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El uso de secuenciamiento de alto
rendimiento para identificación y
detección de patógenos en plantas
Lima, 2020
Taller Internacional: Emergencia fitosanitaria en el cultivo de papa en
Ecuador y sus implicancias para el Perú y la región Andina: Punta
Morada, psílido de la papa y manchado interno de la papa
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Métodos para detectar patógenos de plantas
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Primera generación(1977)
Método SANGER
Próxima generación (NGS)o alta rendimiento (HTS).(2005)
Tecnologíasbasadas en PCR
Tecnologíasde secuenciación de moléculasindividuales
Aunque las tecnologías HTS usan diversos procesos químicos para incorporación y detención, comparten dos pasos básicos:• preparación de liberarías de fragmentos/amplicones• detección de los nucleótidos incorporados
(Shokralla et al 2012)3
Que es el secuenciamiento de alta
rendimiento (HTS o NGS)
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Que es el secuenciamiento de alta
rendimiento (HTS o NGS)?
~500 US$/genoma de
phytophthora
infestans
(resequencing >30x)
~300 US$/genoma de
bacteria (de novo
~50x)
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✓Amplia y gran adopción de etiología: desde 2009, >100
nuevos virus y 400+ publicaciones
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Protocolo de laboratorio
Extracción de ARN
Usa la fracción de ARN pequeño para preparar
librerías
Envío a proveedor
- secuenciamiento
Análisis Bio-informático: VirusDetect v1.7
1 semana, 96 muestras
<1 día cola + 3 días
3-5
día
s
~20-40 US$/muestra
~ 30 US$/muestra
<1 U
S$/
muest
ra*
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sRNA reads
Host-derived sRNA reads
Unmapped sRNA reads
Contigs
Non-redundant contigs
Alignment to host sequences
Contigs
Alignment to reference virus
database &
reference-guided
assembly
De novo assembly
Non-redundant contigs(base error corrected)
Concatenate and remove redundancy
Alignment of sRNA reads back to contigs & correct base errors
virus
Contigs without hit
BLASTN against virus nucleotide database
Undetermined contigsvirus
BLASTX against virus protein database
Alignment to host sequences
Unmapped contigsHost-derived contigs
Facilitando el análisis bio-informático:
VirusDetect Windows
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Bajo precio y análisis automático hace
posible prospección de patógenos
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Xylella fastidiosahttps://doi.org/10.1094/PDIS-08-18-1433-RE
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Patógenos foliares de soyahttps://doi.org/10.1094/PDIS-05-18-0905-RE
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Arrowhead yellowsDOI:10.3969/j.issn.2095-1191.2019.03.19
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Basado en la secuencia del patógeno identificado
se puede diseñar ensayos rápidos específicos
Portable
and battery
operated
For simple sap
extraction
BioRanger
Easy to
interpret
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Resumen
HTS ya es ampliamente aplicado para identificar
nuevos patógenos, también en plantas
Su sensibilidad y rapidez y aplicación genérico tienen
grandes ventajas frente a otros métodos de
identificación de patógenos
Nuevos programas bioinformáticas hacen el análisis
más fácil para no especialistas.