ESTREPTOCOCOSLos estreptococos son organismos anaerobios facultativos y Gram Positivos que a menudo aparecen formando cadenas o por pares y son catalasa-negativa (los estafilococos son catalasa positivos). Los estreptococos se subdividen en grupos mediante anticuerpos que reconocen a los antgenos de superficie. Estos grupos incluyen una o ms especies. Las agrupaciones de estreptococos ms importantes son A, B, y D. Entre los grupos de estreptococos, la enfermedad contagiosa (especificamente faringitis) es causada por el grupo A, el cul se enfatiza aqu. Streptococcus pneumoniae (es la causa principal de pulmona humana), Streptococcus mutans y otros estreptococos llamados viridans (entre las causas de caries dental) no pertenecen a grupos antignicos. Despus del crecimiento de estreptococos en agar con sangre de oveja se observan tres tipos de reaccin de hemlisis (alfa, beta, gamma). La hemlisis alfa se refiere a una lisis parcial de eritrocitos que produce una coloracin verde que se observa alrededor de las colonias (debido a la liberacin de un producto de degradacin de la hemoglobina llamado bili-verdina); la hemlisis beta se refiere a un halo de hemlisis completamente claro y la hemlisis gama se refiere a la ausencia de hemlisis. Los estreptococos del grupo A y B son beta hemolticos, mientras que D es generalmente alfa o gamma. Los Streptococcus pneumoniae y viridans ("verde") son alfa-hemolticos. Por lo tanto la reaccin de hemlisis es importante para la clasificacin de los estreptococos. La reaccin de hemlisis junto con otra de las caractersticas fisiolgicas es suficiente para una identificacin clnica presuntiva.Estreptococo del grupo A (S. pyogenes)Este organismo causa tradicionalmente faringitis supurativa pero no invasiva y menos frecuentemente infecciones en la piel, el imptigo. A mediados de los 1900, las serias complicaciones de las infecciones por estreptococos del grupo A comenzaron a declinar drsticamente y han disminuido ya en la dcada de los 70's. Por lo tanto el inters por este microorganismo disminuy. En los aos 80's y 90's, ha habido un resurgimiento de la "fiebre reumtica" clsica (enfermedad del corazn no supurativa) pero tambin surgieron nuevas formas de enfermedad estreptococal las cuales incluyen a la bacteremia invasiva y al sndrome de choque txico (como se ha visto con S. aureus) y la conocida bacteria carnvora.Las infecciones de estreptococos del grupo A afectan todas las edades con incidencia mxima de 5-15 aos de edad. Las complicaciones serias (incluyendo fiebre reumtica y bacteremia invasiva) pareca que afectaban primariamente aquellos individuos con defectos importantes en su sistema inmune (incluyendo nios, personas de edad avanzada y pacientes inmuno-comprometidos). Sin embargo, hoy en da es claro que los nios y adultos previamente saludables, una vez que se infectan estn definitivamente en riesgo de presentar complicaciones graves.Fiebre reumtica. La fiebre reumtica, es una enfermedad inflamatoria que afecta principalmente el corazn y las articulaciones. Aunque es severa puede tomar un periodo de tiempo para desarrollarse. El mecanismo de la inmunopatolga crnica de la fiebre reumtica no se ha resuelto. La protena M presenta reaccin cruzada con la miosina del corazn y esto conduce a autoinmunidad. Aunque la pared celular de los estreptococos del grupo A es altamente resistente a la degradacin en el hospedero. Estos antgenos persisten in vivo por meses y experimentalmente causan enfermedades que se asemejan a la artritis y a la carditis reumatoide. La artritis reumtica no se debera confundir con la enfermedad reumtica ms comn la artritis reumatoide. La terapia temprana de las infecciones de la garganta usando penicilina, disminuye la incidencia del desarrollo subsecuente de carditis reumtica.Glomerulonefritis aguda. Esta es una enfermedad inmunolgica compleja del rin.Fiebre Escarlatina. El sarpullido tpico es causado por la toxina eritrognica (pirognica) que est codificada a nivel de fagos.Bacteremia y choque txico. Las formas recientemente descritas de la enfermedad (que algunas veces resultan fatales) presentan un sndrome parecido al choque txico (incluyendo sarpullido, fiebre y la invasin de fluidos desde el torrente sanguneo hacia tejidos perifricos, que da como resultado edema ) y/o miositis necrotizante y fasciitis. La produccin de toxinas pirgenicas (A, B y C) son el sello de estas cepas. La toxina pirognica es un superantgeno (un mitgeno) que acta sobre las clulas T, causando activacin no especfica del sistema inmune. Esto puede estar implicado en la patognesis. Esta enfermedad an es poco comn pero puede progresar rpidamente (en el termino de pocos das) y pone en peligro la vida. Caractersticas generales de la patognesisLa identidad de la adhesina que permite la adherencia al epitelio respiratorio (va fibronectina) es controversial. El cido lipoteicoico se localiza en la membrana celular de muchas bacterias. Para el estreptococo del grupo A mucho cido lipoteicico tambin esta presente en las fimbrias del exterior de la clula. Un trabajo clsico sugiere que el cido lipoteicoico es la adhesina del grupo A, aunque ms recientemente se ha sugerido que ese papel lo realiza la "protena F (de unin a fibronectina). El estreptococo del Grupo A en ausencia del fibringeno que fija complemento al encontrarse con la lamina de peptidoglicano y en ausencia de anticuerpos, ya no es fagocitado. La protena M (que tambin se encuentra en las fimbrias) se une al fibringeno del suero y bloquea la unin del complemento con la capa mas interna del peptidoglicano. Esto permite la sobrevivencia del microorganismo debido a la inhibicin de la fagocitosis. Sin embargo, en individuos que son inmunes, los anticuerpos neutralizantes que reaccionan contra la protena M causan la fagocitosis misma que resulta en muerte del micro organismo. Este es el mecanismo principal por el cual la inmunidad es capaz de detener las infecciones del estreptococo del grupo A. Las vacunas contra la protena M son por lo tanto un candidato de importancia que se puede usar contra la fiebre reumtica. Clsicamente se haba considerado que la cpsula del estreptococo del grupo A posee limitada actividad antifagoctica. Muchas de las cepas virulentas recientemente descritas son altamente mucoides y sus cpsulas son importantes en la patognesis. Desafortunadamente, ciertos tipos de la protena M presentan reaccin antignica cruzada con protenas del corazn y esto puede ser responsable de carditis reumtica. El temor que se tenia de adquirir autoinmunidad lo ha inhibido positivamente el uso de las vacunas contra el estreptococo del grupo A. Sin embargo, distintos eptopes protectores contra aquellos de reaccin cruzada ya se han definido y la disponibilidad de una vacuna parece ms probable. Las protenas M varan antignicamente entre las cepas; por lo tanto la inmunidad contra una protena M no implica inmunidad general contra todas las cepas de S. pyogenes. La tipificacin por protena M junto con otros antgenos (T y R) se usan en la serotipificacin.

ESTAFILOCOCOSElestafilococo es un microrganismo (bacteria) que puede causar infecciones en cualquier parte del cuerpo, pero la mayora de stas son infecciones de la piel. Los estafilococos pueden infectar aberturas en la piel, como araazos y granos o quistes cutneos. Cualquiera puede contraeruna infeccin por estafilococos. Los pacientes de los hospitales pueden contraer infecciones por estafilococos de la piel: En cualquier lugar donde un catter o sonda ingrese a su cuerpo. Esto abarca sondas pleurales, sondas vesicales, vas intravenosas (IV) o vas centrales. En heridas quirrgicas, lceras de decbito (tambin llamadas escaras de decbito) o lceras de los pies. Una vez que el estafilococo entra en el cuerpo, puede propagarse a los huesos, las articulaciones y la sangre. Tambin se puede diseminar a cualquier rgano, como los pulmones, el corazn o el cerebro. El estafilococo tambin puede propagarse fcilmente de una persona a otra. Infecciones por estafilococos en el hospitalLa mayora de los estafilococos se propagan por el contacto de piel a piel (tocarse). Un mdico, el personal de enfermera, otro profesional de la salud o incluso los visitantes pueden tener estafilococos enel cuerpo y luego transmitrselos a un paciente. Esto puede suceder cuando: Un profesional de la salud porta el estafilococo en la piel como bacteria normal. Un mdico, el personal de enfermera, otro profesional de la salud o un visitante toca a un paciente que tiene una infeccin por estafilococos. Una persona desarrolla una infeccin por estafilococos en casa y trae esta bacteria al hospital. Si la persona luego toca a otro paciente sin lavarse las manos primero, los estafilococos se pueden propagar. Adems, un paciente puede tener una pequea infeccin por estafilococos antes de venir al hospital. Esto puede ocurrir incluso sin que el pacientesea consciente de ello. En pocos casos, los pacientes pueden contraer infecciones por estafilococos al tocar ropa, lavamanos y otros objetos que contengan los microbios. Un tipo de estafilococo, llamado Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM), es difcil de tratar. Esto se debe a que al SARM no lo destruyen los medicamentos empleados para tratar los estafilococos ordinarios.

Cules son los factores de riesgo de infeccin por estafilococos?Muchas personas sanas tienen normalmente el estafilococo enla piel. La mayora de las veces, ste no causa infeccinni sntomas. Esto se llama ser colonizado con estafilococos. Estas personas son conocidas como portadores y pueden propagarle el estafilococo a otros. Algunas personas que son colonizadas por los estafilococos desarrollan una infeccin real por estafilococos que los enferma. Los factores de riesgo comunes para desarrollar una infeccin grave por estafilococos son: Estar en un hospital u otro tipo de centro mdico durante mucho tiempo. Tener un sistema inmunitario debilitado o una enfermedad continua (crnica). Tener una cortadura o lcera abierta. Tener un dispositivo mdico dentro del cuerpo como una articulacin artificial. Inyectarse drogas ilcitas. Tener contacto cercano o vivir con una persona que tenga estafilococos. Someterse a dilisis renal. Cmo sabe si tiene una infeccin por estafilococos? En cualquier momento que un rea dela piel aparezca roja, hinchada o con costra, la causa puede ser una infeccin por estafilococos. La nica manera de saber con certeza es hacer un examen llamado un cultivo de piel. Para hacer el cultivo, el mdico puede utilizar un hisopo de algodn para recoger una muestra de una herida abierta, una erupcin o una lcera cutnea. La muestra tambin puede tomarse de una herida, la sangre o el esputo (saliva). La muestra se enva al laboratorio para su anlisis. Prevencin de las infecciones por estafilococos en el hospitalLa mejor manera de prevenir la propagacin del estafilococo es que todo el mundo mantenga las manos limpias. Es importante lavarse las manos apropiadamente. Mjese las manos y las muecas, luego aplique jabn. Frtese bien el dorso, las palmas, los dedos de las manos y entreellos hasta que el jabn haga espuma. Enjuague hasta limpiar con agua corriente. Squese con una toalla de papel limpia. Use una toalla de papel para cerrar el grifo.Tambin se pueden usar geles a base de alcohol si las manos no estn visiblemente sucias. Estos geles debenser depor lo menos60% de alcohol. Utilice suficiente gel para humedecerse las manos por completo. Frote las manos hasta que estn secas. Pdales a los visitantes que se laven las manos antes de entrar en su habitacin en el hospital. Ellos tambin deben lavarse las manos al salir del cuarto. Los trabajadores de salud y otro personal del hospital pueden prevenir la infeccin por estafilococos: Lavndose las manos antes y despus de tocar a cada paciente. Usando guantes y otra ropa protectora cuando traten heridas, vas intravenosas y catteres, y cuando manejen lquidos corporales. Utilizando siempre la tcnica estriladecuada. Limpiando oportunamente despus decambios de apsitos (vendajes), procedimientos, cirugas y derrames. Utilizando siempre el equipo y la tcnicaestril al atenderpacientes y cuidar equipos. Revisando e informando con prontitudsobre cualquier seal de infecciones de heridas. Muchos hospitales estimulan a los pacientes a preguntarle al personal mdico si se han lavado las manos. Como paciente, usted tiene derecho a hacerlo. Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM)SARM corresponde a Staphylococcus aureus resistente a meticilina. Es unabacteria estafiloccica que no mejora con la primera lnea deantibiticos que normalmente curalas infecciones por estafilococos.Cuando esto ocurre, la bacteria es "resistente" al antibitico.CausasLa mayora de las bacterias estafiloccicas se propagan por contacto de piel a piel (tocarse). Un mdico, una enfermera, otro profesional de la salud o los visitantes pueden tener estafilococos en su cuerpo que puede propagarse a un paciente. Una vez que el estafilococo entra en el cuerpo, puede propagarse a los huesos, las articulaciones, la sangre o cualquier rgano, como los pulmones, el corazn o el cerebro. Las infecciones graves por estafilococos son ms comunes en personas con un sistema inmunitario debilitado. Esto incluye pacientes que: Se encuentren en hospitales y centros de convalecencia durante mucho tiempo. Estn con dilisis renal (hemodilisis). Reciben tratamiento para el cncer o medicamentos que debiliten su sistema inmunitario. Se inyecten drogas ilcitas. Se sometieron a una ciruga el ao pasado. Las infecciones porSARM tambin se pueden producir en personas sanas que no hayan estado recientemente en el hospital. La mayora de estas infecciones por SARM son en la piel o menos comnmente infecciones pulmonares. Las personas que pueden estar en riesgo son: Los atletas y otras personas que pueden compartir elementos tales como toallas o mquinas de afeitar. Nios en guarderas. Miembros de las fuerzas armadas. Personas que se hayan hecho tatuajes. SntomasEs normal que las personas sanas tengan estafilococos en su piel. A muchos de nosotros nos pasa. La mayora de las veces, no causan una infeccin ni ningn tipo de sntoma. Esto se denomina "colonizacin" o "ser colonizado". Alguien que es colonizado con el SARM puede propagarlo a otras personas.Un signo de una infeccin cutnea por estafilococoses un rea de piel roja, hinchada y adolorida. Puede haber secrecin de pus u otros lquidos de esta rea y sta puede lucir como un fornculo. Estos sntomas tienen mayor probabilidad de presentarse si la piel se ha cortado o frotado porque esto le brinda a la bacteria del SARM una ruta para "entrar". Los sntomas tambin son ms probablesen reas donde hay ms vello corporal debido a los folculos pilosos.Las infecciones por SARM en los pacientes que se encuentran en centros mdicos tienden a ser graves. Estas infecciones por estafilococos puedendarse en el torrente sanguneo, el corazn, los pulmones u otros rganos, la orina o en el rea de una ciruga reciente. Algunos sntomas de estas infecciones graves son: Dolor torcico Tos o dificultad para respirar Fatiga Fiebre y escalofros Sensacin de malestar general Dolor de cabeza Salpullido Heridas que no sanan Pruebas y exmenesEl mdico puede ordenar un "cultivo". Se trata de una muestra de una herida, sangre, orina o esputo (escupitajo). La muestra se enva al laboratorio para su anlisis, el cual se puede demorar unos das.TratamientoDrenar la infeccin de la piel puede ser el nico tratamiento necesario para una infeccin cutneapor Staphylococcus aureus que no se hayadiseminado. Un mdico debe realizar este procedimiento. No intente reventar o drenar la infeccin usted mismo. Mantenga cualquier llaga o herida cubiertas con un vendaje limpio.Las infecciones por SARM graves son cada vez ms difciles de tratar. Los resultados de la prueba de laboratorio le indicarn al mdico con qu antibitico setratar la infeccin. El mdico seguir las pautas sobre los antibiticos a utilizar y mirar su historia clnica. Las infecciones por SARM que son ms difciles de tratar son aquellas en: Los pulmones o la sangre Las personas que ya estn enfermas o que tienen un sistema inmunitario debilitado Usted tal vez necesite seguir tomando estos antibiticos durante un largo tiempo, incluso despus de salir del hospital.Grupos de apoyoPara obtener informacin acerca de SARM, ver el sitio web de los Centros para el Control y Prevencin de Enfermedades: www.cdc.gov/mrsa/.PronsticoEl pronstico de una persona depende de la gravedad de la infeccin y de su estado general de salud. La neumona y las infecciones de la sangre relacionadas con SARM estn asociadas con tasas de mortalidad altas.Cundo contactar a un profesional mdicoConsulte con el mdico si tiene cualquier herida que parece empeorar en lugar de sanar. PrevencinLa mejor manera de prevenir la propagacin del estafilococo es que todo el mundo mantenga sus manos limpias. Es importante lavarse las manos correctamente. Los trabajadores de la salud y otro personal del hospital pueden prevenir los estafilococos. Los visitantes tambin deben tomar medidas para prevenir la propagacin de microbios. Si tiene planeada unaciruga, comntele al mdico si: Tiene infecciones frecuentes. Ha tenido una infeccin por SARM antes.

MICROSCOPIATCNICAS ESPECIALES DE MICROSCOPAUna de las finalidades de la microscopa es permitir observar los especmenes de la mejor manera posible, logrando un buen balance entre el contraste y la resolucin. Esto es de extrema utilidad en muestras incoloras, tales como las clulas vivas, que en su estado natural son transparentes y con poco contraste, en las cuales los detalles permanecen invisibles a pesar de la resolucin. Esto se debe a que las clulas incoloras absorben muy poca luz y por lo tanto en un microscopio de campo claro no se ven correctamente. Hay clulas (eritrocitos por ejemplo) que poseen pigmentos propios que le confieren color y contraste suficientes, pero esto es la excepcin. Desafortunadamente, con los microscopios compuestos de campo claro ordinarios, no se puede lograr un buen contraste de clulas vivas no coloreadas. Los microscopios de campo claro se denominan as debido a que las muestras son observadas en un campo brillante muy iluminado, en el cual, el contraste se sacrifica a expensas de la resolucin y viceversa, limitndose por ejemplo el estudio de clulas y tejidos vivos, en los cuales la adicin de sustancias qumicas para incrementar el contraste puede provocar cambios o modificaciones en la estructura de la clula e incluso producirle la muerte. El inters de observar clulas vivas radica en la posibilidad de captar procesos vitales en pleno desarrollo, tales como la motilidad, la divisin, la fagocitosis y muchos otros. Estas particularidades han motivado a los investigadores a buscar mtodos para incrementar el contraste con la finalidad de obtener imgenes de clulas vivas con ms detalles. De ordinario, en el microscopio convencional, esto se puede lograr de cierta manera si se reduce la apertura del diafragma o se disminuye la cantidad de luz; con estas maniobras se incrementa el contraste, pero lamentablemente tambin se reduce seriamente la resolucin y la nitidez. Durante aos los investigadores han buscado los procedimientos para resolver estas limitaciones al estudiar tanto clulas incoloras como clulas teidas, llegando a aplicar mtodos sencillos que logran incrementar el contraste sin afectar tanto la resolucin. Por ejemplo, cuando la finalidad es tomar micrografas en blanco y negro, aplicando las tcnicas de fotografa convencional se aumenta el contraste empleando filtros de colores y esto ha sido de gran utilidad. En especmenes coloreados de rojo, el empleo de un filtro verde oscurece las reas rojas e incrementa el contraste, pero aclara las reas teidas con colorantes verdes (15). Ms recientemente, con el empleo de programas informticos de digitalizacin y edicin de imgenes, las micrografas de clulas incoloras pueden ser tratadas mejorando de manera significativa el contraste (fig. 6-1), sin embargo, para observar ms detalles en los especmenes vivos necesariamente hay que emplear otros mtodos pticos de contraste ms sofisticados (12). En este sentido, las limitaciones presentadas por los microscopios compuestos ordinarios han sido superadas mediante el diseo y fabricacin de microscopios particulares o de accesorios especiales, notablemente en lo que a sistema de iluminacin se refiere; ya sea empleando otro tipo de fuente luminosa o utilizando filtros para modificar la energa lumnica empleada y modificando la conformacin de los condensadores. Estas modificaciones han permitido la creacin de diversos microscopios cuyas funciones amplan las posibilidades del microscopio compuesto estndar, lo que permite obtener otros datos ms all de los lmites de la microscopa fotnica convencional.

Se han diseado tcnicas microscpicas ms complejas que incrementan el contraste sin afectar la resolucin. Son artificios que proporcionan efectos pticos en la muestra, permitiendo que aquellos detalles que pasan desapercibidos se traduzcan en cambios de intensidades luminosas las cuales si pueden ser reconocidas por el ojo humano.

SIEMBRAS Y CULTIVOCmo se realiza el cultivo? Sembrar es colocar una muestra de inculo, en un medio de cultivo para obtener el crecimiento de los microorganismos. Para ello se extiende la muestra sobre caja de Petri, que contiene un gel (Agar) al que se han aadido las substancias que necesitan los microorganismos para crecer. A esto lo llamamos medio de cultivo. A veces se aaden otras clases de sustancias; por ejemplo, para impedir el crecimiento de otras bacterias que podran contaminar el cultivo. La siembra se puede hacer en otros tipos de medios de cultivo, como tubos de vidrio con gel, frascos con lquidos nutritivos para los microorganismos. A continuacin se procede a la "incubacin" del medio ya sembrado. En cada caso se hace en condiciones particulares de presin de oxgeno, temperatura, agitacin, duracin, etc. Muchas de las bacterias patgenas crecen bien a temperaturas cercanas a los 37C habituales de nuestro organismo. Si el cultivo bacteriano tiene xito, crecern "colonias" de bacterias en el medio de cultivo. Estas colonias tienen caractersticas de color, forma, tamao etc. propias de cada bacteria y esto nos ayuda a identificarlas. Tambin se puede someter a las bacterias de las colonias a pruebas bioqumicas o de otro tipo para lograr su identificacin. Algunas bacterias son muy difciles de cultivar, otras tardan mucho tiempo en crecer y algunas, finalmente, no se han conseguido cultivar. Sistemas de Siembra: Antes de iniciar la siembra se deben cumplir determinadas condiciones: Esterilizacin de los instrumentos de trabajo y de los medios de cultivo. Los medios de cultivo se esterilizan con calor hmedo en la autoclave y los materiales de vidrio se esterilizan con calor seco en el horno Pasteur. En el caso de objetos metlicos, como el asa de siembra, que se esterilizan en el momento de su utilizacin, se mantienen en la llama hasta que se pongan al rojo, teniendo la precaucin de enfriarlos antes de su uso. Que el inculo no se contamine, modifique o destruya para lo cual se utiliza calor directo, flameando las bocas de los tubos de ensayo, matraces, la pipeta y dems elementos antes y despus de su utilizacin. Esterilizacin del rea de trabajo para evitar contaminaciones durante el manejo del instrumental y de los medios de cultivo. Se utilizan la cmara de flujo laminar. Si no se dispone de ella, se utiliza un mechero Bunsen que, debido a que fuerza la circulacin del aire en sentido vertical y hacia arriba, es capaz de crear un ambiente semisteril en la zona inmediata alrededor y debajo de la llama, de forma que los riesgos de contaminacin disminuyen considerablemente. Siembra de medio slido a medio lquido Marque correctamente los tubos con el nmero del grupo, sistema de siembra utilizado y la fecha. Para crear un ambiente de esterilidad encienda el mechero y trabaje siempre al lado de el. Esterilice un asa recta a la llama de un mechero y djela enfriar Tome el tubo que contiene la muestra a sembrar, retire la tapa del tubo, flamee la boca del tubo. Introduzca el asa en tubo sin tocar las paredes y tome un poco de colonia del cultivo, flamee nuevamente la boca del tubo, tapelo y dejelo en una gradilla. Tome el tubo de caldo nutritivo estril en el cual va a colocar la muestra, destapelo, flameando la boca el tubo con el mechero e introduzca el asa con la muestra obtenida. Realice movimientos de rotacin con el asa para emulsionar con el caldo las paredes del tubo. Retire el asa, flamee la boca del tubo y tape. Esterilice el asa en el mechero despus de usarla. Incube los tubos a 37C por 24 horas. Observar el crecimiento obtenido. Si no hay crecimiento el caldo queda transparente. Mtodo de aislamiento por siembra por estra en placa. Para obtener un cultivo axnico: (a) esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero, (b) introducirla en la suspensin bacteriana para recoger una muestra, (c) sembrar haciendo estras sobre la superficie de un medio slido en una placa Petri, y (d) volver a esterilizar el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y hacer un segundo grupo de estras en una regin nueva de la placa. Repetir el proceso una tercera y una cuarta vez, hasta conseguir que los grupos de clulas se diluyan y se separen clulas aisladas. (e) Despus de la incubacin, se desarrollan colonias aisladas. Para estar seguro de que el cultivo es puro, repetir el proceso entero; para ello tomar una colonia aislada y sembrar por estras una segunda placa. Siembra de medio lquido a slido. Se procede en la misma forma que en la siembra anterior pero con el asa de argolla. Si la siembra es en tubo recuerde hacer puncin y estra. Si es en caja de Petri puede utilizar diferentes sistemas como estra, agotamiento, rejilla con el fin de lograr un cultivo puro. Siembra de medio slido a slido. Se realiza de la misma forma que en la siembra anterior pero utilizando el asa recta. Los medios slidos contienen agar en proporcin de 1.5 a 2.0% y se emplean para obtener colonias aisladas. Las placas de agar se pueden inocular mediante varios mtodos: como estras, agotamiento y rejilla con el fin de lograr un cultivo puro. Siembra en rejilla. Realice una estra que atraviese el centro del agar. Luego realice estras en ngulo recto con respecto a la estra inicial. Voltee el agar en ngulo de 90 grados y realice estra hasta cubrir todo el agar. Siembra por agotamiento. Tome una placa de agar, marque la base de la caja de petri con los nmeros 1, 2 y 3. Coloque la muestra a sembrar en el numero 1, realice estras hasta la mitad de la caja. Esterilice el asa y gire la caja hasta el numero 2, tome las dos ultimas estras y siga estriando hasta el numero 3. Gire la caja y termine de estriar, tenga cuidado de no tocar las estras ya hechas. Siembra por estras

Tcnica de siembra en medio de cultivo en placa de Petri (a= inicio de la siembra y d= trmino de la siembra) Siembra masiva. Tome un hisopo estril e introdzcalo en el tubo que contiene la muestra a sembrar, luego frote toda la superficie del agar. Le evaluacin del crecimiento en las placas de agar se hace a travs de la observacin de colonias en la superficie.

Siembra en agar inclinado. Esta se realiza por puncin y por estra. Por puncin: Introduzca el inoculo con el asa recta hasta el fondo del medio con un solo movimiento y teniendo cuidado de hacer el mismo trayecto de entrada que de salida. Por estra: Extienda el inoculo sobre el agar inclinado deslizando suavemente el asa por la superficie en forma de zigzag. No olvide flamear la boca del tubo antes y despus de la siembra. Evalu la presencia de crecimiento en el agar por la formacin de una pelcula o por el crecimiento de colonias en la superficie. Siembra en profundidad. Marque la caja de petri estril con el nmero de grupo, la fecha y siembra en profundidad. Abra ligeramente la caja de Petri cerca del mechero. Abra un tubo con cultivo de bacterias y con ayuda de una pipeta de Pasteur plstica, transfiera 1 ml de ste cultivo a la base de la caja de petri estril. Descarte la pipeta en el frasco de boca ancha con clorox. Vierta un poco de agar nutritivo en la caja de Petri, tape la caja y luego realice movimientos suaves sobre el mesn, en el sentido de las agujas del reloj, luego al contrario, en forma de L y L invertida, y por ltimo en forma de 8. Esto garantiza una distribucin homognea de las bacterias en todo el agar para facilitar su posterior recuento. Envuelva las cajas de Petri y los tubos con cinta de enmascarar, mrquelos con el nmero de grupo, la fecha. Luego incube 37 c por 48 horas. Entregue al coordinador del laboratorio los cultivos bacterianos usados Tcnica del microcultivo Figura 46. Imagen de la tcnica del microcultivo de microorganismos

Esta tcnica se utiliza en micologa para el estudio de estructuras de los hongos (conidias, ascas, hifas, conidioforos, entre otras) que son muy frgiles y se deterioran fcilmente, al ser obtenidas para su observacin a partir de un macrocultivo comn y corriente. La tcnica consiste en colocar en el interior de una caja de Petri estril unas varillas de vidrio estril y sobre ellas una lmina portaobjetos. Las varillas evitan que la lmina portaobjetos haga contacto con el fondo de la caja de Petri. Luego sobre el portaobjetos se coloca el medio de cultivo slido. Con un asa previamente flameada se siembra el hongo a analizar en el medio de cultivo, despus se cubre con la laminilla cubreobjetos, y se adiciona en el fondo de la caja de Petri agua destilada estril para mantener una atmsfera hmeda. Despus se procede a la incubacin a la temperatura requerida y por el tiempo necesario. Luego de incubado se retira con cuidado la laminilla cubreobjetos teniendo en cuenta que en ella se encuentra adherido el hongo. Se monta la laminilla con el hongo a estudiar sobre un portaobjeto y se procede a su observacin en fresco, o se prepara un frotis con una preparacin permanente.

SIEMBRAS Y AISLAMIENTOTCNICAS BSICAS PARA EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS: SIEMBRA Y ESTUDIO DE BACTERIAS INTRODUCCINPara efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseado diversos mtodos que permiten cultivarlos bajocondicione artificiales, en los que es posible cultivarlos bajo condiciones experimentales y manejar un solo tipo demicroorganismo. Una de las tcnicas ms usadas en el laboratorio de microbiologa consiste en transferir unamuestra microbiolgica de un ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener cultivosmicrobianos. A l efectuar este procedimiento, es necesario considerar que en el rea de trabajo, existen muchos otros microorganismos; debido a esto, es necesario tomar precauciones para impedir que stos penetren ycontaminen los cultivos en estudio. Por otra parte, para considerar no slo el aspecto nutricional, sino tambin lascondiciones ambientales de su hbitat natural, por lo que en el medio de cultivo se debe ajustar el pH yconcentracin de sales y durante la incubacin condiciones tales como la temperatura, aireacin, la luminosidad. La aplicacin de estos procedimientos ha permitido propagar a los microorganismos en cultivos mixtos, as comosu aislamiento y la obtencin de cultivos puros, facilitando de este modo, el estudio, caracterizacin, aplicacin y control de los mismos. La forma de sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propsitoespecfico del estudio.Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de ste en medios de cultivo ycondiciones de laboratorio controladas. La poblacin de microorganismos desarrollada en un medio se denominacultivo. Cuando ste contiene una sola especie de microorganismo, se denomina cultivo puro o axnico, cuandocontiene ms de una especie de microorganismos se denomina cultivo mixto..Un cultivo tipo contiene una especie conocida de microorganismos y es conservada en el laboratorio para realizar diversos ensayos y estudios.Un cultivo axnico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola clula. Los cultivos axnicosson muy raros en la naturaleza. En los medios naturales -por ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humano-existen cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies de forma conjunta.Un cultivoaxnico se obtiene artificialmente en el laboratorio. A la hora de obtener un cultivo axnico se han de tomar precauciones especiales, ya que los microorganismos estn por todas partes, en la naturaleza, en el laboratorio yen los instrumentos y recipientes usados en los experimentos. Estos microorganismos no deseados ocontaminantes deben ser eliminados de un cultivo para que ste pueda ser axnico. El segundo paso paraobtener un cultivo axnico es inocular o introducir, una sola clula de un microorganismo en un medio slido o liquido, esterilizado previamente. De esta manera, aislamos un solo microorganismo del resto y se podrmultiplicar en condiciones favorables. Un clon est constituido por una poblacin de clulas descendientes de unsolo microorganismo. Una colonia es un clon lo suficientemente grande como para ser visible sobre la superficiede un medio slido.Un cultivo microbiano que ha estado creciendo por cierto tiempo en el mismo tubo o matraz, debe ser transferidoa un medio de cultivo nuevo, de otra manera el crecimiento y sobrevivencia no pueden continuar. En estatransferencia se deben considerar dos aspectos bsicos referentes a: no introducir microorganismos indeseables(contaminantes) y concentracin o carga microbiana de la muestra (inculo) a sembrar.Dispositivos empleados en la transferencia de muestras microbianas:Los utensilios utilizados para la transferencia de muestras son los siguientes:Hisopo, pipeta (para uso microbiolgico sonterminales y la parte superior o boquilla debe estar protegida con filtro de algodn), pipeta pasteur, cable de Kolle o portasa con alambre de platino dispuesto en forma de: aguja, asa, esptula y/o gancho.En la transferencia de microorganismos se emplean agujas, asas de inoculacin, hisopos, pipetas o pipetaspasteur que debern esterilizarse previamente. La utilizacin de estos dispositivos, as como de los diferentes medios de cultivo tienen aplicaciones especficas. Por ejemplo:Los medios lquidos se preparan en tubos o matraces que se cubren con tapones de algodn o tapones especiales. Un cultivo lquido puede ser transferido mediante un asa microbiolgica, un hisopo, pipeta o pipeta pasteur; el inculo se deposita dentro del caldo o medio lquido. En este tipo de cultivos los microorganismos presentan un desarrollo particular que se manifiesta en la superficie o a travs de todo el lquido. Una de las ventajas que presenta este tipo de cultivo se refiere a laposibilidad de agitarlos acelerando la velocidad de microorganismos anaerobios, por otra parte, en este tipo de cultivos, las poblaciones se encuentran suspendidas y e fcil homogenizarlas, lo que permite estandarizar laconcentracin del inculo. La desventaja que presentan, es que en ellos e difcil detectar contaminacin a simple vista.Los medios semislidos se preparan en tubos, se inoculan con aguja de siembra (asa recta) o pipeta pasteur; en este ltimo caso es necesario calentar el medio y cuando se encuentra en estado lquido y a una temperatura de aproximadamente 42C se agrega el inculo, se homogeniza y se deja solidificar. Estos medios se emplean para estudiar la movilidad de los microorganismos y para favorecer la separacin de microorganismos con diferentes requerimientos de oxgeno.Los medios slidos se preparan en tubos o matraces dependiendo de la cantidad o de las necesidades, despusde esterilizarlos, estos se inclinan o vierten en cajas de petri. La siembra se realiza con el asa, inoculando lasuperficie del agar con mucha suavidad; en estos medios, los microorganismos al multiplicarse forman agregados que se hacen visibles a simple vista; a estos agregados se les denominan colonias, las que presentancaractersticas que varan con el tipo de microorganismo cultivado y el medio de cultivo empleado. En cualquier medio de cultivo es de primordial importancia ajustar el pH, ya que an cuando la mayora de losmicroorganismos crecen mejor en pH neutro, algunos requieren de pH alcalino o cido, por lo que al proporcionar un pH adecuado se favorecer el crecimiento del microorganismo de inters y la obtencin del cultivo. Con este mismo propsito durante la incubacin se deben proporcionar las condiciones adecuadas para el microorganismoen estudio. El crecimiento ptimo de los microorganismos se presenta a temperaturas que la mayora de las veces estn relacionadas con la de su hbitat natural. Algunos microorganismos crecen por debajo de 15C, otros requieren temperaturas ms elevadas (30 a 45C) y algunos hasta 80C. Para alcanzar y mantener estas temperaturas se puede usar una incubadora microbiolgica o un bao de agua a temperatura constante, en tanto que para lo microorganismos que presentan su crecimientoptimo a temperaturas entre 20 y 25C se pueden incubar en la gaveta o cajn del laboratorio, a temperaturaambiente. En general las incubadoras microbiolgicas satisfacen las necesidades en cuanto a los rangos de temperatura requeridas por los microorganismos. La desventaja que tienen es que estos aparatos funcionan con are seco, lo que determina la deshidratacin de los medios de cultivo. Por lo tanto, el crecimiento de cualquier cultivo experimental que se realice en incubadora no debe prolongare por ms de nueve das.Con relacin a las necesidades gaseosas, no todos los microorganismo crecen en presencia de oxgeno atmosfrico; los que slo crecen en presencia de are se llaman aerobios obligados; los que slo crecen en ausencia de oxgeno sedenominan anaerobios obligados o estrictos, un tercer grupo se adapta a las dos condiciones y se le conocecomo facultativos. Existe una cuarta categora que comprende bacterias que requieren oxgeno, pero slo loutilizan cuando ste existe en concentraciones reducidas; a estos se les llama microaeroflicos.El desarrollo de estos diferentes grupos se favorece mediante la agitacin de los cultivos o mediante la exclusin de oxgeno para lo que se emplean sustancias reductoras o equipos especiales.Las bacterias son organismos procariticos, se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, habitan enel agua, el suelo, en la superficie o en el interior de plantas y animales incluyendo al hombre. Pueden vivir en forma libre o en simbiosis con otros organismos, ya sea como parsitos, comensales o mutualistas.Fisiolgicamente este grupo presenta caractersticas muy variables, hay bacterias mviles e inmvilesfotosintticas y quimiotrficas, auttrofas y hetertrofas; se desarrollan en un rango muy amplio de temperatura, pH y condiciones gaseosas. En el estudio de cultivos bacterianos algunos de los criterios que se emplean para caracterizarlas incluyen: tamao, morfologa celular, forma de agrupacin, reaccin a la tincin de Gram, formacin de esporas, movilidad, presencia de inclusiones de reserva y caractersticas culturales en medios lquidos y slidos en los que presentan patrones de desarrollo en cuanto a la forma, tamao, elevacin y color de las colonias.Tcnicas de siembraMtodo de siembra por estra en placaEs el mtodo ms fcil y el ms usado para obtener cultivos axnicos. Para ello, con un asa de siembra se tomauna muestra de la poblacin mixta y a continuacin se hacen estras sobre la superficie de un medio slidopreparado en una placa Petri (a las placas Petri tambin se les denomina simplemente placas). Conforme se van haciendo estras en zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menosmicroorganismos. A continuacin, se flamea el asa, se toca en la regin donde se han realizado las ltimasestras y se contina la siembra con la misma tcnica, en la superficie de medio sin sembrar an. Repitiendo esteproceso varias veces se logra separar clulas individuales. A continuacin, las placas se incuban en un lugar adecuado, permitiendo que las clulas aisladas experimenten un nmero suficiente de divisiones para formar colonias visibles. Aunque cada colonia posiblemente representa un clon derivado de una sola clula, no podemos asegurarlo. Quizs, dos clulas quedaron depositadas tan juntas que han originado una nica colonia mixta. Por tanto, para asegurarnos de que hemos obtenido un cultivo axnico, conviene repetir el procedimiento a partir deuna colonia bien aislada en la primera placa. Las colonias que se desarrollen la segunda vez, sern, casi con todaseguridad, cultivos axnicos.Mtodos de vertido en placa y extensin en placaEn estos mtodos, las suspensiones de clulas microbianas se diluyen antes de su siembra en placa. Se siguenestas tcnicas cuando la muestra contiene tantos microorganismos, que la dilucin no se puede realizar en una sola etapa. Por ejemplo, una suspensin con mil millones de clulas por mililitro debe ser diluida 10veces paraobtener una suspensin con un centenar de clulas por mililitro, Por tanto, se realizan diluciones seriadas (envarias etapas), normalmente de diez en diez, pero a veces de cien en cien.Para realizar diluciones de diez endiez, se aade 1 ml de la suspensin bacteriana a 9 ml (de medio estril o solucin salina, igualmente estril. Se agita vigorosamente para diluir las clulas y el proceso se repite cuantas veces sea necesario. A continuacin, sepuede proceder de dos maneras diferentes.En el mtodo de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar fundido y se vierten en placa. Algunas colonias quedarn embebidas en el agar y otras crecern en la superficie. Las colonias superficiales se extendern y sern ms grandes.En el segundo mtodo (extensin en placa), las muestras diluidas se siembrandirectamente en la superficie de la placa de agar, extendindolas con avuda de un asa de Diralsky de cristal estril. La suspensin se absorbe en el agar, dejando las clulas microbianas sobre la superficie. En ambas tcnicas las placas se incuban hasta la aparicin de las colonias. Como en el mtodo de siembra por estra, no existe la seguridad de que las colonias que aparecen en las placas sembradas por extensin o en el agar solidificado sembrado por el mtodo del vertido en placas sean cultivos axnicos hasta que se repita el proceso. Las dos tcnicas de siembra por dilucin presentan la ventaja de que permiten obtener un mayor nmero decolonias aisladas que el mtodo de siembra por estra, por tanto se eligen cuando se ha de seleccionar una cepa a partir de una mezcla con varios tipos de microorganismos. Para obtener un cultivo axnico mediante este mtodo:(a) Hacer diluciones seriadas de la suspensin bacteriana hasta obtener una muestra con slo unos pocoscientos de bacterias-(b) verter la muestra en un tubo con agar a sobrefusin, mezclar y verter el contenido en una placa Petri.(c) Despus de la incubacin, se desarrollan colonias en el agar (ms pequeas) y en su superficie (ms grandes).Mtodo de aislamiento por siembra por estra en placa: Para obtener un cultivo axnico:(a) esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero.(b) introducirla en la suspensin bacteriana para recoger una muestra.(c) sembrar haciendo estras sobre la superficie de un medio slido en una placa Petri, y(d) volver a esterilizar el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y hacer un segundo grupo de estras enuna regin nueva de la placa. Repetir el proceso una tercera y una cuarta vez, hasta conseguir que los grupos de clulas se diluyan y se separen clulas aisladas.(e) Despus de la incubacin, se desarrollan colonias aisladas. Para estar seguro de que el cultivo es puro, repetir el proceso entero; para ello tomar una colonia aislada y sembrar por estras una segunda placa. 3.2.4 El crecimiento de los cultivos axnicosUna vez que se obtiene un cultivo puro, normalmente se ha de propagar (se le hace crecer de nuevo). Seguramente, el investigador desear obtener ms clulas para poder trabajar con ellas. Para cultivar microorganismos en el laboratorio, se ha de preparar un medio de cultivo, lquido o slido, con todos los nutrientes necesarios para su crecimiento. Los medios slidos se hacen generalmente, aadiendo agar a los lquidos (LA IMPORTANCIA DE SER CULTIVO PUROTodos los microbilogos saben que han de trabajar con cultivos axnicos (puros) para que sus experimentos sean significativos. Pero incluso los microbilogos ms experimentados han cometido errores alguna vez. Esto le sucedi a Ralph Wolfe, uno de los microbilogos americanos ms distinguidos.En 1960 Wolfe obtuvo un cultivo puro de la bacteria Methanobacillus omelianskii. Este microorganismo es anaerobio estricto, capaz de producir metano (gas natural). Wolfe quera conocer de qu manera M. omelianski produca gas metano a partir de etanol y anhdrido carbnico. El procedimiento estaba claro; tena que lisar la bacteria y aislar las enzimas que catalizan la reaccin, en un tubo de ensayo. Esto, aunque suena bastante simple, haba sido intentado previamente por otros investigadores y todos haban fracasado. Wolfe lo intent durante todo un ao y tampoco tuvo xito. De repente lo consigui: una solucin de enzima. sintetizaba metano en un tubo de ensayo! Se trataba de un descubrimiento espectacular, hasta que un colega se pregunt si el cultivo era axnico.Wolfe decidi volver a aislar el culfivo, pero en vez de aadir etanol yanhdrido carbnico al mismo, aadi hidrgeno y anhdrido carbnico. En el nuevo medio se desarrollaron colonias, pero cuando se transfirieron al medio con etanol y anhdrido carbnico no crecieron. Qu haba sucedido? Un colega, M.J. Wolin, se dio cuenta de lo que estaba sucediendo. Aunque M. omelianskii originaba colonias uniformes y aisladas en el medio original, se trataba de una mezcla de dos bacterias. Una, designada cepa S, converta el etanol en hidrgeno gas. La otra, designada cepa M, converta el hidrgeno gas y el anhdrido carbnico en metano. Ninguna de las dos poda crecer sola con etanol y anhdrido carbnico. Todos los experimentos de Wolfe se haban realizado con un cultivo mixto y tuvieron que repetirse para averiguar qu enzimas pertenecan a la cepa S y cules a la cepa M.Qu leccin puede aprenderse de la historia de Wolfe? Primero, que los problemas tcnicos (tales como obtener un cultivo axnico), aunque son tan bsicos que se explican en los textos introductorios, son reales e importunan a los ms prestigiosos investigadores. Segundo, que incluso un buen microbilogo puede equivocarse. Algunas especies pueden crecer juntas (para formar un consorcio) y parecer un cultivo axnico cuando realmente no lo son.