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INTRODUCCIÓN

La criopreservación de ovocitos permitepreservar la fertilidad en pacientes quepor diversas etiologías puedendesarrollar un Fallo Ovárico Prematuro(FOP). Es el caso de exposición a agentesquimio/radioterápicos, enfermedadesautoinmunes o hematológicas, oprocesos quirúrgicos potencialmenteesterilizantes. La criopreservaciónovocitaria puede emplearse tambiénpara evitar la criopreservación deembriones, para rescatar cicloscomplicados con un síndrome dehiperestimulación ovárica o conausencia de muestra seminal el día de lapunción-aspiración folicular, para evitar

la sincronización donante-receptora enciclos de donación de ovocitos o,simplemente, en mujeres fértiles quedeseen posponer la maternidad.

La criopreservación ovocitaria utilizandola técnica de congelación convencional seconsidera un procedimientoexperimental, debido a las bajas tasas desupervivencia y gestación y al limitadonúmero de recién nacidos logrado (ASRM,2006). Los protocolos dec o n g e l a c i ó n / d e s c o n g e l a c i ó nconvencionales conllevan una reducciónlenta de la temperatura en el tiempo,resultando en el daño de estructurasvitales de los ovocitos.

Los microtúbulos, que conforman elhuso meiótico, y los microfilamentos,localizados en el córtex ovocitario, sonmuy susceptibles a la temperatura deenfriamiento (chilling) y a la exposicióna los crioprotectores (Boiso et al.,2002). Una alteración en estasestructuras podría conducir a unaalineación cromosómica incorrectaprevia a la extrusión del corpúsculopolar, a una segregación cromosómicaalterada, fecundación anómala y/o a unaelevada incidencia de aneuploidías.

La vitrificación combina tasas deenfriamiento del orden de -15.000º C a -30.000º C por minuto (Liebermann et al.,2003) y concentraciones elevadas de

EFECTO DEL PROCESO DE VITRIFICACIÓN SOBRE LA ESTRUCTURADEL HUSO MEIÓTICO Y ORGANIZACIÓN CROMOSÓMICA ENOVOCITOS HUMANOS EN METAFASE IIEFFECT OF VITRIFICATION PROCEDURE ON SPINDLE AND CHROMOSOMECONFIGURATION IN METAPHASE II HUMAN OOCYTES

Cristina Costana Duque*1, Javier Alfonso2, Rita Cervera3, Ana Monzó1,2, Vicente Montañana 1,2, Miodrag Stojkovic3, Alberto Romeu 1,2

1Unidad de Reproducción Humana (Servicio de Ginecología). Hospital Universitario la Fe, Valencia. 2Instituto de Medicina Reproductiva (IMER),Valencia. 3Laboratorio de Reprogramación Celular, Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF), Valencia.*Unidad de Reproducción Humana (Servicio de Ginecología). Hospital Universitario la Fe, Valencia. Av/ Campanar 21, 46009, Valencia.e-mail: cristinacostana@hotmail.comFecha recepción: 30 abril 2010 · Fecha aceptación: 3 mayo 2010

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RESUMEN

El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la técnica de vitrificación utilizando el método del Cryotip™ sobre laintegridad del huso meiótico y la organización cromosómica en ovocitos humanos en metafase II. La configuración del husomeiótico y de la placa metafásica de los ovocitos frescos (control) y vitrificados se evaluó mediante microscopía confocal. Latasa de supervivencia para los ovocitos desvitrificados fue del 91,6%. La proporción de ovocitos que mostró una configuraciónnormal del huso meiótico y de la placa metafásica fue similar en ovocitos frescos y vitrificados, sugiriendo que la técnica devitrificación con el Cryotip™ permite mantener el potencial de los ovocitos una vez desvitrificados. Rev Asoc Est Biol Rep 2010;15(1):14-17.

Palabras clave: ovocitos metafase II, vitrificación, huso meiótico, organización cromosómica.

ABSTRACT

The aim of this study was to evaluate the effect of vitrification procedure using the Cryotip™ method on spindle andchromosome configurations in metaphase II human oocytes. The meiotic spindle and chromosome configurations in fresh(control) and vitrified oocytes were studied by confocal microscopy. Survival rate for vitrified oocytes was 91.6%. Theproportion of oocytes showing normal spindle and chromosome configuration was similar for fresh and vitrified oocytesshowing that vitrification with the Cryotip™ method supports oocyte potential after warming. Rev Asoc Est Biol Rep 2010;15(1):14-17.

Keywords: metaphase II oocytes, vitrification, meiotic spindle, chromosome configuration

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Rev Asoc Est Biol Rep Junio 2010 Vol. 15 Nº 1

crioprotectores, aumentando de talmanera su viscosidad que no cristalizasino que forma un estado amorfo similaral vidrio.

La técnica de vitrificación permite burlardos de los factores que limitan el éxitode la criopreservación: por un lado, elproceso conocido como chilling injury(Vatja and Kuwayama, 2006) y, por otro,la formación de cristales de hielo en elinterior de las células (Mazur, 1984). Elprimero se define como el dañoirreversible tras la exposición de lascélulas a bajas temperaturas (de + 15º Ca -5º C) antes de que se produzca laenucleación del hielo. En consecuencia,estructuras celulares como elcitoesqueleto o las membranas celularesse ven claramente afectadas. Elfenómeno del chilling puede minimizarsedurante el proceso de vitrificaciónmediante el empleo de tasas deenfriamiento elevadas (Liebermann etal., 2003). La velocidad de enfriamientode la muestra va a depender del volumende la solución de vitrificación, así, amenor volumen, mayor velocidad deenfriamiento, aumentando éstamediante la inmersión directa ennitrógeno líquido. Para evitar laformación de cristales de hielo, en latécnica de vitrificación se empleanelevadas concentraciones decrioprotectores (Liebermann et al.,2003), sin olvidar su efecto tóxico paralas células. Sin embargo, unacomposición adecuada decrioprotectores puede solventar losefectos tóxicos y osmóticos debidos a laalta concentración de crioprotectores enla solución de vitrificación. La mezcla decrioprotectores más utilizada es laformada por etilenglicol (EG),dimetilsulfóxido (DMSO) y sacarosa.

El objetivo de este estudio fue evaluar elefecto de la criopreservación ovocitariamediante la técnica de vitrificación conun sistema cerrado (Cryotip™) sobre laintegridad del huso meiótico y laorganización cromosómica en ovocitoshumanos Metafase II (MII).

MATERIAL Y MÉTODOS

Ovocitos MII:

A todas las pacientes que formaron partedel estudio se les aplicó un protocolo de

hiperestimulación ovárica controladaque incluyó, como frenado hipofisario,agonistas de la GnRH en protocolo largoy como estimulación FSH recombinante.Los ovocitos se recuperaron por puncióntransvaginal ecoguiada, 36-38 horastras la administración de la hCG. Loscomplejos cúmulo-ovocito fueroncultivados en medio IVF (Universal IVFMedium, Medicult, Jyllinge, Denmark)bajo condiciones de cultivo estándar(37º C y 5% de CO2). Tras al menos 2horas de cultivo in vitro, los ovocitosfueron incubados con 80 IU/mLhialuronidasa (Hyadase, Medicult,Jyllinge, Denmark) y las células delcúmulo fueron eliminadas mediante elpipeteado mecánico de los ovocitos. Losovocitos fueron entonces observadosutilizando un microscopio invertido(x200) y los ovocitos MII se identificaronpor la presencia del primer corpúsculopolar.

Se vitrificaron un total de 12 ovocitos enestadio de MII recuperados de pacientesincluidas en el Programa de Fecundaciónin vitro del Instituto de MedicinaReproductiva (IMER) de Valencia quefirmaron el correspondienteconsentimiento informado. Como grupocontrol (ovocitos MII no vitrificados), seincluyeron 6 ovocitos procedentes depacientes pertenecientes al Programa deFecundación in vitro de la Unidad deReproducción del Hospital Universitariola Fe de Valencia, previa firma delconsentimiento de participación en unProyecto de Investigación desarrollado enel Centro de Investigación Príncipe Felipe(CIPF) de Valencia y con licencia por partedel Instituto de Salud Carlos III.

Protocolo de vitrificación:

Para la vitrificación ovocitaria se utilizóel kit comercial de Irvine Scientific conel Cryotip™ como contenedor. Losovocitos fueron equilibrados en unasolución compuesta por 7.5 % (v/v) deDMSO + 7.5% (v/v) de EG + 20%suplemento sustitutivo de suero enmedio 199. Posteriormente, fueronexpuestos a la solución de vitrificacióncompuesta por 15 % (v/v) de DMSO +15% (v/v) de EG + 0.5M de sacarosa +20% suplemento sustitutivo de suero enmedio 199 y cargados en el Cryotip™.Para la desvitrificación, los ovocitosfueron expuestos a soluciones

compuestas por medio 199 conconcentraciones decrecientes desacarosa (1.0M y 0.5M).

La supervivencia ovocitaria se evaluóinmediatamente tras la desvitrificacióny tras 4 horas de cultivo in vitro,valorándose la integridad de la zonapelúcida, la apariencia del citoplasma yla ausencia de lisis celular.

Fijación y tinción inmunocitoquímica:

La fijación de los ovocitos y tincióninmunocitoquímica del huso meiótico serealizó siguiendo el protocolo descritopor Lin et al. (2008).

Brevemente, los ovocitos MIIdesvitrificados y frescos (grupo control)fueron fijados a 37ºC durante 1 hora enuna solución de formaldehído al 2% ypermeabilizados en una solución deTritón X-100 al 0.5% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Parala tinción de la tubulina, los ovocitos seincubaron durante 90 minutos a 37ºC enuna solución de anticuerpos primariosanti-α y anti-β tubulina (1/400), seguidode 3 lavados y se incubaron durante 120minutos a 37ºC en una solución deanticuerpo secundario Alexa 488(1/200). Para la tinción demicrofilamentos, los ovocitos seincubaron en una solución de rodamina-faloidina durante 60 minutos atemperatura ambiente. Finalmente, losovocitos fueron montados utilizandomedio de montaje con DAPI ymantenidos a 4ºC hasta su evaluación.

Evaluación del huso meiótico:

Para la valoración de los microtúbulos,microfilamentos y cromosomas, seutilizó un microscopio confocal conlasser-scanning (Leica DM IRE 2)equipado con un láser de argón,perteneciente al Servicio de MicroscopíaConfocal del CIPF de Valencia.

RESULTADOS

Se vitrificaron y desvitrificaron 12ovocitos MII. La tasa de supervivenciafue del 91,6% (11/12). Todos losovocitos que sobrevivieron a ladesvitrificación mostraron unaapariencia morfológica normal tras 4horas de cultivo in vitro.

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Cristina Duque et al. Efecto del proceso de vitrificación sobre la estructura del huso meiótico.

Se fijaron para tincióninmunocitoquímica 10 ovocitos MIIdesvitrificados y 6 ovocitos MII frescos.La tasa de ovocitos informativos fue del100% para el grupo control y del 70%para los ovocitos desvitrificados. Estamenor tasa de informatividad paraovocitos desvitrificados fue debida aproblemas acontecidos durante latinción, con independencia de la técnicade vitrificación.

En función de la orientación delcomplejo huso/cromosomas respecto alplano focal, se consideró unaconfiguración normal si: a) cuando alestar orientado de forma paralela alplano focal el huso presenta unaestructura típica en forma de barril conlos polos ligeramente señalados y loscromosomas dispuestos en el ecuador,b) cuando al estar orientado de formaperpendicular al plano focal el husopresenta una estructura circular con loscromosomas orientados en forma decírculo y c) cuando al estar orientado deforma oblicua al plano focal el husopresenta una estructura en forma oval(barril acortado) con los cromosomasalineados en el ecuador. Por otro lado,una configuración anómala del complejohuso/cromosomas quedó representadapor una desorganización parcial ocompleta de los microtúbulos o por unadispersión cromosómica o aparienciacromosómica aberrante o pococondensada. En las Figuras 1 y 2 semuestran una configuración normal yuna anómala del complejohuso/cromosomas, respectivamente.

La proporción de ovocitos con unaconfiguración normal del huso meióticoy una alineación correcta de loscromosomas fue del 100% para losovocitos del grupo control y de 85,7%para los ovocitos desvitrificados, sin quese observaran diferencias significativasentre ambos grupos.

DISCUSIÓN

En este trabajo se evalúa el efecto de latécnica de vitrificación con un sistemacerrado (Cryotip™) sobre laconfiguración del huso meiótico y laorganización cromosómica en ovocitoshumanos en estadio de MII. Laintegridad de este complejo esimprescindible para que se produzca una

correcta segregación cromosómica yevitar así la posible aparición deaneuploidías en el embrión. Aunque sólose observaron anomalías en el husomeiótico/cromosomas en el grupo de ovocitos desvitrificados, las diferencias no fueron estadísticamentesignificativas respecto al grupo control(frescos). Estos resultados son similaresa los descritos en la bibliografía (Li etal., 2006; Cobo et al., 2008).

La vitrificación utilizando el Cryotip™como contenedor permite la vitrificaciónde ovocitos en microvolúmenes (alrededorde 1 μL), incrementando la tasa deenfriamiento y minimizando el efectotóxico de los crioprotectores al disminuirsu concentración. El mantenimiento de laintegridad del huso meiótico y de la placametafásica tras la desvitrificación sugiereque dicha técnica de vitrificación permitepreservar la calidad inicial del ovocito y elpotencial necesario para soportar elposterior desarrollo embrionario.

AGRADECIMIENTOS

Este estudio ha sido parcialmentefinanciado por el Programa de MedicinaRegenerativa del Instituto de SaludCarlos III.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Cobo A, Pérez S, De los Santos MJ, ZulateguiJ, Domingo J, Remohí J. Effect of differentcryopreservation protocols on themetaphase II spindle in human oocytes.Reprod Biomed Online 2008; 3: 350-359.

Li Y, Feng HL, Cao HL, Zheng GJ, Yang Y,Mullen S, Critser JK, Chen ZJ. Confocalmicroscopic analysis of the spindle and

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Figura 1: Configuración normal del complejo huso meiótico-placa metafásica.

Figura 2: Configuración anómala del complejo huso meiótico-placa metafásica.

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Liebermann J, Dietl J, Vanderzwalmen P,Tucker MJ. Recent developments in humanoocyte, embryo and blastocyst vitrification:where are we now? Reprod Biomed Online2003; 7: 623-633.

Lin T, Tsay C, Chen C, Tang P, Ju J. Nuclear andcytoskeletal dynamics during oocytematuration and development of somatic cellcloned pig embryos injected with membranedisintegrated donor cells. Anim Reprod Sci2008; 103: 107-119.

Mazur P. Freezing of living cells: mechanismsand implications. Am J Physiol 1984; 247:C125-42.

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