSC H A 111 1401/64275 HZC M A
81 1401/10677 GSC H J 112 1401/64276 HZC M A
82 1401/64139 GSC H A 113 1401/64277 HZC M A
83 1401/64141 GSC H A 114 1401/64282 HZC M A
84 1401/64051 GSC H A 117 1401/64283 HZC M A
85 1971/10679 GSC M A 118 1401/64220 HZC M A
86 1971/10682 GSC M A 119 1401/64322 HZC M J
87 1971/10691 GSC M A 120 1401/64326 HZC M A
88 1971/10692 GSC M A 121 1401/64252 HZC M J
89 1971/10694 GSC M A 122 1401/64256 HZC M J
90 1401/64003 GSC M A 123 1401/64258 HZC M J
91 1401/64006 GSC M A 124 2461/00168 LAP H A
92 1401/64129 GSC M A 125 2461/00171 LAP H A
74
APÉNDICE 1 (CONTINUACIÓN)
ORGANISMOS SELECCIONADOS PARA ESTE TRABAJO
En la tabla se muestra a los organismos empleado para este estudio en las localidades de Bahía de Santa María (BSM), Ensenada Pabellones (EP) y Guerrero Negro Ojo de Liebre(GNOL). Agrupados por sexos; machos(M) y hembras (H) y por edad; adulto (A) y juvenil (J).
Número Muestra Localidad Sexo Edad Número Muestra Localidad Sexo Edad
126 2461/00182 LAP H A 156 1701/00996 PYC H A
127 1971/10586 LAP H A 157 1701/00999 PYC H A
128 1971/10595 LAP H A 158 1401/64406 PYC H A
129 1971/10596 LAP H A 159 1701/00985 PYC M A
130 1971/10609 LAP H A 160 1701/00989 PYC M A
131 2461/00187 LAP H J 161 1701/00990 PYC M A
132 2461/00189 LAP H J 162 1701/00991 PYC M A
133 1971/10401 LAP H J 163 1401/64353 PYC M A
134 1971/10599 LAP H J 164 1701/00998 PYC M A
135 1971/10608 LAP H J 165 1701/001000 PYC M A
136 2461/00181 LAP M A 166 1401/64403 PYC M A
137 2461/00188 LAP M A 167 1401/64404 PYC M A
138 2461/00191 LAP M A 168 1401/64417 PYC M A
139 1971/10582 LAP M A 169 1401/64436 PYC M A
140 1971/10594 LAP M A 170 1401/64363 PYC M A
141 2461/00169 LAP M J 171 1971/10652 *PB M J
142 2461/10601 LAP M A 172 1971/10653 *PB M J
143 2461/00174 LAP M J 173 1971/10656 *PB M J
144 2461/10626 LAP M A 174 1971/10658 *PB M J
145 2461/00164 LAP M J 175 1971/10661 *PB M J
146 2461/00165 LAP M J 176 1971/10662 *PB M J
147 2461/00166 LAP M J 177 1971/10663 *PB M J
148 1701/00977 PYC H A 178 1971/10665 *PB M J
149 1701/00978 PYC H A 179 1971/10667 *PB M J
150 1701/00980 PYC H A 180 1971/10668 *PB M J
151 1701/00982 PYC H A 181 1971/10669 *PB M J
152 1701/00983 PYC H A
153 1701/00986 PYC H A
154 1701/00994 PYC H A
155 1701/00995 PYC H A
75
APÉNDICE 2
PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE DNA
El método que se empleó para obtener el DNA genómico de la sangre consistió en la combinación de diversos protocolos descritos por Vilanova (2006):
1. A cada individuo se le extrajo 100 µl de sangre de la vena branquial la cual se vertió en un tubo con 500 µl de anticoagulante (0.01 M Tris, 0.01 M NaCl, 0.01 M EDTA, 1% n‐lauroylsarcosine con pH 7.5).
2. Aproximadamente 250 µl de sangre‐anticoagulante se les agregaron 200 µl de solución de sales (Tris‐Hcl pH 8, NaCl 250 mM, EDTA 25mM pH 8 y SDS al 0.5%).
3. Las muestras fueron incubadas durante 60 minutos a una temperatura de 65 °C o hasta que el tejido se digirió.
4. Después de la digestión se agregaron 150 µl de la solución CTAB (Tris ‐Hcl pH 8 100 mM, EDTA pH 8 mM CTAB pH 8 20 mM, PVPP al 0.1%, SDS al 0.1%, β‐ME al 0.2 %), se agitaron los tubos y se incubaron a 65°C por 25‐35 minutos.
5. La mezcla digerida se centrifugó a 12,000 X g por 5 minutos.
6. En un tubo limpio se recuperaron 500 µl del sobrebadante de la mezcla y se agregaron 550 µl de cloroformo: alcohol isoamílico, se mezcló vigorosamente por algunos segundos y se centrifugó a 12,000 X g por 10 minutos
7. En otro tubo se recuperaron 500 µl del sobrenadante, agregando 500 µl de isopropanol al 99%.
8. El tubo se agitó suavemente por inversión y se incubó a‐70 °C por 10 minutos.
9. Se centrifugó a 12,000 X g por 15 minutos, decantando posteriormente el alcohol y agregando 500 µl de etanol al 70%.
10. Se centrifugó a 12,000 X g por 5 minutos, se eliminó el alcohol y se dejó secar por 5 minutos a temperatura ambiente.
11. Finalmente la muestra se seco a 50°C por 10 minutos en una centrifuga de vacío y el DNA se resuspendió en 30 µl de solución amortiguadora de almacenamiento (TE 0.1X) por 12 horas.
12. Las muestras de DNA se preservaron a ‐20°C para su posterior procesamiento.
76
APÉNDICE 3
OPTIMIZACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA REPRODUCIBILIDAD DE LOS LOCI MICROSATÉLITES EMPLEADOS PARA EL GENOTIPADO DEL PLAYERITO OCCIDENTAL
En la siguiente tabla se detallan las secuencias de los cebadores específicos para los loci microsatélites empleados en este trabajo. Se indica también el tamaño (pares de bases) y el número de alelos reportados para las especies de referencia. Adicionalmente se incluye información referente a los problemas particulares encontrados durante la optimización y proceso de control de calidad. De los 16 microsatélites probados solo 9 fueron optimizados para uso en Calidris mauri y siete descartados de este estudio debido a problemas que presentaron los microsatélites en las etapas de control de calidad. Los controles negativos incluidos en los análisis no amplificaron, lo que dio la certeza que las muestras o los reactivos no presentaron contaminación. Asimismo, el grupo de muestras testigo amplificaron de manera consistente en todos los análisis, lo que indicó que no existieron problemas durante la amplificación.
El control de calidad del genotipado de las muestras se basó en tres pasos diferentes: 1. Lectura de las muestras testigo: Se seleccionaron 11 muestras testigo, las cuales se
amplificaron por duplicado para cada microsatélite. 2. Lectura de los electroferogramas: Para rectificar que la asignación de los alelos
fuera consistente, la lectura de los electroferogramas fue realizada por tres personas de forma independiente y posteriormente contrastadas. Tanto las réplicas de las muestras testigo, como las lecturas de los observadores resultaron consistentes. No se presentaron diferencias o ambigüedades en la lectura y asignación del tamaño de los alelos.
3. Análisis de errores mediante el programa MICRO‐CHECKER: Este programa se
empleó para verificar que no hubiese errores de genotipado como alelos nulos, amplificación diferencial de los alelos, tartamudeo de polimerasa o errores tipográficos. De los 10 microsatélites analizados con el programa se encontró que solo el microsatélite Cme08 presentaba los siguientes problemas: a) Bandas fantasmas (Stuttering) que pudieron haber dado lugar a errores de genotipado como lo indica la escases de genotipos heterocigotos, y b) Presencia de alelos nulos como lo sugiere el exceso general de homocigotos observados (ver Apéndice 6).
77
De los 16 microsatélites probados solo 9 fueron optimisados para uso en Calidris mauri y siete fueron descartados de este estudio debido a problemás que presentaron los microsatélites en las etapas de control de calidad.
Nota: Todos los cebadores F empleados fueron complementados con la siguiente secuencia complementaria a la de la secuencia marcada con el fluorocromo específico: 5’‐TGTAAAACGACGGCCAGT‐3’. Los alelos reportados en el presente trabajo tienen tamaños de alrededor de 18 a 20 pares de bases más que los reportados en otras especies debido a la incorporación de la secuencia universal (universal sequence tag).
Locus Secuencia del Primer Tipo de matriz Temp. °C
Tamaño (pb) Alelos Control de calidad
Cme01 F:CTCTCCCAGTGAGCTCTGAAC R:GGCTCTGCATGAAAGTCTAAATG
(CA)19 56 76‐102 14 ok
Cme02 F:GCTTTCAAGAACATCTGAATCCT R:TTAAAAGGGACCGAGTGTCCT
(GT)15AT(GA)13 56 135‐171 17 ok
Cme03 F:ATAAAGCCCTTCAGCAAAGC R:TGGCTGCAGTGAGAAGACTC
(CA)14 56 144‐182 14 ok
Cme04 (GT)14 56 108‐126 9 No amplificó Cme05 F: GTTTACCACACGGCTGCAC
R:CCCCAGCAAGATTTTCTCAT (CA)20 56 192‐210 10 ok
Cme06 F: GAGCAGTGCTGCTGACTTTG R:GCTCTTCCTTGCTTTCATTTC
(CA)11 60 183‐225 23 ok
Cme07 F:AGCTGTGGGAATGGTCCAC R:TGGAGAAAAGCCACTGAAGC
(CA)17A(CA)2 60 70‐98 14 ok
Cme08 F:TGTGAATCGTACAAGGACAAGC R:CAGATCAGAGCCTCGCGT
(CA)16 60 182‐208 13 Desviación del equilibrio de Hardy‐Weinberg
Cme09 F:CCAACAAGAAGGGAAAACTGC R:ACAGAGCCTTTTGCCCACAG
(GT)13 60 113‐155 19 ok
Cme10 F:GAAGGCGAGGAGAACTTCTGT R:TGTTACCAAAGGCTTAAGCAAAG
(CA)14 56 180‐218 19 ok
Cme12 F:GAGCGGGGACGAGGACAGT R:GTTGGGGGACTAAAGGAAGAC
(CT)3(GT)13 56 172‐208 17 Amplificación no reproducible
Ruff01 F:TTTCCAAGAGACCAGCAATAAG R:GATTGCTTTGGCTGGAGAGATG
(ATCT)12 54 160‐204 12 ok
Ruff05 F:GGTCTGAATATAAGATTTCCTTGG R:AGAATAACCTGGTGCATCTTTC
(ATCT)12 52 127‐165 11 Amplificación no reproducible
Ruff10 F:CAGATAGAATTAGGCAAGG R:GTAACTTGAATATCCCATCTTG
(GATA)13 50 260‐305 12 Amplificación no reproducible
Ruff50 F:GAACAGAACAGGACACAAGCTG R:TGCAACAGAAACCCATATAAGC
(GT)24 58‐48 180‐228 25 No amplificó
PGT90 F:ACGCACAATTCCTAAGGTGA R:GACACGTACATGGCTCCTTC
(GT)19 58 No amplificó
78
APÉNDICE 4
PROGRAMÁS DE PCR EMPLEADOS PARA LA AMPLIFICACIÓN DE MICROSATÉLITES
Configuración del programa MICROCCM empleado para amplificar los productos de PCR para los microsatélites Cme 01, Cme 05, Cme 06, Cme 10 y Ruff 01.
Número de ciclos Tiempo Temperatura(°C) Ciclo 1 2 minutos 94 Desnaturalización inicial
10 segundos 96 Desnaturalización 10 segundos 54 Reincorporación
25
15 segundos 72 Extensión (Síntesis) 10 segundos 95 Desnaturalización 10 segundos 53 Reincorporación 15 segundos 72 Extensión (Síntesis)
8
15 minuto 70 Extensión (Síntesis) final
1 α 15
Configuración del programa MICROICM empleado para amplificar los productos de PCR para los microsatélites Cme 02 y Cme 08.
Número de ciclos Tiempo Temperatura (°C) Ciclo 1 2 minutos 94 Desnaturalización inicial
15 segundos 96 Desnaturalización 30 segundos 54 Reincorporación
25
30 segundos 72 Extensión (Síntesis) 15segundos 95 Desnaturalización 30 segundos 53 Reincorporación 30 segundos 72 Extensión (Síntesis)
8
15 minuto 70 Extensión (Síntesis) final
1 α 15
79
APÉNDICE 4 (CONTINUACIÓN)
PROGRAMÁS DE PCR EMPLEADOS PARA LA AMPLIFICACIÓN DE MICROSATÉLITES
Configuración del programa MICROCM7 empleado para amplificar los productos de PCR para los microsatélites Cme 03 y Cme 07.
Número de ciclos Tiempo Temperatura (°C) Ciclo 1 2 minutos 94 Desnaturalización inicial
10 segundos 96 Desnaturalización 10 segundos 54 Reincorporación
25
15 segundos 72 Extensión (Síntesis) 10segundos 95 Desnaturalización 10 segundos 53 Reincorporación 15 segundos 72 ° Extensión (Síntesis)
70 Extensión (Síntesis) final
8 1
15 minuto α
15
Configuración del programa MICROFCM empleado para amplificar los productos de PCR para el microsatélite Cme 09.
Número de ciclos Tiempo Temperatura (°C) Ciclo 1 2 minutos 94 Desnaturalización inicial
7 segundos 96 Desnaturalización 7 segundos 54 Reincorporación
25
12 segundos 72 Extensión (Síntesis) 7segundos 95 Desnaturalización 7 segundos 53 Reincorporación 12 segundos 72 Extensión (Síntesis)
8
15 minuto 70 Extensión (Síntesis) final
1 α 15
80
APÉNDICE 5
FRECUENCIAS ALÉLICAS DE CADA LOCUS POR POBLACIÓN
Tabla de frecuencias de los alelos para el locus Cme 01.
Locus Alelo GN LP SM HZ EP AG PY
Cme 01 95 0.022 0.000 0.021 0.000 0.000 0.043 0.000
97 0.109 0.083 0.083 0.063 0.042 0.043 0.063
101 0.130 0.146 0.042 0.104 0.146 0.109 0.208
103 0.109 0.104 0.083 0.083 0.167 0.022 0.063
105 0.130 0.167 0.229 0.125 0.208 0.239 0.188
107 0.087 0.042 0.083 0.083 0.063 0.130 0.083
109 0.109 0.104 0.063 0.125 0.083 0.065 0.063
111 0.130 0.063 0.083 0.250 0.125 0.130 0.167
113 0.000 0.104 0.104 0.042 0.042 0.000 0.000
115 0.065 0.104 0.042 0.042 0.021 0.065 0.000
117 0.000 0.000 0.042 0.021 0.021 0.022 0.021
119 0.065 0.042 0.083 0.021 0.042 0.087 0.063
121 0.043 0.021 0.021 0.021 0.000 0.022 0.021
123 0.000 0.000 0.021 0.000 0.000 0.022 0.021
125 0.000 0.021 0.000 0.021 0.042 0.000 0.000
127 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.042
81
APÉNDICE 5 (CONTINUACIÓN)
FRECUENCIAS ALÉLICAS DE CADA LOCUS POR POBLACIÓN
Tabla de frecuencias de los alelos para el locus Cme 02.
Locus Alelo GN LP SM HZ EP AG PY
Cme 02 155 0.022 0.021 0.000 0.000 0.021 0.000 0.021
157 0.022 0.063 0.063 0.042 0.042 0.000 0.021
159 0.022 0.042 0.021 0.063 0.083 0.087 0.063
161 0.043 0.042 0.083 0.042 0.063 0.043 0.021
163 0.000 0.021 0.063 0.063 0.021 0.043 0.021
164 0.000 0.021 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
165 0.413 0.521 0.500 0.333 0.396 0.478 0.396
167 0.348 0.146 0.167 0.208 0.229 0.239 0.146
169 0.065 0.104 0.000 0.188 0.042 0.087 0.146
171 0.043 0.021 0.083 0.021 0.042 0.000 0.146
173 0.022 0.000 0.021 0.000 0.021 0.000 0.021
174 0.000 0.000 0.000 0.021 0.021 0.000 0.000
177 0.000 0.000 0.000 0.021 0.000 0.022 0.000
178 0.000 0.000 0.000 0.000 0.021 0.000 0.000
82
APÉNDICE 5 (CONTINUACIÓN)
FRECUENCIAS ALÉLICAS DE CADA LOCUS POR POBLACIÓN
Tabla de frecuencias de los alelos para el locus Cme 03.
Tabla de frecuencias de los alelos para el locus Cme 05.
Locus Alelo GN LP SM HZ EP AG PY
Cme 03 159 0.000 0.000 0.000 0.021 0.000 0.000 0.000
163 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.021
165 0.065 0.021 0.000 0.042 0.042 0.043 0.063
167 0.000 0.000 0.042 0.021 0.042 0.000 0.000
169 0.391 0.417 0.250 0.250 0.438 0.370 0.250
171 0.174 0.146 0.167 0.229 0.146 0.196 0.313
173 0.261 0.208 0.354 0.208 0.229 0.239 0.167
175 0.109 0.125 0.083 0.125 0.063 0.065 0.167
177 0.000 0.021 0.083 0.021 0.042 0.065 0.021
179 0.000 0.021 0.000 0.063 0.000 0.000 0.000
181 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.022 0.000
183 0.000 0.021 0.021 0.021 0.000 0.000 0.000
185 0.000 0.021 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
Locus Alelo GN LP SM HZ EP AG PY
Cme 05 203 0.022 0.021 0.000 0.000 0.042 0.022 0.000
207 0.196 0.104 0.208 0.188 0.125 0.174 0.104
209 0.022 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.021
210 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.022 0.000
211 0.652 0.750 0.708 0.750 0.833 0.630 0.792
213 0.109 0.125 0.083 0.063 0.000 0.152 0.083
83
APÉNDICE 5 (CONTINUACIÓN)
FRECUENCIAS ALÉLICAS DE CADA LOCUS POR POBLACIÓN
Tabla de frecuencias de los alelos para el locus Cme 06.
Locus Alelo GN LP SM HZ EP AG PY
Cme 06 140 0.000 0.000 0.000 0.000 0.021 0.000 0.042
142 0.000 0.021 0.021 0.000 0.000 0.000 0.000
144 0.043 0.146 0.083 0.104 0.125 0.043 0.063
146 0.217 0.146 0.167 0.125 0.083 0.087 0.104
148 0.130 0.104 0.188 0.208 0.146 0.130 0.063
150 0.087 0.042 0.104 0.188 0.125 0.174 0.125
152 0.087 0.063 0.104 0.063 0.104 0.043 0.125
154 0.022 0.125 0.167 0.167 0.146 0.087 0.083
156 0.065 0.083 0.063 0.042 0.021 0.109 0.063
158 0.065 0.104 0.063 0.042 0.104 0.174 0.188
160 0.152 0.042 0.042 0.021 0.042 0.043 0.063
162 0.022 0.063 0.000 0.021 0.063 0.022 0.021
164 0.022 0.000 0.000 0.000 0.021 0.043 0.021
166 0.022 0.042 0.000 0.021 0.000 0.000 0.021
168 0.043 0.021 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
170 0.022 0.000 0.000 0.000 0.000 0.022 0.021
174 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.022 0.000
84
Tabla de frecuencias de los alelos para el locus Cme 07.
Locus Alelo GN LP SM HZ EP AG PY
Cme 07 89 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.021
91 0.022 0.000 0.000 0.000 0.021 0.000 0.000
93 0.022 0.021 0.042 0.000 0.042 0.022 0.000
95 0.348 0.333 0.333 0.479 0.292 0.239 0.458
97 0.348 0.375 0.375 0.333 0.438 0.500 0.375
99 0.022 0.063 0.042 0.063 0.021 0.022 0.021
101 0.109 0.083 0.104 0.063 0.021 0.087 0.021
103 0.109 0.083 0.083 0.042 0.146 0.109 0.104
105 0.022 0.042 0.000 0.021 0.021 0.000 0.000
109 0.000 0.000 0.021 0.000 0.000 0.022 0.000
85
APÉNDICE 5 (CONTINUACIÓN)
FRECUENCIAS ALÉLICAS DE CADA LOCUS POR POBLACIÓN
Tabla de frecuencias de los alelos para el locus Cme 08.
Tabla de frecuencias de los alelos para el locus Cme 09.
Locus Alelo GN LP SM HZ EP AG PY
Cme 08 199 0.043 0.000 0.021 0.042 0.042 0.000 0.021
201 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.022 0.000
203 0.000 0.021 0.042 0.000 0.000 0.000 0.000
205 0.000 0.042 0.000 0.000 0.042 0.000 0.000
207 0.043 0.042 0.000 0.042 0.000 0.022 0.021
208 0.022 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
209 0.304 0.458 0.333 0.479 0.250 0.326 0.500
210 0.000 0.021 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
211 0.261 0.313 0.313 0.271 0.417 0.304 0.229
212 0.000 0.000 0.021 0.000 0.000 0.000 0.000
213 0.283 0.104 0.146 0.042 0.208 0.239 0.188
215 0.043 0.000 0.083 0.104 0.000 0.000 0.042
217 0.000 0.000 0.042 0.021 0.000 0.022 0.000
219 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.043 0.000
221 0.000 0.000 0.000 0.000 0.042 0.000 0.000
227 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.022 0.000
Locus Alelo GN LP SM HZ EP AG PY
Cme09 144 0.000 0.000 0.021 0.021 0.021 0.000 0.021
146 0.261 0.250 0.229 0.313 0.229 0.217 0.229
147 0.022 0.000 0.000 0.021 0.000 0.022 0.000
148 0.022 0.000 0.000 0.042 0.000 0.000 0.042
152 0.087 0.188 0.146 0.146 0.125 0.152 0.104
154 0.304 0.271 0.188 0.229 0.313 0.261 0.292
156 0.239 0.188 0.333 0.229 0.146 0.239 0.208
158 0.065 0.104 0.063 0.000 0.146 0.065 0.083
160 0.000 0.000 0.021 0.000 0.021 0.043 0.021
86
APÉNDICE 5 (CONTINUACIÓN)
FRECUENCIAS ALÉLICAS DE CADA LOCUS POR POBLACIÓN
Tabla de frecuencias de los alelos para el locus Cme 10.
Locus Alelo GN LP SM HZ EP AG PY
Cme 10 199 0.087 0.167 0.313 0.229 0.25 0.13 0.146
201 0.065 0.083 0.042 0.021 0.063 0.043 0.000
203 0.065 0.042 0.042 0.063 0.083 0.022 0.063
205 0.022 0.042 0.021 0.021 0.042 0.043 0.021
207 0.413 0.229 0.208 0.313 0.292 0.304 0.271
208 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.021
209 0.109 0.167 0.146 0.125 0.021 0.152 0.167
211 0.087 0.125 0.063 0.042 0.083 0.087 0.083
212 0.000 0.000 0.021 0.000 0.000 0.000 0.000
213 0.087 0.042 0.063 0.104 0.042 0.043 0.125
214 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.043 0.000
215 0.022 0.063 0.063 0.083 0.042 0.065 0.021
216 0.022 0.021 0.000 0.000 0.021 0.000 0.000
217 0.022 0.021 0.021 0.000 0.063 0.065 0.083
87
APÉNDICE 5 (CONTINUACIÓN)
FRECUENCIAS ALÉLICAS DE CADA LOCUS POR POBLACIÓN
Tabla de frecuencias de los alelos para el locus Ruff 01
Locus Alelo GN LP SM HZ EP AG PY
Ruff 01 180 0.000 0.000 0.000 0.021 0.000 0.000 0.000
183 0.000 0.000 0.000 0.000 0.021 0.000 0.000
184 0.000 0.000 0.021 0.000 0.021 0.022 0.000
188 0.043 0.083 0.000 0.063 0.083 0.087 0.042
191 0.000 0.000 0.000 0.000 0.021 0.022 0.000
192 0.087 0.063 0.000 0.042 0.021 0.043 0.083
194 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.022 0.000
195 0.043 0.021 0.000 0.021 0.021 0.000 0.000
196 0.152 0.188 0.063 0.167 0.188 0.196 0.188
199 0.000 0.000 0.000 0.021 0.000 0.000 0.000
200 0.196 0.167 0.229 0.292 0.271 0.174 0.146
202 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.022 0.000
203 0.043 0.042 0.021 0.021 0.021 0.000 0.063
204 0.261 0.208 0.438 0.146 0.292 0.217 0.271
206 0.022 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
207 0.022 0.042 0.063 0.042 0.000 0.000 0.000
208 0.043 0.104 0.104 0.083 0.000 0.065 0.104
210 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.021
211 0.065 0.021 0.042 0.021 0.021 0.065 0.021
212 0.022 0.021 0.000 0.042 0.000 0.043 0.021
216 0.000 0.042 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
217 0.000 0.000 0.000 0.021 0.000 0.000 0.000
219 0.000 0.000 0.021 0.000 0.000 0.000 0.000
220 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.022 0.021
223 0.000 0.000 0.000 0.000 0.021 0.000 0.021
88
APÉNDICE 6
MICROCHECKER (FRECUENCIA DE HOMOCIGOTOS)
89
APÉNDICE 6 (CONTINUACIÓN)
MICROCHECKER (FRECUENCIA DE HOMOCIGOTOS)
90
APÉNDICE 6 (CONTINUACIÓN)
MICROCHECKER (FRECUENCIA DE HOMOCIGOTOS)
91
APÉNDICE 7
DIFERENCIAS EN LA FRECUENCIA
92
APÉNDICE 7 (CONTINUACIÓN)
(DIFERENCIAS EN LA FRECUENCIA)
93
APÉNDICE 7 (CONTINUACIÓN)
(DIFERENCIAS EN LA FRECUENCIA)
