Diferencias epigenéticas persistentes asociados con la exposición prenatal a la hambruna en los seres humanos

RESUMEN

Estudios epidemiológicos extensos no han sugerido que el riesgo de enfermedades del adulto se asocia a condiciones ambientales adversas tempranas en el desarrollo. Aunque los mecanismos detrás de estas relaciones no son claras, una implicación de la desregulación epigenética ha planteado la hipótesis. Aquí nos muestran que los individuos que fueron expuestos prenatalmente a la hambruna durante el holandés invierno del hambre en 1944-45 tenían, 6 décadas más tarde, menos la metilación del ADN del gen IGF2 impresa en comparación con sus hermanos no expuestos, del mismo sexo. La asociación fue más específico para la exposición periconcepcional, reforzando que el desarrollo de los mamíferos muy temprana es un período crucial para establecer y mantener las marcas epigenéticas. Estos datos son los primeros en aportar apoyo empírico a la hipótesis de que las condiciones ambientales de la vida temprana puede causar cambios epigenéticos en los seres humanos que persisten durante toda la vida.

Superpuesta a la secuencia de ADN es una capa de información epigenética que es heredable, particularmente durante la mitosis, y controla el potencial de una región genómica que ha de transcribirse (1). Los grupos metilo acoplados a las citosinas en citosina-guanina (CpG) dinucleótidos y modificaciones de histonas que el paquete de ADN son las dos principales marcas moleculares que constituyen esta información y regulan la estructura de la cromatina y la accesibilidad de ADN (2).

Los estudios en animales han indicado que ciertas influencias ambientales transitorios pueden producir cambios persistentes en las marcas epigenéticas que tienen consecuencias fenotípicas de larga duración (3, 4). El desarrollo embrionario temprano es de especial interés en este sentido, porque este es un período crucial para establecer y mantener las marcas epigenéticas (5). De hecho, el cultivo de embriones de ratones preimplantación encontró que las marcas epigenéticas son susceptibles a las condiciones nutricionales en las primeras etapas de desarrollo de los mamíferos (6, 7).

Una de las pocas oportunidades para estudiar la relevancia de estos hallazgos para los seres humanos es presentada por individuos que fueron expuestos prenatalmente a la hambruna durante el holandés invierno del hambre (8). Este período de hambre era la consecuencia de un embargo de comida alemana-impuesto en la parte occidental de los Países Bajos hacia el final de la Segunda Guerra Mundial en el invierno de 1944-1945. Durante este período, los registros y los cuidados de salud se mantuvo intacta, por lo que las personas que fueron expuestos prenatalmente a esta hambruna se pueden rastrear. Por otra parte, el período de hambruna estaba claramente definido, y se documentaron las raciones oficiales de los alimentos. Estas características únicas nos permiten evaluar si la exposición prenatal a la hambruna se asocia con diferencias epigenéticas persistentes en los seres humanos.

Uno de los loci epigenéticamente regulado mejor caracterizada es el factor de crecimiento similar a la insulina II (IGF-2). IGF-2 es un factor clave en el crecimiento y el desarrollo humano y se imprime la madre (9). La impronta se mantiene a través de la región IGF2 diferencialmente metilado (DMR), la hipometilación de los cuales conduce a la expresión bi-alélica de IGF-2 (10). Se estudiaron recientemente IGF2 DMR metilación en 372 gemelos (11). IGF2 DMR metilación es un rasgo cuantitativo normalmente distribuida que está determinada en gran medida por factores genéticos, tanto en la adolescencia y la mediana edad, lo que indica que la marca de metilación es estable hasta la mediana edad. Por lo tanto, si está afectado por las condiciones ambientales temprano en el desarrollo humano, alterado IGF2 DMR metilación puede detectar muchos años después.

Aquí hemos utilizado nuestro estudio en curso Familias invierno del hambre (8) para investigar si la exposición prenatal a la hambruna se asocia con diferencias persistentes en la metilación del IGF2 DMR. Nuestro enfoque principal era la exposición durante periconcepción, garantizando así que la exposición estuvo presente durante las primeras etapas de desarrollo que son fundamentales en la programación epigenética. Para investigar más a fondo el papel de la oportunidad, también estudiamos las personas que estuvieron expuestas al final de la gestación.

RESULTADOS

Exposición periconcepcional.

Nuestro principal objetivo era probar si la exposición periconcepcional a la hambruna se asoció con diferencias en IGF2 DMR metilación en la edad adulta. Con este fin, se seleccionaron los 60 individuos de las familias estudiadas invierno del hambre que se concibió durante la hambruna hace 6 décadas. Así, el período de exposición incluyó las primeras etapas de desarrollo. Los individuos expuestos se compararon con su hermano del mismo sexo para lograr compatibilidad genética parcial. El uso de un método cuantitativo basado en la espectrometría de masa (12, 13), se midió la metilación de cinco dinucleótidos CpG dentro de la IGF2 DMR (11). Tres sitios CpG se midieron de forma individual, y dos se midieron simultáneamente, porque no podían ser resueltos debido a su estrecha proximidad. Todos los sitios CpG pero uno fueron significativamente menos metilado entre individuos periconcepcional expuestas en comparación con sus hermanos (1,5 × 10-4 ≤ P ≤ 8,1 × 10-3; véase el cuadro 1). La fracción media de metilación del IGF2 DMR basado en los cinco sitios CpG era 0.488 entre hermanos expuestas y 0.515 entre los hermanos no expuestos. Así, la exposición periconcepcional se asoció con una metilación 5,2% menor (P = 5,9 × 10-5), correspondiente a 0,48 desviaciones estándar (DE) de los controles. La asociación fue independiente del sexo (Pinteraction = 0,20).

Tabla 1.

IGF2 DMR metilación entre individuos periconcepcional expuestas a la hambruna y sus no expuestos, hermanos del mismo sexo

Fig. 1A muestra la diferencia en IGF2 DMR metilación dentro de las hermandades de acuerdo con la fecha de la concepción estimado del individuo hambruna expuestos. IGF2 DMR metilación fue menor en los individuos expuestos al hambre entre el 72% (43/60) de las hermandades; esta metilación más baja se observó en las concepciones de todo el período de hambruna. Raciones diarias Oficiales se establecieron semanalmente durante el período de hambruna y fueron los mismos para todas las personas. Las raciones diarias promedio fueron de 667 kcal (SD, 151) (Fig. 1A), y había poca variación en el porcentaje de calorías provenientes de proteínas (≈12%, de los cuales el 4% de origen animal), grasa (19%), e hidratos de carbono (69%) (14).

FIG 1) Diferencia en IGF2 metilación DMR entre individuos prenatalmente expuestos a la hambruna y su hermano del mismo sexo. (A) la exposición periconcepcional: Diferencia en la metilación de acuerdo al último período menstrual de la madre (una estimación común de la concepción) antes de la concepción del individuo hambruna expuestos. (B) La exposición final de la gestación: Diferencia en la metilación de acuerdo con la fecha de nacimiento del individuo hambruna expuestos. Para describir la diferencia en la metilación de acuerdo con las fechas estimadas de concepción y nacimiento, se dibuja una curva lowess (rojo o azul). Las raciones promedio distribuido (en kcal / día) entre diciembre de 1944 y junio 1945 se representan en verde.

Como validación técnica, IGF2 DMR metilación se vuelve a medir en 46 de 60 individuos periconcepcional expuestos y sus hermanos del mismo sexo, siguiendo todo el proceso de tratamiento con bisulfito de cuantificación. Se observó un 5,6% IGF2 DMR metilación igualmente menor (P = 2,1 × 10-3), lo que confirma nuestros resultados iniciales.

La exposición gestacional Tardío.

Para investigar más a fondo la influencia del tiempo, se seleccionaron las 62 personas que estuvieron expuestas a la hambruna durante la gestación durante al menos 10 semanas, por lo que nacieron en o poco después de la hambruna. No se encontraron diferencias en IGF2 DMR metilación entre los individuos expuestos y sus hermanos no expuestos (Cuadro 2; Fig. 1B).

Tabla 2.

IGF2 metilación DMR entre las personas expuestas a la hambruna durante la gestación avanzada y sus no expuestos, hermanos del mismo sexo

Para probar formalmente si la asociación con una menor metilación DMR IGF2 dependía del momento de la exposición, se analizaron los grupos de exposición periconcepcional y finales junto con los 122 controles en un solo modelo (Tabla 3). La exposición periconcepcional se asoció con la metilación inferior (P = 1,5 × 10-5), mientras que la exposición tarde no era (P = 0,69). Además, no había pruebas estadísticamente significativas para la interacción entre el tiempo y la exposición (Pinteraction = 4,7 × 10-3), lo que indica que la asociación se-momento específico.

Tabla 3.

El momento de la exposición hambruna durante la gestación, IGF2 DMR metilación, y el peso al nacer

El peso al nacer

El peso medio al nacer de los 62 individuos expuestos tarde en la gestación era de 3126 g (SD, 408), que es 296 g inferior (95% de intervalo de confianza [IC], -420 a -170 g) que la media (3,422 g; SD , 464) de 324 nacimientos de referencia en 1943 en las mismas instituciones (P = 4 × 10-6) (15). El peso al nacer menor de relieve el impacto de la hambruna durante el invierno del hambre a pesar de la ausencia de una asociación con IGF2 DMR metil ación. El peso medio al nacer de las 60 personas que estuvieron expuestas periconcepcional era de 3612 g (SD, 648), no menor que la de los nacimientos de referencia (IC del 95%, 15 a + 365 g; P = 0,03). IGF2 DMR metilación no se asoció con el peso al nacer (P = 0,39).

Asociación Edad.

Para poner la asociación entre la exposición hambruna periconcepcional con un 5,2% inferior IGF2 DMR metilación en perspectiva, se evaluó la relación entre la edad y IGF2 DMR metilación en los individuos de control 122. Dentro de la gama de edad estudiado (43-70 años), una edad de 10 años de más edad se asoció con una metilación 3,6% menor (P = 0,015).

DISCUSIÓN

Aquí mostramos que la exposición periconcepcional a la hambruna durante el holandés invierno del hambre se asocia con una menor metilación del IGF2 DMR 6 décadas después. La hipometilación que observamos es muy comparable a la encontrada para los genes NR3C1 y Ppara en las crías de ratas hembras alimentadas una deficiente en proteínas dieta isocalórica de partida antes del embarazo (-8,2% y -10,2% vs -5,2% en nuestro estudio en humanos) ( 16), aunque se han encontrado mayores efectos para el gen Agtr1b en un modelo de rata similar (17). Estos datos de

modelos animales son consistentes con la interpretación de que el hambre subyace a la hipometilación IGF2 que observamos y puede estar relacionada a una deficiencia en donantes de metilo, tales como el aminoácido metionina (3). Una aportación adicional de otros factores estresantes, como el estrés por frío y emocional (8), no se puede descartar, sin embargo. Nuestro estudio proporciona la primera evidencia de que las condiciones ambientales transitorios temprano en la gestación humana pueden ser registrados como cambios persistentes en la información epigenética.

En contraste con la exposición periconcepcional a la hambruna, la exposición final de la gestación no se asoció con IGF2 DMR metilación. Las marcas epigenéticas pueden ser especialmente vulnerables durante la etapa muy temprana del desarrollo de los mamíferos, que es un período crucial para el establecimiento y mantenimiento de marcas epigenéticas (5). Los experimentos en los que los cigotos de ratón se cultivaron a blastocistos favorecen esta hipótesis (6, 7). La dependencia calendario de la asociación que se observó también puede estar relacionada con el tiempo de desarrollo de los tejidos, sin embargo (18). Se estudió la sangre y los adultos células madre de sangre del sistema hematopoyético, que se establece relativamente temprano en el desarrollo de mamíferos (por ejemplo, día 10,5 en el embrión de ratón [cf. semanas 4-6 en la gestación humana] (19)). Se necesitan futuros estudios detallados para establecer si la susceptibilidad de las marcas epigenéticas es una propiedad intrínseca del desarrollo de los mamíferos temprano o una característica general de los tejidos de reciente desarrollo en toda la gestación. Nuestros resultados no excluyen la aparición de cambios epigenéticos más tarde en el desarrollo (20) o durante el envejecimiento (21).

La hipótesis de los orígenes del desarrollo indica que las condiciones adversas durante el desarrollo contribuyen al riesgo de las enfermedades del adulto (22). Aunque los mecanismos detrás de estas relaciones no están claros, se ha propuesto la implicación de la desregulación epigenética (22-24). Nuestros resultados son un elemento clave en la elaboración de esta hipótesis. Los estudios en humanos sobre los orígenes de la salud y la enfermedad a menudo usan bajo peso al nacer como un proxy para un desarrollo prenatal comprometida (22). Nuestros datos indican que este tipo de estudios no son necesariamente suficientes para probar la participación de la epigenética y así ampliar nuestra anterior conclusión de que el peso al nacer es un pobre sustituto de la situación nutricional durante la gestación (15). Se encontraron diferencias epigenéticas entre las personas que fueron expuestas a la hambruna temprano en la gestación y que tenían un peso normal al nacer. La exposición a la hambruna durante la gestación se asoció con bajo peso al nacer, como se esperaba, pero no con los cambios epigenéticos. Para supervisar las etapas cruciales del desarrollo temprano, la evaluación de estilo de vida de la madre, especialmente en relación con la nutrición (25), y el crecimiento del embrión mediante ecografía tridimensional (26) puede ser más apropiado que la evaluación de peso al nacer.

El actual estudio presenta un primer ejemplo de una asociación entre una exposición periconcepcional y la metilación del ADN en los seres humanos. Será de interés primordial para investigar si otras exposiciones durante el desarrollo temprano que son más comunes en las sociedades modernas, como el exceso (3) y las tecnologías de reproducción asistida (27), dan lugar

a asociaciones similares. Además, la medida en que las marcas epigenéticas en otras regiones genómicas son vulnerables a tales exposiciones queda por establecer. Un área clave para explorar en futuros estudios será evaluar las consecuencias fenotípicas de los cambios en las marcas epigenéticas. Enfermedades que han sido asociados con la exposición gestacional temprano para el hambre, tales como la esquizofrenia (28) y la enfermedad cardíaca coronaria (29), son de particular interés a este respecto. Análogo a los estudios actuales en epidemiología genética (30), este tipo de estudios epidemiológicos epigenéticos pueden necesitar ser grande y que incluya la replicación. La comprensión de cómo el control epigenético depende de la exposición temprana puede arrojar luz sobre el vínculo entre el desarrollo y la salud durante toda la vida y, finalmente, sugerir nuevas formas de prevenir las enfermedades humanas.

MÉTODOS

Población de estudio.

El diseño de la contratación y de las familias estudiadas invierno del hambre fueron descritas anteriormente (8). Las personas expuestas a la hambruna prenatalmente fueron reclutados por la identificación y seguimiento de los nacimientos simples vivos en 1945 y principios de 1946 en tres instituciones en las ciudades de hambruna expuestas (las escuelas de formación de matronas en Amsterdam y Rotterdam y el hospital de la Universidad de Leiden). Como controles, hermanos del mismo sexo y los individuos no relacionados de las mismas instituciones que nacieron antes o concibieron después se contrató el período de hambruna. El examen clínico, incluyendo la extracción de sangre, se completó para 311 personas expuestas, 311 hermanos del mismo sexo, y 349 controles no relacionados. El peso al nacer fue extraída de los registros de nacimiento de las tres instituciones. Están disponibles para los hermanos del mismo sexo que no nacieron en estas instituciones no los datos de peso al nacer.

Para el estudio epigenético actual, nos hemos centrado en los individuos expuestos y sus hermanos como controles para lograr compatibilidad genética parcial en vista de la alta heredabilidad de IGF2 DMR metilación (11). De éstos, se seleccionaron las hermandades con un individuo expuesto a la hambruna periconcepcional y aquellos con un individuo expuesto a la hambruna durante la gestación avanzada. Exposición periconcepcional se definió como la última menstruación de la madre antes de la concepción del individuo expuesto entre 28 de noviembre 1944 y 15 de mayo de 1945. Esto produjo 60 hermandades. Exposición tarde en la gestación se define como un nacimiento entre enero 28 y 30 de mayo de 1945, de modo que la duración de la exposición hambre era al menos 10 semanas. Esto produjo 62 hermandades.

Metilación del ADN

La metilación del IGF2 DMR se midió utilizando el ADN genómico de sangre entera extraída usando el método de salado-out. Un microgramo de ADN genómico era-bisulfito tratada utilizando el kit de metilación de ADN 96-EZ (Zymo Research). Hermandades eran-bisulfito tratados en la misma placa. Tres placas se utilizan para procesar las 244 muestras, cada una con un número igual de muestras y una distribución similar en sujetos expuestos-finales y periconcepcional. La región que

alberga el IGF2 DMR (chr11: 2,126,035-2,126,372 en NCBI Build 36.1) se amplificó usando los cebadores descritos en otra parte (11). La metilación del ADN se midió usando un método de espectrometría de masa a base de (Epityper, Sequenom) (12), la exactitud cuantitativa (mediciones duplicadas R2 ≥ 0,98) y concordancia con la reacción en cadena de la polimerasa clonal secuenciación de bisulfito de los cuales se ha informado anteriormente (13, 31) . Todas las mediciones se realizaron por triplicado. Dinucleótidos CpG cuya medida fue confundido por los polimorfismos de nucleótido único, como ya comentamos en un informe anterior (11), fueron descartados como parte del control de calidad. Los dinucleótidos CpG reportados en el presente estudio se encuentran en las posiciones 41, 57 y 60, 202, y 251 pb en el amplicón focalización del IGF2 DMR. Metilación de datos fueron de 93% de avance. La metilación del ADN de cinco dinucleótidos CpG podría medirse, tres de forma individual y dos como un par porque eran directamente adyacente y no podían resolverse individualmente.

Statistical analysis

Las fracciones de metilación medios de CpG individuales y sus desviaciones estándar que se presentan en las tablas y figuras se basan en los datos brutos. Para obtener la metilación promedio de todo el DMR IGF2 presentado en las tablas y figuras, faltan datos de metilación fueron los primeros imputados utilizando estimaciones de los modelos lineales mixtos, explotando así las correlaciones entre los sitios CpG (11). Para probar las diferencias entre los individuos expuestos y sus hermanos no expuestos, se aplicaron modelos mixtos lineales ajustadas por edad a los datos en bruto sin imputación de valores perdidos. Estos análisis en cuenta la edad en el examen, las relaciones familiares, correlacionados metilación de los dinucleótidos CpG, y metilación de datos faltantes al azar. Estado de exposición, dinucleótido CpG, y la edad se introdujeron como efectos fijos y hermandad se introducen como un efecto aleatorio. El modelo incluye tanto el periconcepcional y los grupos finales de la exposición se amplió con una variable que indica el momento de la exposición y un término de interacción de la condición de tiempo de exposición tiempos de exposición. Para probar la asociación entre IGF2 DMR metilación y el peso al nacer, se añadió peso al nacer como efecto fijo. El modelo mixto lineal puede ser visto como una extensión de la prueba t pareada; el modelo se reduce a una prueba t pareada con resultados idénticos si dentro familiar diferencias de metilación se evalúan, para un solo nucleótido CpG y si los datos son completos y ajuste por edad se omite. Todos los valores de p son dos caras, y todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS 14.0.