Diseño, síntesis y caracterización de complejos …Ejemplos de ligandos monodentados, bidentados...
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Diseño, síntesis y caracterización de complejos enjaulados
de ácido γ-amino butírico de baja toxicidad para aplicaciones en
electrofisiología.
TESIS DE LICENCIATURA
Autora: María Gabriela Noval
Director: Roberto Etchenique
Director Asistente: Luís Baraldo
Laboratorio de Dispositivos Moleculares
Instituto de Química-Física de Materiales, Medio Ambiente y Energía
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas
Buenos Aires, Abril 2010
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1 RESUMEN
Los compuestos enjaulados, son entidades capaces de liberar moléculas al ser
irradiados con luz. Esta estrategia permite liberar un compuesto con precisión espacio
temporal. En particular, los complejos enjaulados de neurotransmisores son muy
utilizados en la elucidación de la dinámica de estructuras biológicas como circuitos
neuronales, estudios cinéticos rápidos en canales iónicos, mapeo de receptores, etc.
En nuestro laboratorio se desarrollan complejos enjaulados de base rutenio-
bipiridina que poseen moléculas bioactivas coordinadas, que son liberadas luego de ser
irradiadas con luz (un fotón de luz visible o dos fotones de infrarrojo). Principalmente
se enjaulan neurotransmisores como ácido γ-amino butírico (GABA), glutamato,
glicina, entre otros y moléculas con actividad modulatoria en el sistema nervioso como
nicotina. El GABA es el principal neurotransmisor inhibitorio del sistema nervioso
central en adultos. Tiene una gran importancia fisiológica, principalmente porque los
receptores GABAérgicos ionotrópicos son modulados por fármacos de uso clínico en
síndromes como epilepsia.
En este trabajo se realizó el diseño, síntesis y caracterización de compuestos
enjaulados de GABA basados en rutenio, de baja lipofilicidad. Se logró obtener una
familia de complejos de gran efectividad en la liberación del neurotransmisor en
preparados biológicos, con alta eficiencia cuántica y baja toxicidad. Se realizó un
ensayo funcional en un sistema de expresión heteróloga de ovocitos de Xenopus laevis;
expresando receptores de GABAc. Finalmente, se logró comprender alguno de los
mecanismos que regulan la toxicidad de los complejos.
Palabras clave: Complejos enjaulados de GABA-complejos de rutenio-receptores
GABAérgicos-sistema de expresión heteróloga de ovocitos de Xenopus laevis.
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2 INTRODUCCIÓN
En el constante desarrollo de herramientas para la realización de experimentos,
un criterio importante a tener en cuenta es, por ejemplo, qué precisión espacial puede
lograrse en la aplicación de un estímulo o tratamiento a una célula o a un organismo.
Para poder tener un control espacio-temporal y para aumentar la selectividad de ciertos
efectos que son causados por compuestos biológicamente activos (neurotransmisores,
hormonas, metabolitos, segundos mensajeros, etc) una estrategia posible es poner al
compuesto bajo el control de una señal, de manera de “activarlo” en el momento y
región del preparado que se desee.
A principios de los años 70 se comenzó a desarrollar una nueva familia de
compuestos orgánicos derivados de moléculas de interés biológico, que permiten la
liberación selectiva de la misma, cuando se las irradia con luz.
2.1 Compuestos enjaulados
En la figura 1.1 se observa un esquema de la primera molécula enjaulada
desarrollada en 1978 por Hoffman (Kaplan, 1978), un derivado del Adenosin trifosfato
(ATP).
.
Figura 1.1. Esquema de la reacción de fotólisis del primer compuesto enjaulado publicado en
literatura (Tomado de Kaplan, 1978).
Complejo enjaulado de ATP
Molécula con actividad biológica
(enjaulado)
Grupo protector
(jaula)
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El término “compuesto enjaulado” (caged compound) fue probablemente usado
por primera vez por J. F. Hoffman (Kaplan, 1978). Un compuesto enjaulado es una
molécula orgánica que está compuesta por dos partes, un grupo protector fotolábil
(jaula) y una molécula con actividad biológica (enjaulado). Cuando las dos partes se
encuentran unidas, la molécula biológica en cuestión no presenta actividad. Al irradiar
con luz, el grupo protector es removido irreversiblemente, con la concomitante
activación de la molécula con actividad biológica.
Idealmente, los compuestos enjaulados deben ser moléculas con alta solubilidad
en agua, resistentes a la hidrólisis y a cualquier proceso de ruptura no activado por luz.
Sus productos de fotólisis no deben ser tóxicos ni interactuar con el sistema biológico y
la fotólisis debe ocurrir con fotones de baja energía (preferentemente en el rango de luz
visible), de manera que la irradiación no sea nociva para la célula (Givens, 1998).
Este tipo de herramienta se utiliza en experimentos biológicos para generar
concentraciones efectivas de una sustancia en un punto determinado del espacio y en un
tiempo dado. Estos compuestos, hasta el momento, representan la mejor herramienta
para el estudio de cinéticas de receptores, el mapeo de receptores, el mapeo de circuitos
neuronales, entre otros (Corrie, 1992; Yoshimura, 2005; Rial Verde, 2008).
Los grupos protectores más utilizados para el diseño de compuestos enjaulados
son los basados en ésteres de nitrobencilo (ONB) (McCray, 1989) y en 4,5-dimetoxi-2-
nitrobencilo (DMNB) (Patchomik, 1970). Éstos son fáciles de sintetizar y son
compatibles con muchos grupos funcionales (carboxilatos, amidas, aminas, grupos
hidroxilo y fosfatos) permitiendo entonces enjaular una amplia variedad de moléculas.
En las últimas décadas, se ha logrado enjaular una gran variedad de
neurotransmisores, aminoácidos y segundos mensajeros, lo cual generó grandes avances
en el campo de la neurobiología (Kiskin, 2002).
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En la Tabla 1.1 se listan algunos de los compuestos obtenidos a partir de éstas
jaulas, su eficiencia cuántica (φ) y su absortividad molar (ε). La eficiencia cuántica se
puede definir como el número de enjaulado liberado por cada fotón de luz absorbido. Es
particularmente importante el producto de estas dos cantidades, εφ, que define la
sensibilidad efectiva del compuesto.
Tabla 1.1. Características fisicoquímicas de los compuestos enjaulados con jaulas orgánicas.
(Adaptada de Mamotake, 2006).
Es importante destacar que todos los compuestos sintetizados hasta el momento
necesitan absorber luz entre 300 y 350 nm para poder liberar el enjaulado (Momotake,
2006). A longitudes de onda mayores a 350 nm, estos compuestos, absorben débilmente
siendo necesario irradiar con luz UV para que ocurra la ruptura del enlace entre el
enjaulado y el grupo protector. En la figura 1 del ANEXO, se muestra el espectro de luz
UV y de luz visible con sus respectivas longitudes de onda.
El uso de la luz UV en experimentos biológicos presenta muchas desventajas,
entre ellas podemos destacar:
• Altamente mutagénica. La luz UV es un mutágeno físico muy potente,
porque las bases púricas o pirimidínicas del DNA absorben fuertemente
Grupo protector Enjaulado ε ε ε ε (absortividad molar) εφεφεφεφ
Nitrobencilo ATP 430 0,63
IP3 430 0,65
glutamato 500 0,14
Calcio (Ca2+) 970 0,20
DMNB ATP 5000 0,07
cAPM 5000 0,05
5500 0,012Calcio (Ca2+)
φ φ φ φ (eficiencia cuántica)
271
280
70
194
350
250
66
6
luz del rango del UV (254-260 nm). Esta absorción produce dímeros de
pirimidinas lo cual puede generar mutaciones puntuales (Wees, 2007).
• Desencadena mecanismos de respuesta a estrés.
• La alta dispersión que presenta en los tejidos biológicos y, por lo
tanto, su baja penetrancia. Este tipo de luz es de baja penetrancia, por
lo que representa un problema cuando se quiere utilizar los complejos en
experimentos con tejidos u órganos enteros, como ganglios de
sanguijuela o sobre rodajas de cerebro.
• Costos de equipamiento. Los equipos son muchos más caros que los
utilizados para los experimentos con luz visible (Zayat, 2008).
Por otro lado, cuando estos compuestos son fotolizados generan como producto
de reacción un nitrosaldehido que es altamente tóxico para sistemas biológicos
(Pelliccioli, 2002; Corrie, 2003).
Para disminuir la energía necesaria para liberar el enjaulado, una opción es el
uso de compuestos de coordinación, donde la molécula con actividad biológica actúa
como ligando del complejo. Hoy en día se conocen numerosos complejos que pueden
sufrir rupturas heterolíticas cuando son irradiados con luz de baja energía, en el rango
de la luz visible (Balzani, 1970).
2.2 Complejos de rutenio como “jaulas”
Dentro de los complejos sintetizados a partir de metales de transición, los
complejos de rutenio, son los más estudiados desde el punto de vista fotoquímico en los
últimos tiempos. Estos complejos presentan elevada estabilidad química, una gran
reactividad en el estado excitado y absorben energía en el rango de la luz visible.
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Los compuestos de coordinación generalmente están constituidos por un átomo
metálico central alrededor del cual se disponen una serie de ligandos. El enlace entre el
centro metálico y los ligandos se da a través de uniones de coordinación, en las que el
ligando aporta la mayor parte de la densidad electrónica.
Se denomina ligando, a las moléculas que forman uniones de coordinación con
un metal. Estas deben poseer un par de electrones libres para formar dicha unión. Según
el número de átomos donores de electrones que posea la molécula puede clasificarse en
ligando monodentado o polidentado. Los ligandos monodentados poseen un único
átomo donor de electrones capaz de formar una unión con el metal, mientras que los
polidentados poseen más de un átomo donor. (Housecroft, 2005)
En estos compuestos, en particular en los complejos de polipiridinas de Ru (II),
el Ru (II) es el metal central y establece interacciones electrostáticas con ligandos que se
disponen a su alrededor. Como el número de coordinación más común para el Ru (II) es
seis, éste suele formar un complejo hexacoordinado octaédrico como se muestra en la
figura 1.2.
Figura 1.2. Estructura del [Ru(bpy)3]2+
. El átomo de metal central de Ru(II) se encuentra
hexacoordinado. Como ligandos contiene tres bipiridinas, adoptando una conformación
octaédrica.
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Las seis posiciones del Ru(II) pueden ser ocupadas tanto por ligandos
monodentados como por ligandos polidentados (Cotton, 1999). Como ejemplos de
estos, se pueden citar el cloruro, aminas y fosfinas (monodentados), la bipiridina
(bidentado), el tris(pirazolil)metano y la terpiridina (tridentado), etc. En la figura 1.3 se
puede observar la estructura química de algunos de ellos.
Figura 1.3. Ejemplos de ligandos monodentados, bidentados y tridentados coordinables a Ru
(II). En color se marca el átomo donor de electrones para cada ligando.
En la tabla 1.2 se muestra la eficiencia cuántica de fotoliberación para un
ligando monodentado piridina (py) y para un ligando bidentado bipiridina (bpy) en
complejos similares (Durham, 1982). Se puede observar que cuando el ligando es
bidentado, la eficiencia cuántica de fotoliberación en agua es cercana a cero, mientras
que para un ligando monodentado como la piridina es aproximadamente de 0,3, es decir,
30%. Esto indica, que los ligandos monodentados son liberados más fácilmente que los
ligandos polidentados.
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Tabla 1.2. Eficiencias cuánticas de fotoliberación de ligandos monodentados y ligandos
bidentados. En rojo se indican los valores correspondientes a las eficiencias cuánticas medidas
en agua a una longitud de onda de irradiación 436 nm. Ru(bpy)2(py)22+
libera piridina (py) y
Ru(bpy)32+
libera bipiridina (bpy).( Adaptado de Durham, 1982).
Como se mencionó previamente, una de las características principales de los
complejos de Ru-bipiridina es su capacidad de absorber energía en el rango de luz
visible. En la figura 1.4 se observa el espectro de barrido de absorción del complejo
[Ru(bpy)3]2+ en agua. La banda de absorción entre 400 y 500 nm corresponde a la banda
de transferencia de carga metal ligando (MLCT, por sus siglas en inglés).
Figura 1.4. Espectro de absorción del complejo [Ru(bpy)3]2+
en agua. En los ejes se representa
ε (absortividad molar) vs λ (longitud de onda).
Complejo medio φ φ φ φ (eficiencia cuántica)
Ru(bpy)2(py)22+ CHCl2 0,3
H2O 0,3
0,068
0,000021
CHCl2
H2O (0,1 M HCl)
Ru(bpy)32+
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En la figura 1.5 se muestra un diagrama de estados excitados para este tipo de
complejos. La banda MLCT representa la transferencia de un electrón en el estado
excitado desde el orbital πM (orbital pi del metal) al orbital π*L (orbital pi del ligando).
Desde éste estado, el electrón puede volver al estado basal de forma radiativa, no
radiativa o decaer a un estado de menor energía 3MLCT. Si la energía es suficiente,
desde el estado 3MLCT se puede poblar otro estado de mayor energía llamado d-d, en
donde la carga electrónica está centrada en el metal (MC), conduciéndose a la
disociación de los ligandos coordinados al mismo (Housecroft, 2nd Ed.). Esta
disociación se da principalmente porque esta transición implica la población de orbitales
no enlazantes.
A menor diferencia de energía (∆E) entre los estados 3MLCT y d-d mayor será
la probabilidad de que este último se pueble, y con ello mayor será la participación de
este en la relajación del estado excitado, produciendo la formación de fotoproductos
provenientes de la disociación del complejo. Las energías relativas de estos estados
dependen de la combinación de ligandos en la esfera de coordinación y de su capacidad
de modificar la densidad electrónica sobre el metal.
Figura 1.5. Diagrama de los estados excitados de baja energía de compuestos del tipo Ru-bipiridina. Las flechas verticales lisas y punteadas indican los decaimientos radiativos y no
ratiativos respectivamente de cada uno de los estados excitados.
∆EFOTOPRODUCTOS
Coordenada de reacción
Ene
rgía
1MLCT
3MLCT
d-d
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Los ligandos aceptores, reducen la densidad electrónica sobre el metal y
producen el corrimiento de la banda MLCT hacia longitudes de onda menores (mayor
energía), mientras que los ligandos donores corren la banda MLCT hacia longitudes de
onda mayores (menor energía). Un ejemplo de este comportamiento, se observa para la
familia de compuestos [Ru(bpy)2XY] donde Y=Cl- y X = trifenilfosfina o Cl-. La
trifenilfosfina (PPh3) es un ligando de características π-aceptor, el cual produce el
corrimiento de la banda hacia longitudes de onda menores comparado con el cloruro
que tiene características donoras, lo que provoca un corrimiento de la banda MLCT
hacia longitudes de onda mayores.
Finalmente la posición de la banda MLCT influye fuertemente en el potencial
redox de la cupla Ru3+/Ru2+ del complejo y en la eficiencia cuántica de fotoliberación
(Pinnik, 1984). Los ligandos más donores estabilizan el estado Ru3+ y por lo tanto bajan
el potencial de reducción de la cupla.
Debido a estas características que presentan los complejos de rutenio-bipiridina,
en donde según el tipo de ligando se puede modificar la posición de la banda MLCT y
su eficiencia cuántica, es que se los comenzó a utilizar como jaulas inorgánicas, para
permitir la liberación de un ligando con actividad biológica (Zayat, 2003; Zayat, 2006).
2.3 El neurotransmisor ácido γγγγ-amino butirico
El ácido γ-amino butírico (GABA) es el principal neurotransmisor inhibitorio del
sistema nervioso central en vertebrados adultos (Zhang, 2001). Es un derivado del ácido
glutámico que se origina por la descarboxilación del mismo mediante una reacción
enzimática catalizada por la enzima L- ácido glutámico descarboxilasa (GAD, por sus
siglas en ingles; Hong Jin, 2003).
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En las neuronas del sistema nervioso existen dos familias de receptores para este
ligando:
• RECEPTORES IONOTRÓPICOS: Canales de cloruro (Cl-). (GABAA y
GABAC).
• RECEPTORES METABOTRÓPICOS: Receptores acoplados a proteína G.
(GABAB).
Los receptores ionotrópicos son proteínas pentaméricas que forman canales
iónicos. En condiciones fisiológicas, GABA actúa generando un aumento de la
conductancia a Cl-. Esta corriente entrante hiperpolariza a las neuronas; llevando a la
membrana de la célula a voltajes más negativos. (Nota: En los párrafos referidos a
canales, el término “ligando” se utiliza en su acepción bioquímica. No se debe
confundir con el término “ligando” utilizado anteriormente en referencia a los
complejos de coordinación, situación en que existe un enlace mucho más fuerte.)
En particular los receptores GABAC representan una subclase de la familia de
receptores ionotrópicos, insensible a moduladores alostéricos como benzodiazepinas y
barbitúricos. Su localización incluye muchas regiones del cerebro como por ejemplo el
colículo superior, cerebelo, hipocampo y principalmente en neuronas de la retina. Se
caracterizan principalmente, por su alta sensibilidad a GABA ya que presentan una
concentración efectiva 50 (EC50) del orden de 1 µM. Se han descrito tres subunidades
constituyentes de éstos receptores (ρ1-3) las que podrían formar homómeros o
heterómeros (Zhang, 2001).
Se eligió GABA como molécula con actividad biológica dada su importancia
fisiológica. Principalmente porque los receptores GABAérgicos ionotrópicos son
modulados por fármacos de uso clínico como benzodiazepinas y barbitúricos. Estas
drogas son utilizadas en la clínica en síndromes como epilepsia y desórdenes de
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ansiedad. Además, debido a las características del ligando, la presencia de un grupo
amino (NH2) en el carbono γ permite su coordinación a iones de metales de transición,
por lo que se lo puede incorporar en complejos de Ru-bipiridina.
2.4 Complejos enjaulados de GABA
Hasta el momento, los complejos enjaulados de GABA obtenidos a partir de
jaulas orgánicas, siguen presentando como desventaja la necesidad de ser irradiados con
luz UV para poder liberar el enjaulado (Cürten, 2005; Gee, 1994).
En el laboratorio, se ha desarrollado, un complejo de GABA de base inorgánica,
a partir de jaulas de rutenio-bipiridina Ru(bpy)2(GABA)2 (Zayat, 2006), llamado a partir
de ahora bisGABA. Éste complejo tiene su máximo de absorbancia en 480 nm, lo cual
representa una gran ventaja, frente a los complejos comerciales, ya que permite la
fotoliberación de GABA irradiando con luz visible. Sin embargo, este complejo posee
una baja eficiencia cuántica de fotoliberación (Tabla 1.3).
Tabla 1.3. Distintos compuestos enjaulados de GABA presentes en la literatura.
Ru(bpy)2(GABA)2 (Zayat, 2006); BC204 (Cürten, 2005) ; O-CNB-GABA (Gee, 1994).
En la tabla 1.3 se listan las longitudes de onda de absorción (λabs), de irradiación
(λirrad) y la eficiencia cuántica de fotoliberación (φ) de varios complejos de GABA de
base orgánica comparados con Ru(bpy)2(GABA)2. La obtención de un compuesto
Compuesto λλλλ abs (nm) λλλλ irrad (nm) φφφφ eficiencia cuántica
BC204 17 348 300-400 0,4
O-CNB-GABA18 262 308 0,16
Ru(bpy)2(GABA)214 488 450 0,04
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enjaulado que libere GABA cuando se irradia con luz de baja energía, es un buen
antecedente para el desarrollo de nuevos compuestos enjaulados de GABA con mayor
eficiencia cuántica, en base a complejos de rutenio-bipiridina.
2.5 Biocompatibilidad de los complejos
Un punto importante a tener en cuenta en el desarrollo de dispositivos para
aplicación en sistemas biológicos es su biocompatibilidad, esto significa que el
compuesto utilizado debe interactuar lo menos posible con el sistema a estudiar.
Para poder monitorear éste efecto, uno de los abordajes a seguir es el análisis de
la capacidad que posee un compuestos para particionar en una mezcla 1:1 octanol agua.
La partición octanol agua (KOW) o su logaritmo (LogP) es la propiedad fisicoquímica
más utilizada y aceptada para predecir la interacción compuesto-membrana. Este
coeficiente puede tomar valores entre 10-3 y 107 y se considera relativamente
hidrofílico, si su KOW < 10 (Ikonen, 2009).
Por otro lado, es necesario probar su biocompatibilidad. Para ello se deben
realizar estudios de citotoxicidad. Éstos permiten determinar el porcentaje de viabilidad
luego de tratar el cultivo con una determinada concentración del compuesto en cuestión.
Los ensayos de citotoxicidad más utilizados son: el método de exclusión de Tripan blue
y el ensayo de MTT.
El MTT (Bromuro de 3(4,5 dimetil-2-tiazoil)-2,5- difeniltetazolico) es un
compuesto de coloración amarilla. Las células pueden internalizarlo y reducirlo
mediante la enzima succinato deshidrogenasa mitocondrial. El producto obtenido,
llamado formazan es insoluble y de color azul. La capacidad de las células para reducir
MTT a formazan es una medida de la viabilidad celular y un indicador de la integridad
mitocondrial. Por lo tanto, si se realiza el ensayo después de incubar con un compuesto
X, se permite evaluar la toxicidad del mismo (Jimenéz, 2007).
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Finalmente, para estudiar los posibles efectos de un compuesto sobre un cultivo
celular, se puede evaluar las variaciones morfológicas y comportamentales producidas
sobre el cultivo durante el tratamiento. Para evaluar esto, se puede utilizar microscopía
time lapse. Ésta técnica consiste en el monitoreo de un cultivo, mediante la toma de
fotos consecutivas del mismo. Los tiempos entre fotos pueden variar entre 1 segundo
hasta el tiempo que se desee. Luego, a partir del set de fotos y utilizando un sofware
adecuado, es posible analizar en tiempo real la evolución del ensayo en cultivo. De esta
manera se puede evaluar el comportamiento de un cultivo y sus distintos parámetros,
como por ejemplo, migración celular, variaciones en la morfología, adherencia, ciclo
celular, etc.
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3 HIPOTESIS Y OBJETIVOS
Resultados recientes de nuestro laboratorio indican que es posible la obtención
de complejos enjaulados de base inorgánica del tipo rutenio-bipiridina con excelentes
propiedades fisicoquímicas y biocompatibilidad.
Los complejos de Ru(bpy)2GABA2 obtenidos hasta el momento presentan una
baja eficiencia cuántica. La hipótesis principal de este trabajo es que el agregado de un
ligando monodentado con características π aceptoras como son las fosfinas producirá un
aumento en la eficiencia cuántica de fotoliberación, por el corrimiento de la banda
MLCT hacia regiones de mayor energía en el espectro de absorbancia. Por otra parte,
esta hipótesis principal sugiere que el uso de fosfinas como ligandos permitirá no solo
mejorar la eficiencia cuántica sino también, variando los sustituyentes, modificar la
lipofilicidad de los complejos y por lo tanto mejorar su biocompatibilidad, ya que
suponemos que al disminuir la lipofilicidad del complejo, disminuiremos su afinidad
por las membranas celulares mejorando mucho su compatibilidad con distintos cultivos
celulares.
El objetivo principal de éste trabajo es sintetizar un complejo enjaulado de GABA,
a partir de complejos de rutenio-bipiridina, que liberen al neurotransmisor con luz visible y
con una elevada eficiencia cuántica. Asimismo, se busca que el complejo obtenido no
resulte tóxico permitiendo ampliar su utilización a organismos vivos.
Los objetivos particulares implican probar el complejo en sistemas biológicos para
evaluar su funcionalidad, como también evaluar su toxicidad.
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4 MATERIALES Y MÉTODOS
4.1 Síntesis
Todos los reactivos comerciales fueron usados sin purificaciones adicionales. El
complejo precursor Ru(bpy)2Cl2 fue sintetizado de acuerdo a la literatura (Sullivan,
1978). Las fosfinas comerciales utilizadas fueron compradas en Aldrich. El resto de
disolventes y reactivos son de las marcas comerciales: Cicarelli, Aldrich y Fluka.
Todas las síntesis de los complejos salvo que se indique lo contrario fueron
realizadas sin controlar la atmosfera y fueron seguidas por espectroscopía UV-Visible.
4.1.1 Sulfonación de la trifenilfosfina (PPh3)
Na(m-TPPMS)
Se disolvieron 1,6 g de PPh3 en 6 mL de H2SO4/SO3 fumante. La mezcla se
calentó a 70 °C durante dos horas. Se detuvo la reacción enfriando la mezcla con hielo.
El ácido se tituló con 22 mL de NH4OH hasta pH=7, en este paso precipita la
trifenilfosfina que no reaccionó. Se filtró y el filtrado se llevó a seco en rotavap. El
sólido del fondo del balón fue redisuelto en etanol absoluto. Luego, se le agrego a la
disolución anterior 2 mL de solución saturada de NaCl y se dejó precipitar toda la noche
a 4 °C. Al día siguiente, se filtró y se llevó a seco en desecador.
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4.1.2 Cloro complejos
[RuB2(m-TPPMS)Cl]PF6
Se disolvieron 500 mg de Ru(bpy)2Cl2 en 30 mL de una mezcla 1:1 etanol agua
y se calentó en reflujo durante media hora hasta formar el [Ru(bpy)2(H2O)Cl]+. Luego,
se agregaron 400 mg de Na(m-TPPMS) sólido. Luego de 90 minutos, se agregó 1
equivalentes respecto al cloruro de AgNO3, se detuvo la reacción y el etanol de la
mezcla de reacción fue evaporado en rotavap. La solución acuosa obtenida se filtró para
remover cualquier sólido y el filtrado se precipitó por el agregado de exceso de KPF6 a
0°C en medio básico y en hielo.
[RuB2TPPTSCl]PF6
Se disolvieron 200 mg de Ru(bpy)2Cl2 en 12 mL de una mezcla 1:1 etanol agua
y se calentó en reflujo durante media hasta formar el [Ru(bpy)2(H2O)Cl]+. Luego, se
adicionaron 400 mg de sal de sodio de trifenilfosfina-3,3',3''-tris ácido sulfónico
(Aldrich, 63995-70-0) y 20 ml HCl. Luego de 90 minutos, se quitó del reflujo y se
llevó a seco en rotavap. El sólido se redisolvió en etanol absoluto. Se agregó exceso de
KPF6 y se dejo precipitar el complejo en frío durante toda la noche. Al día siguiente, la
solución fue filtrada y el sólido obtenido fue secado en desecador.
[RuB2PMe3Cl]PF6 (Salierno, 2009).
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Se disolvieron 520 mg de Ru(bpy)2Cl2 en 20 mL de una mezcla 1:1 metanol
agua y se calentó en reflujo durante media hora bajo atmósfera de N2, el control de la
atmosfera de nitrógeno es muy importante debido a la fuerte tendencia que presenta esta
fosfina para oxidarse. Se agregaron 1.2 mL de solución 1M trimetilfosfina en THF.
Luego de 90 minutos se detuvo la reacción, el metanol y el exceso de fosfina fueron
removidos en rotavap. La solución acuosa obtenida se filtró para remover cualquier
sólido y el filtrado se precipitó por agregado de exceso de una solución acuosa 0,5M
KPF6 a 0 °C. El sólido obtenido se secó en un desecador. Rendimiento: 93%.
A continuación se indican los desplazamientos químicos de las señales
correspondientes al espectro de Resonancia Magnética Nuclear. Entre paréntesis
aparecen la multiplicidad de la señal, el valor de la constante de acoplamiento (J), JH-H
indica el acoplamiento protón-protón, JH-P indica acoplamiento protón-fósforo y el
número de protones para los que integra respectivamente.
1H-NMR (500 MHz, D2O): δ = 1.07 (d, , 9H, JH-P = 8.8Hz); 7.10 (t, 1H, JH-H = 8Hz);
7.27 (t, 1H, JH-H = 8Hz); 7.51 (d, 1H, JH-H = 6Hz); 7.71 (t, 1H, JH-H = 8Hz); 7.75-7.82
(m, 2H); 7.86 (d, 1H, JH-H = 5Hz); 7.94 (t, 1H, JH-H = 8Hz); 8.12 (t, 1H, JH-H = 8Hz);
8.19 (t, 1H, JH-H = 8Hz); 8.29 (d, 1H, JH-H = 7.5Hz); 8.42-8.53 (m, 3H); 9.19 (d, 1H, JH-
H = 5Hz); 9.45 (d, 1H, JH-H = 5Hz) ppm.
[RuB2PPhMe2Cl]PF6
Se disolvieron 800 mg de Ru(bpy)2Cl2 en 10 mL de una mezcla 1:1 etanol agua
y se calentó en reflujo durante 30 minutos en atmosfera de N2. Luego se agregaron 1.3
equivalentes respecto al complejo de cloro de una solución de PPhMe2 en THF. La
mezcla se calentó en reflujo durante 120 minutos. Luego se detuvo la reacción quitando
20
del reflujo y la fosfina remanente y los restos de etanol fueron evaporados en rotavap.
La solución acuosa obtenida se filtró para remover cualquier sólido que no haya
reaccionado y el filtrado se precipitó por exceso de una solución acuosa de KPF6 0,5 M.
El sólido obtenido se secó en desecador.
A continuación se indican los desplazamientos químicos de las señales
correspondientes al espectro de Resonancia Magnética Nuclear. Entre paréntesis
aparecen la multiplicidad de la señal, el valor de la constante de acoplamiento (J), JH-H
indica el acoplamiento protón-protón, JH-P indica acoplamiento protón-fósforo y el
número de protones para los que integra respectivamente.
δH (500 MHz; C3D6O) 1.63 (d, 6H, JH-P=8.69), 7.14 (m, 4H), 7.24 (m, 2H), 7.39 (t, 1H,
JH-H=6.53), 7.47 (d, 1H, JH-H=4.09), 7.57 (t, 1H, JH-H=6.99), 7.75 (t, 1H, JH-H=7.08),
7.92 (t, 1H, JH-H=7.62), 8.05 (t, 2H, JH-H=8.16), 8.13 (t, 1H, JH-H=7.55), 8.19 (t, 1H, JH-
H=7.08), 8.51 (d,1H, JH-H=8.03), 8.56 (d, 1H, JH-H=8.03), 8.63 (d, 1H, JH-H=8.03), 8.68
(d, 1H, JH-H=7.55), 9.38 (d, 1H, JH-H=5.75), 9.46 (d, 1H, JH-H=5.7).
[RuB2PPh2MeCl]PF6
Se disolvieron 1,5 g de Ru(bpy)2Cl2 en 20 ml de una mezcla 1:1 etanol agua.
Luego se calentó en reflujo durante 30 minutos con atmosfera de N2. A la mezcla, se
agregaron 1.3 equivalentes de una solucion de PPh2Me en THF. La reacción se mantuvo
durante 120 minutos en reflujo. Luego se detuvo la reacción quitando del reflujo y la
fosfina remanente y los restos de etanol fueron evaporados en rotavap. La solución
acuosa obtenida se filtró para remover cualquier sólido que no haya reaccionado y el
filtrado fue precipitado por agregado de exceso de una solución acuosa de KPF6 a 0 °C.
El sólido obtenido se secó en un desecador.
21
A continuación se indican los desplazamientos químicos de las señales
correspondientes al espectro de Resonancia Magnética Nuclear, entre paréntesis
aparecen la multiplicidad de la señal, el valor de la constante de acoplamiento (J), JH-H
indica el acoplamiento protón-protón, JH-P indica acoplamiento protón-fósforo y el
número de protones para los que integra respectivamente.
δH (500 MHz; C3D6O) 1.65 (d, 3H, JH-P=8.20), 7.26 (t, 2H, JH-H=7.5), 7.5 (m,
10H), 7.83 (t,1H, JH-H=6.79), 8.01 (d, 1H, JH-H=6.41), 8.08 (t, 2H, JH-H=8.12), 8.16 (t,
2H, JH-H=7.9), 8.24 (t, 1H, JH-H=7.69), 8.31 (d, 1H, JH-H=7.69), 8.49 (d,1H, JH-H=8.12),
8.67 (d, 1H, JH-H=8.0), 8.71 (d, 1H, JH-H=7.69), 8.85 (d, 1H, JH-H=7.69), 9.09 (d, 1H,
JH-H=5.13), 9.49 (d, 1H, JH-H=5.55).
[Ru(bpy)2PPh3Cl]Cl
Se disolvieron 680 mg de Ru(bpy)2Cl2 en 45 mL de metanol. Se agregaron 410
mg de trifenilfosfina en agitación. Luego se adicionaron 20 mL de agua y la mezcla se
calentó a reflujo por 120 minutos. Una vez finalizada la reacción se quitó de reflujo y se
llevó a seco en rotavap. El sólido se disolvió en 50 mL de acetona. Este procedimento
provocó la disolución del producto [Ru(bpy)2PPh3Cl]+. Luego se mantuvo over night en
la heladera donde se produce la precipitación de [Ru(bpy)2PPh3Cl]Cl. El sólido
obtenido fue lavado con tres porciones de acetona y una de éter etílico y secado.
A continuación se indican los desplazamientos químicos de las señales
correspondientes al espectro de Resonancia Magnética Nuclear, entre paréntesis
aparecen la multiplicidad de la señal y el número de protones para los que integra
respectivamente.
22
δH (500 MHz; D2O) 6.84 (t, 1H), 7.19 (m, 6H), 7.24 (t, 1H), 7.25 (d, 1H), 7.29 (d, 1H),
7.31 (m, 3H), 7.33 (t, 1H), 7.39 (m, 6H), 7.43 (t, 1H), 7.73 (t, 1H), 7.99 (t, 1H), 8.12
(t,1H), 8.35 (d, 1H), 8.45 (d, 1H), 8.56 (d, 1H), 8.62 (d, 1H), 9.22 (dd, 2H).
4.1.3 Complejos de GABA
[RuB2(TPPTS)GABA]PF6
Se disolvieron 100 mg de [Ru(bpy)2(TPPTS)Cl]Cl en 10 mL de agua. La
mezcla, se calentó a 80°C durante 30 minutos. Luego se agregaron 60 mg de GABA en
13 ml de NaOH 1M, de manera que el pH de la mezcla este entre 10,5 y 11. Se calentó a
80 °C durante 90 minutos. La reacción se detuvo en hielo. Para precipitar las impurezas
se agregan 2 ml de una solución de KPF6 0,5 M a 0 °C. Se filtró y se lavó con agua
helada varias veces. Luego para la precipitación del complejo se agregaron 10 ml de la
solución de KPF6 y se llevo a pH= 2 con HCl. El sólido se dejó precipitar en heladera
toda la noche. Luego el sólido envuelto en papel aluminio, para proteger de la luz, fue
llevado a seco en desecador. Para una mayor pureza y eliminar el GABA libre se
purifica por columna de intercambio aniónico DEAE-Sephadex A-25 cargada con Cl- a
pH 9.
[RuB2PMe3GABA]PF6
Este complejo fue sintetizado previamente en el laboratorio por el Dr. Roberto
Etchenique.
23
Se disolvieron 100 mg de [Ru(bpy)2PMe3Cl]PF6 en 10 mL de una mezcla
acetona agua para intercambiar el ión con resina DOWEX-Cl. Se dejó evaporar la
acetona mientra se cambia el ión. Luego de realizar el cambio del contraión a cloruro, se
filtró la resina obteniendo una solución acuosa. Se calentó a 80°C la disolución acuosa
de [Ru(bpy)2PMe3Cl]Cl durante 30 minutos hasta obtener [Ru(bpy)2PMe3H2O]2+.
Luego se agregaron 100 mg de GABA en 6 mL de disolución de NaOH 1M. La mezcla
fue calentada a 80 °C durante 90 minutos. Las impurezas fueron precipitadas con 0.8
mL de KPF6 1M a 0 °C. Se filtró para eliminar lo insoluble. A la solución remanente, se
le agregó HCl 1M gota a gota en frio, hasta que comenzó a precipitar un sólido naranja.
Luego se filtró y se llevó el sólido, envuelto en papel aluminio, a seco en desecador.
Para una mayor pureza se purifica por columna de intercambio anionico DEAE-
Sephadex A-25 cargada con cloruro a pH 9.
A continuación se indican los desplazamientos químicos de las señales
correspondientes al espectro de Resonancia Magnética Nuclear, entre paréntesis
aparecen la multiplicidad de la señal, el valor de la constante de acoplamiento (J), JH-H
indica el acoplamiento protón-protón, JH-P indica acoplamiento protón-fósforo y el
número de protones para los que integra respectivamente.
δH (500 MHz; D2O) 1.08 (d, 9H, JH-P=8.55), 1.54 (m, 2H), 1.67 (m, 1H), 1.93 (m, 1H),
2.03 (m, 2H),3.58 (t ,1H, JH-H=11.54), 3.89 (t, 1H, JH-H=11.54), 7.12 (t, 1H, JH-H=6),
7.28 (t, 1H, JH-H=6.41), 7.49 (d, 1H, JH-H=5.56), 7.55 (d, 1H, JH-H=5.56), 7.73 (t, 1H,
JH-H=6),7.79 (t,1H, JH-H=6), 7.81 (t, 1H, JH-H=7.69), 7.97 (t, 1H, JH-H=7.69), 8.17 (t,
1H, JH-H=7.69), 8.22 (t, 1H, JH-H=7.69), 8.28 (d, 1H, JH-H=7.69), 8.42 (d,1H, JH-
H=7.69), 8.48 (d, 1H, JH-H=8.12), 8.53 (d, 1H, JH-H=8.12), 8.91 (d, 1H, JH-H=5.56), 9.10
(d, 1H, JH-H=5.56).
24
[RuB2PPhMe2GABA]PF6
Se disolvieron 100 mg de [Ru(bpy)2PPhMe2Cl]PF6 en 10 ml una mezcla acetona
agua para intercambiar el ión con resina DOWEX-Cl. Se dejó evaporar la acetona
mientra se cambió el ión. Luego de realizar el cambio del contraión a cloruro, se filtró la
resina obteniendo una solución acuosa. Se calentó a 80 °C durante 30 minutos la
solución de [Ru(bpy)2PPhMe2Cl]Cl hasta obtener [Ru(bpy)2PPhMe2H2O]2+. Luego se
agregaron 100 mg de GABA en 6 mL de solución de NaOH 1M, de manera que el pH
de la solución final oscile alrededor de 10,3 y 11. La mezcla se calentó durante 90
minutos a 80 °C. Una vez finalizada la reacción, se precipitaron las impurezas con 0.8
mL de KPF6 1M a 0 °C, se filtró y se eliminó la fracción insoluble. Luego se agregó a la
solución HCl 1M gota a gota en frio, hasta que comenzó a precipitar un sólido naranja.
Se filtró y se secó el sólido, envuelto en papel aluminio, para proteger de la luz. Para
una mayor pureza se purifica por columna de intercambio aniónico DEAE-Sephadex A-
25 cargada con cloruro a pH 9.
A continuación se indican los desplazamientos químicos de las señales
correspondientes al espectro de Resonancia Magnética Nuclear, entre paréntesis
aparecen la multiplicidad de la señal, el valor de la constante de acoplamiento (J), JH-H
indica el acoplamiento protón-protón, JH-P indica acoplamiento protón-fósforo y el
número de protones para los que integra respectivamente.
δH (500 MHz; C3D6O) 1.07 (d, 6H, JH-P=8.55), 1.58 (m, 2H), 1.60 (m, 1H), 1.98 (m,
1H), 2.04 (m, 2H), 3.59 (t ,1H, JH-H=11.54), 3.92 (t, 1H, JH-H=11.54), 6.68 (t, 2H, JH-
H=7.82), 6.99 (m, 3H), 7.14 (m, 2H), 7.29 (d, 1H, JH-H=5.87),7.35 (d,1H, JH-H=5.87),
7.53 (t, 1H, JH-H=7.34), 7.64 (t, 1H, JH-H=7.34), 7.7 (t, 1H, JH-H=6.36), 7.85 (t, 1H, JH-
25
H=7.82), 7.93 (t, 1H, JH-H=7.82), 8.02 (d,1H, JH-H=8.31), 8.07 (d, 1H, JH-H=7.82), 8.09
(d, 1H, JH-H=7.82), 8.30 (d, 1H, JH-H=8.31), 8.43 (d, 1H, JH-H=7.82), 8.69 (d, 1H, JH-
H=5.38), 9.11 (d, 1H, JH-H=5.38).
[RuB2PPh2MeGABA]PF6
Se disolvieron 100 mg de [Ru(bpy)2PPh2MeCl]PF6 en 10 mL de acetona para
intercambiar el ión con resina DOWEX-Cl. Se calentó durante 30 minutos a 80 °C la
solución acuosa de [Ru(bpy)2PPh2MeCl]Cl hasta obtener [Ru(bpy)2PPh2MeH2O]2+.
Luego se agregaron 100 mg de GABA en 6 mL de disolución de NaOH 1M, de manera
que el pH final de la mezcla oscile entre 10,3 y 11. Luego se calentó 90 minutos a 80
°C. Se precipitaron las impurezas con 0.8 mL de KPF6 1M a 0 °C, se filtró y se elimino
la fracción insoluble. Se agregó a la solución HCl 1M gota a gota en frio, hasta que
comenzó a precipitar un sólido naranja. Finalmente, se filtró y se llevó el sólido,
envuelto en papel aluminio, a seco. Para una mayor pureza se purifica por columna de
intercambio aniónico DEAE-Sephadex A-25 cargada con cloruro a pH 9
[RuB2PPh3GABA]PF6
Se disolvieron 110 mg de [Ru(bpy)2PPh3Cl]Cl en 10 mL de agua. La mezcla se
calentó a 80°C durante 30 minutos hasta obtener [Ru(bpy)2PPh3H2O]2+. Luego se
agregaron 455 mg de GABA en 4.4 mL de solución de NaOH 1M, de manera que el pH
de la mezcla final oscile entre 10,3 y 11. Se calentó durante 90 minutos a 30 °C. El
complejo se precipitó con 0.8 mL de KPF6 1M a 0 °C, se filtró y se lavó con agua
helada varias veces. El sólido fue llevado, envuelto en papel aluminio para proteger de
26
la luz, a seco. Para una mayor pureza se purifica por columna de filtración cargada con
DEAE-Sephadex A-25 a pH 9. A continuación se indican los desplazamientos químicos
de las señales correspondientes al espectro de Resonancia Magnética Nuclear, entre
paréntesis aparecen la multiplicidad de la señal, el valor de la constante de acoplamiento
(J) y el número de protones para los que integra respectivamente.
δH (500 MHz; D2O)1.33 (m, 1H),1.43 (m, 1H), 1.49 (m, 1H), 1.78 (t, 2H), 1.82 (m, 1H),
3.16 (t, 1H), 3.55 (t, 1H), 7.15 (t,1H), 7.21 (m, 6H), 7.27 (t, 1H), 7.33 (m, 6J), 7.37 (t,
1H), 7.42 (d, 1H), 7.49 (m, 3H),7.6 (t, 1H), 7.85 (t, 1H), 7.9 (d, 1H), 8.01 (t, 1H), 8.02
(d, 1H), 8.13 (d, 1H), 8.22 (t,1H), 8.52 (d, 1H), 8.62 (d, 1H), 8.71 (d, 1H), 9.14 (d, 1H).
Las formaciones de los acuo-complejos como todas las síntesis aquí descriptas
fueron seguidas por espectroscopía UV-Vis.
4.2 Caracterización química: UV-visible (UV-Vis), fotólisis, Resonancia
Magnética Nuclear (RMN) , voltametría cíclica y partición octanol-agua.
Descripción de las técnicas utilizadas para la caracterizaciín química de los
complejos sintetizados.
4.2.1 UV-Vis y fotólisis
Los espectros de UV-Vis fueron obtenidos con un espectrofotómetro de arreglo
de diodos HP8453 (HewlettPackard).
27
Para determinar la eficiencia cuántica de fotodisociación, se midieron espectros
a diferentes tiempos de irradiación en solución acuosa, utilizando una cubeta de cuarzo.
Las irradiaciones fueron hechas con un LED LXHLLR3C a 455 nm (Luxeon Star
LEDs), tomadas cada 10 segundos de irradiación en agitación continua. La potencia de
la luz fue medida en una fotólisis patrón usando una solución de [Ru(bpy)2(py)2]2+
como referencia y considerando una eficiencia cuántica de fotosustitución de 0.26
(Pinnik, 1984). A partir de los espectros de absorción entre 300 y 700 nm, y conociendo
los espectros de las especies inicial y final, se obtuvo el grado de avance de la
fotorreacción para cada tiempo de irradiacion. Para los cálculos de la eficiencia cuántica
se utilizó una hoja de datos (ad-hoc).
4.2.2 Resonancia Magnética Nuclear
Los espectros de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) se obtuvieron con
equipos Bruker Avance II 500. Para el análisis de los espectros se utilizó el software
MestreC 4.8.6.0.
4.2.3 Voltametría Cíclica
Los voltagramas se realizaron en acetonitrilo (CH3CN) agregando 0.1M de sal
de hexafluorofosfato de tetrabutilamonio (TBAPF6) como electrolito soporte. Se utilizó
un potenciostato de tres electrodos basado en un amplificador operacional TL071 en
configuración corriente-voltaje y un software teq3. Como electrodo de trabajo se utilizó
un electrodo de carbono vítreo. Como electrodo de referencia se utilizó un alambre de
28
Ag/AgCl y como contraelectrodo se utilizó un electrodo de platino. Los voltagramas
fueron todos referenciados al electrodo normal de hidrógeno (NHE).
4.2.1 Partición octanol-agua
Se prepararon disoluciones de los complejos entre 20 y 50 mM en PBS, de las
cuales se tomó 1 mL y se les agregó a 1 mL de n-octanol. Se mezclaron las fases por
agitación durante varios minutos y se dejó que la mezcla llegue al equilibrio. Luego de
60 minutos se centrifugó y se midió la absorbancia de cada una de las fases.
El coeficiente de partición (KOW) se obtuvo de dividir las absorbancias obtenidas
en la fase orgánica y la fase acuosa.
4.3 Set up Time-Lapse
Para los ensayos de seguimiento celular mediante microscopía Time-Lapse, se
utilizó un set up construido ad hoc en el laboratorio y se siguió el método descripto por
el Dr. Marcelo Salierno (Salierno, 2007; Salierno, 2009).
Se partió de células crecidas al 70 % de confluencia en cápsulas de pretri de 35
mm marca corning. Esta cápsula se colocó en el set up. Este set up consiste en un
sistema semi-abierto que mantiene constante la humedad, pH y osmolaridad, y por otro
lado permite, la entrada de una micropipeta para el agregado de una droga.
29
Figura 4.1. Corte transversal del sistema encapsulado, y la micropipeta por donde se
dosifican las drogas. La posición de la micropipeta es regulada por un micromanipulador.
(Tomado de Salierno, 2009).
Previo a los ensayos se procedió a realizar un seguimiento durante 60 minutos
como control, en donde solo fue dosificado medio de cultivo sin droga. Los distintos
experimentos fueron realizados luego de controlar el comportamiento normal del
cultivo.
4.4 Cultivos Celulares
Para los ensayos de citotoxicidad y los ensayos de viabilidad celular frente a la
incubación con los distintos complejos enjaulados, se utilizó la línea celular de hámster
Baby Hamster Kidney (BHK-21) provista por integrantes del grupo del Dr. Eduardo
Canepa.
4.4.1 Mantenimiento de la línea celular
Las células fueron crecidas en DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)
10% suero fetal bovino, 2 mM de glutamina y 1 mM de piruvato de sodio. Además se
les agregó al medio 100 µg/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina y 250
30
ng/mL de anfotericina B. Estás células fueron mantenidas en estufas a 37 °C con
suministro de 5% de carbógeno.
4.5 Ensayo de toxicidad MTT
4.5.1 Preparación del material
Se plaquearon 4 placas de ELISA con 3.104 células BHK/pocillo con medio de
cultivo DMEM. Las placas se mantuvieron en estufa a 37 °C con suministro de
carbógeno durante 24 horas.
4.5.2 Desarrollo experimental
En el momento de realizar el experimento, se retiró el medio de cultivo de cada
pocillo y se agregó en su lugar 200 µl de las soluciones seriadas 1 mM, 500 µM, 100
µM y 10 µM de cada uno de los siguientes complejos: [RuB2PMe3Cl]PF6,
[RuB2PPhMe2Cl]PF6, [RuB2PPh2MeCl]PF6 y [RuB2PPh3Cl]PF6, diluidos a partir de
soluciones madre de 5 mM en DMEM. Las disoluciones madre fueron obtenidas a partir
de la disolución de los sólidos en PBS (Buffer fosfato de sodio). Los tiempos de
incubación fueron 30 o 90 minutos. Se realizaron 3 controles experimentales:
incubación con DMEM solo en presencia y ausencia de MTT, con PBS solo en
presencia de MTT. Cada uno de los tratamientos fue realizado por octuplicado.
4.5.3 Método de MTT
31
Se partió de una solución madre 5 mg/ml de MTT (Invitrogen) disuelta en H2O
destilada, la cual fue diluida al décimo con medio de cultivo. A partir de ésta solución
0.5 mg/ml se realizó el ensayo. Se procedió a sacar de cada posillo el medio de cultivo,
se lavó con PBS y se agregó 200 µl de la solución anterior. Se dejó incubar durante 2
horas. Se quitó el MTT, se lavó con PBS y finalmente se procedió a resuspender el
colorante con Etanol 96°. Se dejó en oscuridad durante 15 minutos y se leyó la
absorbancia de cada placa en un lector de ELISA Sensident Scan, Merck a 590 nm.
4.5.4 Análisis estadístico
A los resultados obtenidos se les realizó un ANOVA de un factor seguida de un
test de Tukey, utilizando el software GraphPad Prism.
4.6 Experimento con ovocitos de Xenopus laevis.
Es importante aclarar que la preparación de los ovocitos y el manejo del set up
de electrofisiología fue realizado por integrantes del grupo del Dr Daniel Calvo.
4.6.1 Preparación del material
Se expresaron heterólogamente receptores homoméricos GABAc ρ1 en ovocitos
de ranas de la especie Xenopus laevis. Los animales se anestesiaron utilizando MS-222
al 1%, los ovarios se aislaron quirúrgicamente y los ovocitos se separaron manualmente
con forceps. El ARNm codificante para las subunidades ρ1 del receptor de GABAC se
sintetizó in vitro utilizando un kit de transcripción (Ambion message-machine T7). El
ARNm se inyectó en los ovocitos con un microinyector manual (Drummond) montado
32
en un micromanipulador. A las 24hs se trataron las células con 0.5 mg/ml colagenasa
(en 96mM NaCl, 2mM KCl, 5mM HEPES,1.8mM MgCl2, pH 7.5). Después de tres
días de incubación a 17°C los ovocitos se colocaron en una cámara de superfusión
continua (10ml / min) en solución normal de Ringer para rana: 115mM NaCl, 2mM
KCl, 1.8mM CaCl2, 1,8mM MgCl2, 5mM HEPES, pH 7.0.
4.6.2 Electrofisiología
Los registros electrofisiológicos se llevaron a cabo utilizando la técnica de
fijación de voltaje con dos electrodos (amplificador Axoclamp 2B) y se adquirieron con
el programa pClamp (Axon Instruments). El potencial de membrana de los ovocitos se
fijó en -70mV.
El estudio de la respuesta al GABA se examinó mediante el agregado de una
solución de complejo enjaulado de GABA (disueltos en DMSO) de manera de obtener
una concentración final de 30 µM. La liberación del GABA enjaulado se hizo
irradiando con flashes de luz blanca directamente sobre el baño. Los datos fueron
almacenados en una computadora y analizados con el Origin Lab 8.0.
33
5 RESULTADOS
5.1 Síntesis, caracterización, estudio de toxicidad y estudiosfuncionales en ovocitos de Xenopus laevis del complejo[Ru(bpy)2PPh3GABA]+.
Para poder cumplir este objetivo, se eligió trabajar con complejos de rutenio-
bipiridina de la forma [Ru(bpy)2XY]n+ donde X representa a la trifenilfosfina (ligando
monodentado) e Y representa la posición ocupada por el GABA. Se eligió modificar el
complejo y trabajar con trifenilfosfina (PPh3) principalmente porque éste ligando
presenta un elevado carácter π-aceptor y por lo tanto por teoría se espera que el uso de
este tipo de ligando lleve a un aumento en la eficiencia cuántica de liberación de los
complejos, con respecto a lo observado en los complejos de bisGABA.
5.1.1 [Ru(bpy)2PPh3Cl]Cl (cloro-complejo a partir de trifenilfosfina)
Como primer paso, se sintetizó el complejo de rutenio-bipiridina
[Ru(bpy)2XY]n+, en donde X= PPh3 e Y=Cl. Como todos los ligandos aceptores, la
trifenilfosfina reduce la densidad electrónica sobre el metal provocando el corrimiento
de la banda MLCT hacia longitudes de onda de mayor energía..
La síntesis se realizó según lo indicado en materiales y métodos y la identidad
del complejo se verifico mediante 1H-RMN.
La tabla 5.1 lista los resultados obtenidos en la caracterización del complejo.
Tabla 5.1 Valores correspondientes a la caracterización química del complejo. Las medidas
fueron realizadas a 298 ºK.
17
Compuesto λλλλ abs (nm) E1/2 (Volts)
[Ru(bpy)2PPh3Cl]+ 456 1,24
ε ε ε ε (M-1 cm-1)
6200
KOW
34
En la tabla se observan los valores correspondientes al máximo de absorción del
complejo (máximo MLCT) y la absortividad molar, medidas en agua, el potencial redox
de la cupla Ru3+/Ru2+ medido en acetonitrilo y el coeficiente de partición octanol agua.
La partición de un compuesto entre dos fases puede verse afectada por distintos
factores como la concentración de sales en la fase acuosa, la temperatura, etc. Los
complejos enjualados se utilizan en medios biológicos como soluciones buffer con
elevada concentración de sales, por lo tanto, resulta necesario probar si hay efecto de la
fuerza iónica en la partición octanol agua. Para ello se analizó la partición octanol-PBS,
octanol-RINGER y octanol-agua destilada. Los resultados mostraron diferencias entre
los coeficientes obtenidos para agua destilada y los de soluciones salinas. Los
coeficientes obtenidos para soluciones salinas resultaron menores. Por lo tanto, debido a
esta observación y a las características de los medios biológicos todos los KOW
presentados en este trabajo fueron medidos en PBS.
5.1.2 [Ru(bpy)2PPh3GABA]+(complejo de GABA)
A partir del compuesto precursor [Ru(bpy)2PPh3Cl]+, se prosiguió con la síntesis
del complejo de GABA. El compuesto obtenido fue analizado por 1H-RMN.
La figura 5.1 muestra el espectro de resonancia magnética nuclear obtenido para
el [Ru(bpy)2PPh3GABA]+ en agua deuterada (D2O).
Se muestran dos secciones del espectro de 1H RMN, una correspondiente a la
región aromática (10-6 ppm) (figura 5.1 a) y otra correspondiente a la región alifática
(0- 6 ppm) (figura 5.1 b).
En la región aromática se observan las señales correspondientes a los protones
de las bipiridinas y a los de la trifenilfosfina. Se pueden ver 16 señales correspondientes
a los protones de las bipiridinas. Como en el complejo hay dos bipiridinas idénticas se
35
espera obtener 8 señales que integren para dos protones cada una. Esto no sucede
debido a que la trifenilfosfina como quinto ligando rompe la simetría del complejo y
permite la diferenciación de las bipiridinas.
La figura 5.1.b, muestra la región alifática del espectro, donde se observan las
señales de los protones correspondientes al GABA coordinado. Las señales A marcadas
en la figura son las producidas por los protones del grupo amino de la molécula y son
las que permiten identificar al GABA coordinado. Esto se debe a que cuando el GABA
no se halla coordinado, hay un continuo intercambio con el solvente deuterado y por lo
tanto, los protones del mismo no son detectados en el espectro.
36
Figura 5.1. Espectro de Resonancia Magnética Nuclear de [Ru(bpy)2PPh3GABA]+
en D2O.
a .Región aromática del espectro (rosa). b. Región alifática del espectro (azul).
Para determinar la eficiencia cuántica en solución acuosa, se realizaron una serie
de registros, a distintos tiempos, de espectros de absorción luego de la irradiación con
un LED a 450 nm. En las figuras 5.2.a y b se observan los de espectros de absorción del
9,0 8,5 8,0 7,5 7,0
dd
d d
d
d t
t2t
d
d-t
3t
señales de la fosfina (integran para 15
protones)
señales de las bipiridinas(integran para 16 protones)
a
3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0Desplazamiento quimico (ppm)
A A
C C´
3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0Desplazamiento quimico (ppm)
D
B
3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0Desplazamiento quimico (ppm)
A A
C C´
3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0Desplazamiento quimico (ppm)
D
Bb
37
complejo obtenidos durante el proceso de fotólisis a dos valores de pH (pH=7 y
pH=12). En ambos casos se identificaron puntos isosbésticos, los cuales indican la
presencia de solo dos especies durante la fotolisis. La medición a pH=12 se realizó para
poder identificar de forma clara las dos especies que se forman, puesto que los
complejos de GABA y de acuo a pH fisiológico presentan espectros de absorción muy
similares.
Figura 5.2. Fotólisis del complejo [Ru(bpy)2PPh3GABA]+ . En los detalles de las figuras se
muestra como disminuye la banda de absorción del complejo con GABA y aumenta la del acuo-
complejo. Las flechas negras indican la variación de los espectros a lo largo de la fotólisis.
300 400 500 600 700
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Abso
rba
ncia
λ (nm)
a
b
300 400 500 600 700
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Ab
sorb
an
cia
λ (nm)
b
aa
b
300 400 500 600 700
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Ab
sorb
an
cia
λ (nm)
b
a
38
En la tabla 5.2 se detallan los valores correspondientes al máximo de
absorbancia (λmax), la absortividad molar (ε), la eficiencia cuántica (φ) medida a dos
valores de pH distintos y el coeficiente de partición octanol agua (KOW) del complejo de
GABA. Se observa que el máximo de absorción del complejo se halla en 424 nm,
correspondiendo a longitudes de onda dentro del rango de luz visible. El complejo
presentó una eficiencia cuántica de fotoliberación en agua, a pH fisiológico, del 48 %.
Por otra parte, el complejo de GABA presentó un coeficiente de partición
octanol agua un orden de magnitud menor que el obtenido para su complejo precursor
(el complejo [Ru(bpy)2PPh3Cl]+), indicando que este último sería la especie más
hidrofóbica.
Tabla 5.2 Caracterización química de [Ru(bpy)2PPh3GABA]+. La fotoliberación se efectuó
irradiando con un Led de 450 nm. Todas las mediciones se realizaron a 298 K.
En este trabajo, además, se determinaron los potenciales redox de los complejos
empleando la voltametría cíclica. Esta técnica consiste en aplicar un barrido de
potencial directo e inverso a un electrodo de trabajo y analizar la variación de corriente.
En presencia de un proceso redox reversible (es decir si el proceso redox es rápido y no
hay reacciones químicas acopladas) se observan dos ondas, una para cada barrido cuyos
máximos distan 59 mV. Usualmente se informa el potencial medio (E1/2) que es el
promedio de los dos potenciales con corriente máxima denominados potencial de pico
(Ep). Este potencial es cercano al potencial estándar (E°) de la cupla redox. En cambio,
si el proceso es irreversible se observan dos picos separados o frecuentemente solo una
onda por lo que sólo se informa el Ep.
Compuesto λλλλ abs (nm) φφφφ (pH=7)
[Ru(bpy)2PPh3GABA]+ 424 0,48
ε ε ε ε (M-1 cm-1)
6400
KOW
0,26
φφφφ (pH=12)
0,42
Compuesto λλλλ abs (nm) φφφφ (pH=7)
[Ru(bpy)2PPh3GABA]+ 424 0,48
ε ε ε ε (M-1 cm-1)
6400
KOW
0,26
φφφφ (pH=12)
0,42
39
En la tabla 5.3 se listan los potenciales redox obtenidos para el complejo de
GABA. Se identificaron tres potenciales. El primer pico de oxidación corresponde a la
oxidación del rutenio coordinado al GABA, mientras que los otros dos picos se
atribuyen a compuestos que contienen los productos de la oxidación de la unión N-C en
el grupo amino.
El valor de estos potenciales es característico para cada complejo.
Tabla 5.3 Potenciales redox del complejo [Ru(bpy)2PPh3GABA]+. Fueron realizados en
acetonitrilo y con TBAPF6 0,1 M como electrolito soporte. Medida realizada a 298 K y
referenciada a NHE. Los barridos de potencial fueron realizados desde 800 hasta 2200 mV.
E1/2 representa al potencial de media onda. Ep representa al potencial de pico.
Compuesto
[Ru(bpy)2PPh3GABA]+ 1,721,23
Ep(Volts) E1/2 (Volts) Ep (Volts)
1,87
40
5.1.3 Prueba de funcionalidad del complejo: Experimento en ovocitos de Xenopus
laevis.
Se realizaron los estudios de funcionalidad del complejo de GABA utilizando el
sistema de expresión heteróloga de ovocitos de Xenopus laevis; expresando receptores
de GABAc recombinantes de retina humana.
Estos estudios consistieron en mediciones de corrientes de Cl- utilizando la
técnica de Fijación de Voltaje con dos electrodos, luego de fotoliberar el complejo de
GABA. El potencial de membrana fue fijado en -70 mV. El set up de electrofisiología y
los ovocitos de Xenopus fueron provistos por el laboratorio de Daniel Calvo en el
INGEBI y el equipo fue operado por la Licenciada Cecilia Calero.
En la figura 5.3.a se muestra la respuesta control de receptores GABAc ρ1 en
presencia de GABA. La aplicación de concentraciones crecientes de GABA sobre estos
receptores evocó corrientes de cloruro entrantes. Dichas respuestas se incrementaron a
medida que se aumentó la concentración de GABA.
Es importante destacar, que debido a las concentraciones de cloro en el ovocito
el potencial de equilibrio para el mismo se halla cercano a 0 mV y por lo tanto cuando
se trata con GABA se observan corrientes entrantes.
La respuesta de los receptores GABAc ρ1 se caracteriza por poseer una cinética
lenta que no desensibiliza con la aplicación constante del agonista. Esta característica
permitió realizar curvas dosis-respuesta sin lavados intermedios. En la figura 5.3.a, se
pueden observar las respuestas escalonadas evocadas por concentraciones crecientes de
GABA.
41
Figura 5.3 Experimento de Fijación de Voltaje con dos electrodos en ovocitos de Xenopus
laevis que expresan receptores GABAc ρρρρ1. a. Curva dosis-respuesta control para GABA libre.
Se aplicaron concentraciones crecientes de neurotransmisor. b. Experimento con una solución
de 30 µM del complejo [Ru(bpy)2PPh3GABA]+
en Ringer irradiando con flashes.
Los trazos azules y rosas representan corrientes de Cl- mediadas por los receptores evocadas
por el GABA libre o el GABA liberado por luz.
50 mseg
flash
flashflash
flash
flashflash
flash
flash
lavado lavado lavadoflash
100 nA
50 mseg
flash
flashflash
flash
flashflash
flash
flash
lavado lavado lavadoflash
100 nA
50 mseg
100 nA
0,3 µM
1 µM
10 µM
30 µM
a
b
50 mseg
100 nA
50 mseg
100 nA
0,3 µM
1 µM
10 µM
30 µM
a
b
50 mseg
100 nA
Vm= - 70 mV
Vm= - 70 mV
42
Por otro lado, en la figura 5.3 b se muestran los resultados obtenidos luego de
agregar al medio 30µM de [Ru(bpy)2PPh3GABA]+ y fotoliberar GABA en el medio.
Inicialmente, el complejo por si solo no evocó ningún tipo de respuesta. Esto podría
indicar que la solución del complejo no presenta GABA libre (es decir, que todo el
GABA de la muestra se encuentra coordinado al complejo) y que el complejo es
efectivo en el bloqueo de la actividad biológica del GABA cuando se encuentra
enjaulado. Cuando se irradió la muestra se obtuvieron registros escalonados similares al
control y con respuestas similares luego del lavado, pudiéndose repetir el experimento
varias veces sin que se modifique la respuesta.
Estos resultados muestran que el complejo obtenido posee la propiedad de
liberar GABA, sin presentar toxicidad aparente en el sistema utilizado, pudiendo
reproducir un comportamiento similar al de los receptores ante la presencia del
neurotransmisor libre.
Ensayos de citotoxicidad
Como se mencionó previamente, uno de los puntos más importantes en el diseño
de complejos enjualados es lograr que los productos secundarios de la fotoliberación de
la molécula con actividad biológica resulten inocuos para la célula. Para evaluar la
citotoxicidad de los complejos es necesario conocer cuáles son las especies que
intervienen durante la reacción, esto se muestra en el esquema de la figura 5.4.
43
Figura 5.4 Esquema de la fotólisis del complejo [Ru(bpy)2PPh3GABA]+ en solución
fisiológica. En la imagen se muestran las especies que se forman durante el proceso.
Teniendo en cuenta la composición de los medios de cultivo y soluciones salinas
donde se realizan los experimentos electrofisiológicos, algunas de las especies
secundarias que pueden formarse son los acuo-complejos y los cloro-complejos. Si bien
estos últimos poseen una muy baja probabilidad de formarse, son más hidrofóbicos que
los acuo-complejos y por lo tanto son candidatos a poseer mayor toxicidad. Debido a
esto, y a la dificultad experimental que presenta poder obtener los acuo-complejos,
todos los ensayos de toxicidad presentados en este trabajo se realizaran a partir de los
cloro-complejos.
Esta elección, se basa en la hipótesis de que la toxicidad de estos compuestos
esta dada por su hidrofobicidad y por lo tanto con la probabilidad de interacción con las
44
membranas celulares. Entonces, partiendo de los cloro-complejos, se realizó un ensayo
de viabilidad por el método de MTT en células BHK-21. Se incubó a dos tiempos (30 y
90 minutos) y a distintas concentraciones. La selección de tiempos se realizó teniendo
en cuenta que la duración promedio de los registros electrofisiológicos es relativamente
corta, y rara vez se exceden los 60 minutos.
En la figura 5.5 a se muestran los resultados del ensayo de MTT luego de
incubar por 30 minutos con [Ru(bpy)2PPh3Cl]+. A concentraciones de 1 mM, el
porcentaje de supervivencia es cero, esto indica que a esta concentración el complejo es
altamente tóxico al ser aplicado sobre un cultivo celular. En cambio, se puede ver que
concentraciones menores a 100 µM resultan inocuas, ya que no se detectan diferencias
significativas con respecto al control.
Por otro lado, la figura 5.5 b muestra resultados de los experimentos de 90
minutos de incubación. En esta figura, se observó que al igual que en el experimento de
30 minutos, a concentraciones de 1 mM de complejo se registran porcentajes de
supervivencia celular cercanos a cero. También, se vio que concentraciones menores a
100 µM resultan inocuas para los cultivos celulares, en los tiempos ensayados.
Además de las tres concentraciones medidas a los 30 minutos, en el experimento
de 90 minutos se midió toxicidad a una concentración de 500 µM. A esta concentración
el complejo presenta una elevada toxicidad, registrándose un 80% de mortalidad celular.
Este último resultado, mostró que para tiempos de incubación de 90 minutos, la
dosis letal de estos complejos se hallaría entre las concentraciones 500 y 100 µM.
45
Figura 5.5 Resultados del ensayo de citotoxicidad por el método de MTT. a. Experimento
incubando células con soluciones de 1mM, 100µM y 10 µM de [Ru(bpy)2PPh3Cl]+
durante 30
minutos. b. Experimento incubando con soluciones de 1mM, 500µM, 100µM y 10 µM de
[Ru(bpy)2PPh3Cl] durante 90 minutos.***P<0.001 con respecto al grupo control.
También se monitoreó por microscopía time lapse las variaciones en el
comportamiento (migración, adherencia, división, etc.) de un cultivo de células BHK
antes y después de tratarlos con una solución tóxica del cloro-complejo (con una
concentración final de 500 µM). La dosificación fue realizada con pulsos de carbógeno
0
20
40
60
80
100
120
CONTRO
L
PPh3 1mM
PPh3 500uM
PPh3 100uM
PPh3 10uM
% d
e su
per
vive
nci
a
0
20
40
60
80
100
120
CONTROL
PPh3 1mM
PPh3 100uM
PPh3 10uM
% d
e su
per
vive
nci
a
******
a
b
***
46
a través de una micropipeta. En la figura 5.7 se muestran los resultados obtenidos en
este ensayo.
Figura 5.6 Estudio por microscopía time lapse del efecto de una concentración tóxica de
cloro complejo sobre el comportamiento del cultivo celular. Figuras a,b,c y d control con
medio dosificado con micropipeta .Figuras e, f, g y h agregado con micropipeta de 500µM de
cloro complejo.
50 µm
47
Los resultados obtenidos para el control y el tratamiento se muestran en los
siguientes videos:
CONTROL (http://www.youtube.com/watch?v=JWGU2AA8OjI)
TRATAMIENTO (http://www.youtube.com/watch?v=AF_yyxFb5Tc)
La figura 5.6 muestra una selección de imágenes a 0, 15, 30 y 60 minutos de
iniciado el experimento. La primera columna corresponde al control con medio y la
segunda al complejo de cloro.
Como la aplicación del complejo fue realizada puntualmente a través de una
micropipeta, solo las células dentro del campo de difusión de la misma se encuentran en
contacto con el complejo. Esto corresponde a un campo de un diámetro aproximado de
300 µm tomados desde la posición de la micropipeta.
De trabajos previos del laboratorio, se sabe que la pérdida de adherencia celular
luego de un tratamiento con un compuesto hidrofóbico, es un indicio de interacción con
la membrana celular (data not shown).
Se puede observar que a partir de 15 minutos de agregado de complejo las
células pierden adherencia solo en el campo de difusión de la micropipeta, comparado
con el control. Esta pérdida de adherencia se mantiene durante los 60 minutos del
experimento.
La elevada hidrofobicidad que le confieren los anillos aromáticos de las
bipiridinas y de la trifenilfosfina, pueden ser la causa de la toxicidad registrada de este
complejo, ya que podría interactuar con las membranas celulares.
Si bien los resultados obtenidos para los coeficientes de partición octanol:agua
sugieren cierta tendencia a particionar hacia la fase orgánica, no se puede afirmar que el
48
compuesto interactúe con las membranas a menos que se realice un ensayo directo
midiendo efecto del compuesto sobre la membrana.
El Doctor Leonardo Zayat estudió la interacción complejo-membrana en el
laboratorio de Rafael Yuste en la Universidad de Columbia, y demostró que al incubar
células piramidales de la capa 2/3 de corteza de cerebro de ratón con soluciones de 400
a 800 µM complejo de cloro hay una drástica reducción en la resistencia de la
membrana plasmática (ver figura 2 ANEXO) lo cual estaría confirmando la interacción
del complejo con las membranas celulares.
49
5.2 Diseño y síntesis de jaulas de rutenio a partir de fosfinassulfonadas.
Como hemos mencionado para el diseño de complejos enjaulados es sumamente
importante que ni el compuesto, ni ningún producto de la fotolisis interfieran con el
sistema de estudio. En particular los resultados de la sección 5.1 mostraron que el
complejo de trifenilfosfina, posiblemente por gran cantidad de añillos aromáticos,
interactuaba con las membranas celulares.
En la siguiente sección de la tesis, se modificaron las propiedades de los
complejos ([Ru(bpy)2XY]2+) sólo por la variación del ligando monodentado X. Para
ello, se exploró el campo de las fosfinas hidrofílicas. Para evitar los problemas
derivados de la lipofilicidad, se utilizaron trifenilfosfinas mono y tri sulfonadas. Estas
fosfinas poseen una estructura similar a la trifenilfosfina, planas y rígidas, por lo que se
espera que no modifiquen significativamente las propiedades fisicoquímicas del
complejo, principalmente la posición de la banda MLCT y por lo tanto su eficienciaa
cuántica.
5.2.1 Trifenilfosfina meta sulfonada (m-TPPMS): Derivatización de
trifenilfosfina, síntesis y ensayos de toxicidad.
Para hacer más hidrofílica la trifenilfosfina se decidió adicionar a los anillos
aromáticos sustituyentes sulfonilos (SO3-). Para ello, se realizó una reacción de
sulfonación sobre la trifenilfosfina con ácido sulfúrico fumante (H2SO4/SO3) en
condiciones controladas de tiempo y temperatura, de manera de obtener fosfinas
monosulfonadas.
La figura 5.7 muestra un esquema de la reacción de la sulfonación de la
trifenilfosfina. Se obtuvó trimetil fosfina monosulfonada en posición meta (m-TPPMS).
50
Figura 5.7 Esquema de reacción de sulfonación de la trifenilfosfina, empleado en este
trabajo para su derivatización.
Este ligando fue utilizado para sintetizar un complejo de cloro [Ru(bpy)2(m-
TPPMS)Cl]Cl. La tabla 5.4 muestra algunas de las características fisicoquímicas de
este complejo.
Tabla 5.4 Valores correspondientes a la caracterización química del complejo, medidas a
298 K. Se muestran el máximo de absorción del complejo (λλλλabs), el coeficiente de absortividad
molar (εεεε) y el potencial redox (E1/2).
Debido al efecto observado sobre la adherencia celular en la sección anterior,
producido por una concentración 500 µM de complejo de [Ru(bpy)2PPh3Cl]+. Se realizó
un estudio preliminar en cultivos celulares de BHK-21 por microscopía time lapse para
analizar el efecto del nuevo complejo sobre el comportamiento del cultivo.
El video del link http://www.youtube.com/watch?v=M3JCWSMUNZ4 muestra,
a diferencia de lo que se observó para el complejo [Ru(bpy)2PPh3Cl]+, que el agregado
de [Ru(bpy)2(m-TPPMS)Cl]+ no produce pérdida adherencia del cultivo a
concentraciones nocivas (500 µM).
P P
SO3-
H2SO4 /SO32-
Compuesto λλλλ abs (nm) E1/2 (Volts)
[Ru(bpy)2(m-TPPMS)Cl] 428 1,12
ε ε ε ε (M-1 cm-1)
4000
51
La figura 5.8 muestra una selección de fotos a 0, 15, 30 y 60 minutos de
dosificación de complejo. Se observa que no hay diferencias entre el cultivo tratado con
medio de cultivo (control) o el cultivo tratado con una solución de 500 µM de complejo
de [Ru(bpy)2(m-TPPMS)Cl]+, durante el tiempo que duro el experimento. Este resultado
muestra que la reducción de la hidrofobicidad del complejo, reduce la interferencia del
mismo en la pérdida de adherencia celular.
Finalmente, fue evaluada la funcionalidad del complejo, por el Dr Emiliano Rial
Verde en la Universidad de Columbia, en ensayos de corriente voltaje (I-V), sobre
células piramidales de rodajas de cerebro de ratón. El protocolo seguido para el
experimento I-V fue realizado según Thompson, 1989 (Figura 3 ANEXO). Los
resultados mostraron una reducción de la conductancia (g=6,68 nS) luego de tratar con
el cloro-complejo del compuesto monosulfonado y GABA, comparada con la obtenida
al tratar solo con GABA (g=18,67 nS). Estos resultados sugieren que el complejo se
comportaría como antagonista de los canales GABAA.
Frente a este resultado, resultó necesario seguir indagando sobre nuevos ligandos
para sintetizar los complejos.
52
Figura 5.8 Estudio por microscopía time lapse del efecto de una solución 500 µµµµM de cloro
complejo sobre el comportamiento del cultivo celular. Figuras a,b,c y d control con medio
dosificado con micropipeta . Figuras e, f, g y h agregado con micropipeta de 500µM de cloro
complejo.
53
5.2.2 Complejos a partir de trifenilfosfina trisulfonada (TPPTS).
Debido a los efectos antagonistas del complejo sintetizado en la sección anterior,
fue necesario probar con nuevas fosfinas. Se eligió una fosfina comercial (trifenilfosfina
trisulfonada) la cual está trisulfonada, es decir posee un grupo sulfonilo en cada fenilo.
En la figura 5.9 se muestra un esquema de éste ligando. Los tres sulfonilos elevan
significativamente la solubilidad de la fosfina en agua.
Figura 5.9 Esquema del ligando elegido para sintetizar el complejo.
Se siguieron los procedimientos de síntesis convencionales y se obtuvo tanto el
complejo de cloro como el complejo de GABA, ambos dos presentaron una elevada
solubilidad en H2O.
Sin embargo, debido a la baja basicidad de la fosfina el enlance Ru-P es débil
por lo que en el complejo de GABA [Ru(bpy)2TPPTSGABA]- la irradiación en 450 nm
resulta en la liberación de la fosfina en lugar del GABA. En la figura 5.9 se observan los
espectros de absorción, antes y después de irradiar con luz azul, del complejo
[Ru(bpy)2TPPTSGABA]-. La posición de la banda MLCT antes de irradiar corresponde
con el espectro UV característico del complejo de GABA, luego de irradiar se obtiene el
espectro característico del [Ru(bpy)2(H2O)GABA]+.
54
Este resultado indica que el ligando TPPTS no es adecuado para el diseño de
complejos que liberen GABA y la necesidad de seguir buscando nuevos ligandos.
Figura 5.9 Fotólisis del complejo [Ru(bpy)2TPPTSGABA]- con LED de 450 nm. La línea azul
representa el espectro del complejo antes de irradiar y la línea verde representa el espectro
luego de irradiar. La flecha indica el corrimiento del espectro luego de la fotólisis. Se muestra
un detalle de la reacción que ocurrió.
.
400 450 500 550 600 650 7000,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Ab
sorb
an
cia
λ (nm)
55
5.3 Complejos enjaulados de GABA sintetizados a partir demetilfosfinas comerciales.
De los resultados de la sección anterior, surge la necesidad de buscar nuevos
ligandos hidrofílicos, a partir de los cuales se pueda sintetizar complejos biocompatibles
con sistemas biológicos. Para esto, se decidió trabajar con una familia de fosfinas del
tipo metilfenilfosfinas comercializadas por Sigma Aldrich. Las fosfinas utilizadas
fueron dimetilfenilfosfina (PPhMe2) y difenilmetilfosfina (PPh2Me).
En esta sección se presentan los resultados de la caracterización química de cada
uno de los complejos sintetizados y los resultados de los ensayos de toxicidad. Además,
se presenta la caracterización química de los complejos de cloro y GABA ya
sintetizados en el laboratorio a partir de jaulas con trimetilfosfina como ligando
([Ru(bpy)2PMe3GABA]+).
5.3.1 Complejos de cloro
Se sintetizaron dos complejos de cloro: [Ru(bpy)2PPhMe2Cl]+ y
[Ru(bpy)2PPh2MeCl]+, a partir de las fosfinas comerciales mencionadas previamente.
En la tabla 5.5 se listan los valores correspondientes al máximo de absorbancia
(λabs), absortividad molar (ε), potencial redox (E1/2) y constante de partición (KOW) de
los complejos obtenidos a partir de trimetilfosfina ([Ru(bpy)2PMe3Cl]+),
dimetilfenilfosfina ([Ru(bpy)2PPhMe2Cl]+) y difenilmetilfosfina
([Ru(bpy)2PPh2MeCl]+).
56
Tabla 5.5 Valores correspondientes a la caracterización química del complejo, medidas a
298 °K.Se pueden observar tendencias en cuanto al número de fenilos de la fosfina y las
posiciones de la banda MLCT, potencial redox del metal y la partición octanol agua.
Las tendencias observadas para la posición de la banda MLCT y el potencial redox, se
deben a una disminución en la basicidad de la fosfina provocada por los fenilos. A
medida que aumentan los anillos aromáticos del ligando, disminuye su basicidad y esto
produce el corrimiento de la banda a longitudes de onda menores (de mayor energía),
registrando potenciales redox mayores.
En cuanto a la tendencia observada para el coeficiente de partición octanol agua,
se registró por cada fenilo del complejo un incremento en un orden de magnitud del
KOW, lo que indica un aumento en la hidrofobicidad de los complejos.
Los complejos obtenidos fueron analizados por 1H RMN, se detectó la presencia
de las señales características y sus correspondientes desplazamientos químicos. Estos
compuestos de cloro, debido al elevado número de anillos aromáticos que poseen en su
estructura, presentan la mayoría de sus señales desplazadas hacia la región aromática
del espectro (> 6 ppm), presentando en la región alifática únicamente las señales
correspondientes a los protones de los metilos.
Todos tienen en común las 16 señales correspondientes a las bipiridinas (8
dobletes y 8 tripletes), y las señales de los fenilos de las fosfinas, las cuales variarán
dependiendo del número de fenilos del complejo.
Compuesto λλλλ abs (nm) E1/2 (Volts)
[Ru(bpy)2PMe3Cl]+ 456 1,12
ε ε ε ε (M-1 cm-1)
5200
KOW
0,03
[Ru(bpy)2PPhMe2Cl]+450 1,146600 0,22
[Ru(bpy)2PPh2MeCl]+ 444 1,166800 1,1
57
5.3.2 Complejos de GABA
En la tabla 5.6 se observan las características principales de los tres complejos
de GABA obtenidos a partir de los cloro-complejos descriptos en la sección anterior.
Para la posición de la banda MLCT se observó la misma tendencia que para los cloro-
complejos.
Se midieron las eficiencias cuánticas a dos pH distintos, uno correspondiente al
pH fisiológico y otro a pH 12 (pH > pKb del GABA). Se pueden observar cierta
dependencia de la eficiencia cuántica con el pH.
Tabla 5.6 Valores correspondientes al la caracterización química de los complejos de GABA,
medidas a 298 K.
La tabla muestra también las KOW de los distintos complejos. Se puede ver que
por cada fenilo de la fosfina, hay un aumento en la hidrofobicidad.
Al igual que con los cloros complejos, los complejos de GABA fueron
analizados por RMN. La figura 5.12 muestra un espectro obtenido para el complejo
[Ru(bpy)2PMe3GABA]+, realizado en agua deuterada. En la figura, se observa la
asignación de las señales del complejo tanto de la región aromática como de la región
alifática del espectro.
En la región alifática se pueden ver las señales correspondientes a los protones
A, B, C y D del GABA coordinado. Las señales de los protones A, que son los protones
del grupo amino, son las que permiten identificar que el GABA se halla coordinado al
Compuesto λλλλ abs (nm) φφφφ (pH=7)
[Ru(bpy)2PMe3GABA]+ 446 0,10
ε ε ε ε (M-1 cm-1)
5300
KOW
<10-3
φφφφ (pH=12)
0,05
[Ru(bpy)2PPhMe2GABA]+444 0,176000 0,060,10
[Ru(bpy)2PPh2MeGABA]+431 0,305500 0,150,27
58
complejo, ya que en el caso del GABA libre estos protones tienen un gran intercambio
con los protones correspondientes al agua deuterada y por lo tanto no se observan.
Además, la posición de las señales del resto de protones de la cadena sufren
pequeños corrimientos, comparadas con las obtenidas para el GABA libre las cuáles se
pueden apreciar cuando se fotoliza la muestra.
59
Figura 5.12 Espectro de RMN de [Ru(bpy)2PMe3GABA]+ en agua deuterada. a Región
aromática del espectro con las señales características de las bipiridinas. b. Región alifática
donde se muestra el análisis de los protones del GABA.
9,2 8,8 8,4 8,0 7,6 7,2
señales de las bipiridinas(integran para 16 protones)
a
Ru
NMe
PMe
Me
NH
COO-
N
N
4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5Desplazamiento quimico (ppm)
A A C C´
D D´
B
b
60
Además del análisis de las señales correspondientes a los protones de la
molécula, también se evaluó la liberación de GABA por irradiación. Para ello se realizó
RMN de los complejos de GABA en agua deuterada, y se irradiaron los tubos de RMN
para verificar la liberación del enjaulado. Se sometió la muestra a dos pasos de
irradiación-medición (50 y 200 pulsos de luz blanca) hasta lograr liberar todo el GABA
coordinado.
En la figura 5.13 se muestra el resultado obtenido luego de medir RMN antes de
irradiar y luego de la irradiación con 50 y 200 pulsos de luz blanca. Las señales
obtenidas en la región alifática del espectro luego de irradiar con 200 pulsos de luz se
corresponden con las señales de GABA libre, observando la desaparición de las señales
correspondientes a los protones coordinados. Las flechas rojas identifican las señales del
GABA coordinado y las flechas azules las del GABA libre.
61
Figura 5.13 Región alifática del espectro de 1H RMN del complejo [Ru(bpy)2PMe3GABA]
+
medido antes (a), y después de irradiar con 50 (b) y 200 (c) pulsos de luz.
Para la medición de las eficiencias cuánticas de fotoliberación en agua, que se
muestran en la tabla 5.6, se irradiaron a 450 nm soluciones acuosas de los distintos
complejos de GABA y se midió un espectro UV-vis inmediatamente después de cada
irradiación. Estas medidas fueron realizadas, como ya se mencionó, a dos pH distintos
(pH=7 fisiológico y pH= 12). La figura 5.14 muestra los resultados obtenidos para los
tres complejos analizados.
A la izquierda se pueden ver los resultados de las fotolísis realizadas a pH=7.
Para los tres compuestos se pueden ver puntos isosbésticos, los cuales determinan la
4 ,0 3 ,5 3 ,0 2 ,5 2 ,0 1 ,5D esp lazam ien to qu im ico (pp m )
4 ,0 3 ,5 3 ,0 2 ,5 2 ,0 1 ,5D esp lazam ien to qu im ico (pp m )
a
b
c
Señales delGABA libre
Señales delGABAcoordinado
62
existencia de solo dos especies en la reacción de fotoliberación (el complejo de GABA
y el acuo-complejo). A la derecha se muestran los resultados de las fotólisis a pH=12, se
observan grandes diferencia en los espectros de absorción de las dos especies
involucradas en la reacción. Esto se debe a que a pH básico el acuo-complejo pierde un
protón y se transforma en hidroxo-complejo, el cual absorbe a longitudes de onda
mayores.
En todos los casos las figuras muestran un recuadro insertado que muestra el
porcentaje de fotoconversión. Donde se representan los moles de GABA liberado por
moles de fotones absorbidos.
63
Figura 5.14. Fotólisis de los complejos (a) [Ru(bpy)2PMe3GABA]+, (b)
[Ru(bpy)2PPhMe2GABA]+ y (c) [Ru(bpy)2PPh2MeGABA]
+. A la izquierda fotolisis realizada a
pH=7, a la derecha fotólisis realizada a pH=12. Las flechas negras indican el aumento o la
disminución de las bandas durante la fotólisis.
350 400 450 500 550 600
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0 1 2 3 4 5 6
50
100
150
200
250
300
350
GA
BA
lib
re(n
mol
)
Fotones absorbidos (µmol)
10
20
30
40
50
60
70
80
90
% F
otoc
onve
rsió
n
Abs
orba
ncia
λ (nm)
350 400 450 500 550 600
0,0
0,3
0,6
0,9
1,2
0,0 8,0x10-7
1,6x10-6
2,4x10-6
3,2x10-6
4,0x10-6
0,0
5,0x10-8
1,0x10-7
1,5x10-7
2,0x10-7
2,5x10-7
% d
e fo
toco
nver
sión
GA
BA
libr
e (m
oles
)
Fotones absorbidos (moles)
0
20
40
60
80
100
λ (nm)
Abs
orba
ncia
a
b
350 400 450 500 550 600
0,0
0,3
0,6
0,9
1,2
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
20
40
60
80
100
120
140
160
GA
BA
lib
re (
nmol
)
Fotones absorbidos (µmol)
10
20
30
40
50
60
70
% f
otoc
onve
rsió
n
Abs
orba
ncia
λ (nm)
c
300 350 400 450 500 550 600 650 700
0,0
0,4
0,8
1,2
0,0 2,0x10-6
4,0x10-6
6,0x10-6
8,0x10-6
0,0
5,0x10-8
1,0x10-7
1,5x10-7
2,0x10-7
2,5x10-7
GA
BA
libr
e (m
oles
)
Fotones absorbidos (moles)
0
20
40
60
80
100
% d
e fo
toco
nver
sión
Abs
orba
ncia
λ (nm)
300 350 400 450 500 550 600 650 7000,0
0,3
0,6
0,9
1,2
0,0 0,3 0,6 0,9 1,2
20
40
60
80
100
120
140
160
% f
otoc
onve
rsió
n
GA
BA
libr
e (n
mol
)
Fotones absorbidos (µmol)
10
20
30
40
50
60
70
80
160160
Abs
orba
ncia
λ (nm)
300 350 400 450 500 550 600 650 700
0,0
0,3
0,6
0,9
1,2
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,50,0
0,4
0,8
1,2
1,6
Fotones absorbidos (µmol)
% fo
toco
nver
sión
GA
BA
libr
e (n
mol
)
0
20
40
60
80
100
Abs
orba
ncia
λ (nm)
64
Por otro lado, se estudió mediante voltametría cíclica el comportamiento
electroquímico de los compuestos sintetizados. Para ello se realizó un barrido de
potencial desde 700 a 2200mV. Los resultados se muestran en la tabla 5.7 y los
voltagramas obtenidos se pueden ver en la figura 5.15.
Tabla 5.7 Potenciales redox los complejos de GABA medidos en acetonitrilo y con TBAPF6
0,1 M como electrolito soporte. Medida realizada a 298 °K y referenciada a NHE.
Estos complejos, al igual que el [Ru(bpy)2PPh3GABA]+ presentan tres
picos característicos. El primer pico registrado corresponde a la oxidación del rutenio
coordinado al GABA, mientras que los otros dos picos se atribuyen a compuestos que
contienen los productos de la oxidación de la unión N-C en el grupo amino.
Se puede ver que en estos complejos el proceso redox de la cupla Ru(III/II)
resulta irreversible, comparado con los resultados obtenidos para los cloro-complejos
pudiendo registrar únicamente potenciales de pico. Se probó acotar el rango de
potencial a 800 hasta 1300 mV y el proceso siguió siendo irreversible. No tenemos una
explicación para este fenómeno.
Compuesto
[Ru(bpy)2PMe3GABA]+ 1,571,25
Ep(Volts) E1/2 (Volts) Ep (Volts)
1,72
1,711,18 1,84
1,661,19 1,82
[Ru(bpy)2PPhMe2GABA]+
[Ru(bpy)2PPh2MeGABA]+
65
Figura 5.15 Voltametrías cíclicas de los complejos (a) [Ru(bpy)2PMe3GABA]+, (b)
[Ru(bpy)2PPhMe2GABA]+ y (c) [Ru(bpy)2PPh2MeGABA]
+. A 100 mV/s en acetonitrilo.
0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2
E / V vs. NHE
20 µA
a
0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2
E / V vs. NHE
50 µA
E / V vs. NHE
b
0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2
E / V vs. NHE
20 µA
c
66
5.3.3 Ensayos de citotoxidad
Para evaluar la toxicidad de cada uno de los complejos sintetizados en esta
sección se realizó, un ensayo de citotoxicidad por el método de MTT sobre células
BHK-21. Se estudió la toxicidad de los cloro-complejos a tiempos de incubación de 30
minutos y 90 minutos.
Para el experimento de 30 minutos se utilizaron concentraciones de 10 µM, 100
µM y 1 mM para los complejos de trimetilfosfina y dimetilfosfina. Los resultados
obtenidos se muestran en la figura 5.16.
Figura 5.16 Resultados del ensayo de MTT en células BHK. Se incubaron células durante 30
minutos con concentraciones 1mM, 100µM y 10µM de los cloro complejos
[Ru(bpy)2PPh3Cl]+,[Ru(bpy)2PPhMe2Cl]
+ y [Ru(bpy)2PMe3Cl]
+. El control fue incubado con
medio. *P<0.05 y ***P<0.001 con respecto al grupo control.
En la figura 5.16 se puede ver que a concentraciones menores a 100 µM,
ninguno de los dos complejos evaluados son citotóxicos, ya que no muestran diferencias
significativas con respecto al control.
***
****
0
20
40
60
80
100
120
CONTROL
PPhMe2 1m
M
PPhMe2 100uM
PPhMe2 10uM
PMe3 1m
M
PMe3 100uM
PMe3 10 uM
% d
e s
uperv
ivencia
****
67
El compuesto de trimetilfosfina es el que presenta menor toxicidad a
concentraciones de 1 mM con respecto a los tres complejos estudiados, ya que presenta
un porcentaje de supervivencia del 60%. Por otro lado, el complejo de dimetilfenil
cloro a concentraciones de 1 mM produce aproximadamente un 50% de mortalidad
celular comparado con el control. Este resultado indica que el compuesto presenta cierta
toxicidad a dicha concentración, pero que es muy inferior a la registrada para los
complejos de trifenilfosfina.
Asimismo, se estudió el efecto de los complejos realizando una incubación de 90
minutos. En la figura 5.17 se muestran los resultados obtenidos para los tres complejos
estudiados en esta sección. Se analizaron cuatro concentraciones 1 mM, 500 µM, 100
µM y 10 µM.
Figura 5.17 Resultados del ensayo de MTT en celulas BHK. Se incubaron células durante 90
minutos con concentraciones 1mM, 500µM, 100µM y 10µM de los cloro complejos
[Ru(bpy)2PPh3Cl]+, [Ru(bpy)2PPh2MeCl]
+, [Ru(bpy)2PPhMe2Cl]
+ y [Ru(bpy)2PMe3Cl]
+.
*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 con respecto al grupo control.
0
20
40
60
80
100
120
140
CONTROL
PPh2Me 1mM
PPh2Me 500uM
PPh2Me 100uM
PPhMe2 10uM
PPhMe2 1mM
PPhMe2 500uM
PPhMe2 100uM
PPhMe2 10uM
PMe3 1mM
PMe3 500uM
PMe3 100uM
PMe3 10uM
% d
e s
up
erv
iven
cia
*** ***
***
68
En la figura se puede ver que todos los complejos sintetizados a partir de
metilfosfinas presentan menor toxicidad que la registrada para los complejos de
trifenilfosfina previamente descriptos. Esta diferencia se puede apreciar a
concentraciones de 500 µM y 1 mM, no pudiéndose registrar diferencias significativas a
concentraciones menores o iguales a 100 µM entre los cuatro compuestos evaluados y
entre estos y el control. Estos resultados indican que los complejos de metilfosfinas
presentan una menor toxicidad que los de trifenilfosfina, lo cual correlaciona con lo
observado con los KOW.
69
5.4 Comparación global de los complejos enjaulados de GABA
En esta sección se describen y comparan algunas de las características más
importantes de los cuatro compuestos enjaulados de GABA sintetizados y/o
caracterizados en este trabajo.
5.4.1 Características fisicoquímicas
La figura 5.18 muestra la correlación entre la eficiencia cuántica medida a pH=7
y la posición de la banda MLCT para los complejos: [Ru(bpy)2PPh3GABA]+,
[Ru(bpy)2PPh2MeGABA]+, [Ru(bpy)2PPhMe2GABA]+ y [Ru(bpy)2PMe3GABA]+.
También se muestran los coeficientes de partición octanol agua (KOW) de los cloro-
complejos obtenidos.
420 430 440 450 4600,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
KOW
=0,03
KOW
=0,22
KOW
=1,1
D
B
AA [Ru(bpy)2PPh3GABA]
+
B [Ru(bpy)2PPh2MeGABA]+
C [Ru(bpy)2PPhMe2GABA]+
D [Ru(bpy)2PMe3GABA]+
Efi
cien
cia
cuá
nti
ca
( φ)
λ(nm)
C
KOW
=17
Figura 5.18. Correlación entre la eficiencia cuántica y la posición de la banda MLCT. En
rosa, los complejos de GABA analizados en este trabajo: A=[Ru(bpy)2PPh3GABA]+,B=
[Ru(bpy)2PPh2MeGABA]+, C=[Ru(bpy)2PPhMe2GABA]
+y D=[Ru(bpy)2PMe3GABA]
+. Además
se muestran los Kow del producto de fotólisis (cloro complejo). Las eficiencias cuánticas fueron
medidas en agua, a pH=7 y a 298 °K.
70
Se observó que a medida que se sustituye un fenilo por un metilo en el ligando,
hay una disminución en un orden de magnitud en el coeficiente de partición
octanol:agua, y un aumento en la eficiencia cuántica.
Existe correlación entre la energía de la banda MLCT (que es inversamente
proporcional a su λ) y las eficiencias cuánticas obtenidas para los distintos complejos
medidas en agua a pH fisiológico. Este comportamiento se vincula con la diferencia de
basicidad entre las distintas fosfinas usadas como ligandos.
Menos básico PPh3 <PPh2Me <PPhMe2 <PMe3 Más básico
A mayor basicidad de la fosfina, menor es la eficiencia cuántica de
fotoliberación obtenida y la posición de la banda MLCT se desplaza a mayores
longitudes de onda.
5.4.2 Citotoxicidad
En esta sección, se resumen y se comparan los resultados de los ensayos de
viabilidad celular realizados a dos tiempos (30 y 90 minutos), en cultivos celulares de
células BHK-21 para los complejos: [Ru(bpy)2PPh3Cl]+, [Ru(bpy)2PPhMe2Cl]+,
[Ru(bpy)2PPh2MeCl]+ y [Ru(bpy)2PMe3Cl]+.
En la figura 5.19 se muestran comparados, todos los resultados obtenidos para el
tratamiento de 30 minutos. Los resultados de los tratamientos fueron sometidos a un
ANOVA de un factor, seguido de un test de Tukey.
Para concentraciones menores o iguales a 100 µM, de los complejos, no se
observó efectos sobre la viabilidad celular luego de incubaciones de 30 minutos.
En cambio, para concentraciones de 1 mM, se observó, para todos los
complejos, diferencias significativas respecto al control. Realizando comparaciones
entre los distintos tratamientos a los que fueron sometidos los cultivos, el complejo
71
[Ru(bpy)2PPh3Cl]+ resultó significativamente más tóxico que los otros dos complejos
sintetizados a partir de fosfinas de mayor hidrofilicidad (trimetilfosfina y
dimetilfenilfosfina).
Figura 5.19. Ensayo de citotoxicidad MTT para los complejos de cloro:[Ru(bpy)2PPh3Cl]+,
[Ru(bpy)2PPhMe2Cl]+y [Ru(bpy)2PMe3Cl]
+ a concentraciones (a) 1mM, (b) 100µM y (c) 10
µM, luego de 30 minutos de incubación. Estadística por test de Tukey, seguido de un ANOVA de
un factor***P<0.001 respecto al control. *** P<0.001 entre [Ru(bpy)2PPh3Cl]+
y los otros dos
complejos.
0
20
40
60
80
100
120
PPh3 1mM
PPhMe2 1mM
PMe3 1mM
CONTROL
% d
e su
per
vive
nci
a
****
***
***a
0
20
40
60
80
100
120
PPh3 100uM
PPhMe2 100uM
PMe3 100uM
CONTROL
% d
e su
per
vive
nci
a
b
020406080
100120
PPh3 10uM
PPhM e2 10uM
PMe3 10 uM
CONTROL
% d
e su
per
vive
nci
a
c
72
Por otro lado, en la figura 5.20 se muestran los resultados de los tratamientos de
90 minutos.
Figura 5.20. Ensayo de citotoxicidad MTT para los complejos de cloro:[Ru(bpy)2PPh3Cl]+,
[Ru(bpy)2PPh2MeCl]+,[Ru(bpy)2PPhMe2Cl]
+y [Ru(bpy)2PMe3Cl]
+ a concentraciones (a) 1mM,
(b) 500µM, (c) 100 µM y (c) 10 µM, luego de 90 minutos de incubación. ***P<0.001 respecto
al control, ** P< 0,01 y *** P<0.001 entre [Ru(bpy)2PPh3Cl]+ y los otros tres complejos.
Como ocurrió para los tratamientos a 30 minutos, a 90 minutos tampoco se
observaron efectos sobre la viabilidad celular luego de incubar los cultivos de células
BHK, con concentraciones menores o iguales a 100 µM de los complejos de cloro.
Para concentraciones de complejo de 1 mM, se observó que todos los complejos
presentan cierta toxicidad. Al igual que en el experimento de 30 minutos, el complejo de
trifenilfosfina ([Ru(bpy)2PPh3Cl]+) resultó el más tóxico, no pudiendo registrar
0
20
40
60
80
100
120
PPh3 1mM
PPh2Me 1mM
PPhMe2 1mM
PMe3 1mM
CONTROL
% d
e s
up
erv
iven
cia
0
20
40
60
80
100
120
PPh3 500uM
PPh2Me 500uM
PPhMe2 500uM
PMe3 500uM
CONTROL
% d
e su
perv
iven
cia
0
20
40
60
80
100
120
140
PPh3 100uM
PPh2Me 100uM
PPhMe2 100uM
PMe3 100uM
CONTROL
% d
e su
perv
iven
cia
0
20
40
60
80
100
120
140
PPh3 10uM
PPhMe2 10uM
PPhMe2 10uM
PMe3 10uM
CONTROL
% d
e s
up
erv
iven
cia
***
*** ******
***
****
a b
***
***
c d
73
supervivencia celular luego del tratamiento. En cambio, para los otros complejos
probados, si bien los tratamientos con éstos presentaron diferencias significativas
respecto al control resultaron significativamente menos tóxicos que el complejo de
trifenilfosfina.
Los experimentos de incubación con soluciones de 500 µM de complejo
mostraron que salvo el [Ru(bpy)2PPh3Cl]+, el restos de los complejos de cloro
resultaron inocuos para los cultivos celulares. Esto indicaría que los complejos
sintetizados a partir de metilfosfinas son significativamente menos tóxicos que el
complejo sintetizado a partir de trifenilfosfina.
74
6 DISCUSIÓN
Para poder cumplir el objetivo de esta tesis de licenciatura, se trabajó con
complejos de rutenio-bipiridina de la forma [Ru(bpy)2XY]n+ donde X representa al
ligando no biológico e Y representa la posición ocupada por el GABA. La posibilidad
de cambiar el ligando no biológico proveyó una gran ventaja, ya que se pudieron
modificar las características fisicoquímicas del complejo como por ejemplo su
eficiencia cuántica, su solubilidad y su toxicidad. Se trabajó con fosfinas aromáticas y
metilfosfinas porque éstas poseen características muy interesantes, entre las cuales
podemos destacar:
• El carácter ππππ-aceptor de las fosfinas: Desplaza la energía de la banda MLCT
hacia menores longitudes de onda (mayor energía). Esto facilita que se pueble el
estado d-d y consecuentemente produce complejos con rendimientos cuánticos
de fotodisociación altos (ver introducción).
• La fortaleza del enlace Ru-P: Debido al basicidad de la fosfina y a su carácter
aceptor, evita que el ligando que se libere sea la fosfina, dando un grupo
protector robusto que libera exclusivamente la molécula bioactiva.
En esta tesina de licenciatura se logró sintetizar una familia de complejos
enjaulados de GABA de baja toxicidad y alta eficiencia cuántica, que liberan GABA al
ser irradiados con luz visible.
Los complejos sintetizados son de la característica [Ru(bpy)2XGABA]n+, donde
X= trifenilfosfina, dimetilfenilfosfina o difenilmetilfosfina.
75
6.1 [Ru(bpy)2PPh3GABA]+. Primer complejo enjaulado de GABA de alta
eficiencia cuántica y utilizable en el rango de luz visible
El complejo de GABA ([Ru(bpy)2PPh3GABA]+) obtenido a partir del
[Ru(bpy)2PPh3Cl]+ presentó una eficiencia cuántica de fotoliberación en agua y a pH
fisiológico del 48 %. Está eficiencia cuántica resulto ser un orden de magnitud superior
a la registrada para el complejo Ru(bpy)2GABA2 (Zayat, 2006) y levemente superiores
a las registradas para los complejos de GABA de base orgánica publicados en literatura:
BC204 (Cürten, 2005), O-CNB-GABA (Gee, 1994).
La diferencia observada entre el [Ru(bpy)2PPh3GABA]+ y el Ru(bpy)2GABA2,
esta dada principalmente por la trifenilfosfina (PPh3). Como se mencionó a lo largo del
trabajo, las fosfinas poseen carácter π aceptor que desplaza la energía de la banda
MLCT hacia mayores energías (menores longitudes de onda). Esto se evidencia
comparando las posiciones de las bandas MLCT de los dos complejos, en donde el
[Ru(bpy)2PPh3GABA]+ presenta su banda en λ=424 nm, mientras que el
Ru(bpy)2GABA2 la presenta en λ=488 nm. El corrimiento de 64 nm hacia longitudes de
onda menores es, por lo tanto, efecto de la trifenilfosfina. En consecuencia, el
corrimiento hacia mayores energías, disminuye la diferencia de energía (∆E) entre el
estado 3MLCT y el estado d-d, facilitando la población de este último. Con una mayor
participación del estado d-d en la relajación del los estados excitados, mayor será la
eficiencia cuántica.
Se realizaron los estudios de funcionalidad del complejo de GABA utilizando el
sistema de expresión heteróloga de ovocitos de Xenopus laevis; expresando receptores
de GABAC. Estos estudios consistieron en mediciones de corrientes de Cl- utilizando la
técnica de Fijación de Voltaje con dos electrodos, luego de fotoliberar el complejo de
GABA.
76
Los resultados mostraron que utilizando el complejo de GABA y fotoliberando
con pulsos de luz blanca se pueden obtener registros similares a los del registro control.
Además, se pudo demostrar que el complejo de GABA no posee actividad biológica en
oscuridad, demostrando que el GABA coordinado no puede ser reconocido por los
receptores a menos que éste sea liberado. Este resultado mostró que el complejo de
trifenilfosfina es una buena “jaula” para el neurotransmisor GABA, bloqueando la
actividad biológica del mismo cuando se halla unido al complejo y permitiendo su
liberación con una elevada eficiencia cuántica.
Este complejo de GABA es el primer compuesto enjaulado que libera GABA
con luz visible y con una buena eficiencia cuántica. Su síntesis, caracterización y
pruebas funcionales fueron publicadas en la revista ChemBioChem en el año 2007 (ver
figura 4 del ANEXO). Y desde el año 2009 es comercializado por TOCRIS (ver figura
5 del ANEXO).
A pesar de ser el primer compuesto de GABA del mercado que libera el
enjaulado con luz visible y elevada eficiencia cuántica, a concentraciones del orden del
milimolar presentó cierta toxicidad.
Para evaluar la toxicidad de los complejos sintetizados, se trabajó con la especie
más hidrofóbica que esta en contacto con el sistema biológico durante un experimento.
Esta elección, se basó en la hipótesis de que la toxicidad de estos compuestos esta dada
por su hidrofobicidad y por lo tanto con la probabilidad de interacción con las
membranas celulares.
Teniendo en cuenta la composición de los medios de cultivo y soluciones salinas
donde se realizan los experimentos electrofisiológicos, las especies secundarias que
tienen más probabilidad de formarse son los acuo-complejos y los cloro-complejos.
Estos últimos, son más hidrofóbicos (KOW= 17) y por lo tanto son candidatos a poseer
77
mayor toxicidad. De todas maneras, la probabilidad que se forme el cloro-complejo
frente al acuo-complejo es muy baja, debido principalmente a que la concentración de
cloruro de las soluciones fisiológicas o medios de cultivos es relativamente baja.
Se demostró, por un ensayo de citotoxicidad con MTT, que el complejo de cloro
es altamente tóxico, en cultivos celulares, a concentraciones iguales o superiores a 500
µM en exposiciones de 30 y 90 minutos. Además, se observó por microscopía time
lapse, que tratamientos con 500 µM de complejo de cloro produjo la pérdida de
adherencia en el campo de dosificación de la micropipeta. Esta pérdida de adherencia
resultó irreversible, por lo tanto podría asociarse a un efecto tóxico del complejo.
De todas maneras, si bien resultó necesario diseñar nuevos compuestos que
presenten una mejor biocompatibilidad, esté complejo de GABA es una buena
alternativa cuando se requiere realizar experimentos en donde se necesitan bajas
concentraciones de GABA en el medio. Como por ejemplo cuando se trabaja con
canales de GABAC cuyas concentraciones efectivas 50 (EC50) se encuentran en el orden
de 1 µM (Zhang, 2001).
6.2 Nuevos complejos a partir de fosfinas de menor lipofilicidad.
En el laboratorio se obtuvieron evidencias experimentales de que los complejos
de rutenio-bipiridina con fosfinas lipofílicas presentan una elevada probabilidad de
particionar hacia la fase orgánica durante un proceso de extracción. Este
comportamiento determina el carácter lipofílico de los complejos. En un experimento
con células, tejidos u órganos, el análogo a la fase orgánica de una extracción son las
membranas celulares y el análogo de la fase acuosa es el medio en el que se encuentran
78
las células (medios de cultivo, PBS, etc). Por lo tanto, existe la probabilidad que
complejos lipofílicos interactúen con las membranas celulares.
Inferimos que la toxicidad de los complejos radica principalmente en su
lipofilicidad. Para poder modificar éste efecto, se utilizaron fosfinas polares, de manera
de obtener jaulas más hidrofílicas y en consecuencia de menor toxicidad.
6.2.1 Complejos de rutenio-bipiridina sintetizados a partir de fosfinas
sulfonadas (m-TPPMS y TPPTS).
Las jaulas obtenidas a partir de las fosfinas sulfonadas, no resultaron útiles para
la obtención de complejos enjaulados de GABA.
En primer lugar, el cloro-complejo obtenido a partir de la trifenilfosfina
monosulfonada ([Ru(bpy)2(m-TPPMS)Cl]) resultó ser antagónico de los canales
GABAA. Esto se puede ver en las figura 2 del ANEXO, donde se muestra que el
agregado del complejo de cloro redujo la conductancia de los receptores GABAA entre
3 y 5 veces. Esto sugiere que alguno de los ligandos del complejo podrían estar
interactuando específica o inespecíficamente con el receptor.
De todas maneras, se obtuvieron resultados favorables en los ensayos
preliminares realizados por microscopía time lapse, donde se mostró que la incubación
con jaula no produjo pérdida de adherencia ni ningún otro tipo de efecto sobre la
morfología del cultivo celular. Por lo tanto, a pesar que el complejo [Ru(bpy)2(m-
TPPMS)Cl] no puede ser utilizado como jaula para el GABA, se demostró que el
cambio por un ligando menos lipofílico (trifenilfosfina por trifenilfosfina
monosulfonada) redujo la toxicidad del complejo.
79
Por otro lado, el complejo de GABA ([Ru(bpy)2TPPTSGABA]2-) sintetizado a
partir de la jaula con trifenifosfina trisulfonada (TPPTS) mostró que la reducida
basicidad del ligando TPPTS no lo hace apto para su uso en complejos enjaulados de
GABA. Esto se puede observar en la figura 5.9, donde se mostró que la fotolisis del
complejo [Ru(bpy)2TPPTSGABA]2- libera el ligando no biológico TPPTS en lugar del
GABA.
6.2.2 Complejos enjaulados de GABA a partir de metilfosfinas y
fenilfosfinas.
Se sintetizó una nueva familia de complejos enjaulados de GABA a partir de
jaulas de rutenio-bipiridina utilizando como ligando no biológico metilfosfinas
(dimetilfenilfosfina y difenilmetilfosfina). Además se realizó la caracterización química
y biológica de un compuesto ya sintetizado en el laboratorio llamado
[Ru(bpy)2PMe3GABA]+.
Se obtuvieron complejos de GABA con eficiencias cuánticas superiores a la del
complejo Ru(bpy)2(GABA)2 (Zayat, 2006) y de menor lipofilicidad que el complejo
[Ru(bpy)2PPh3GABA]+.
En la tabla 6.1 se listan algunas propiedades fisicoquímicas de los complejos de
GABA presentados en este trabajo y de los publicados hasta el momento en
bibliografía.
80
Tabla 6.1. Comparación de los compuestos enjaulados de GABA caracterizados en este trabajo
con los compuestos de GABA obtenidos en bibliografía. Ru(bpy)2(GABA)2 (Zayat, 2006);
BC204 (Cürten, 2005) ; O-CNB-GABA (Gee, 1994.)
Al igual que el complejo Ru(bpy)2(GABA)2 todos los complejos presentados en
este trabajo absorben en el rango de luz visible. Haber mantenido esta propiedad es
importante debido a los efectos nocivos que presenta la luz UV (Wees, 2007), además
de la alta dispersión que presenta en tejidos biológicos y los altos costos de
equipamiento que implica su uso (Zayat, 2008). Esto, representa un gran avance
comparado con los complejos de base orgánica que solo pueden liberar la biomolécula
irradiando con luz UV (Cürten, 2005).
Por otro lado, si bien las eficiencias cuánticas medidas a pH=7 para los
complejos de metilfosfinas ([Ru(bpy)2PMe3GABA]+, [Ru(bpy)2PPhMe2GABA]+ y
[Ru(bpy)2PPh2MeGABA]+) fueron superiores a la registrada para el Ru(bpy)2(GABA)2,
resultaron menores a la obtenida para el complejo de trifenilfosfina.
Esto se debe principalmente a la diferencia de basicidad que existe entre las
distintas fosfinas utilizadas. A continuación se muestra como es la tendencia de
basicidad de las distintas fosfinas.
Compuesto λλλλ abs (nm) φφφφ (pH=7)
[Ru(bpy)2PMe3GABA]+ 446 0,10
ε ε ε ε (M-1 cm-1)
5300
KOW
<10-3
φφφφ (pH=12)
0,05
[Ru(bpy)2PPhMe2GABA]+ 444 0,176000 0,060,10
[Ru(bpy)2PPh2MeGABA]+ 431 0,305500 0,150,27
[Ru(bpy)2PPh3GABA]+ 424 0,486400 0,260,42
BC204 300-400 0,4
O-CNB-GABA 262 308 0,16
Ru(bpy)2(GABA)2 488 450 0,04
λλλλ irrad (nm)
450
450
450
450
348 -------
-------
-------
-------
-------
-------
-------
-------
-------
81
Menor basicidad PPh3 > PPh2Me > PPhMe2 > PMe3 Mayor basicidad
Se puede ver que a medida que aumenta el número de fenilos de la fosfina,
disminuye su basicidad. Existe una tendencia entre la basicidad del ligando y la
posición de la banda MLCT. A mayor basicidad del ligando la banda MLCT se corre
hacia regiones de menor energía (mayor longitud de onda), mientras que a menor
basicidad del ligando, la banda se corre hacia regiones de mayor energía (menor
longitud de onda). Esto puede verse en la tabla 6.1 comparando las longitudes de onda
de máxima absorción de los primeros cuatro complejos. Además, como ya fue
explicado, a mayores energías de la transición, mayor es la probabilidad que decaiga
fotoliberando los ligandos monodentados, es decir, mayor será su eficiencia cuántica.
En cuanto a las particiones octanol agua, se pudo ver que los complejos de
GABA resultaron menos lipofílicos que sus cloro-complejos precursores. Esto indicaría
que éstos últimos presentan una mayor tendencia a interactuar con las membranas
celulares. En la tabla 6.2 se detallan los coeficientes de partición octanol agua
registrados para los complejos de GABA y los complejos de cloro.
Tabla 6.2. Comparación de los coeficientes de partición octanol agua obtenidos para todos los
complejos presentados en este trabajo. Los resultados se muestran de a pares (complejo de
cloro- complejo de GABA). La flecha roja indica lipofilicidad creciente.
17
Compuesto
[Ru(bpy)2PMe3Cl]+
KOW
0,03
[Ru(bpy)2PPhMe2Cl]+ 0,22
[Ru(bpy)2PPh2MeCl]+ 1,1
[Ru(bpy)2PMe3GABA]+
[Ru(bpy)2PPhMe2GABA]+
[Ru(bpy)2PPh2MeGABA]+
[Ru(bpy)2PPh3Cl]+
[Ru(bpy)2PPh3GABA]+
<10-3
0,06
0,15
0,26
82
En la tabla se puede observar una tendencia entre el número de fenilos de la
fosfina utilizada como ligando y la lipofilicidad del complejo resultante. A medida que
se sustituyó un fenilo por un metilo en la fosfina, el complejo resultó cada vez más
hidrofílico, indicado por una disminución en un orden de magnitud en el coeficiente de
partición octanol agua. Esto demuestra que el uso de fosfinas polares provoca un efecto
apreciable en la lipofilicidad del compuesto.
Este abordaje experimental permitiría, a partir de este trabajo, generar nuevas
líneas de investigación basadas en la reducción de la toxicidad de esta clase de
complejos utilizando otro tipo de fosfinas polares (hidroxiladas, carboxiladas, etc) y de
esta forma ampliar el espectro de compuestos disponibles para utilizar como
dispositivos moleculares en experimentos biológicos. A su vez, se podría analizar la
posibilidad de incluir modificaciones en las bipiridinas de la molécula, de manera de
aumentar la versatilidad de las características de los complejos.
Biocompatibilidad de los complejos
Cuando se pone una solución de complejo de GABA en contacto con material
biológico durante un experimento y se realiza fotólisis para la liberación del enjaulado,
la muestra está en contacto con tres especies químicas: el complejo de GABA que no se
fotolizó, y los productos de cloro y acuo. Estos productos se forman cuando el GABA
es liberado y su posición en el complejo es ocupada por un cloruro o una molécula de
agua. La proporción que se forme de cada uno va a depender en parte de las
características del medio donde se realiza la fotolisis. El complejo de cloro es la especie
más hidrofóbica (ver Kow) y por lo tanto es la candidata a ser la especie que más
interactúe con la membrana plasmática y por consiguiente resulte la más tóxica.
83
Los complejos sintetizados a partir de trimetilfosfina, dimetilfenilfosfina y
difenilmetilfosfina: [Ru(bpy)2PMe3Cl]+, [Ru(bpy)2PPhMe2Cl]+, [Ru(bpy)2PPh2MeCl]+
presentaron menor toxicidad que el complejo de trifenilfosfina ([Ru(bpy)2PPh3Cl]+).
Los resultados de los experimentos de citotoxicidad realizados por el método
de MTT, mostraron que los cuatro complejos resultaron inocuos a concentraciones
menores o iguales a 100 µM para los dos tiempos de incubación estudiados.
Por otro lado, para los tratamientos de 90 minutos con soluciones de 500 µM de
los distintos complejos, se observó que salvo para la solución de [Ru(bpy)2PPh3Cl]+, el
restos de los tratamientos con los otros complejos de cloro no presentaron diferencias
significativas con respecto al control. Esto sugiere que a concentraciones del orden de
500 µM los complejos sintetizados a partir de metilfosfinas resultan inocuos para
cultivos celulares.
El hecho que tratamientos con estas concentraciones de complejo no hayan
producido muerte celular, no implica que los complejos no estén interactuando con las
membranas celulares. Es importante aclarar que las pruebas de viabilidad celular, son
solo ensayos que permiten detectar toxicidad por muerte celular, pero no dan
información en cuanto a la interacción del complejo con las membranas plasmáticas.
Para poder evaluar este fenómeno, hubiese sido necesario estudiar la interacción
complejo membrana de manera directa. Para ello se podría haber medido la variación de
la resistencia de la membrana celular antes y después de tratarlas con distintas
concentraciones de los complejos.
Sin embargo, integrando los resultados obtenidos para las pruebas de toxicidad
con los resultados de los coeficientes de partición octanol agua, se pudo observar una
correlación directa entre estos resultados, lo cual sugiere que la causa directa de la
84
toxicidad es la interacción con la membrana plasmática. De todas formas, más ensayos
son necesarios para determinar el mecanismo implicado en la toxicidad.
Todos los complejos presentados en este trabajo resultaron tóxicos cuando
fueron utilizados en concentraciones de 1 mM. El complejo de trifenilfosfina
([Ru(bpy)2PPh3Cl]+) resultó el más tóxico, no pudiendo registrar supervivencia celular
luego del tratamiento. En cambio, para los complejos de metilfosfinas, si bien los
tratamientos con éstos presentaron diferencias significativas respecto al control
resultaron significativamente menos tóxicos que el complejo de trifenilfosfina.
Por otra parte, si bien en este trabajo no se presentan pruebas de funcionalidad
para los complejos de metilfosfinas, el Dr. Darcy Peterka de la Universidad de
Columbia, confirmó que estos complejos no presentan actividad biológica en oscuridad.
Todos estos resultados indican que el uso de fosfinas polares para el diseño de
complejos enjaulados de GABA de baja toxicidad, resultó una buena estrategia para
reducir la toxicidad del complejo sin variar en gran medida su eficiencia cuántica.
Concluyendo, se ha logrado sintetizar una familia de complejos enjaulados de
GABA de alta eficiencia cuántica, que liberan las moléculas con actividad biológica
luego de irradiar con luz visible. Los complejos obtenidos a partir de metilfosfinas
presentan una menor toxicidad que el complejo obtenido a partir de trifenilfosfina. Estos
nuevos complejos representan una plataforma conveniente para el desarrollo de nuevos
complejos enjaulados de baja toxicidad para otras moléculas con actividad biológica. La
obtención compuestos de menor toxicidad permitirán ampliar su rango de uso para
experimentos in vivo.
85
7 ANEXO
Figura 2 Resistencia de entrada de neuronas piramidales en presencia (trazo rojo) o
ausencia (trazo azul) de [Ru(bpy)2PPh3Cl]+
Figura 1 Esquema del espectro UV-Visible. Se puede ver que de 400 a 750 nm el espectro
corresponde al rango de luz visible, para longitudes de ondas menores a 400 nm
corresponde con el espectro ultravioleta y longitudes de onda mayores a 750 nm
corresponden con el espectro Infra Rojo. Además, se muestra marcada dentro del espectro
de luz visible, la longitud de onda del LED utilizado en este trabajo para fotoliberar los
complejos.
LED de450 nm
86
Figura 2 Resistencia de membrana de neuronas piramidales de la capa 2/3 de rodajas
coronales de corteza visual de ratón en presencia (trazo rojo) o ausencia (trazo azul) de
una solución 400 µµµµM del complejo [Ru(bpy)2PPh3Cl]+. Se puede observar que en presencia
de cloro complejo hay una marcada reducción en la resistencia de la membrana,
indicando que la presencia del compuesto produce un aumento en la corriente de fuga.
Esto indicaría que el complejo interactúa con las membranas celulares (Zayat, 2008).
87
Figura 3 Curva corriente voltaje. El estudio fue realizado sobre neuronas piramidales de
rodajas de cerebro de ratón. En los ejes se grafica corriente (pA) en función del potencial
de membrana (mV). Se muestran los valores obtenidos para las conductancias antes y
después de tratar con una solución 1mM de [Ru(bpy)2(m-TPPMS)Cl].
a
b
c
88
Figura 4 Síntesis, caracterización y ensayo funcional del [Ru(bpy)2PPh3GABA]+
publicado en la revista ChemBioChem.
89
Figura 5 Catalogo de TOCRIS para el complejo [Ru(bpy)2PPh3GABA]+.
90
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93
INDICE
1 RESUMEN ........................................................................................ 2
2 INTRODUCCIÓN............................................................................. 32.1 Compuestos enjaulados ................................................................................... 32.2 Complejos de rutenio como “jaulas” .............................................................. 62.3 El neurotransmisor ácido �-amino butirico ................................................ 112.4 Complejos enjaulados de GABA................................................................... 132.5 Biocompatibilidad de los complejos.............................................................. 14
3 HIPOTESIS Y OBJETIVOS .......................................................... 16
4 MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................... 174.1 Síntesis ........................................................................................................... 174.2 Caracterización química: UV-visible (UV-Vis), fotólisis, ResonanciaMagnética Nuclear (RMN) , voltametría cíclica y partición octanol-agua. ........ 264.3 Set up Time-Lapse......................................................................................... 284.4 Cultivos Celulares.......................................................................................... 294.5 Ensayo de toxicidad MTT ............................................................................. 304.6 Experimento con ovocitos de Xenopus laevis. ............................................... 31
5 RESULTADOS................................................................................ 335.1 Síntesis, caracterización, estudio de toxicidad y estudios funcionales enovocitos de Xenopus laevis del complejo [Ru(bpy)2PPh3GABA]+. ...................... 335.2 Diseño y síntesis de jaulas de rutenio a partir de fosfinas sulfonadas. ........ 495.3 Complejos enjaulados de GABA sintetizados a partir de metilfosfinascomerciales. ........................................................................................................... 555.4 Comparación global de los complejos enjaulados de GABA ....................... 69
6 DISCUSIÓN .................................................................................... 74
7 ANEXO............................................................................................ 85
8 BIBLIOGRAFÍA............................................................................. 90
94