Efecto de la manipulación del fotoperíodo en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss ), la calidad del huevo: Un estudio genómico

E. Bonnet-  un ,

J. Montfort  una ,

D. Esquerre  b ,

K. Hugot  b ,

A. Fostier  una ,

J. Bobe  una , , 

el INRA, UR1037 SCRIBE, IFR 140, Ouest-Genepole, F-35000, Rennes, Francia

b INRA, DGA, UMR 314, CRB GADIE, Jouy en Josas, F-78350, Francia

http://dx.doi.org/10.1016/j.aquaculture.2007.04.027  , Cómo citar o enlazar Usando DOI

Permisos y reimpresiones

Abstracto

El propósito de este estudio fue investigar el efecto de desove avanzada fotoperiodo en

la calidad del huevo y huevo transcriptome. La experimentación se realizó con 2

grupos de la trucha arco iris ( Oncorhynchus mykiss ) de una cepa de otoño-desove. En

2003, un primer grupo de mujeres fue expuesto, después de su primer desove natural,

a un régimen de fotoperíodo largo-corto a partir de enero (grupo manipulado

fotoperíodo, PM de grupo, n  = 17), resultando en una segunda reproducción en junio-

julio. Un segundo grupo de hembras logra su primera reproducción en el otoño (2003)

y se utilizó como control ( n  = 25). Para cada uno, la calidad del huevo hembra se

evaluó por la supervivencia de monitoreo mirando a (E) y la resorción de saco vitelino

(YSR), así como la aparición de malformaciones en YSR. Se observó una disminución

significativa de la calidad de los huevos en el grupo AM. La supervivencia a mirando

era 49 ± 18% (media ± IC del 95%) en el grupo PM, mientras que se observó un ± 3%

de supervivencia a 93 en el grupo control. En YSR, las frecuencias de alevines vivos

que presentan ningún tipo de malformación notable fueron 37 ± 16% en el grupo de

PM y 84 ± 5% en el grupo de control. Este aumento de la mortalidad se asoció con una

mayor variabilidad individual entre las hembras y un aumento de malformaciones

observadas en alevines vivos.Estas malformaciones se caracterizan sobre todo por

defectos de saco vitelino resorción (48% de malformaciones observadas en PM

grupo). El análisis de transcriptoma se ha realizado mediante microarrays de nylon que

muestran 9.152 trucha arco iris cDNA manchado. Análisis diferencial permitió la

identificación de 6 genes significativamente menos abundantes en los huevos PM que

en los huevos de control. Estos resultados sugieren que la manipulación del fotoperiodo

de la fecha de desove puede inducir defectos significativos calidad del huevo. Por otra

parte, el transcriptoma del ovocito no fertilizado parece estar influida por

perturbaciones ambientales, como el régimen de fotoperíodo, y parece ser el reflejo de

la capacidad de desarrollo de huevo después de la fertilización.

Palabras clave Fotoperíodo ;

La calidad del huevo ;

Malformaciones ;

Microarray ;

MRNA materna ;

Oncorhynchus mykiss

1. IntroducciónCalidad de los huevos de pescado se puede definir como la capacidad de óvulo para

ser fertilizado y para dar lugar posteriormente al desarrollo de un embrión normal. No

sólo las tasas de mortalidad en diferentes etapas de desarrollo embrionario y larval,

sino también malformaciones larvas deben tenerse en cuenta para evaluar plenamente

la calidad del huevo ( Brooks et al., 1997 para una revisión). En la naturaleza, o en

condiciones de cría, las variaciones en la calidad del huevo son considerables

( Bromage et al., 1992 ).Mejoras del conocimiento de las diferencias serían de gran

valor económico para los criaderos ( Lee, 2003 ).

La mayoría de los datos dedicados a la calidad del huevo de pescado es complejo

debido al uso de condiciones experimentales variables y los tratamientos de los

reproductores. Además, la calidad del huevo se ha estudiado principalmente en

relación con las variaciones de las características del huevo intrínsecas, tales como

antecedentes genéticos ( Su et al., 1997 ), la composición del huevo ( Craik y Harvey,

1984  y Craik, 1985 tamaño), o huevo ( Springate y Bromage, 1985 ). De hecho,

muchos estudios han tratado de vincular composición yema y el éxito en el desarrollo

observada después de la fertilización ( Kjørsvik, 1994 y  Brooks et al., 1997 para una

revisión). Sin embargo, aparte de algunos parámetros bioquímicos relacionados con las

actividades metabólicas ( Lahnsteiner y Patarnello, 2004 ), el posible papel de los

componentes citoplásmicos no yolky acumula durante la ovogénesis, tales como las

proteínas estructurales y reguladoras, el contenido de gránulos corticales y mRNAs

(ARNm), ha recibido mucha menos atención (Brooks et al., 1997 ). Sin embargo, los

ARNm maternos son esenciales para el desarrollo embrionario temprano ( Dworkin y

Dworkin-Rastl, 1990  y  Nagler, 2000 ). Al igual que en otros animales, algunos mRNAs

materna están involucrados en las células germinales embrionarias formación en el

pescado ( Hashimoto et al., 2004 ), pero otros ARNm de ovocitos, como los que

participan en la regulación del crecimiento, podrían ser necesarias para garantizar un

desarrollo temprano normal ( Yang et al., 1999 ). Por lo tanto, en los embriones de dos

células de la especie bovina, una relación entre el embrión competencia de desarrollo,

evaluada en términos de tiempo de la primera hendidura, y se informó de la expresión

de ARNm de IGF-1 (Lonergan et al., 2000 ). Además, otros estudios mostraron una

relación entre la variación de los niveles maternos de poliadenilación de ARN y la

competencia de desarrollo de oocitos de mamíferos, lo que apunta a una relación entre

la estabilidad del mRNA materna y la capacidad de desarrollo embrionario ( Brevini et

al., 2002 ).

Las variaciones de los factores intrínsecos, por ejemplo yema de composición, se han

planteado la hipótesis de que se correlaciona con los efectos significativos de factores

externos, tales como la dieta hembra durante la ovogénesis. Hasta ahora, los dos más

estudiados factores externos han sido constitución y disponibilidad de alimentos

durante la vitelogénesis ( Izquierdo et al., 2001 ). Se cree que influyen en la calidad del

huevo a través de la yema de construcción de los componentes, y por lo tanto a través

de las tiendas tróficos utilizados durante el desarrollo temprano. Muchos otros factores

extrínsecos tales como los regímenes de fotoperíodo ( Taranger et al., 1998 ), el estrés

( Schreck et al., 2001 ), la temperatura del agua (Davies y Bromage, 2002 ), la

inducción o sincronización de la ovulación ( Gillet et al., 1996  y  ARABACI et al., 2004 ),

el exceso de la maduración de los huevos ( Springate et al., 1984 ) podría actuar a

través de la alteración de la composición del huevo y, especialmente, de los

componentes citoplásmicos no yolky. En efecto, la posibilidad de que los ARNm

específicos también pueden verse afectados por factores externos se ha sugerido

seriamente por un trabajo previo tratar con el efecto de huevo envejecimiento post-

ovulatorio en los niveles de mRNA de muchos genes (~ 40) en huevos de trucha arco

iris ( Aegerter et . al, 2005 ).

Estudios previos llegaron a la conclusión de que la calidad de la trucha arco iris

gametos no parece verse afectada por las manipulaciones de fotoperiodo ( Bromage et

al., 2001 ). Sin embargo, estos trabajos se centraron en el impacto de las

manipulaciones fotoperiodo sobre la fecundidad femenina. En efecto, mientras que el

peso de ovocitos, número y tamaño se utilizaron para caracterizar cada desove, no se

realizó la estimación de las capacidades de desarrollo de huevo. Debido al amplio uso

de esta técnica en acuicultura para manipular la fecha de desove, el presente estudio

tiene como objetivo (1) explorar el efecto de la manipulación del fotoperíodo en la

trucha arco iris y la calidad de los huevos (2) el análisis de los posibles vínculos entre el

transcriptoma huevo y capacidades de desarrollo después de la fertilización .

A tal efecto, la trucha arco iris de una cepa de otoño-desove fueron expuestos a un

régimen fotoperíodo utilizado en piscifactorías para obtener una reproducción

avanzada durante el comienzo del verano. El desarrollo embrionario se controló con

especial interés para la supervivencia mirando en (E) y en la resorción etapas del saco

vitelino (YSR). Malformaciones morfológicas notables observados en YSR también

fueron monitorizados cuidadosamente. Al mismo tiempo, para cada hembra, huevo

transcriptome se analizó mediante la trucha arco iris cDNA microarrays.

2. Materiales y métodos

2.1. Animales

Hombres y mujeres de la trucha arco iris de una cepa de otoño-desove se celebraron

bajo fotoperiodo natural hasta su primera reproducción en el INRA granja experimental

(Sizun, Francia). Para el experimento, se realizaron los peces en 4 m 3 tanques

suministrados con el río Elorn agua resultante en un rango de temperatura de 7-18 ° C

( Fig. 1 ). Todos los peces recibieron una dieta similar.

. Figura 1.  Efecto del fotoperíodo en época de desove de la trucha arco iris hembra de una

cepa de otoño-desove. Los dos paneles inferiores muestran los regímenes de fotoperiodo

(curva) y el número de hembras en desove (barras) en el grupo control (  n  = 25) y el grupo

de fotoperíodo manipulada (PM grupo, n  = 17). El panel superior (T) muestra la temperatura

del agua, que es la temperatura del río (Elorn, Francia, línea continua) hasta que la

transferencia a un sistema de agua reciclada de la PM (línea discontinua) y de control (línea

de puntos) grupos.

Opciones Figura

Manipulado grupo Fotoperíodo (PM): Después de una primera reproducción en el otoño

de 2002, los peces fueron aisladas en los tanques a prueba de luz para ser expuestos a

un fotoperiodo artificial en 2003. A partir del 15 de enero, se celebraron los peces bajo

una luz constante (24L: 0D) de 490 ° C el día. Comenzando el 27 de marzo, se celebró

a continuación, bajo fotoperiodo corto (8L: 16D) hasta la ovulación (1230 ° C el día).Luz

fue suministrado por 4 tubos de neón (58 W).

Grupo control: Las mujeres y los hombres lograron su primera reproducción en otoño

de 2003.

2.2. Recogida de gametos

Tres a cuatro semanas antes de la ovulación se esperaba, los peces de los dos grupos

se transfirió a un sistema de recirculación de agua a 12 ° C en las instalaciones de INRA

(Rennes, Francia) ( . Fig. 1 ). Para ambos grupos, un descenso progresivo de la

temperatura del agua (0.5 ° C / día) se realizó con el fin de alcanzar los 12 ° C. Cada

pez se pesó y etiquetada de forma individual. Antes de cada manipulación, los peces

fueron anestesiados en 0,05% 2-fenoxi-etanol. Las hembras fueron revisadas para la

ovulación 3 veces a la semana. Cinco días después de la ovulación detectada, los

huevos se recogieron en tubos de plástico estériles de 50 mL por el manual de

extracción. Dos lotes de 5 ml de los huevos (aproximadamente 100 a 200 huevos por

grupo) se utilizaron para la fertilización, mientras que 10 lotes de 20 huevos no

fertilizados se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a - 80 ° C hasta el

análisis posterior transcriptómica.

En cada día de recolección de huevos, las muestras de semen se obtuvieron de 10

machos adultos con el fin de fertilizar los huevos con una piscina de esperma. Después

de la eliminación de la orina de la vejiga de la orina, las muestras de esperma fueron

cuidadosamente obtenerse a través de presión manual sobre el abdomen y se

mantuvieron a 4 ° C antes de su uso.

2.3. La fertilización y el desarrollo temprano

La fertilización se realizó como se ha descrito previamente con modificaciones menores

( Aegerter et al., 2004b ). Brevemente, inmediatamente antes de la fertilización, se

descartó el fluido celómico y los huevos se lavaron con 5 ml de 10 ° C Ovafish ®

solución de lavado (IMV, L'Aigle, Francia). Después de la eliminación de solución de

lavado (. Mediante el vertido de los huevos en un colador de plástico), 5 l de un

espermatozoide se pipetearon en los huevos, y 5 ml de solución de 10 ° C Actifish ®

(activación de la motilidad del esperma solución salina; IMV, L'Aigle, se añadieron

inmediatamente Francia). El esperma utilizado fue un grupo proveniente de 10 machos

diferentes. Después de 5 min, Actifish ® se drenó y los huevos fertilizados fueron

transferidos en bandejas de incubación compartimentadas suministrados por agua

recirculada (10 ° C). La temperatura del agua y la química se monitorizaron de forma

rutinaria y se mantienen constantes durante todo el período de incubación. Huevos

muertos y los embriones fueron retirados periódicamente y las tasas de supervivencia

se expresaron como porcentajes del número inicial de huevos utilizados para la

fertilización. La supervivencia a los mirando (150 ° C día) y la finalización de la

reabsorción de saco vitelino (YSR, 550 ° C día) fueron monitoreados. La ocurrencia de

malformaciones morfológicas notables de torsión (la médula espinal, la cabeza o

malformaciones aleta caudal, etc) en YSR se expresó como un porcentaje de alevines

vivos presentes en YSR. Se expresó el número de alevines vivos y normal (ANA) en YSR

como un porcentaje de huevos fertilizados. Además, la ocurrencia de tipos específicos

de malformaciones fue grabado en YSR.

Datos sobre la calidad del huevo se analizaron estadísticamente mediante Khi-dos

pruebas. El nivel de significación utilizado en todas las pruebas fue p  <0,05.

2.4. La extracción de RNA

Las extracciones se realizaron como se ha descrito previamente ( Aegerter et al.,

2004b ) con modificaciones menores. El ARN total se extrajo a partir de 20 huevos no

fertilizados usando 9 ml de Trizol (Invitrogen) en tubos de polipropileno de 13 ml

estériles. Cada extracción de RNA fue seguido por una purificación en columna

(Macherey Nagel, Francia) con el fin de obtener la calidad del ARN genómico de

grado. Para cada muestra de huevo, se obtuvieron, se reunieron y se precipitaron con

acetato de sodio (3 M, pH 5,2) para aumentar la concentración de ARN tres extractos

de ARN. Por lo tanto, cualquier muestra de ARN utiliza para el análisis de

transcriptómica se originó a partir de 60 huevos no fecundados de una hembra

individual.

2.5. cDNA microarrays

Microarrays de nylon (7,6 × 2,6 cm) se obtuvieron de INRA-GADIE (Jouy-en-Josas,

Francia) el centro de recursos. Un conjunto de 9152 la trucha arco iris cDNA clones

procedentes de una biblioteca combinada de tejido ( Aegerter et al., 2004a ) fueron

vistos después de la amplificación por PCR. Los productos de PCR fueron vistos en

Hybond N + membranas como se ha descrito previamente ( Nguyen et al., 1995 ). Los

controles positivos (luciferasa) y negativo (agua) también fueron vistos en cada

microarray.

2.6. Hibridación

Cuatro muestras de ARN procedentes del grupo de control y 14 muestras de ARN

procedente de la PM grupo se utilizaron para la hibridación de microarrays de acuerdo

con el siguiente procedimiento. Una primera hibridación se realizó utilizando un

oligonucleótido marcado con 33P (que está presente en la extremidad de cada

producto de PCR) para estimar la cantidad de ADNc en cada punto. Después de

extracción (3 h 68 ° C, 0,1 X SSC, 0,2% SDS), hibridaciones se llevaron a cabo como se

ha descrito previamente ( Bertucci et al., 1999 ), con modificaciones menores, en el

INRA IFR140 instalación transcriptómica (Rennes). Brevemente, las matrices se

hibridaron previamente durante 1 hora a 65 ° C en solución de hibridación (5X solución

de Denhardt, 5X SSC, 0,5% SDS). Sondas de cDNA marcadas se preparan a partir de 3

g de ARN por transcripción inversa simultánea y etiquetado durante 1 hora a 42 ° C en

presencia de 50 Ci [alfa-33P] dCTP, 5 mM dCTP, 0,8 mM de cada dATP, dTTP, dGTP y

200 unidades de M-MLV superíndice RNasa H-transcriptasa inversa (Gibco BRL) en 30 l

volumen final. ARN fue degradado por tratamiento a 68 ° C durante 30 min con 1 l 10%

de SDS, 1 l de EDTA 0,5 M y 3 l de NaOH 3 M, y después se equilibró a temperatura

ambiente durante 15 min. La neutralización se llevó a cabo mediante la adición de 10 l

1 M Tris-HCl además de 3 l de HCl 2 N. Las matrices fueron incubadas con los

correspondientes ADNc marcadas desnaturalizadas durante 18 horas a 65 ° C en

solución de hibridación. Después de 3 lavados (1 h 68 ° C, 0,1 X SSC 0,2% SDS), arrays

fueron expuestos 65 horas a las placas de fósforo de imágenes que luego fueron

escaneados utilizando un FUJI BAS 5000. Intensidades de señal se cuantificaron

utilizando el software ArrayGauge (Sistemas FujifilmMedical, de Stanford, CT).

2.7. Microarrays de análisis de datos

El procesamiento de señales se lleva a cabo utilizando los datos de oligonucleótidos del

vector para corregir la cantidad relativa de ADN presente en cada lugar. En este paso,

las señales de oligonucleótidos bajas (inferiores a tres veces el nivel de fondo) fueron

excluidos del análisis. Después de la corrección, la señal se normalizó dividiendo cada

valor de la expresión génica por el valor de la mediana de la matriz. Los datos se

normalizaron posteriormente por el algoritmo más bajo ( Cleveland, 1979 ) antes de

ser analizados utilizando el software estadístico SAM ( Tusher et al., 2001 ).

3. Resultados

3.1. Ovulaciones

Las hembras del fotoperíodo manipulada (PM) grupo ( n  = 17) ovularon en junio y julio,

3 meses antes que el grupo control ( n  = 25). Se observó el pico de la ovulación en

julio en lugar de noviembre para el grupo de control ( . Fig. 1 ). En el momento de la

ovulación, los pesos corporales de peces fueron mayores en el grupo de PM que en el

control (2620 ± 300 g vs 1.810 ± 260 g, media ± SD).

3.2. La calidad del huevo en los grupos de control y PM

3 Los parámetros utilizados para evaluar la calidad del huevo mostraron diferencias

significativas entre los 2 grupos. En mirando, PM grupo exhibió un 49 ± 18% (media ±

IC del 95%) la supervivencia embrionaria, mientras que un 93 ± 3% ( p  <0,001,

puntos en la Fig. 2. A) se observó la supervivencia en el grupo de control. Esta

diferencia aumentó aún más al saco vitelino resorción (YSR). El porcentaje de alevines

vivos que no presentan malformaciones notables (ANA, vivo y alevines normal) fue de

37 ± 16% para el grupo de PM, mientras que se observó un ± 5 ANA porcentaje 84

para el grupo control ( p  <0,001, puntos en la figura. 2 Un ). Frecuencia de alevines

con formato incorrecto también fue mayor para el grupo de PM (15 ± 8%) que para el

grupo de control (5 ± 2%, puntos en la figura. 2 B).

. Figura 2.  Comparación de los parámetros de calidad de huevo entre el control ( n  = 25) y el

fotoperiodo manipulados (PM, n  = 17) grupos. A - diagrama de caja de supervivencias

mirando a (190 ° C día) y vivo y alevines normal (ANA) en el saco vitelino resorción (YSR, 550

° C día) expresada como un porcentaje de huevos fertilizados. B - diagrama de caja de

malformaciones morfológicas como porcentaje de alevines vivos en YSR.

Opciones Figura

En YSR, la distribución de tipos de malformaciones fue ligeramente diferente entre los

dos grupos ( . Fig. 3 A y B). Las abundancias relativas de malformaciones como una

torsión de la médula espinal, un defecto prognate u otras malformaciones conocidos no

fueron significativamente diferentes entre PM y los grupos de control ( Fig. 3 A). Sin

embargo, Cíclope se observaron sólo en el grupo de control. Además, se observó una

mayor proporción de YSR incompleta (48%) en el grupo de PM, aunque no

significativamente diferente del control ( p  = 0,057).

. Figura 3.  Los tipos específicos de malformaciones morfológicas observadas en alevines vivos

al saco vitelino resorción (550 ° C el día). A - malformaciones específicas como porcentaje de

alevines vivos en el grupo control y el fotoperíodo manipulada (PM) de grupo. B - Descripción

de los 6 tipos de malformaciones morfológicas identificadas: C, Cyclops. SCT, la torsión

médula espinal. DYSR, defecto en la reabsorción del saco vitelino. P, prognate.

Opciones Figura

En contraste con el grupo de control, se observaron grandes diferencias en términos de

calidad de los huevos entre las 17 hembras utilizados en el grupo de PM ( Fig.. 2 ). De

hecho, la supervivencia mirando varió de 0% a 99%. Estas diferencias se

incrementaron aún más en el YSR. En esta etapa, el porcentaje ANA permitió la

identificación de 3 sub-grupos en PM grupo ( Fig.. 4 A). Un primer sub-grupo de 7

hembras mostró una proporción de ANA que van desde 0% a 8%. Un segundo

subgrupo de 6 hembras mostró una proporción de ANA que van desde 29% a 44%. Un

último sub-grupo de 5 hembras mostró una proporción de más del 71% de ANA.

. Figura 4.  Representación de la supervivencia individual y las malformaciones observadas en

el saco vitelino-resorción (550 ° C el día) en el fotoperíodo manipulada (PM) de grupo.  A -

alevines vivos y normal (ANA) como un porcentaje de huevos fertilizados. B - malformaciones

morfológicas como porcentaje de alevines vivos a YSR en grupos extremos (alto y bajo).

Opciones Figura

3.3. Análisis de microarrays

Entre los 9.216 puntos, 8.422 mostraron intensidades significativamente más altas que

el fondo. 85% de las secuencias (7134 clones) presenta alguna similitud con genes ya

conocidos en la trucha arco iris o de otras especies. Las secuencias restantes (1288

clones) no mostró homología significativa con otras secuencias registradas en bases de

datos públicas.

El análisis estadístico entre PM y los grupos de control con plomo a la identificación de

6 ARNm significativamente más abundantes en las muestras de control que en las

muestras PM (Tasa de Falso Descubrimiento 15%). Después de la identificación de los

clones correspondientes, secuencias fueron blasted contra la base de datos GenBank

NR para identificar Descripción de golpe gen ( Tabla 1 ).

. Tabla 1 Las transcripciones que muestran una menor abundancia en el grupo manipulado

fotoperíodo relación con el control (la tasa de falso descubrimiento: 15%)

GenBank adhesión #

Descripción de Hit (especies) Hit acceso #

AA% de identidad de secuencia

Símbolo La abundancia relativa

CA377449 Amino-ácido N sub-unidad-acetiltransferasa ( Danio rerio )

NP_955844 92% MAK10 0.65

GenBank adhesión #

Descripción de Hit (especies) Hit acceso #

AA% de identidad de secuencia

Símbolo La abundancia relativa

BX886170 Precursor glucagón II ( trucha arco iris )

AAC59668 90% GLP2 0.61

CA353335 Producto proteico Sin nombre (Tetraodon nigroviridis )

CAF96769 78% 0.37

CA351681 El triptófano hidroxilasa 1 ( Danio rerio )

AAN59951 75% TPH1 0.67

BX080208 Proteína predicha ( Danio rerio )

XP_691908 67% 0.66

CA381309 Péptido: N -glicanasa ( Homo sapiens )

AAF74720 51% NGLY1 0.64

Adhesión GenBank números correspondientes de la trucha arco iris cDNA clones se

muestran. Después BlastX contra la base de datos NR: Descripción de éxito, número de

afectados, y el símbolo de identidad de secuencia se muestran.

Opciones de tabla

4. Discusión

4.1. El momento de la ovulación

En el presente estudio, se observó que un régimen de fotoperíodo largo-corto, cuando

a partir de enero, indujo un desove avanzada ocurren entre junio y julio en lugar de

octubre a noviembre en las condiciones de control. Resultados similares se informó

anteriormente después de un régimen de fotoperíodo largo corto en esta especie

( Bromage et al., 2001 ) y otros ( Takashima y Yamada, 1984  y  Carrillo et al.,

1989 ). El fotoperiodo es conocido por ser el principal factor ambiental controlar el

tiempo de maduración y el desove en la trucha arco iris. Más exactamente, el

momento del desove sería dependiente del arrastre de un ritmo circanual endógeno o

reloj por el cambio fotoperiódico ( Bromage et al., 1992  y  Bon et al., 1999 , para una

revisión). Por lo tanto, nuestras observaciones están en total acuerdo con estos

estudios previos.

4.2. Supervivencia embrionaria

En el presente estudio, un régimen de fotoperíodo largo-corto indujo claramente una

disminución de la supervivencia embrionaria en las dos etapas estudiadas: mirando (E)

y el saco vitelino resorción (YSR).Además, se observó un aumento importante en la

calidad del huevo heterogeneidad entre las hembras en el grupo de PM. En el presente

trabajo se estudió la calidad del huevo en dos grupos de diferentes edades y diferentes

pesos celebrado en las mismas condiciones de temperatura. En efecto, las hembras del

grupo PM eran mayores y exhibieron mayor peso corporal que las hembras del grupo

de control. Sin embargo, no se observó correlación entre el peso de los peces y la

calidad de los huevos en cualquiera de los dos grupos experimentales. Si bien se ha

demostrado que el tamaño del huevo se correlacionó con el peso del cuerpo femenino,

nunca se observó ninguna relación significativa entre el tamaño del huevo y de la

calidad del huevo ( Springate y Bromage, 1985 , Knox et al., 1988 , Bromage et al.,

1992  y  Estay et al., 1994 ).Nuestras observaciones son por lo tanto, en buen acuerdo

con los datos existentes. Por lo tanto, puede ser la hipótesis de que el peso corporal

hembra tenía poca o ninguna influencia en la calidad de los huevos en comparación

con el principal efecto de la manipulación del fotoperíodo en la calidad del

huevo. Además, las mujeres fueron recogidas durante la primera época reproductiva

en el grupo control y durante la segunda temporada reproductiva en el grupo

AM. Estudios previos en la trucha arco iris manifiestan una menor fecundidad y el

tamaño de los huevos de las hembras de primer desove que para las mujeres el

segundo desove. Sin embargo, las tasas de supervivencia no fueron significativamente

diferentes ( Logan y Johnston, 1992 ). En el presente estudio, se observó una menor

calidad de los huevos en la segunda temporada reproductiva. En este contexto, se

puede plantear la hipótesis de que el efecto de este factor (primera o segunda época

reproductiva) en la calidad del huevo, en su caso, es menor en comparación con el

efecto de la manipulación del fotoperíodo.

La mayoría de los estudios existentes sobre manipulación del fotoperíodo y la calidad

de los huevos a menudo involucrados los efectos de una combinación de variaciones

fotoperíodo y la temperatura nombrados cambios fototérmica. De hecho, la mayoría de

los autores coincidieron en que el fotoperíodo se utiliza para controlar la cinética

oogénesis y calendario de ovulación, mientras que la temperatura del agua tuvo

también un efecto modulador sobre la calidad del huevo en Sole ( Solea

solea , Devauchelle et al., 1987), lubina ( Dicentrachus labrax L., Carrillo et al., 1989 ),

la perca amarilla ( Perca flavescens , Ciereszko et al., 1997 trucha arco iris), y ( Breton

et al., 1983  y  Davies y Bromage, 2002 ). En el presente experimento, durante el mes

que precede a la ovulación, la temperatura del agua se mantuvo constante a 12 ° C

para los dos grupos. Esta temperatura se había demostrado que no tienen ningún

impacto negativo en la calidad de los huevos de trucha arco iris ( Pankhurst et al.,

1996  y  Aegerter y Jalabert, 2004 ). En los estudios existentes, cuando los efectos de

los cambios de fotoperiodo podría estudiarse sin condiciones críticas de temperatura

del agua, la mayor parte de los datos disponibles corresponden a las características de

la fecundidad en lugar de un análisis detallado calidad de los huevos. Por lo tanto,

estos estudios no mostraron ninguna variación significativa de la fecundidad mundial,

incluso si se observó una disminución del tamaño de los huevos en la trucha arco iris

( Bon et al., 1997  y  Davies y Bromage, 2002 ). Como se discutió previamente, el

tamaño del huevo no parece tener ninguna correlación significativa con la calidad del

huevo (Knox et al., 1988  y  Bromage et al., 1992 ). En el presente estudio, la calidad

del huevo se controló de forma individual para cada mujer. De hecho, nuestros datos

muestran claramente una disminución significativa de la supervivencia en dos etapas

de desarrollo y un aumento de la variación individual dentro del grupo fotoperíodo-

manipulado. Si se ha demostrado que muchos factores a ser determinantes para la

calidad de los huevos, como el envejecimiento post-ovulatoria ovocito ( Springate et

al., 1984 , Craik, 1985  y  Aegerter y Jalabert, 2004 ) o de alta temperatura del agua

( Pankhurst et al., 1996  y  Aegerter y Jalabert, 2004 ), los regímenes de fotoperiodo

artificial también tienen que ser reconsiderada como importantes factores

determinantes de la variación de la calidad del huevo.

4.3. Malformaciones morfológicas

Correlativamente a la disminución de la supervivencia, se observó un aumento de la

aparición de malformaciones en YSR. Un aumento de malformaciones relacionadas con

una pérdida de la calidad del huevo ha sido ya reportado en el siluro. La frecuencia de

las larvas de malformaciones fue significativamente menor en los controles que en el

grupo de edad post-ovulatorio exhibe baja calidad del huevo ( Varkonyi et al.,

1999 ). Estas observaciones también fueron hechas en la trucha arco iris. A los 14 días

de ovocitos envejecimiento post-ovulatoria resultó en 60% de los malformados vivos

alevines concomitante con una pérdida del 29% de la supervivencia embrionaria

( Aegerter et al., 2005 ). Nuestros resultados están de acuerdo con la continuidad de

las obras. En conjunto, estas observaciones sugieren que, para todos los factores

experimentales capaces de afectar a la calidad del huevo, una pérdida de la calidad del

huevo siempre se asocia con un aumento de alevines malformaciones. En el presente

estudio, se observó la rarefacción de los tipos específicos de malformaciones como

Cyclops concomitante con un aumento de otros, tales como una incompleta de saco

vitelino resorción (grupo pm 48%, p  = 0,057). En pez gato, se observaron tres tipos de

anormalidad, es decir, fuerte curvatura de la columna vertebral, deforma la cola y

edema pericárdico, pero no se proporcionaron detalles acerca de una ocurrencia

preferencial (Varkonyi et al., 1999 ). Además, en la trucha arco iris, el efecto del

envejecimiento de la post-ovulatoria huevo en malformaciones se asoció con una

mayor incidencia de malformaciones "Cyclops", que llega al 80% de los alevines

malformaciones en YSR. Factores externos, tales como el envejecimiento o

fotoperiódico postovulatorio temporización de la ovulación, parecen actuar en calidad

de los huevos mediante la modulación de los tipos de anormalidad morfológica

observada. De hecho, puede ser la hipótesis de que cada factor de variación de la

calidad del huevo induciría tipos de malformación preferenciales.

4.4. MRNAs materna

La hibridación de mRNA de ovocitos en la trucha arco iris cDNA microarrays de nylon se

ha realizado correctamente. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio utilizando

microarrays para analizar los niveles de ARNm de los ovocitos en las especies de

teleósteos. En otras especies de vertebrados, tal tecnología se ha utilizado

anteriormente para analizar transcriptoma ovocito ( Leo et al., 2001 , Dalbies-Tran y

Mermillod, 2003 , Wang et al., 2004 , Dobson et al., 2004  y  Vallee et al.,

2005 ). Mientras PCR en tiempo real (RT-PCR) permite un análisis sensible de un

número limitado de genes, se esperaba que el genoma de seguimiento de la expresión

génica en ovocitos utilizando microarrays de ADNc para proporcionar muchos clientes

potenciales en la meiosis minería y la gametogénesis ( Schlecht y Primig, 2003 , para

su revisión) y en los mecanismos de calidad de los ovocitos ( Sirard et al.,

2002  y  Krisher, 2004 , para una revisión). En nuestro caso, el uso de la trucha arco iris

cDNA microarrays podría ser considerado como una herramienta útil para caracterizar

los peces transcriptoma huevo. De hecho, se detectaron 8.422 puntos después de la

hibridación de ARNm procedentes de huevos de trucha arco iris no fertilizados. Genes

detectados están involucrados en una gran variedad de funciones biológicas. La

diversidad similar fue observado previamente dentro de los 300 genes identificados en

ovocitos bovinos después de la hibridación de un 900 macrochips genes humanos

( Dalbies-Tran y Mermillod, 2003 ). Esto ilustra la complejidad y la importancia

potencial de la herencia materna ARNm para el embrión.

En el presente estudio, 6 transcripciones de más de 8422 mostraron una abundancia

significativamente menor en los huevos del grupo PM. Estudios anteriores mostraron

que otros factores externos pueden afectar transcriptoma ovocito. Los cambios en los

niveles de los ovocitos de algunos mRNAs en relación con las condiciones de

maduración se observaron previamente en el uso de RT-PCR bovina ( Watson et al.,

2000  y  Lonergan et al., 2003 ) o microarrays ( Dalbies-Tran y Mermillod, 2003 ) y en

humana ( Metcalfe et al., 2003 ). En la trucha arco iris, un estudio de RT-PCR mostró

que 8 transcripciones entre los 39 mostraron una abundancia diferencial durante huevo

envejecimiento post-ovulatoria ( Aegerter et al., 2003  y  Aegerter et al., 2004b ). Esos

estudios anteriores mostraron que los acontecimientos finales de oogenenic

(maduración de los ovocitos, el envejecimiento después de la ovulación) pueden

afectar a la abundancia de algunas transcripciones heredados por vía materna. En el

presente estudio, también se puso de manifiesto que una modificación de las

condiciones de oogénesis también puede resultar en una modificación de la

abundancia de algunos mRNAs-heredadas por vía materna.

Uno de los 6 transcripciones muestran una abundancia menor en PM huevos grupos

tenían gran similitud de secuencia con el pez cebra ( Danio rerio ) triptófano hidroxilasa

1 (TPH1). El triptófano hidroxilasa (TPH) cataliza la reacción limitante de la velocidad en

la biosíntesis de la serotonina. En humanos, se han detectado dos formas: TPH1 y TPH2

( McKinney et al, 2005. ). En el pez cebra también, dos ADNc que codifican formas

distintas de triptófano hidroxilasa han sido clonados: tphD1 et tphD2 ( Bellipanni et al,

2002.). Además, la actividad de TPH1 ha encontrado en folículos ováricos en ratones

( Amireault y Dube, 2005 ).Este hidroxilasa está implicado en los efectos celulares de

modulación de la serotonina (5-hidroxitriptamina [5-HT]) que se ha demostrado que

inhibe la maduración de ovocitos meiótica en Fundulus ( Cerda et al., 1998 ). Nuestra

observación refuerza la posible participación de TPH1 en ovocitos.

MAK10, en Saccharomyces cerevisiae , es una sub-unidad auxiliar de N-acetil

transferasa terminal de C (NAT C). Este gen se correlaciona con una respiración óptima

en la levadura. Hay 3 NAT en S. cerevisiae y sub-unidades de pocos auxiliar específico

para cada uno de ellos, precisamente 3 específico para ANCT (Polevoda y Sherman,

2001 ). En una revista sobre la composición y función de las unidades de sub-

acetiltransferasa N-terminales eucariotas ( Polevoda y Sherman, 2003 ), la Mak10p

ortólogos de mamíferos, se informó T4a designado para ser expresado en el epitelio de

la córnea curación ( Yi et al., 2000 ).Expresión diferencial de este gen también se

encontró en cultivos, que se replica autónomamente las células del músculo liso

embrionarias y de neoíntima, y células adultas normales ( Weiser-Evans et al.,

2000). Además, en humanos, la actividad ovárica NAT se correlacionó con la síntesis de

la melatonina y la serotonina ( Itoh et al., 1999 ). En cucaracha ( Periplaneta

americana ), NAT podría ser un gen controlada por reloj en el funcionamiento del

cerebro como un regulador de salida del reloj circadiano ( Bembenek et al., 2005 ).

Otra transcripción identificada correspondió a la trucha arco iris glucagón II y también

fue menos abundante en los huevos del grupo PM. El glucagón es una hormona

peptídica de la superfamilia de las glucagón / crecimiento péptidos de liberación

hormonal ( Luna, 1998 ). En los peces, se ha demostrado que el glucagón / péptidos

glucagón-como (GLP) están involucrados en la regulación de la glucogenolisis y la

gluconeogénesis hepática (revisado por Plisetskaya y Mommsen, 1996  y  Luna,

1998 ). En los mamíferos, los estudios admitieron que el glucagón, la hormona contra-

reguladora a la insulina, desempeñaron un papel importante en la corrección de la

hipoglucemia. Curiosamente, insuficiencias de glucosa están involucrados en el

desarrollo embrionario anormal y alteran con mayor precisión la morfología del corazón

embrionario y el metabolismo mediante el aumento de la captación de glucosa y la

glucólisis en ratones ( Smoak, 2002 ).Glucagón también se han demostrado ser

esencial para la inducción paracrina de la diferenciación de otros componentes

pancreáticos en el páncreas embrionario temprano en ratones ( Prasadan et al.,

2002 ). Estas observaciones son consistentes con la disminución de la supervivencia

observada en YSR en el grupo de PM para el cual glucagón fue menos abundante.

El último gen identificado es la N -glicanasa. Esta proteína actúa por glicoproteínas

desglicosilación antes de la degradación en el proteasoma. Es importante destacar que

pNG1 discrimina entre glicoproteínas no nativos y doblado, en consonancia con el

papel de la N -glicanasa de la facturación frente al citoplasma de las glicoproteínas

( Hirsch et al., 2003 ).

Se identificaron dos mRNAs que no presenten homología con proteínas conocidas y que

muestran una expresión diferencial en el ovocito después de una manipulación del

fotoperíodo. Se necesitan más estudios para caracterizar completamente los genes

correspondientes y su papel en la ovogénesis.

La identificación de estos seis mRNAs materna es alentador y da nuevas pistas para la

comprensión de los mecanismos implicados en la construcción de la calidad del

huevo. Otros estudios están ahora obligados a mejorar nuestro conocimiento de la

calidad de los huevos de peces. De hecho, el estudio de otros factores externos que se

sabe afectan la calidad del huevo en relación con transcriptoma ovocito utilizando

microarrays podría proponerse. Por otra parte, el análisis funcional podría ser también

cepillada para explorar una o más ARNm específica materna ( Boonanuntanasarn et al.,

2002 ).

5. Conclusiones

El presente trabajo muestra que un régimen de fotoperíodo largo-corto de uso común

para avanzar en la fecha de desove de trucha arco iris puede inducir defectos en la

calidad del huevo significativos como supervivencias inferiores a mirando y saco

vitelino resorción, mayor porcentaje malformación y también mayor variación

individual entre las mujeres. Además, las nuevas pistas sugieren una posible relación

entre las malformaciones firmas específicas y perturbaciones oogénesis. Por último,

algunos mRNAs mostraron una abundancia diferencial entre los grupos control y

PM. Esto sugiere que el transcriptoma ovocito antes de la fertilización puede ser

influenciada por perturbaciones ambientales y refleja las capacidades de desarrollo de

huevo después de la fertilización.