Efecto inhibidor de acetilcolinesterasa por extractos de ...II 5.5 Extracto vegetal de Bouvardia...

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

Centro de Desarrollo de Productos Bióticos

Efecto inhibidor de acetilcolinesterasa por extractos

de Bouvardia ternifolia cultivada en hidroponía

T E S I S

Que para obtener el grado de Maestría en Ciencias en Desarrollo de

Productos Bióticos

PRESENTA

Biol. Giovanni García Morales

Directores de tesis

Dra. Elsa Ventura Zapata, Dr. Jesús Enrique Jiménez Ferrer

Yautepec Morelos, Diciembre 2009

El presente trabajo se llevó a cabo en el Departamento de Biotecnología del

Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional bajo

la dirección de la Dra. Elsa Ventura Zapata y en el Laboratorio de farmacología

del Centro de Investigación Biomédica del Sur bajo la dirección del Dr. Jesús

Enrique Jiménez Ferrer. Para la realización de los estudios se obtuvo el apoyo

económico de la beca CONACYT (No. de registro 235254) y de la beca del

Programa Institucional de Formación de Investigadores (PIFI). La investigación

fue realizada con el financiamiento económico del proyecto de la Secretaría de

investigación y Posgrado SIP 20071059.

AGRADECIMIENTOS

Al Centro de Desarrollo de Productos Bióticos y al Centro de Investigación

Biomédica del Sur por las facilidades otorgadas para el desarrollo y

conclusión de este trabajo de tesis en el laboratorio de cultivo de células

vegetales y el laboratorio de Farmacología respectivamente, a la Dra. Elsa

Ventura Zapata y el Dr. Enrique Jiménez Ferrer por haberme dirigido,

supervisado y corregido de manera constante y exhaustiva en el desarrollo de

esta investigación, al comité tutorial conformado por la Dra. Elsa Ventura

Zapata, la Dra. Kalina Bermúdez Torres, la Dra. Martha Lucia Arenas

Ocampo y el Dr. Javier Solorza Feria por sus observaciones y aportaciones en

beneficio no solo del trabajo como tal sino también de mi desarrollo y formación

como Maestro en Ciencias en Desarrollo de Productos Bióticos. Agradezco

también la participación y aportaciones del Dr. Alejandro Zamilpa

Investigador del Centro de Investigación Biomédica del Sur en el desarrollo de

la investigación fitoquímica de los extractos.

DEDICATORIA

a culminación de este trabajo de investigación lo dedico a mi

hijo Cristian Giovanni García Noguerón quien aun a su corta

edad ya forma parte de los sacrificios que como familia

realizamos para que pudiera alcanzar mi sueño de ser un

profesionista con grado de maestro, a mi esposa Ma. Del Carmen

Noguerón Merino por su paciencia y apoyo incondicional no obstante

las adversidades. A mis padres Angélica Morales Terán y Walfré

García Arroyo que con su apoyo y su confianza una vez más han

acompañado mis pasos en éste difícil camino para ser alguien en la

vida. A mi hermano Otman García Morales quien ahora emprende su

camino hacia el éxito y forma parte del orgullo que siento de formar

parte de esta familia.

L

I

I N D I C E

Pagina

Índice de figuras III

Índice de cuadros V

Abreviaturas VI

Resumen VIII

Abstract IX

1. INTRODUCCIÓN 1

2. ANTECEDENTES 3

2.1 El neurotransmisor acetilcolina 3

2.2 La enzima acetilcolinesterasa (E.C. 3.1.1.7) 4

2.2.1 La catálisis enzimática 5

2.3 Alzheimer 8

2.3.1 Fisiopatología 9

2.3.2 Tratamiento 12

2.4. Plantas medicinales utilizadas para contrarrestar

padecimientos del Sistema Nervioso Central

13

2.4.1. Bouvardia ternifolia 15

2.5 Métodos de propagación vegetal 18

2.5.1. Hidroponía 21

3. JUSTIFICACIÓN 22

3.1.Hipótesis 23

4. OBJETIVOS 24

4.1. Objetivo general 24

4.2. Objetivos particulares 24

5. MATERIALES Y METODOS 25

5.1. Material biológico 25

5.1.1 Material vegetal 25

5.1.2 Animales utilizados para pruebas farmacológicas 25

5.2. Métodos 25

5.2.1. Micropropagación 25

5.3 Aclimatización 28

5.4 Cultivo Hidropónico 29

II

5.5 Extracto vegetal de Bouvardia ternifolia cultivada 30

5.6 Estudios fotoquímicos 31

5.7. Inhibición de la enzima acetilcolinesterasa in vitro 32

6. RESULTADOS Y DISCUSION 34

6.1 Micropropagación 34

6.2 Aclimatización 40

6.3 Cultivo hidropónico 41

6.4 Obtención de extractos 44

6.5 Estudio Fitoquímico del extracto de Bouvardia ternifolia 45

6.5 Inhibición enzimática 49

7 CONCLUSIONES 58

9 PERSPECTIVAS 60

10 LITERATURA CITADA 61

11 ANEXOS 68

III

ÍNDICE DE FIGURAS

Número Figura

Página

1 Ejemplar de Bouvardia ternifolia 15

2 Diagrama de flujo del trabajo experimental 26

3 Diagrama del protocolo para desinfestación de semillas 26

4 Maquina picadora 30

5 Evaporador rotatorio 31

6 Esquema general del estudio fitoquímico 31

7 Efecto de las concentraciones de cinetina 35

8 Efecto de las concentraciones de bencilaminopurina 36

9 Segmentos nodales con formación de brotes

Efecto de las auxinas en la formación de raíces

37

38 10

11 Raíces inducidas con ácido naftalenacético 39

12 Plántulas en proceso de aclimatización 39

13 Efecto de la solución nutritiva en el crecimiento de la planta 41

14 Efecto de la solución nutritiva en el número de nodos 43

15 Plantas provenientes de la micropropagación 44

16 Diagrama del fraccionamiento del extracto hidroalcohólico 45

17 Presencia de áido ursólico en fracción acetato de etilo 46

18 Confirmación de la presencia de ácido ursólico en la fracción

acetato de etilo

46

19 Flavonoides en extracto hidroalcohólico y Fr-acetato de etilo 47

20 Comparación del extracto hidroalcohólico de la planta cultivada

y la fracción de acetato de Etilo

48

21 Presencia de flavonoides en la planta cultivada 48

22 Cinética enzimática acetilcolinesterasa 50

23 Representación de la transformación Lineweaver-Burkde la

actividad enzimatica de la acetilcolinesterasa

51

24 Transformación Lineweaver-Burk / Inhibidor Fr-Acetato de etilo 53

25 Transformación Lineweaver-Burk / Inhibidor Fr- Metanólica 54

IV

26 Transformación Lineweaver-Burk / Inhibidor Precipitado 55

27 Transformación Lineweaver-Burk / Inhibidor planta cultivada 56

28 Transformación Lineweaver-Burk expresiones 18 y 19 67

29 Transformación Lineweaver-Burk / Inhibidor competitivo 69

30 Transformación Lineweaver-Burk / Inhibidor no competitivo 71

31 Transformación Lineweaver-Burk / Inhibición mixta 73

32 Transformación Lineweaver-Burk / Inhibición mixta sistema C2 74

33 Transformación Lineweaver-Burk / Inhibición mixta sistema C5 75

V

INDICE DE CUADROS

Número Cuadro

Página

1 Diseño experimental para la inducción de brotación

múltiple

27

2 Diseño experimental para inducir la formación de raíces 28

3 Rendimientos de extractos hidroalcoholicos de B.

ternifolia silvestre y cultivada

44

4 Efecto Inhibidor del extracto hidroalcohólico de la planta

silvestre

51

5 Efecto inhibidor de la Fr- Acetato de etilo 52

6 Efecto inhibidor de la Fr-Metanólica 54

7 Efecto inhibidor del Precipitado 3 55

VI

ABREVIATURAS

Factor modificador de la constante de equilibrio de la formación

del complejo enzima-sustrato.

Factor modificador de la velocidad de reacción de la formación

de producto en reacciones enzimáticas en inhibición mixta

a β-amiloide

g Microgramo

mol Micromol

Ac Ácido

Ach Acetilcolina

Achasa Acetilcolinesterasa

AcoEt Acetato de Etilo

AIA Ácido Indolacético

ANA Ácido Naftalenacético

AtchI Acetiltiocolina

atm Atmosfera

BAP Bencilaminopurina

Ca++ Ion calcio

Cm Centímetro

D. O. Densidad óptica

DLB Demencia con cuerpos de Lewi

DTNB Ditio-bis-nitro benzoato

E Enzima

EA Enfermedad de Alzheimer

EI Complejo enzima inhibidor

ES Complejo enzima sustrato

ESI Complejo enzima sustrato inhibidor

F-Aq Fracción acuosa

Fr-AcoEt Fracción acetato de etilo

Fr-MeOH Fracción metabólica

Gln Glutamina

VII

HA Hidroalcohólico

I Inhibidor

IC50 Concentración inhibitoria 50 porciento

IBA Ácido Indolbutírico

Ki Constante de inhibición

KIN Cinetina

KM Constante de Michaelis-Menten en reacciones enzimáticas

KMapp KM aparente en reacciones enzimáticas inhibidas

kp Constante de velocidad de la reacción de formación de producto

KS Constante de equilibrio de la formación del complejo ES

KSapp KS reacción aparente

L Litro

M Metro

MeOH Metanol

Mg Miligramo

min Minuto

ml Mililitro

mM Milimolar

mm Milímetro

mmHg Milímetros de mercurio

MS Medio Murashige y Skoog

Msnm Metros sobre el nivel del mar

Na+ Ion sodio

NaCl Cloruro de Sodio

Nm Nanómetro

P Producto

S Sustrato

Ser Serina

SNC Sistema Nervioso Central

U Unidades

Vmax Velocidad máxima

Vmaxi Velocidad máxima inhibida

vo Velocidad Inicial

VIII

RESUMEN

El Alzheimer es una enfermedad crónica degenerativa que se caracteriza principalmente por la pérdida progresiva de la memoria. Los tratamientos actuales se basan en retrasar el avance de la enfermedad, incrementando las concentraciones del neurotransmisor acetilcolina por medio de la inhibición de la enzima acetilcolinesterasa y utilizando antioxidantes para la evitar la muerte neuronal causada por los radicales libres generados por el proceso inflamatorio que se presenta, desafortunadamente estos tratamientos presentan varios efectos secundarios como vómitos diarreas etc., lo que hace que la calidad de vida de los pacientes se vea disminuida por estos otros padecimientos; por lo que el objetivo del presente trabajo fue encontrar en el extracto hidroalcohólico de Bouvardia ternifolia cultivada en hidroponía un efecto inhibidor de la enzima acetilcolinesterasa, como lo hace la planta silvestre para contrarrestar los efectos de esta enzima. Dentro de los objetivos particulares están, establecer el protocolo de micropropagación por cultivo de nodos, establecer las condiciones de crecimiento y desarrollo en hidroponía, y evaluar farmacológicamente la actividad antiacetilcolinesterasa de los extractos hidroalcohólicos de Bouvardia ternifolia cultivada. Para lograr esto se propuso un método de micropropagación que permitiera obtener material aséptico a partir de semillas las cuales fueron tratadas con 0.3% de hipoclorito de sodio por 5 minutos y una vez obtenida la planta se usaron secciones nodales para inducir brotación con KIN y BAP a concentraciones de 0.2, 0.5, 1.0 y 1.5 mg/L; para inducir enraizamiento los brotes fueron tratados con ANA, IBA y AIA a concentraciones de 0.1, 0.2, 0.5, 1.0 y 1.5 mg/L. Para evaluar su desarrollo en hidroponía éstas se cultivaron con solución nutritiva de Hoagland y Arnon a concentraciones de 25, 50, 75, 100 y 125%. Los extractos obtenidos fueron evaluados en el ensayo de inhibición enzimática a concentraciones de 0.0125, 0.025 y 0.05 mg/ml, con concentraciones de sustrato de 5,10, 25, 50 y 75 mM de Acetiltiocolina. Las semillas tratadas con 0.3% de hipoclorito durante 5 minutos tuvieron un porcentaje de desinfestación del 97%. Para inducir brotación el mejor resultado se obtuvo con la concentración de 1.5 mg/L de BAP y se dio la formación de callos en la misma concentración de KIN. En la formación de raíces IBA a 0.5 mg/L fue el que mayor número de brotes con raíces generó. Posteriormente en el cultivo hidropónico la concentración a la que mejor se desarrolló la planta fue de 100%. En el ensayo de inhibición enzimática se observó un comportamiento de inhibición de tipo mixta por parte del extracto hidroalcohólico obtenido de la planta cultivada similar al de la planta silvestre.

Palabras Clave: Bouvardia ternifolia, Alzheimer, micropropagación, hidroponía,

inhibición enzimática.

IX

ABSTRACT

The Alzheimer Disease is a degenerative chronic illness that characterized mainly by the progressive loss of the memory. The current treatments are based on retarding the advance of the illness, increasing the concentrations of the neurotransmisor acetilcholine by means of the inhibition of the enzyme acetilcholinesterase and using antioxidant drugs. It for avoiding the death neuronal caused by the free radicals, generated by the inflammatory process, these treatments present several adverse side effects, that makes that the quality of the patients' life is diminished by these other sufferings. For that the objective of the present work was to find in the hidroalcoholic extract of Bouvardia ternifolia cultivated in hidroponia, an enzyme inhibitor effect of the acetilcholinesterase, as makes it the wild plant to counteract the effects of this enzyme. Inside the particular objectives they are, to establish the micropropagation protocol for growing the nodes, to establish the conditions of growth and development in hidroponia, and to evaluate the antiacetilcholinesterase activity of the hidroalcoholic extracts of Bouvardia ternifolia cultivated in hothouse pharmacologically. To achieve this, was meant a micropropagation method that allowed to obtain aseptic material starting from seeds to put in 0.3% of sodium hypochlorite for 5 minutes and once obtained the plant nodal sections were used to induce buds with KIN and BAP to concentrations of 0.2, 0.5, 1.0 and 1.5 mg/L. To induce take root the buds were treated with ANA, IBA and AIA, to concentrations of 0.1, 0.2, 0.5, 1.0 and 1.5 mg/L. To evaluate the growth in hidroponia these they were cultivated with Hoagland and Arnon solution, to concentrations of 25, 50, 75, 100 and 125%. The obtained extracts were evaluated to enzymatic inhibition assay in concentrations of 0.0125, 0.025 and 0.05 mg/ml, with substrate concentrations of 5, 10, 25, 50 and 75 mM of Acetyltiocholine. The seeds tried with 0.3 sodium hypochlorite during 5 minutes had a percentage of desinfestation of 97%. To induce buds the best average it was obtained with the concentration of 1.5 mg/L of BAP and the formation of tripes was given in the same concentration of KIN. In the formation of roots was obtained with 0.5 mg/L of IBA concentration. Later on in the cultivation hidroponic the concentration to the one that better the plant was developed it was of 25% of concentration of Hoagland and Arnon solution. In the assay of enzymatic inhibition a behavior of mixed type inhibition was observed on the part of the extract obtained hidroalcoholic from the plant similar cultivated to that of the wild plant. Key words: Bouvardia ternifolia, Alzheimer, micropropagation, hidroponic, enzymatic inhibition.

Introducción

1

1. INTRODUCCIÓN

l Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa que afecta a mas de 20

millones de personas en el mundo principalmente a las personas mayores

de 60 años, y es considerada como un problema importante de salud

pública debido a los estragos que causa no solo en las personas que la padecen,

sino también en los familiares que deben atenderlos o en su defecto pagar la

atención requerida por los pacientes, así como los medicamentos, afectando la

economía familiar.

El avance de la medicina moderna permiten que las personas tengan una

esperanza de vida mucho mayor, con lo que también incrementa el riesgo para

padecer la enfermedad de de Alzheimer (EA) debido a que la edad es el principal

factor de riesgo.

La EA se caracteriza principalmente por la pérdida progresiva de la memoria

debido a la muerte de las células del cerebro, principalmente neuronas

colinérgicas. Lo anterior asociado principalmente a la deposición de la proteína β-

amiloide (βA) extracelular (placas seniles), que genera una gran cantidad de

radicales libres que activan a su vez a las células de la microglia generando un

proceso inflamatorio que deriva en daño orgánico, deteriorando la estructura

cerebral. La principal consecuencia de ello es la reducción de la en las

concentraciones del neurotransmisor acetilcolina que está directamente

relacionado con el proceso cognitivo, también ocurre lo que repercute en la

calidad de vida de las personas.

Actualmente dentro de los tratamientos para la EA, uno de los mas empleados

es el que se orienta a incrementar la disponibilidad de acetilcolina en el espacio

sináptico por medio de inhibidores de la enzima acetilcolinesterasa, como son la

tacrina, donezepil y galantamina. Con ellos se trata de disminuir los síntomas

asociados a EA como pérdida de memoria y depresión. Sin embargo, se ha

observado que estos medicamentos tienen efectos secundarios adversos como

nauseas, vómitos, diarrea etc.

EE

Introducción

2

Desde tiempos muy antiguos las plantas han sido utilizadas para aliviar

muchos malestares y enfermedades del hombre, y una de las ventajas de

utilizarlas es que en su mayoría poseen una gran cantidad de metabolitos

secundarios capaces de contrarrestar no solo uno, sino varios síntomas de una

enfermedad al mismo tiempo. Por lo tanto la utilización de plantas medicinales

como una alternativa para tratar los síntomas de la enfermedad es una opción que

permite mejorar la calidad de vida de las personas que padecen la EA.

Debido a las propiedades químicas de la planta Bouvardia ternifolia como son

la presencia de ácido ursólico y oleanólico, farmacológicas como antiinflamatorias

e inhibidoras de la enzima acetilcolinesterasa y de uso tradicional como

antiinflamatorias y problemas del sistema nervioso, se propone ésta planta como

un modelo de estudio en la búsqueda de un tratamiento que mejore la calidad de

vida de las personas que padecen la EA ya que como se mencionó anteriormente

la actividad de la enzima acetilcolinesterasa juega un papel importante en esta

enfermedad. A pesar de que ésta planta no presenta diagnóstico de peligro de

extinción, la posibilidad de la producción de un fitofármaco para tratar los efectos

de la EA, hace que se requiera de gran cantidad de material vegetal con calidad

homogénea, por lo que hace necesario obtenerlo de un modo controlado para no

depender del material vegetal silvestre.

Con base en lo anterior, la micropropagación es una herramienta alternativa

para la obtención del material vegetal con dichas propiedades, permitiéndonos

obtener la cantidad y calidad deseada de material vegetal independientemente de

la estación del año o del lugar de procedencia. Ésta técnica permite obtener

plantas libres de bacterias, hongos y nemátodos, confiriéndole una mejor calidad

con respecto a una planta silvestre.

Antecedentes

3

2. ANTECEDENTES

2.1 El neurotransmisor Acetilcolina

a acetilcolina (ACh) es un neurotransmisor ampliamente distribuido

en el sistema nervioso central y en el sistema nervioso periférico. Su

función, al igual que la de otros neurotransmisores, es mediar la

actividad sináptica del sistema nervioso. La Ach es sintetizada en el citoplasma

neuronal a partir de la unión de colina con acetato proveniente de acetil-CoA y

posteriormente es almacenada en vesículas sinápticas que son pequeños

compartimientos de unos 40 nm de diámetro que se acumulan en la región

presináptica de la terminal del axón. Se estima que cada vesícula contiene

1,000 a 50,000 moléculas de ACh y una sola terminación nerviosa motora

contiene 300,000 o más vesículas. En dichas vesículas se transporta a las

terminaciones nerviosas donde es utilizada para la transmisión del impulso

nervioso en las sinapsis neurona-neurona y neurona-célula muscular a través

de los receptores colinérgicos (Kandel, 2001).

La ACh es liberada en la hendidura sináptica, por fusión de las

membranas de las vesículas con la membrana de la neurona. La llegada de un

potencial de acción a la terminal presináptica estimula la entrada del ion calcio

(Ca++) al interior de la célula. Éste aumento del Ca++ intracelular es el que

provoca la exocitosis de las vesículas. Una vez que las moléculas de ACh han

sido liberadas en la hendidura sináptica, alcanzan por difusión los receptores

postsinápticos donde interaccionan con ellos, ocasionando en el plazo de 0.1

mseg un aumento transitorio de la permeabilidad de la membrana al ión sodio

(Na+) (Mathews et al, 2002; Purves et al., 2004).

En el Sistema Nervioso Central (SNC), las neuronas colinérgicas forman

un gran sistema ascendente cuyo origen se halla en el tronco cerebral e inerva

amplias áreas de la corteza cerebral, además de mantener la consciencia

parecen intervenir en la transmisión de información visual, tanto en el colículo

superior como en la corteza occipital. La acetilcolina también interviene en la

percepción del dolor y la memoria (Guyton y Hall, 2001; Purves et al., 2004).

LL

Antecedentes

4

2.2 La Enzima Acetilcolinesterasa (E.C. 3.1.1.7)

La acetilcolinesterasa (Achasa) es una enzima situada en las hendiduras

sinápticas donde hidroliza a la ACh, después de que ésta ha realizado su

función mediante la unión a sus receptores transmitiendo los impulsos

nerviosos. De esta manera la Achasa, limita o termina el estímulo en la sinapsis

colinérgicas (Massoulié et al., 2009). La reacción catalizada es la hidrólisis de

la ACh hasta colina y acetato: La Achasa es una esterasa tipo B y tiene un

resto de serina (Ser) en el centro activo y cuenta con un mecanismo de acción

catalítica del tipo "catálisis covalente", con la generación de un intermediario

covalente. En el centro activo de la enzima se distinguen dos dominios,

denominados esteárico, donde reside el resto de Ser, y aniónico donde tiene

una glutamina (Gln) que le proporciona carga negativa, adecuada para la

aproximación y orientación del sustrato con su carga positiva (Silman et al.,

2008).

La acetilcolinesterasa genera la inactivación de la acetilcolina, y por los

tanto la disminuye la transmisión del impulso nervioso. La reacción química

producida en este proceso es:

En la 1ª etapa de la reacción, el resto de Ser del centro activo de la

acetilcolinesterasa reacciona con la acetilcolina, generándose un intermedio

acetil-enzima y la liberación de la colina.

Acetilcolina + enzima (Acetilcolinesterasa) Colina + Acetilcolinesterasa

acetilada

E1n la 2ª etapa de la reacción se produce la hidrólisis de la acetil-

enzima, regenerándose la acetilcolinesterasa y liberándose el acetato (Silman

et al, 2008)

Acetilcolinesterasa acetilada + H2O Acetilcolinesterasa + ácido acético

Este mecanismo de acción es característico de las Serin-proteasas,

similar al de la quimitripsina. La colina puede regresar a la membrana

presináptica y ser reutilizada en la síntesis de la acetilcolina. Las

Antecedentes

5

colinesterasas, es decir, las enzimas que producen la hidrólisis de la

acetilcolina pueden ser de dos tipos, a saber:

La colinesterasa verdadera, acetilcolinesterasa, colinesterasa

eritrocitaria, específica o de tipo e, se encuentra unida a las membranas de las

neuronas, en las sinapsis ganglionares de la estructura neuromuscular del

organismo y en los eritrocitos.

La pseudocolinesterasa o colinesterasa inespecífica, también

denominada butirilcolinesterasa, colinesterasa plasmática o de tipo s, está

presente generalmente en forma soluble en casi todos los tejidos

(principalmente hígado) y en el plasma, pero en poca concentración en el

sistema nervioso central y periférico (Massoulié et al., 2009).

La importancia de la señalización de ACh se ha determinado por la

localización y participación de la acetilcolina en el proceso de aprendizaje y

memoria, mediante la infusión de medicamentos que inhiben los receptores de

este neurotransmisor causando daños selectivos; por ejemplo, la infusión de

escopolamina en el hipocampo daña la memoria espacial, por reducir la

liberación del neurotransmisor en el hipocampo. Estudios de localización

anatómica permite unir los efectos conductuales con los efectos celulares

específicos de acetilcolina. Modelos computarizados demuestran como el

mecanismo celular de estos efectos incrementan el proceso de codificación que

genera la memoria (Mesulam, 2004).

2.2.1 La catálisis enzimática.

Es uno de los procesos biológicos fundamentales para el desarrollo del

fenómeno viviente. Lo hace a través de acelerar las reacciones químicas con

un factor por arriba de 1x106. La aceleración que producen se alcanza en

condiciones de baja concentración de reactantes, por debajo de 150 mM; baja

presión del sistema de reacción, 1 atm o 760 mmHg y temperatura baja (25 a

35°C). Además de que, las reacciones catalizadas enzimáticamente son

transformaciones químicas en condiciones “suaves”, estas representan uno de

los mecanismos principales de control homeostático de los procesos biológicos.

Antecedentes

6

Por lo que las enzimas son entonces tanto un biocatalizador y como un punto

de control. Los procesos de control biológico centrado en las enzimas son

aquellos que se sustenta en: a) Ubicación física de la enzima

(compartamentalización), b) Biodisponibilidad (tiempo de recambio y control de

la expresión genética), y c) Modulación de la actividad (inhibición y alosterismo)

(Nelson y Cox. 2004). Dentro este último aspecto, en este trabajo de

investigación aprovecharemos a la inhibición como sistema de control.

La inhibición enzimática existe de dos tipos, la irreversible y la reversible;

la segunda de ellas es la que exploraremos, en tanto es la que representa un

mecanismo operativamente adecuado para el control farmacológico de la

actividad enzimática. La inhibición enzimática sigue diferentes patrones de

comportamiento, de acuerdo a los equilibrios químicos que se establecen en

función de la interacción de la enzima (E), el sustrato (S) y el inhibidor (I).

Dentro de la inhibiciones del tipo simple está la inhibición competitiva (Anexo 2,

figura 29 ecuaciones 29, 30 y 31); en esta inhibición se establece una

competencia entre S y e I por el sitio activo de la enzima. Es un proceso

mutuamente excluyente, ya que solo una de las dos especies químicas o

reactantes puede ocupar el sitio activo. Como se observa en el desarrollo de la

ecuación de Michaelis-Menten (Anexo 2, ecuaciones 29 y 31) la KM, es

afectada por el factor (1+[I]/Ki), por lo que se define como KM aparente (KMapp).

Además, como se aprecia en la figura 29, el valor de 1/Vmax es el mismo para la

reacción inhibida como para la que no lo está. Lo que confirma el hecho de que

la competencia que se establece entre el sustrato y el inhibidor no altera la

disponibilidad de sitios activos disponibles en la mezcla de reacción.

La inhibición no competitiva es el segundo de los patrones de

comportamiento de inhibición enzimática simple; en esta forma de inhibición, I

no afecta la unión de S con E ni, ni lo contrario, es decir que, S no afecta la

unión de I con E. De esta forma I y S se unen a E de manera reversible,

estocásticamente e independientemente en distintos sitios de la enzima. Lo

anterior se muestra en el Anexo 2, ecuación 32, donde se establece que el

complejo ternario ESI no es productivo, es decir que genere la transformación

de S en P. Lo anterior es lo que define a este proceso de inhibición, donde si se

Antecedentes

7

modifica la disponibilidad de sitios activos y por tanto la Vmax, como se observa

en el Anexo 2 figura 30 y ecuación 35. En esta se define que 1/Vmaxi =

1/Vmax·(1+[I]/Ki), lo que indica que hay un efectiva disminución de Vmax.

Un tercer patrón de inhibición es el de inhibición acompetitiva, en el cual

I se une reversiblemente al complejo productivo ES generando un complejo

ternario ESI inactivo, por lo que I no se une a E libre. Este tipo de inhibición se

le llama también inhibición anticompetitiva o inhibición acoplante (Anexo 2

ecuaciones 36 y 37).

Los anteriores sistemas de inhibición tienen como característica común,

que tanto el complejo EI como el ESI son complejos no productivos, ya que no

generan la transformación de S en P. Existen otros sistemas de inhibición

donde el esquema de equilibrio entre las especies químicas participantes en la

catálisis enzimática, tienen la posibilidad de que exista una salida productiva

del proceso. Esta salida del proceso, es una más además de la propuesta en el

esquema de enzimas que siguen el modelo de Michaelis-Menten y en los

procesos de inhibición simple (Anexo 2, ecuaciones 1, 20, 32 y 36). Este tipo

de modulación de la actividad enzimática se le denomina inhibición mixta. De la

inhibición del tipo mixto existen diferentes modalidades. En primer lugar está la

que denomina Sistema C1 (Siegel, 1975); este es el mas sistema de inhibición

mixta más simple (Anexo 2, ecuación 40), en el cual EI tiene una menor

afinidad (la disminución de la afinidad está determinada por ) por S que E y el

complejo ESI es no productivo. Cabe hacer notar que como el esquema de

equilibrio de la reacción es similar al que presenta la inhibición no competitiva

simple (Anexo 2, ecuación 32), también se le denomina “Intersección con

inhibición no competitiva lineal”. Del esquema de reacción y la gráfica de

transformación de Lineweaver-Burk asociada (Anexo 2 ecuación 40 figura 31),

se observa que, independientemente de [ I ] esté presente en el sistema

siempre una parte de E se encuentra como complejo ESI no productivo, aun

cuando se esté presente una alta concentración de [S] consecuentemente Vmaxi

< Vmax. Del igual manera, cualquier [ I ] produce un complejo EI de menor

afinidad por S, por lo que KSapp> KS. También como ESI es no productivo la vo

tiende a cero conforme se incrementa [ I ].

Antecedentes

8

Otro de los sistemas de inhibición es el que describe Siegel como C2

(Siegel, 1975) (Anexo 2 ecuación 42). Se observa que en este sistema E y EI

se unen a S aunque con diferentes afinidades. En cualquier [S], se reparte para

la formación de ES y ESI. Como ESI es productivo aunque en menor

proporción que ES entonces Vmaxi < Vmax. Además, KSapp > KS porque en

cualquier [ I ], una parte de E se utiliza para la formación de EI de menor

afinidad por S. En este sistema se proponen dos parámetros y ; el primero

de ellos como se planteó en C1, describe una menor afinidad de EI o I por S.

El parámetro , indica la disminución de la constante de velocidad que afecta la

transformación de ESI en P. Una diferencia entre los sistemas de inhibición

simple C1 y C2, que se observa en la comparación de las figuras 31 y 32 del

Anexo 2, es que cuando [ I ] es muy alta, una parte forma ESI que es productor

por lo que el valor de vo nunca es cero.

Otro sistema de inhibición mixta relevante en este trabajo de

investigación, es el que se denomina C5 (Anexo 2 ecuaciones 46 y 47 figura

33). En este sistema el inhibidor disminuye la constante de velocidad de

formación de producto (), pero a su vez incrementa la afinidad de la enzima

por el sustrato (). Y describe el comportamiento de los parámetros de la

siguiente manera yComo se nota en el esquema

propuesto, la kP tiende a disminuir pero KS disminuye mucho más.

2.3 Alzheimer

La enfermedad de Alzheimer (EA) es una forma común de demencia,

caracterizada por la degeneración de las neuronas colinérgicas que inervan la

corteza, amígdala y el hipocampo, con dificultad de mantener la atención, y con

un daño cognitivo profundo, como la pérdida de memoria y la habilidad de

aprendizaje. Estos déficits cognitivos causan deterioros significativos en la

ocupación y función social. (Fodale et al., 2006)

En la actualidad, la EA es la primera causa de demencia en el mundo

afectando a más de 20 millones de personas. Se espera esta cifra se

incremente debido principalmente a dos razones: el aumento de la población

Antecedentes

9

de edad avanzada y que el principal factor de riesgo de padecer esta

enfermedad es precisamente la edad. En Estados Unidos, en el año 2000, se

calculaba que 4.5 millones de personas sufrían la EA y se calcula que para el

año 2020 esta cifra se incrementará en un 27%, para el 2030 un 70% y casi un

300 % para el año 2050 es decir aproximadamente 13 millones de personas

padeciendo esta enfermedad (Grant, 2004; Hebert, 2003; García, S. et al.,

2009). México no es la excepción, las transiciones sociales, demográficas y

económicas que ha experimentado nuestro país en las últimas décadas han

propiciado que un mayor número de personas llegue a la tercera edad, debido

particularmente a los avances registrados por la medicina, lo que ha

incrementado sustancialmente la esperanza de vida y con ello el riesgo del

deterioro intelectual durante la senectud. Se estima que alrededor del 25 por

ciento de la población mexicana sufrirá en el curso de su vida algún trastorno

mental. Así mismo estos padecimientos constituyen una de las principales

causas de pérdida de años de vida saludable. Las autoridades de salud mental

en México informaron que de 600 mil personas de edad avanzada que padecen

algún tipo de demencia, se calcula que 60% de los casos corresponde a la EA

(Magally, 2002). La transformación de la pirámide poblacional en nuestro país

permite prever que durante los próximos años la demanda de servicios de

salud mental será mayor debido al envejecimiento de la población y, en

particular, es probable que los casos de EA muestren una mayor prevalencia

(www.salud.gob.mx).

2.3.1 Fisiopatología

Aunado al proceso de envejecimiento en los pacientes que sufren la EA

los cambios morfológicos como la contracción del cerebro y las modificaciones

en la vascularización del mismo hacen que el proceso de deterioro cognoscitivo

sea exacerbado (Robertson, 2002).

Todas las regiones de la corteza cerebral reciben intensas inervaciones

colinérgicas, en la EA hay actividad reducida de proyecciones colinérgicas al

hipocampo y corteza, mientras que las alucinaciones experimentadas por

Antecedentes

10

personas con demencia con cuerpos de Lewy (DLB) están asociadas con

reducciones en la actividad de la acetilcolina neocortical. Funciones cognitivas

superiores como la memoria y el aprendizaje están estrictamente relacionadas

a eventos moleculares que son consecuencia de la expresión temprana de

productos génicos. Esto incluye la activación de receptores colinérgicos,

potenciación a largo plazo y depresión a largo plazo, plasticidad sináptica y

mantenimiento y diferenciación de neuronas (Fodale et al., 2006).

La EA se caracteriza por el deterioro de las funciones cognoscitivas,

resultado de la pérdida irreversible de las células cerebrales, particularmente

en la corteza e hipocampo. Las características más importantes de esta

enfermedad son la perdida de la memoria, el juicio, alteraciones en la toma de

decisiones, orientación y lenguaje aunque pacientes que presentan esta

enfermedad presentan otros síntomas como agitación, psicosis, depresión y

cambios en la personalidad. Sin embargo el diagnóstico definitivo sólo se

puede hacer mediante la autopsia. (Raskind et al., 2002).

La hipótesis colinérgica de disfunción de la memoria fue propuesta por

Bartus en 1982, se basa en dos nociones principales: la primera es que el

sistema colinérgico sostiene una gran variedad de procesos cognitivos,

particularmente los involucrados en el aprendizaje y memoria, la segunda es

que el déficit cognitivo relacionado con la edad es en parte causado por un

declive en la integridad funcional de ese sistema colinérgico cerebral. Lo

anterior deja ver que la pérdida de neuronas colinérgicas corticales se

considera como marcador de la enfermedad. Esto estudios han estimado la

relación entre la EA y el sistema colinérgico central son consistentes con

deficiencias en la neurotransmisión colinérgica y daño en la función cognitiva

de pacientes con EA (Fodale et al., 2006).

La inflamación juega un papel muy importante en muchas enfermedades

asociadas a la edad. Es probable que la actividad inflamatoria derive en la

muerte neuronal en el paciente con EA. Este proceso inflamatorio que circunda,

rodea e infiltra las placas neuríticas se asocia con la liberación de sustancias

mediadoras de inflamación como: la alfa 1 antiquimotripsina, la alfa 2

Antecedentes

11

macroglobulina, la interleucina 1 y la interleucina 6, que son sobreexpresadas y

activan mas células gliales, lo que provoca la muerte neuronal en pacientes con

EA (Griffin, 2006).

En general, las alteraciones fisiopatológicas y anatómicas de la

enfermedad se dividen en estructurales y funcionales. Dentro de la primera, se

identifican: marañas neurofibrilares que están compuestas de filamentos

helicoidales apareados y ocasionalmente filamentos rectos simples. Contiene

principalmente una forma anormal de la proteína tau hiperfosforilada, asociada

a los microtúbulos. En las neuronas saludables la proteína tau une y estabiliza

los microtúbulos que constituyen el citoesqueleto de la célula mediado por un

proceso de fosforilación y desfosforilación enzimática reversible. La formación

de estas marañas neurofibrilares destruye a la proteína tau interrumpiendo el

transporte neuronal y la muerte de las neuronas afectadas (Satyabrata et al.,

2004). Otro elemento estructural de daño orgánico lo representa la aparición de

placas neuríticas de material amiloide tóxico. Estas placas constituidas por la

proteína -amiloide regulan negativamente la síntesis y liberación de

acetilcolina, inhibiendo la piruvato deshidrogenasa que genera Acetil-Coenzima

A de piruvato. Un incremento en la forma soluble de -amiloide es considerada

un predictor de degeneración sináptica y esta relacionada con el daño cognitivo

en pacientes con EA (Fodale et al., 2006). La principal alteración funcional de

EA es la disminución en la producción o funcionamiento de sustancias

neurotrasmisoras. Los cambios estructurales y funcionales son el resultado de

una cadena de conmutaciones del programa genético neuronal y cambios

ambientales que modifican la estructura y la neurotransmisión del cerebro

(García, S. et al., 2009). Las placas neuríticas se forman primero en la

neocorteza basal y luego se expanden hacia la formación hipocampal y áreas

corticales adyacentes (Rogers y Morrison, 1985; Pearson et al., 1985;

Duyckaerts et al., 1986; Ingelsson et al., 2004). El sistema límbico está

fuertemente involucrado en la EA, particularmente el área del hipocampo está

relacionada con la función cognoscitiva y de memoria. Además, la muerte de

subpoblaciones neuronales como las colinérgicas, generan un déficit específico

de neurotransmisores, principalmente ACh como parte del escenario que

engloba a la EA. La evidencia clínica de la degeneración de las neuronas

Antecedentes

12

colinérgicas y las observaciones experimentales en animales, apoyan la

hipótesis de que la actividad nerviosa colinérgica juega un papel clave en la

función cognoscitiva (Matsuoka et al., 1992). Una de las características más

destacadas en los estudio postmortem en personas que padecieron la EA es la

disminución de los niveles de ACh en el Sistema Nervioso Central (SNC)

(Hebert et al., 2003). Otra característica importante es la formación de

astrocitos reactivos y el daño oxidativo originado por la microglia durante el

desarrollo de la enfermedad (Selkoe, 2001; Reddy y Beal, 2005; Reddy y

McWeeney, 2005).

2.3.2 Tratamiento

Los tratamientos que actualmente se utilizan para tratar la EA están

dirigidos a retrazar el avance de la enfermedad y disminuir la sintomatología de

la misma; principalmente se utilizan inhibidores de la enzima Achasa que tiene

como función destruir la ACh una vez que es liberada al espacio sináptico para

ejercer su acción, de esta manera lo que se busca es que aumente la ACh

acetilcolina a nivel de sistema nervioso central y que permanezca más tiempo

ejerciendo su acción sobre los receptores de las células postsinápticas. Existen

cuatro fármacos inhibidores de la Achasa, la tacrina, donezepilo, galantamina y

la rivastigmina, el primero que salió al mercado fue la tacrina, sin embargo, no

fue utilizado por mucho tiempo debido a su hepatotoxicidad. El donezepilo es

un inhibidor reversible, mejora la memoria y es relativamente selectiva a la

acetilcolinesterasa del SNC. La galantamina también es un inhibidor reversible,

además de que es un modulador alostérico de las receptores nicotínicos

presinápticos que aumentan la liberación de acetilcolina, glutamato y de GABA.

La rivastigmina ejerce su efecto principalmente en la corteza cerebral y el

hipocampo no es hepatotóxico pero al igual que los dos fármacos anteriores

produce efectos secundarios como calambres e incontinencia y en general

nauseas, vómitos, diarreas e insomnio, la (Wilkinson et al., 1999; Farlow et al.,

2007).

Antecedentes

13

Los agentes antiinflamatorios y antioxidantes son utilizados para reducir

el riesgo EA, atenuando la neurodegeneración generada por la actividad de las

células de la glía. La inflamación es un proceso que genera radicales libres que

inicialmente provocan daño celular, y posteriormente la muerte celular, por lo

tanto sustancias con actividad antioxidante se vuelven elementos básicos en la

búsqueda de alternativas para el tratamiento de la EA (Heneka et al., 2007).

2.4 Plantas medicinales utilizadas para contrarrestar padecimientos del

SNC.

La medicina tradicional menciona el uso de plantas con propiedades

sobre el sistema nervioso, como Ginkgo biloba y Panax ginsen que han

confirmado su eficacia terapéutica en numerosas alteraciones de la función

cerebral de origen isquémico vascular, demencias seniles ligeras y severas

como el Alzheimer. En todos los casos se apreció mejoría de los signos y

síntomas de las funciones cognitivas, particularmente de aquellas relacionadas

con pérdida de memoria, atención, alerta, vigilancia y fluidez mental. El Ginkgo

biloba en la EA parece actuar sobre el control de su progresión. Se ha

comprobado igualmente un efecto neuroprotector específico en células del

hipocampo (Diamond, 2000).

Los extractos vegetales que sustentan los tratamientos con

fitomedicamentos se están constituidos principalmente por sustancias

derivadas el metabolismo secundario. Dentro de ellas son los flavonoides son

pigmentos que protegen al organismo del daño producido por agentes

oxidantes, como los rayos ultravioletas, la polución ambiental, sustancias

químicas presentes en los alimentos, etc. El organismo humano no puede

producir estas sustancias químicas protectoras, por lo que deben obtenerse

mediante la alimentación o en forma de suplementos. Los flavonoides

contienen en su estructura química un número variable de grupos hidroxilo

fenólicos que les confieren excelentes propiedades de quelación del hierro y

otros metales de transición. Por ello presentan una gran capacidad antioxidante

y desempeñan un papel esencial en la protección al daño orgánico provocado

por el estrés oxidativo. Siendo muy efectivos en la terapéutica de un elevado

Antecedentes

14

número de patologías como: cardiopatía isquémica, aterosclerosis, cáncer,

diabetes mellitus, infecciones víricas, úlcera estomacal y duodenal, y procesos

inflamatorios asociados. Su capacidad de secuestrador de radicales libres se

dirigen fundamentalmente hacia radicales hidroxilo y superóxido, especies

altamente reactivas implicadas en el inicio de la cadena de peroxidación lipídica

y se ha descrito su capacidad de modificar la síntesis de eicosanoides (con

respuestas anti-prostanoide y anti-inflamatoria), de prevenir la agregación

plaquetaria (efectos antitrombóticos) y de proteger a las lipoproteínas de baja

densidad de la oxidación (prevención de la placa de ateroma) (Martínez-Flores

et al. 2002). Se ha evaluado la actividad de los flavonoides en enfermedades

como el Alzheimer en la que como ya se ha mencionado existen niveles

reducidos del neurotransmisor acetilcolina, que es hidrolizado por la enzima

acetilcolinesterasa. A la par existe otra enzima llamada Butirilcolinesterasa que

funciona como un corregulador de la neurotransmisión colinérgica ya que

posee una similitud estructural con la acetilcolinesterasa, sin embargo, durante

el desarrollo de la EA su actividad se incrementa hasta un 90% dañando

también la comunicación entre zonas cerebrales como la corteza y el

hipocampo. Los flavonoides se han estudiado con el objetivo de buscar la

inhibición tanto de la acetilcolinesterasa como butirilcolineterasa debido a su

similitud estructural. Como se menciona anteriormente las flavonoides poseen

una gran variedad de propiedades, entre ellas la de inhibir enzimas como las

cinasas dependientes de tirosina y ciclina, de donde fue posible suponer en la

inhibición de acetilcolinesterasa y butirilcolinesterasa. En un estudio realizado

con 10 flavonoides respecto a la capacidad inhibitoria de acetil colinesterasa

fue posible establecer la siguiente secuencia: Miricetina=Quercetina

>Luteolina>Galangina=Kampherol>Fisetina>Apigenina y Rutina no presentó

efecto inhibitorio relevante (Katalinic et al., 2009).

Otro grupo de compuestos que se han descrito como inhibidores de la

acetil colinesterasa son los ácidos triterpénicos (Reuter et al., 2007),

específicamente el ácido ursólico, que mostró inhibición mixta competitiva – no

competitiva, con un valor de Ki = 6 pM e IC50 = 7.5 nM, comparado con tacrina

que tuvo Ki =0.4 nM e IC50 = 1.0 nM (Chung et al., 2001).

Antecedentes

15

Otros estudios realizados con el extracto hidroalcohólico de Bouvardia

ternifolia silvestre han demostrado su eficacia como antiinflamatorio y mejora

de la memoria en ratones e inhibidor de la enzima acetilcolinesterasa in vitro,

procesos relacionados directamente con la EA (García, 2008).

2.4.1 Bouvardia ternifolia

Figura 1. Ejemplar de Bouvarida ternifolia colectada en la localidad de Coajomulco Municipio de Huitzilac Morelos. (N 19° 01’ 37.38”, WO 99° 12’ 38.37”, 2572 msnm).

Taxonomía

Reino: Plantae

Subreino: Traqueobionta (plantas vasculares).

Superdivisión: Spermatophyta (plantas con semillas).

División: Magnoliophyta (plantas con flor).

Clase: Magnoliopsida (dicotiledóneas).

Subclase: Asteridae.

Orden: Rubiales.

Familia: Rubiaceae.

Género: Bouvardia

Especie: Bouvardia ternifolia

Antecedentes

16

Descripción botánica

Es una planta herbácea, que llega a alcanzar los 3 m de altura, en el

tallo y ramas hay presencia de pelos blancos y cortos, sus hojas pueden ser de

forma linear, lanceoladas o elípticas pero en la mayoría de los casos son de

forma elíptico-lanceoladas, llegan a medir de 1 a 10 cm de largo y 0.2 a 2.5 cm

de ancho, tienen un ápice agudo, base cuneiforme, nervación pinnada y

comúnmente verticiladas, en numero de 3 a 4 por nodo, los peciolos miden

entre 0.5 y 11 mm de largo, su inflorescencia se encuentra en la parte terminal

de las ramas en numero de 3 a 40, con pedicelos de 2 a 14 mm de largo. Las

flores tienen corola de forma tubular de color salmón, rojo o naranja, en raras

ocasiones de color blanco, el tubo mide de 5 a 30 mm de largo, con un anillo

velloso interno hacia la base, sus anteras miden de largo entre 2 y 4 mm, los

lóbulos del cáliz son de forma lanceolada o lineares con una longitud de 2 a 10

mm. El fruto es una capsula de 4.5 a 9 mm de largo y de 5 a 10 mm de ancho

sin pelos; sus semillas miden de 2 a 3.5 mm de ancho (Rzedowski et al., 2001).

Usos

Es utilizada para problemas del sistema circulatorio y digestivos,

infecciones, desórdenes mentales, nervios, inflamación, problemas en el

embarazo, parto, desórdenes del sistema respiratorio, envenenamientos y

dolor, así como para la disentería, rabia, cólicos y diarrea, sangrado, también

se usa como tónico cardiaco, sus hojas y flores se usan para la erisipela, en

forma de cataplasma o ingerida como infusión es usada contra piquetes de

insectos (planta completa o semilla). Hervida y tomada como té se usa contra

el prurito (Argueta, 1994; Aguilar-Contreras et al., 1998).

Distribución geográfica

Es originaria de Mesoamérica y de México. Se distribuye en zonas de

bosque de pino-encino, pastizales y matorral xerófilo, se le ha encontrado hasta

los 3000msnm. En los Estados Unidos de America se ha localizado en los

condados de Texas, Nuevo México y Arizona, en México en los estados de

Chihuahua, Coahuila, Distrito Federal, Durango, Guanajuato, Hidalgo, Estado

de México, Michoacán, Morelos, Nayarit, Nuevo León, Oaxaca, Puebla,

Antecedentes

17

Querétaro, San Luís Potosí, Sinaloa, Sonora, Tamaulipas, Tlaxcala, Veracruz

(Villaseñor et al., 1998). En México se le conoce como Donita, nucppuetel,

candelilla, doto, en el estado de Sinaloa se le conoce como hierba del indio,

hierba del pasmo, en Coahuila y Durango se le conoce como mirto, trompetilla,

hierba del burro, mirto de campo (Aguilar-Contreras et al., 1998; Martínez,

1979).

Estudios fitoquímicos

Se han aislado de las partes aéreas de esta planta componentes

peptídicos como el bouvardín que es un hexapéptido cíclico, formado por 2 L-

alaninas, una D-alanina y 3 N-metil-L-tirosinas modificadas, además posee un

anillo formado por el acoplamiento oxidativo del oxígeno fenólico de una

tirosina por el carbono orto del grupo hidroxil fenólico de una tirosina adyacente

(Jolad et al.1977) además de los derivados desoxi y metilados (Shivanand et

al., 1977). En la su raíz de existe una elevada concentración de los ácidos

ursólico y oleanólico (Pérez et al., 1998.), los cuales poseen actividades

antiinflamatorias, analgésicas, sedantes, hepatoprotectoras y sobretodo de

inhibición de la enzima acetil colinesterasa (Chung et al., 2001; Jiménez-Ferrer

et al., 2005.).

Estudios farmacológicos

Se comprobó que el extracto metabólico de las partes aéreas presenta

actividad antitumoral y citotóxica; mediante una evaluación en ratón

administrados por vía intraperitoneal. La actividad citotóxica fue observada en

células tumorales de carcinoma in vitro a una concentración de 20 g/ml

(Argueta, 1994). Los extractos hexánico y metanólico presentaron efecto

inhibitorio de la acción tóxica del veneno de Centruroides limpidus limpidus en

ratones (Jiménez-Ferrer et al., 2005). Se demostró en estudios preeliminares

que el Bouvardín tiene alta efectividad contra la leucemia P388 y es

ligeramente activo contra el melanoma B16. Como antitumoral inhibe de la

síntesis de proteínas (Johnson et al., 1978). Además tiene un elevado efecto

Antecedentes

18

contra el ciclo de división celular en el cultivo de células de Hámster Chino

(Tobey et al., 1978).

El extracto hidroalcohólico de presentó efecto inhibitorio de la enzima

acetilcolinesterasa, efecto antiinflamatorio en el pabellón auricular de ratones y

nootrópico en ratones expuestos al modelo de laberinto en forma de “T”

(García, 2008).

2.5 Métodos de propagación vegetal

Como todos los seres vivos las plantas llevan a cabo un ciclo de vida

que consiste en nacer, crecer, reproducirse y morir. Existen solo dos métodos

de reproducción vegetal para las plantas: la forma sexual y la asexual, en esta

última se producen nuevos organismos a partir de semillas, haciendo posible

obtener nuevas variedades de plantas, detectar aquellas que se han adaptado

a las condiciones de un medio concreto y mejorar la especie mediante la

selección de ejemplares con características de interés (Boutherin, 2005).

En la propagación asexual no se produce la recombinación genética; ya

que el genoma de la planta hija, es idéntico al de la madre, lo cual permite

obtener preservar las características de interés y crear lotes con plantas

homogéneas (Boutherin, 2005). En este tipo de propagación se producen

organismos a partir de algún otro órgano de la planta (tallo, hoja o raíz). Sin

embargo la propagación vegetal se basa en el potencial de propagación de

cada especie (Vázquez et al., 1997). Existen varias técnicas de propagación

asexual: desqueje, injertos, acodo, división de matas, división de retoños,

macolladura y la micropropagación que es la propagación asexual de plantas

utilizando técnicas de cultivo in vitro. La micropropagación es una de las

aplicaciones mas utilizadas debido a su gran productividad comparada con las

técnicas tradicionales de propagación. Esta técnica ofrece varas ventajas,

como son un sistema de propagación clonal, es decir que mantiene las

características genotípicas del material seleccionado inicialmente; es un

sistema independiente de las condiciones externas como las estaciones del

año, sequías, heladas, debido a que todo se realiza bajo condiciones

Antecedentes

19

controladas de laboratorio: el número de plantas que se puede obtener es

ilimitado; requiere de espacios pequeños el proceso es relativamente corto;

otra ventaja importante es que las plantas obtenidas se encuentran libres de

patógenos que pueden afectar la calidad de las plantas. La micropropagación

se puede llevar a cabo a partir de meristemos apicales, yemas axilares (nodos)

y ápices, siendo la propagación por nodos la más comúnmente utilizada, ya

que son zonas naturales de crecimiento capaces de formar nuevos brotes que

al cabo de varios ciclos de corte de nodos y siembra permite aumentar de

manera exponencial el número de plantas obtenidas, algunas ventajas

importantes de este tipo de propagación son que ofrecen una estabilidad

genética excelente, el sistema es muy similar en todas las especies y permite la

obtención rápida de plantas libres de patógenos. La micropropagación de

cualquier especie vegetal consta de cinco etapas básicas:

La etapa 0. Es la etapa en la que se seleccionan y acondicionan las

plantas madre que serán utilizadas para iniciar el cultivo in vitro.

La etapa 1. Establecimiento de los cultivos axénicos. En esta se

selecciona el explante y se lleva a cabo la esterilización del mismo.

Etapa 2. Multiplicación del tejido. En esta etapa se lleva a cabo la

verdadera micropropagación con la finalidad de obtener un gran número

de brotes nuevos a partir de las mínimas cantidades de tejido,

Etapa 3. Elongación y Enraizamiento. En esta etapa se hace uso del

material generado en la etapa 2 que son básicamente pequeños brotes,

la mayoría carentes de raíz y de los cuales se pretende que lleven a

cabo la formación de su sistema radical, al mismo tiempo de que su

elongación se vea incrementada para poder llevar a cabo una mejor

manipulación de las plántulas y hacer más probable su adaptación a las

condiciones ambientales externas.

Etapa 4. Adaptación al medio externo. Las plantas generadas in vitro

presentan grandes dificultades a la adaptación hacia el medio externo,

por lo que se hace necesario enfrentar a tal planta a cambios moderados

de humedad relativa, horas luz etc. (Pérez et al., 1999)

Antecedentes

20

Ventajas:

Permite controlar las condiciones ambientales, debido a su

independencia de los mismos (luz, temperatura, y humedad).

Permite estudiar diversos procesos Fisiológicos.

Evita el riesgo de contaminación con patógenos, ya que se realizan en

medios estériles.

Se puede obtener grandes cantidades de plántulas en espacios

reducidos

Permite tener plántulas con características homogéneas (Segretin, 2007)

El cultivo de plantas medicinales se ha vuelto de gran importancia

debido a varias razones, por ejemplo, los metabolitos secundarios de las

plantas son un recurso importante de las industrias farmacéuticas,

experimentando en el comercio medicinal un incremento a nivel mundial en los

últimos 20 años; en el mundo, 1.5 billones de personas pertenecientes a países

en desarrollo continúan utilizando plantas medicinales en la forma tradicional.

Los productos naturales han empezado a ser nuevas estrategias comerciales y

se han implementado en programas de salud alternativa en países

desarrollados sin excluir a los no desarrollados. Por lo que la demanda de

plantas medicinales ha crecido en Europa y todo el mundo; la comercialización

de plantas medicinales significa cada año un negocio de 20,000 millones de

dólares en todo el mundo. Siendo un área de gran importancia a nivel

internacional tanto para químicos, biólogos, antropólogos, sociólogos como

también para economistas, administradores y grandes empresarios (Secretaria

de Desarrollo Rural, 2005). Por lo que el establecimiento de técnicas para el de

cultivo de plantas medicinales se hace indispensable para el aprovechamiento

de este recurso. La biotecnología provee de las técnicas adecuadas de cultivo

que favorecen el mejoramiento de la calidad de los cultivos de plantas.

Antecedentes

21

2.5.1 Hidroponía

Existen varias formas de cultivo de plantas, la tradicional que se realiza

en suelo directamente el cultivo en sustrato y la hidroponía que forma parte de

los llamados “cultivos sin suelo”. En estos sistemas el medio de crecimiento o

soporte de las plantas puede estar constituido por sustancias de origen

orgánico o inorgánico e inertes, donde se garantiza que la nutrición de la planta

es exclusivamente externa. Por lo tanto la hidroponía es un sistema de

producción donde el agua es el medio donde las plantas encuentran los

nutrientes necesarios para su desarrollo sin la participación del suelo. Las

ventajas más sobresalientes de este sistema es que requieren un número

menor de horas de trabajo, las plantas no tienen competencia por los

nutrientes, las raíces tienen mejores condiciones de crecimiento, se logra una

perdida mínima de agua, no tiene problemas con las malezas, se reduce la

aplicación de agroquímicos, entre otros. Por lo tanto estas dos técnicas en

conjunto permiten la propagación, el crecimiento y desarrollo de plantas en

condiciones controladas (Gilsanz, 2007).

Si bien existen antecedentes en la micropropagación de la especie

Bouvardia ternifolia (Fernández y Sánchez de Jiménez, 1983), hasta el

momento no se han registrado diseños del desarrollo en hidroponía de la

planta. El protocolo de cultivo en hidroponía establecido en este trabajo de

tesis, será el pionero en esta área, para poder establecer el desarrollo

controlado de la planta y evaluar sus propiedades farmacológicas.

Justificación

22

3. JUSTIFICACION

a EA representa un grave problema de salud pública para México y

para el mundo, debido que se encuentra en franco crecimiento por el

incremento de los estratos poblacionales mayores de 60 años, al

aumentar la esperanza de vida. Estos son segmentos de la población son los

que presenta el mayor riesgo de padecer EA. Otro factor que agrava la

situación, es el aumento de la prevalencia de enfermedades crónico-

degenerativas asociadas al envejecimiento, donde el daño orgánico se

incrementa por la exposición al estrés oxidativo. La búsqueda de nuevas

terapias tiene en los fitomedicamentos un recurso de enorme potencial, en

tanto que consisten en extractos vegetales que se definen como una mezcla de

principios activos. Siendo la EA un proceso fitopatológico multifactorial, la

administración de mezclas complejas sustancias diversas actividades

farmacológicas, surge como un tratamiento lógico. Se tiene antecedentes

químico-farmacológico, de que el extracto de Bouvardia ternifolia presenta la

capacidad de contrarrestar las principales alteraciones de EA; por el efecto

nootrópico, antiinflamatorio y antioxidante, destacando la actividad como

inhibidor de la acetilcolinesterasa. Con ello se puede concebir a esta planta,

como una especie con la que se puede alcanzar el desarrollo de un

fitomedicamento anti Alzheimer. Sin embargo, una de las limitantes mas

importantes que presenta cualquier desarrollo tecnológico de un

fitomedicamento fundamentado en una planta silvestre y por ello no cultivada,

es asegurar el abasto de material vegetal de buena calidad, que contenga los

principios activos asociados a la actividad farmacológica deseada.

Es por ello que en este proyecto se pretende caracterizar el efecto

farmacológico como inhibidor de acetil colinesterasa del extracto de Bouvardia

ternifolia micropropagada y cultivada en hidroponía; estableciendo su perfil de

composición fitoquímica y una la comparación tanto química como

farmacológica con un extracto de B. ternifolia silvestre.

LL

Hipótesis

23

3.1 Hipótesis

l extracto hidroalcohólico de Bouvardia ternifolia cultivada en hidroponía

tiene el efecto inhibidor de la enzima acetilcolinesterasa igual que la

planta silvestre.

EE

Objetivos

24

4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo general

valuar el efecto inhibidor de acetilcolinesterasa por extractos de

Bouvardia ternifolia cultivada.

4.2 Objetivos particulares

Establecer el protocolo para la micropropagación de Bouvardia ternifolia

por cultivo de nodos.

Establecer las condiciones de crecimiento y desarrollo en hidroponía.

Realizar la caracterización fitoquímica de los extractos de Bouvardia

ternifolia.

Evaluar el efecto de los extractos de Bouvardia ternifolia en la inhibición

de la enzima acetilcolinesterasa.

EE

Materiales y Métodos

25

5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1 Material biológico

5.1.1 Material vegetal

as partes aéreas y semillas de B. ternifolia se colectaron en la

localidad Coajomulco, Municipio de Huitzilac Morelos, un ejemplar de

herbario fue enviado para ser identificado en el Herbario de Centro

Médico Siglo XXI- IMSS por la M. en C. Abigail Aguilar Contreras quien la

registro con el número: HPMIMSS 13596.

5.1.2 Animales utilizados para las pruebas farmacológicas

Se utilizaron ratones hembra de la cepa ICR para obtener la enzima

acetilcolinesterasa mediante la extracción y maceración de cerebro, estos

animales fueron mantenidos y acondicionados en el laboratorio bajo

condiciones controladas, como son 12 hrs luz por 12 hrs oscuridad,

temperatura de 24 ºC y acceso libre al agua y alimento. Además se

manipularon bajo la ética de la Norma Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999

(Especificaciones técnicas para la producción, cuidado y uso de los animales

de laboratorio).

5.2 Métodos

Los métodos utilizados para la realización de este trabajo se muestran

en el diagrama de flujo de la figura 2.

5.2.1 Micropropagación

Desinfestación de semillas. Se llevó a cabo de acuerdo al diagrama de

la figura 3 basado en lo reportado por Eugenio Martín Pérez y colaboradores

en 1999.

LL


26

Figura 2. Diagrama de flujo del trabajo experimental.

Figura 3. Diagrama del protocolo para la desinfestación de semillas.

Extran al 2% 5min

Etanol al 50% 10s.

Hipoclorito de sodio a 0.3 % 5min.

Siembra medio semisólido MS


27

La desinfestación de semillas comenzó con un lavado en extran al 2%

por 5 minutos (min), seguido de la inmersión en etanol al 50% por 10 segundos

(s) y después en condiciones asépticas se hizo la inmersión en hipoclorito de

sodio al 0.3% ( a partir de cloro comercial al 6%), al final se realizó la siembra

en medio MS. Un frasco tipo Gerber con cinco semillas se consideró como

unidad experimental, de las cuales se hicieron cinco repeticiones por cada

tratamiento. Se evaluó el porcentaje de desinfestación por unidad experimental

durante 8 días antes de la germinación y 10 días más después de la

germinación. Con las plántulas obtenidas se procedió a la micropropagación

por cultivo de nodos.

Cultivo de nodos.

Se evaluó el efecto de las citocininas Cinetina y Bencilaminopurina en la

brotación múltiple de los segmentos nodales provenientes de plantas asépticas

conforme al diseño experimental indicado en el cuadro 1. Los explantes fueron

colocados en medio MS al 100%. Se cuantificó el número de brotes por unidad

experimental. Se consideró unidad experimental un frasco tipo Gerber con

cuatro explantes. El tiempo de de valuación fue de 3 semanas. Con los datos

obtenidos se realizó una ANOVA para determinar si había diferencia entre los

tratamientos.

Cuadro 1. Diseño experimental para la inducción de brotación múltiple en segmentos nodales de B. ternifolia. Cada letra del abecedario es un tratamiento.

Concentración (mg/L)

CITOCININAS

Cinetina (KIN) Bencilamiopurina (BAP)

0.0 A E 0.2 B F 0.5 C G 1.0 D H 1.5 E I


28

Inducción de raíces.

Se emplearon las auxinas Acido Naftalenacético, Indolbutírico e

Indolacético para inducir la formación de raíz en los brotes desarrollados

después de 3 semanas en el medio de inducción de brotación múltiple, el

diseño aplicado para este fin se muestra en el cuadro 2.

Cuadro 2. Diseño experimental para inducir la formación de raíces de explantes provenientes de la brotación múltiple de B. ternifolia. Cada letra del abecedario es un tratamiento.

Concentración (mg/L)

AUXINAS

Ácido Naftalenacético

(ANA)

Ácido Indolbutírico

(IBA)

Ácido Indolacético

(AIA) 0.1 A E J 0.2 B F K 0.5 C G L 1.0 D H M 1.5 E I N

Los explantes fueron colocados en medio MS al 100%. Se cuantificó el

número de explantes con raíz por unidad experimental el cual nuevamente fue

un frasco tipo Gerber con cuatro explantes; de ésta cuantificación se obtuvo un

promedio por cada tratamiento y se determino si existía diferencia significativa

de los tratamientos mediante una ANOVA.

5.3 Aclimatización.

Se realizó aplicando el método reportado por Ventura y colaboradores

en el 2003 el cual consistió en la transferencia de las plántulas a sistemas

hidropónicos construidos con recipientes de plástico de 5 cm de alto por 6 cm

de diámetro en los que se vertió solución nutritiva de Hoaglan y Arnonn 1950.

Estos se cubrieron con una tapa de goma EVA (Ethylene Vinyl Acetate)

perforada en el centro para el sostener las plántulas, posteriormente se

cubrieron con bolsas de nylon de 10 x 20 cm previamente asperjadas con agua

destilada en su interior. Después de la primer semana se les hicieron

perforaciones de 6 mm de diámetro con una perforadora convencional cada

tercer día durante 2 semanas, con la finalidad de igualar las condiciones del


29

interior del sistema hidropónico con el ambiente externo, después de la tercer

semana se determino el porcentaje de supervivencia al contar el número de

plántulas aclimatizadas entre el número total de plántulas transferidas

inicialmente.

5.4 Cultivo Hidropónico

Efecto de la solución nutritiva de Hoagland en el desarrollo de plántulas

de B. ternifolia.

Se evaluó el efecto de diferentes concentraciones de la solución nutritiva

de Hoagland en el desarrollo de plántulas de B. ternifolia provenientes de la

germinación de semillas ex vitro. Los tratamientos fueron concentraciones de

solución nutritiva al 25, 50, 75, 100 y 125% con diez repeticiones por cada uno,

siendo la unidad experimental un recipiente de plástico del No. 8 con capacidad

de 250 ml con una plántula la cual se sostuvo con una tapa de papel aluminio,

los recipientes se cubrieron con papel aluminio para impedir el desarrollo de

organismos fotosintéticos y colocados en invernadero. Se hizo el registro de

longitud de brote (cm), de raíz (cm), y número de nodos cada siete días en un

periodo de 2 meses. Se aplicó una ANOVA para encontrar diferencias

significativas en el desarrollo de las plantas.

Cultivo hidropónico de plántulas provenientes de la micropropagación.

Plántulas provenientes del procesos de aclimatización se colocaron en

macetas de 7 cm de diámetro que contenían una mezcla de vermiculita y

agrolita en proporción de 3 a 1 respectivamente, las cuales se colocaron en

charolas de plástico de color negro de 40 cm de largo x 18 cm de ancho y 5.5

cm de profundidad en las que se vertió solución nutritiva de Hoagland y Arnon

al 100% ya que este tratamiento fue el que generó el mejor desarrollo de

plántulas de B. ternifolia. Permanecieron en condiciones de invernadero

durante un periodo de 10 semanas, al cabo del cual se cosecharon para su

secado y posterior evaluación fitoquímica y farmacológica.


30

5.5 Extracto vegetal de Bouvardia ternifolia cultivada

Secado y obtención de extractos.

Las plantas cosechadas se secaron en un cuarto obscuro a temperatura

ambiente hasta alcanzar un estado de quebradizo. Posteriormente se procedió

a moler en una picadora maraca Pulvex Plaxtic (Fig.4) el material molido se

maceró en una solución hidroalcohólica al 60% (60 etanol-40 agua), el líquido

recuperado mediante tres lavados consecutivos fue concentrado en un

evaporador rotatorio marca “Heidolph” modelo “Laborota 4000” (Fig.5) a 60°C

para la eliminación del disolvente, el material que se recuperó fue liofilizado y

almacenado para su posterior uso en las pruebas biológicas.

Figura 4. Maquina picadora marca PULVEX PLASTIC.


31

Figura 5. Evaporador rotatorio “Heidolph” modelo

“Laborota 4000”

5.6 Estudio fitoquímico

Fraccionamiento del extracto hidroalcohólico de la planta silvestre

Se tomaron 20 g del extracto hidroalcohólico de partes aéreas, se

disolvieron en 300 ml de agua y 300 ml de Acetato de Etilo (AcoEt) con la

finalidad de separa los compuestos de diferente polaridad, Figura No. 3.

Figura 6. Esquema general del estudio fitoquímico.

Primero se montó una columna de separación en donde se colocó la

solución de extracto con agua y AcoEt se agitó vigorosamente y se esperó a la

separación física de los solventes, se recuperó la fracción de AcoEt que es mas

densa que el agua y para ser concentrada en el evaporador rotatorio, el

Fracción- Acuosa

Fracción-Acetato de Etilo

Fraccionamiento del

extracto hidroalcohólico


32

extracto recuperado se fue almacenando para ser liofilizado posteriormente, el

solvente recuperado se agregó nuevamente a la columna y se realizo el mismo

procedimiento 3 veces, una vez terminados los tres lavados las dos fracciones

obtenidas se concentran nuevamente en el evaporador rotatorio y se liofilizan.

Identificación de compuestos en el extracto hidroalcohólico de la planta

silvestre.

Se pesó 10 mg de cada fracción que se obtuvo incluyendo el extracto

hidroalcohólico se disolvieron en 1 ml de metanol y 0.2 ml de agua. El análisis

de compuestos en cada una de las fracciones se realizó a través de una

cromatografía de placa en fase normal. Las fracciones que se obtuvieron

fueron probadas en el ensayo de inhibición enzimática.

La comparación fitoquímica del extracto hidroalcohólico de plantas

silvestres y cultivadas, se hizo mediante placas cromatográficas de fase normal

con un revelador para flavonoides y otra con revelador para terpenos.

5.7 Inhibición de la enzima Acetilcolinesterasa in vitro.

La evaluación de la actividad farmacológica como inhibidor de la

Acetilcolinesterasa se realizó de la siguiente manera (Rabanal y col., 2005):

Para un volumen final total de 360 l, en la celda de un

espectrofotómetro se adicionaron 300 l de buffer (100 mM de fosfatos

pH 8.0), 20 l de ATChI (Sigma Aldrich Química) (yoduro de

acetiltiocolina como sustrato en las concentraciones de 75, 50, 25, 10 y

5 mM), 20 l de DTNB (Sigma-Aldrich Química)(10 mM de dithio-bis-

nitro-benzoato, como marcador) incubado a 37°C.

Para iniciar la reacción enzimática se adicionaron 20 l de solución

enzimática (acetilcolinesterasa) (5 x 10-3 U) y se determino el incremento

de la D.O. a 412 nm, la actividad es reportada en unidades. El extracto


33

enzimático obtenido de la maceración de cerebro de ratón, se

estandarizó contra acetil colinesterasa purificada de anguila eléctrica

(Sigma Aldrich Química).

La unidad se define como 1 mmol de ATChI transformada por minuto,

para lo que se construyo una curva estándar de ATChI la cual reacciona

con DTNB formando un compuesto de color amarillo.

Para el ensayo de inhibición se utilizaron soluciones de: 0.00625,

0.0125, 0.025, 0.05 y 0.1 mg/ml del extracto vegetal de B. ternifolia

silvestre y cultivada, utilizando 280 l de buffer de fosfatos, 20 l de

ATChI, 20 l de DTNB, 20 l de extracto y 20 l de solución enzimática.

Resultados y Discusión

34

6 RESULTADOS Y DISCUSION

6.1 Micropropagación

e obtuvo un porcentaje de desinfestación de semillas de 96.92 con el

método propuesto de las cuales germinaron el 88.31%.

Flores-Escobar en el 2008 utilizó un método de desinfestación para

semillas muy similar al que se utilizo en este trabajo, las semillas empleadas en

este trabajo fueron de flores de orquídeas las cuales fueron tratadas con

hipoclorito de sodio al 5% con un tiempo de inmersión de 5 minutos obteniendo

con este método un porcentaje de desinfestación de 47.69%, Romero-Tirado en

el 2007 también menciona el uso de un método de desinfestacion muy similar con

etanol al 70% e hipoclorito de sodio al 0.5% para semillas de la orquídea Laelia

anceps. Lo cual nos permite determinar que el uso de concentraciones bajas de

hipoclorito de sodio son eficientes en la desinfestación semillas pequeñas (1 a 4

mm) sin dañar el embrión. En el caso de Bouvardia el uso de hipoclorito de sodio

a una concentración de de 0.3% a partir de cloro comercial (6%), influyó de

manera positiva en el de semillas desinfestadas y germinadas ya que el

tratamiento no fue tan agresivo para el embrión pero suficiente para eliminar los

agentes contaminantes de las semillas.

Cultivo de nodos

Los resultados de la inducción de brotación con los reguladores de

crecimiento cinetina (KIN) y bencilaminopurina (BAP) se muestran en la Figura 7

y 8 respectivamente, en donde se observa que con cinetina hubo una tendencia a

disminuir el número de brotes en la medida en que se incrementó la

concentración. Adicionalmente al desarrollo de brotes hubo formación de callo en

todos los tratamientos con éste regulador del crecimiento (datos no mostrados),

llegando a un valor máximo a partir de 0.5 mg/L. La formación de callo pudo influir

negativamente en la formación de brotes. En el caso de los tratamientos con BAP

ocurrió lo contrario respecto al desarrollo de brotes, ya que el número promedio

incrementó con el aumento de la concentración de la citocinina. El rendimiento

SS


35

más alto se obtuvo con 1.5 mg/L de BAP (7.2 brotes/explante), el cual es superior

al máximo valor obtenido con 0.2 mg/L de KIN (5.5 brotes/explante). Estos

resultados al ser analizados con el programa estadístico SPSS 14.0, con una

prueba de ANOVA y una postprueba de Tukey mostraron que el mejor tratamiento

fue el de BAP a 1.5mg/ml con una diferencia significativa p<0.05.

Los resultados de la obtención de callos con los diferentes tratamientos con

cinetina de este trabajo, concuerda con los resultados obtenidos por Ezequiel

Murillo en 1985 donde se indujo la formación de callos con cinetina a partir de

explantes foliares de Bouvardia ternifolia a una concentración de 0.005 mg/L. Esta

concentración fue menor a la que se utilizó para este proceso, este hecho hace

pensar que la cinetina en el caso de esta especie es una hormona que mas allá

de favorecer la formación de nuevos brotes, promueve la desdiferenciación

celular, lo cual permite que su aplicación sirva como modelo a seguir si se

quisiera establecer un cultivo celular a partir de esta planta.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

KIN 0 KIN 0.2 KIN 0.5 KIN 1 KIN 1.5

Tratamientos (mg/L)

Nú

me

ro d

e b

rote

s (

pro

me

dio

)

Figura 7. Efecto de diferentes concentraciones de cinetina en la brotación múltiple de B. ternifolia.


36

Los resultados obtenidos por Ponce en el 2006 en la propagación in vitro de

Lecanophora heterophylla donde utilizó a la bencilaminopurina como regulador

para inducir la brotación múltiple, muestra que la utilización de este regulador

favorece la formación de brotes en plantas herbáceas. La concentración con la

que logró obtener hasta 11 brotes por explante fue la de 1mg/L, que es una

concentración que también fue utilizada para este trabajo siendo uno de los

mejores con la cual se lograron un promedio de 6 brotes. Sin embargo, una

característica observada por Ponce fue que los tallos presentaban

engrosamientos y disminución en el tamaño de las hojas. Lo que no sucedió con

los explantes de B. ternifolia aunque no se alcanzó el mismo número de brotes,

probablemente a causa del reducido tamaño del tallo que solo mostraba en un

principio espacio para tres nodos, pero aun así las plántulas obtenidas fueron

suficientes para realizar los demás procesos.

La utilización de citocininas para inducir el desarrollo de brotes in vitro y ex

vitro a partir de las yemas axilares, es algo muy frecuente, ya que este es uno de

los papeles fisiológicos característicos de estos reguladores del crecimiento

vegetal. Taiz y Seiger (1998) refieren que las citocininas aumentan la capacidad

de los tejidos jóvenes de funcionar como demandas metabólicas creando

vertederos metabólicos, Claassens y Vreugdenhil (2000) mencionan que están

involucradas en el control de actividades enzimáticas que regulan el metabolismo

de carbohidratos. Esto explicaría el desarrollo de brotes vegetativos en papa

cuando se le aplican citocininas (Hemberg, 1970). García y col. en 2009 reportan

un incremento de sustancias con actividad citoquinínica antes y durante la

formación de brotes en el proceso de tuberización en tres variedades de papa,

que presentan periodos de dormancia diferentes. Por otro lado Bradford y

Trewavas en 1994 reportan que eventos como el desarrollo de yemas y

regeneración de brotes es una respuesta en la que están involucrados los

reguladores del crecimiento y que es dependiente de la concentración de los

mismos.


37

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

BAP 0 BAP 0.2 BAP 0.5 BAP 1 BAP1.5

Tratamientos (mg/L)

Nú

me

ro d

e b

rote

s (

pro

me

dio

)

Figura 8. Efecto de diferentes concentraciones de becilaminopurina en la brotación múltiple de B. ternifolia.

Figura 9. Segmentos nodales con formación de brotes.

*


38

Inducción de raíces

En la figura 10 se presenta el número promedio de explantes con raíz que

se generaron en cada tratamiento. Lo relevante de este gráfico fue que con una

concentración de 0.5 mg/L de IBA y de ANA se lograron los promedios más altos:

2.7 y 3.2 respectivamente, mientras que para AIA, se logró un máximo de 2.9 con

0.2 mg/L.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

0.1mg/L 0.2mg/L 0.5mg/L 1.0mg/L 1.5mg/L

T ra ta mientos

Pro

m.d

e e

xp

lan

tes

co

n r

aíz

IBA

AIA

ANA

Figura 10. Efecto de diferentes auxinas en la formación de raíces.

De acuerdo con los resultados, el mejor tratamiento para obtener el mayor

número de explantes con raíz por unidad experimental fue el de 0.2 mg/L de ANA.

Sin embargo, al hacer el análisis estadístico con el programa SPSS 14.0 se

encontró que no existe diferencia significativa entre ninguno de los tratamientos.

Es decir, en todos los casos la formación de raíces se dio de manera exitosa,

determinando que el mejor tratamiento fue aquel que indujo la formación de las

raíces de mayor longitud, grosor y vigor, las cuales correspondieron al

tratamiento con IBA a la concentración de 0.5mg/L (figura 11).

Las auxinas cumplen un papel importante en el enraizamiento adventicio,

siendo su aplicación, un hecho común en la mayoría de los sistemas de

propagación. En este sentido, los ácidos naftalenacético (ANA), indolbutírico (IBA)


39

e indolacético (AIA) son las fitohormonas más utilizadas, por ejemplo en el estudio

de enraizamiento in vitro de Limonium sinuatum se utilizaron las mismas

concentraciones que las que se utilizaron para el enraizamiento de B. ternifolia.

Sin embargo, el AIA no tuvo efecto en la longitud de las raíces pero el IBA si tuvo

efecto sobre la longitud de las raíces sin embargo su efecto fue inversamente

proporcional a la concentración de auxina, es decir a menor concentración de

auxinas mayor era la longitud de las raíces (Hernán et al, 2007). Aunque con B.

ternifolia no se cuantificó la longitud de las raíces si se observó un efecto similar a

lo ocurrido en el trabajo con L. sinuatum, aunque en todos los tratamientos de

igual manera se formaron raíces. La longitud y grosos de las raíces implicó un

mejor desarrollo de las plantas por lo que se decidió utilizar IBA como el

tratamiento con mejor desarrollo de raíces.

Figura 11. Raíces inducidas con ANA.

b


40

6.2 Aclimatización

Durante el proceso de aclimatización (figura 12) se registraron valores

promedio de temperatura y de humedad relativa dentro de la cámara de

incubación de 25ºC y 40 % respectivamente. Los valores de estos parámetros

dentro del sistema hidropónico al inicio del experimento fueron de 29ºC y 89.25 %.

Al final de cuatro semanas después de la apertura total los parámetros fueron

27ºC y 48 % de humedad relativa, muy cercanos a las de la cámara de

incubación. Cuando las plántulas del sistema in vitro cuentan con un sistema

radicular abundante, no presentan problemas durante la adaptación a las

condiciones ambientales. Generalmente la aclimatización de plántulas

provenientes de propagación in vitro, por éste método ha sido exitosa, se ha

utilizado en alfalfa (Medicago sativa), camotillo (Curcuma longa) y “guaco”

(Aristolochia elegans) entre otras, con porcentajes de supervivencia del 100 %

(Ventura et al, 2003; Bazaldúa et al, 2008; Osuna et al, 2007).

Figura 12. Plántulas en proceso de aclimatización en sistema hidropónico.


41

6.3 Cultivo hidropónico

Efecto de la solución nutritiva de Hoagland y Arnon en el desarrollo de

plántulas de B. ternifolia.

La figura 13 muestra los resultados de la longitud de la planta y de raíz

obtenidos con las distintas concentraciones de la solución nutritiva de Hoagland.

Se observó que prácticamente no hubo diferencias significativas en el crecimiento

de brotes ni de raíz entre los diferentes tratamientos, pues para el caso de los

brotes alcanzaron una altura entre 16 y 18 cm en todos los tratamientos. El mismo

comportamiento ocurrió en la raíz, la longitud de esta en todos los tratamientos

fue de 12.5 y 13.3 cm (ANOVA, Post Prueba de Tukey p=0.05).

0

5

10

15

20

25

25% 50% 75% 100% 125%

Tratamientos

Pro

med

io d

e lo

ng

itu

d (

cm

)

Brote

Raíz

Figura 13. Efecto de las diferentes concentraciones de solución nutritiva de Hoagland y Arnon en el crecimiento de la planta.

En relación al número de nodos, a diferencia de los parámetros anteriores,

se observó una tendencia hacia la generación de mayor número de nodos con el

tratamiento de solución nutritiva. El tratamiento al 100% dio un promedio de 32.5

nodos por planta (figura 14). Este resultado tiene importancia para los fines de

propagación, ya que cada segmento nodal, potencialmente es una unidad para la

generación de nuevos individuos. En contraste, las plantas desarrolladas en el

tratamiento con solución nutritiva al 25 % desarrollaron entrenodos más largos y


42

por lo tanto un menor número de nodos. Cabe mencionar que los resultados aquí

mostrados corresponden a los datos obtenidos en la semana 8 de cultivo

hidropónico de plantas obtenidas de la germinación ex vitro de semillas en

condiciones de invernadero.

La cantidad de nutrimentos que requieren las plantas depende de la

especie, la variedad, la etapa fenológica y las condiciones ambientales. Cada

especie vegetal que se cultiva requiere de una solución nutritiva con

características específicas (Lara, 2000). En el caso de B. ternifolia la

concentración que le permitió el mejor desarrollo fue el tratamiento con solución

de Hoagland y Arnon al 100%, que aportaron a las plantas los nutrientes

adecuados y en cantidades suficientes.

Por otro lado, el crecimiento de los tejidos, órganos y plantas en parte está

dado por la cantidad de agua que absorben y almacenan. En el continum: suelo

(solución nutritiva en este caso)-raíz-tallo-hojas-atmósfera, la absorción y

transporte de agua depende del potencial osmótico generado por la concentración

de sales; cuando esta es mayor en la solución del suelo y menor en el interior de

los tejidos de la planta experimentará dificultad para absorberla, sufriendo estrés

por déficit hídrico, pueden presentar un bajo crecimiento causados por la

disminución de la expansión celular. En casos extremos, además de los efectos

hídricos hay efectos tóxicos provocados por los propios iones (Salisbury y Ross,

1994). Existe una clasificación de plantas con base en su respuesta a la elevada

concentración de sales:

1. Plantas sensibles, muy sensibles ó algo tolerantes: glucófitas

a. Muy sensibles detiene el crecimiento

b. Moderadamente sensibles disminuyen el crecimiento

c. Glucófitas tolerantes, ligera disminución del crecimiento.

2. Plantas poco sensibles: halófitas

a. Facultativas

b. Obligadas: 70mM de NaCl ó 4dS/m.


43

La solución nutritiva de Hoagland y Arnon es ampliamente utilizada para el

desarrollo de diversas especies, debido a que la concentración de los elementos

que la componen, se encuentra dentro de los intervalos para el desarrollo

adecuado de las plantas. Sin embargo, algunas pueden ser sensibles a esta

formulación y más aún cuando se incrementa la concentración de sus nutrientes

como en el caso del tratamiento al 125 %. Los datos de crecimiento mostrados en

la figura 13 aparentemente indicaron que el crecimiento de B. ternifolia no es

afectado por el amplio intervalo de concentraciones de nutrientes, sin embargo, la

información de la figura 14 sugiere que las concentraciones mayores (100 y 125

%), tienden a acortar la longitud de los internodos y el número de nodos. Sería

interesante continuar investigando la relación entre concentración de sales y el

crecimiento y desarrollo de esta planta, ya que probablemente pudiera tener

efecto en la biosíntesis de metabolitos con la actividad biológica buscada.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

25% 50% 75% 100% 125%

Tratamientos

Nú

me

ro d

e n

od

os

(p

rom

ed

io)

Figura 14. Efecto de las diferentes concentraciones de solución nutritiva de Hoagland y Arnon en

el número de nodos por planta desarrollada en cada tratamiento.


44

Cultivo hidropónico de plántulas provenientes de la micropropagación.

Con los datos obtenidos se determinó que el mejor tratamiento para el

desarrollo de las plantas fue a la concentración de 100% con el cual se trataron

las plantas provenientes de la micropropagación y se desarrollaron en

condiciones de invernadero. Con este tratamiento se logró obtener un número de

plantas suficiente con una altura promedio de 45 cm para la obtención del extracto

hidroalcohólico (figura15).

Figura 15. Plantas provenientes de la micropropagación cultivadas con solución de Hoagland y Arnon al 100%.

6.4 Obtención de extractos

Cuadro 3. Rendimientos de extracto hidroalcohólico de B. ternifolia silvestre y cultivada.

Planta Rendimiento de extracto hidroalcohólico (%)

Referencia

Silvestre 9.4 García, 2008

Silvestre 12.99 En la presente investigación

Cultivada 21.27 En la presente investigación


45

En el cuadro número 3 se presentan los rendimientos del extracto

hidroalcohólico obtenidos de planta silvestre y cultivada. La diferencia entre los

valores de la planta silvestre, pudo deberse a diferentes factores, como el lugar de

colecta, la época, la edad y el estado fisiológico de la planta, así como al tiempo

de maceración. En el caso del rendimiento obtenido con la planta cultivada, la

diferencia es del 63.74 % más que la silvestre. Se desconoce el o los factores que

pudieron haber influido mayoritariamente en la síntesis de metabolitos en ambos

tipos de plantas, sin embargo, lo que si puede decirse es que en la planta

cultivada, la utilización de una formulación nutricional balanceada influyó en el

rendimiento, ya que en condiciones naturales es imposible encontrar la

concentración y proporción de nutrientes óptimas para el desarrollo vegetal

adecuado (Lara, 2000).

6.5 Estudio Fitoquímico del extracto de Bouvardia ternifolia

Las fracciones obtenidas a partir de la bipartición del extracto

hidroalcohólico de la planta silvestre se resume en la figura 16 donde entre

paréntesis se muestran los solventes utilizados para hacer el fraccionamiento:

Figura 16. Diagrama de flujo de fraccionamiento del extracto hidroalcohólico de B. ternifolia. Esquema de las fracciones obtenidas.

Las fracciones obtenidas se analizaron por cromatografía en placa fina de

fase normal, en sistemas con diferentes polaridades para separar e identificar los

compuestos de en cada una de las fracciones lo que se observó fue lo siguiente:

Extracto H.A. Partes Aéreas

F-Aq F-AcoEt

AcoEt/H2O

Precipitado 3 F-MetOH

MetOH


46

En un sistema de elusión 7:3 (hexano/acetato de etilo) se reveló la placa

con sulfato sérico (para revelar terpenos). Las muestras utilizadas fueron el

extracto hidroalcohólico de las partes aéreas, la fracción acetato de etilo y

precipitado 3 del extracto de la planta silvestre (figura 17).

Figura 17. Presencia de un terpeno aparentemente Ac. Ursólico en la fracción de Acetato de etilo.

En otro sistema de elusión 90:10 (cloroformo:metanol) se corrieron dos

placas de fase normal una usando como control el Ac. oleanólico y otra

usando quercetina, pero no se encontró ninguno de estos compuestos en

la muestra de extracto Hidroalcohólico de partes aéreas.

Con el sistema de elusión cromatográfica 95:5 (cloroformo metanol) y Ac.

Ursólico como control, se comprobó la presencia de Ac. ursólico en el la

fracción de acetato de etilo de la planta silvestre (figura 18).


47

Figura 18. Confirmación de la presencia de ácido ursólico en la fracción de acetato de etilo de usando como control un estándar del ácido triterpénico.

También se comprobó la presencia de flavonoides (figura 19) en el extracto

hidroalcohólico de la planta silvestre en una placa corrida en un sistema 7:3

(hexano/ acetato de etilo).

Figura 19. En la que se observa la presencia de flavonoides en (a) el extracto hidroalcohólico y (b) la fracción de acetato de etilo de la planta silvestre. La placa fue revelada con 2-Aminoetildifenilborinato.

Se corrió una placa en el sistema de elusión 8:2 (cloroformo/metanol) para

analizar los compuestos del extracto de la planta silvestre (a) y planta

cultivada (b). La secuencia de carriles en ambas placas correspondieron a.

extracto hidroalcohólico, extracto de acetato de etilo y precipitado que se

a b


48

obtuvo en la fracción acuosa de la bipartición AcOEt:Agua (figura 21). La

diferencia mas importantes se observa en el extracto hidroalcohólico, ya

que la mancha que eluye en primer termino cambia de coloración en UV.

Por lo demás presenta una alta homología, es decir que la expresión de

sus compuestos es de manera constitutiva sin importar las condiciones de

crecimiento y desarrollo en las que fue cultivada.

Figura 20. Comparación del extracto HA de la planta cultivada y la fracción de AcoEt en la que se observa la presencia de acido ursólico.

b

Figura 21. Presencia de flavonoides en el extracto hidroalcohólico de (a) la planta silvestre, comparado con los flavonoides de (b) la planta cultivada.

b a

B.t

cultivada

AcoEt

silvestre


49

Con estos resultados se procedió a probar las diferentes fracciones

obtenidas del extracto de planta silvestre y el extracto hidroalcohólico de la planta

cultivada en el ensayo de inhibición enzimática para evaluar en que fracción

existía mayor actividad inhibitoria de la acetilcolinesterasa.

La presencia del acido ursólico (figura 20) en las partes aéreas de la planta

cultivada, es un dato que amplía la información que se tenia de la planta, pues

como se menciona en la literatura solo se había reportado la presencia del acido

triterpénico en las raíces (Argueta, 1994, Pérez GRM et al. 1998). De esta manera

se fortaleció la idea de una supuesta actividad inhibitoria de la enzima

acetilcolinesterasa. Ya que como se mencionó anteriormente se sabe que este

compuesto tiene esa actividad (Chung et al., 2001; Reuter et al. 2007) y el hecho

de que este ácido presente en la planta cultivada permite pensar que el extracto

obtenido de esta planta tendrá un efecto similar al que presenta el extracto

obtenido de la planta silvestre.

6.6 Inhibición enzimática

La evaluación farmacológica del extracto de B. ternifolia, dirigida a

contrarrestar los efectos discapacitantes de la Enfermedad de Alzheimer se centra

en la actividad biológica que presenten los extractos y/o los compuestos aislados

para inhibir a la enzima acetilcolinesterasa. Para ese fin se determinó el

comportamiento cinético de esta enzima en la condiciones de laboratorio. Como

se puede observar en la figura 22 se trata de una enzima que sigue el

comportamiento establecido por el modelo de Michaelis – Menten. Las constantes

cinéticas determinadas fueron: el valor de la constate de Michaelis – Menten fue

8.7 mM y la Velocidad máxima fue de 0.00385 D.O.412nm/min (ver Anexo 2

ecuaciones 15, 18, 19 y figura 28). Para transformar las unidades de absorbancia

obtenidas de los ensayos, se aplicó el coeficiente de extinción molar de tiocolina,

el cual es el producto de la reacción de hidrólisis de la acetil tiocolina (A = 1.36 x

104 cm2/ mol) con lo que el valor de Vmax resultó en: 2.83 x 10-7 mol/min .


50

0

0.0005

0.001

0.0015

0.002

0.0025

0.003

0.0035

0.004

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Acetiltiocolina (mM)

vo (

DO

412 n

m/m

in)

Figura 22. Cinética enzimática de acetil colinesterasa. Las constantes cinéticas medidas fueron: KM = 8.720 mM y la Vmax = 0.00385 D.O.412nm/min, aplicando el coeficiente de extinción molar de

tiocolina A = 1.36 x 104 cm

2/ mol, por lo tanto Vmax = 2.83 x 10

-7 mol/min.

Al comparar el valor de KM de obtenido en este trabajo con lo se reporta en

la literatura, encontramos una diferencia substancial de dos ordenes de magnitud

(Di Giovanni S, et al. 2008). Sin embargo, existen factores que pueden modificar

la capacidad de reconocimiento de E por S que no hayan sido considerados en el

proceso obtención del extracto enzimático (Di Giovanni S, et al. 2008) o la

concentración de Na+, en la mezcla de reacción también puede ser determinante

(Smissaert HR, 1981).

Al determinar la actividad enzimática de la acetil colinesterasa en presencia

de concentraciones crecientes del extracto hidroalcohólico de B. ternifolia

silvestre, fue evidente que hubo modificaciones en los valores de la constantes

cinéticas, como se muestra en la figura 23. Se pudo comprobar que hubo un

incremento en el valor de la KMapp respecto a la reacción sin inhibidor y el valor de

la Vmax no tuvo variaciones de gran magnitud Cuadro 4. Por el comportamiento

cinético se puede pensar en una inhibición de tipo mixta, debido a que la familia

de curvas no intercepta a la recta que representa a la enzima sin inhibidor en la

ordenada al origen. Debido a que se observa que el punto de intersección de la


51

familia de rectas se encuentra antes del eje “y”, el tipo de inhibición mixta tiene

correspondencia con una del tipo Mixta Lineal, Sistema C5. En este tipo de

inhibición disminuye la constate de velocidad de formación de producto, pero

incrementa la afinidad de la enzima por el sustrato, bajo los siguientes parámetros

< 1, < 1 y > (Anexo 2, ecuación 46, 47 y figura 33). Sin embargo, al

calcular dichos parámetros para cada una de las concentraciones del extracto

hidroalcohólico (0.05, 0.025 y 0.0125 mg/ml), se obtuvo para = 1.31, 1.21 y

1.63. Para = 1.047, 1.044 y 1.052 respectivamente para ambos parámetros. Con

esto no se cumple con < 1, < 1 y > Por lo tanto se puede considerar como

un comportamiento como inhibidor competitivo (ver Anexo 2 ecuación 31 y figura

29).

200

300

400

500

600

700

800

900

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

1/{S}

1/v

o

Figura 23. Representación de la transformación de Lineweaver-Burk, de la actividad enzimática de Acetilcolinesterasa en presencia de concentraciones crecientes (mg/ml) del inhibidor, extracto hidroalcohólico de las partes aéreas de B. ternifolia silvestre. Sin inhibidor (------), inhibidor 0.0125 mg/ml (), inhibidor 0.025 mg/ml () e inhibidor 0.05 mg/ml (▲).


52

Cuadro 4. Constantes cinéticas del efecto inhibidor del extracto hidroalcohólico de las partes aéreas de B. ternifolia silvestre

Inhibidor (mg/ml)

KMapp

(mM) Vmaxi

( mol/min) x10-7

0.0000 8.72 2.83 0.0500 11.38 2.92 0.0250 10.51 2.92 0.0125 10.15 2.95

En la determinación de la capacidad inhibitoria de la fracción de acetato de

etilo (figura 24 y Cuadro 5), se puede establecer la capacidad inhibitoria de dicho

extracto. En todas las concentraciones de esta fracción que se probaron que

incrementaron el valor de la KM. De igual manera se aprecia una disminución de

los valores del Vmax, por lo que la familia de rectas presentan valores crecientes

para el punto de intersección con el eje de “y”. El tipo de inhibición nuevamente es

mixta, entre un inhibidor de tipo competitivo.

Existen dos sistemas que puede explicar este comportamiento de inhibición

mixta. El primero de ellos se denomina Sistema C1 donde > 1 y = 0 y

corresponde a uno en el que el complejo EI tiene una afinidad mas baja ( KS) por

S en comparación con E (KS) y el complejo ternario ESI es un complejo no

productivo (Anexo 2 ecuación 40, 41 y figura 31). El segundo es denominado C2 y

en este sistema la enzima libre E y el complejo EI se unen a S, pero con

diferentes afinidades (KS y KS respectivamente). Ambos complejos ES y ESI

forman producto, pero con diferentes velocidades de reacción (kP y kP

respectivamente), bajo las siguientes parámetros 1< <∞ y 0< <1. Los sistemas

de inhibición mixta C1 y C2 pueden ser considerado como mezcla de una

inhibición competitiva (Anexo 2 ecuaciones 20, 31 y figura 29) y una inhibición no

competitivo (Anexo 2 ecuaciones 32, 35 y figura 30). Para definir qué tipo de

sistema de inhibición mixta esta rigiendo en el ensayo con el extracto de B.

ternifolia, será necesario identificar cada uno de los compuestos activos presentes

en los extractos y determinar cuál es el resultado de la interacción de los

diferentes tipos de inhibición. Para determinar si se trata de una inhibición C1 ó

C2 es necesario determinar cual es el comportamiento de la inhibición a alta

concentración del extracto. Ya que como se observa solo altas concentraciones


53

se puede definir que a tipo de sistema de inhibición mixta obedece la acetil

colinesterasa en presencia de este extracto. Independientemente a que tipo de

sistema obedece, es posible calcular a partir del punto de intersección de la

familia de rectas. El valor de calculado ponderado fue 18.6.

Cuadro 5. Constantes cinéticas del efecto inhibidor de la fracción de acetato de etilo de las partes aéreas de B. ternifolia silvestre.

Inhibidor (mg/ml)

KMapp

(mM) Vmaxi

( mol/min) x10-7

0.0000 8.72 2.83 0.0500 9.45 2.17 0.0250 10.33 2.55 0.0125 9.23 2.63

0

200

400

600

800

1000

1200

-0.15 -0.1 -0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

1/{S }

1/v

o

Figura 24. Representación de la transformación de Lineweaver-Burk, de la actividad enzimática de Acetilcolinesterasa en presencia de concentraciones crecientes (mg/ml) del inhibidor, fracción de acetato de etilo de las partes aéreas de Bouvardia ternifolia silvestre. Sin inhibidor (-----), inhibidor 0.0125 mg/ml (), inhibidor 0.025 mg/ml () e inhibidor 0.05 mg/ml (▲).


54

Con la fracción metanólica de las partes aéreas de B. ternifolia silvestre se

pudo establecer que se generó una inhibición de tipo mixta (figura 25), aunque de

características distintas a la inhibición mixta obtenida con el extracto de acetato

de etilo. La principal diferencia estriba en que este extracto presenta una

capacidad inhibitoria proporcional al aumento de la concentración (cuadro 6), lo

que es contrario a lo que sucede con el extracto de acetato de etilo. Y de la

misma manera que lo que se observó con el extracto hidroalcohólico se observó

que el punto de intersección de la familia de rectas se encuentra antes del eje “y”,

el tipo de inhibición mixta tiene correspondencia con una del tipo Mixta Lineal,

Sistema C5. (Anexo 2, ecuación 46, 47 y figura 33). Calculando los valores para

los para los parámetros y , se obtuvieron las siguientes cifras para las

concentraciones de extracto metanólico (0.05, 0.025 y 0.0125 mg/ml), fueron para

0.274, 0.525 y 0.740 respectivamente. Para el parámetro los valores fueron

0.736, 0.816 y 0.894 en el mismo orden. Cumpliendo con < 1, < 1 y > .

0

100

200

300

400

500

600

700

800

-0.15 -0.1 -0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

1/{S }

1/v

o

Figura 25. Representación de la transformación de Lineweaver-Burk, de la actividad enzimática de Acetilcolinesterasa en presencia de concentraciones crecientes (mg/ml) del inhibidor, fracción metanólica de las partes aéreas de B. ternifolia silvestre. Sin inhibidor (---), inhibidor 0.0125 mg/ml (), inhibidor 0.025 mg/ml () e inhibidor 0.05 mg/ml (▲).


55

Cuadro 6. Constantes cinéticas del efecto inhibidor de la fracción metanólica de las partes aéreas de B. ternifolia silvestre.

Inhibidor (mg/ml)

KMapp

(mM) Vmaxi

( mol/min) x10-7

0.0000 8.72 2.83 0.0500 2.39 2.06 0.0250 4.56 2.33 0.0125 6.41 2.52

En la figura 26 se representa la gráfica de la transformación de Lineweaver

Burk del efecto inhibitorio del precipitado obtenido en la fracción metanólica de B.

ternifolia. Se aprecia como el comportamiento inhibitorio más definido y

corresponde a una inhibición de tipo no competitiva (Anexo 2 ecuaciones 32, 35 y

figura 30). Este efecto inhibitorio, de mayor definición pudiera ser explicado por la

menor complejidad en la composición, puesto que se trata de un precipitado

obtenido en el proceso de fraccionamiento. De esta manera se considera que el

compuesto mayoritario en la muestra presenta actividad de inhibición no

competitiva.

0

200

400

600

800

1000

1200

-0.15 -0.1 -0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

1/{S}

1/v

o

Figura 26. Representación de la transformación de Lineweaver-Burk, de la actividad enzimática de Acetilcolinesterasa en presencia de concentraciones crecientes (mg/ml) del inhibidor, precipitado de las partes aéreas de B. ternifolia silvestre. Sin inhibidor (-------), inhibidor 0.0125 mg/ml (), inhibidor 0.025 mg/ml () e inhibidor 0.05 mg/ml (▲).


56

Cuadro 7. Constantes cinéticas del efecto inhibidor del precipitado del extracto hidroalcoholico de las partes aéreas de B. ternifolia silvestre.

Inhibidor (mg/ml)

KMapp

(mM) Vmaxi

( mol/min) x10-7

0.0000 8.72 2.83 0.0500 8.21 1.88 0.0250 9.11 2.19 0.0125 8.46 2.39

La figura 27 muestra el efecto inhibitorio del extracto hidroalcohólico de la

partes aéreas de la planta cultivada. Nuevamente se presenta una inhibición de

tipo mixta, la cual contrasta con lo que se obtuvo con el extracto hidroalacoholico

de las partes aéreas de la B. ternifolia silvestre. Ya que el extracto tiene un

comportamiento similar al observado por el extracto metanólico de la planta

silvestre.

200

300

400

500

600

700

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

1/{S}

1/v

o

Figura 27. Representación de la transformación de Lineweaver-Burk, de la actividad enzimática de Acetilcolinesterasa en presencia de concentraciones crecientes (mg/ml) del inhibidor, extracto hidroalcohólico de las partes aéreas de B. ternifolia cultivada. Sin inhibidor (, -------), inhibidor 0.0125 mg/ml (), inhibidor 0.025 mg/ml () e inhibidor 0.05 mg/ml (▲).


57

Es decir que se ajusta a un sistema de inhibición mixta C5, por lo que fue posible

calcular los valores de los parámetros y para las concentraciones ensayadas

(0.05, 0.025 y 0.0125 mg/ml). Los valores calculados para fueron: 0.594, 0.683

y 0.740 respectivamente. Y para fueron: 0.763, 0.815 y 0.842 en el mismo

orden. El comportamiento de dichos valores corresponde al criterio que define a

este sistema de inhibición mixta, es decir que cumple con < 1, < 1 y > .

Conclusiones

58

7. CONCLUSIONES

e acuerdo a los objetivos particulares planteados en el inicio del

presente trabajo podemos concluir que:

En cuanto al establecimiento de para la micropropagación de Bouvardia

ternifolia

Se estableció el protocolo para la desinfestación de semillas.

El regulador de crecimiento Bencilaminopurina indujo el mayor número de

brotes por explante a la concentración de 1.5mg/L.

El tratamiento con Ácido indolbutírico a 0.5mg/L fue el que generó la

respuesta más alta de enraizamiento.

En lo referente al establecimiento de las condiciones de crecimiento y desarrollo

en hidroponía de Bouvardia ternifolia

Se determinó que las plantas cultivadas en hidroponía presentaron el

mayor número de nodos con la solución Hoagland al 100%.

El proceso de cultivo por hidroponía es un procedimiento factible para la

obtención de material vegetal de buena calidad

Por lo que respecta a la caracterización fitoquímica de los extractos de Bouvardia

ternifolia.

Se obtuvo un mayor rendimiento de extracción en el material vegetal

cultivado respecto al silvestre, en una proporción que se aproxima a una

relación de 1:2.

Las plantas cultivadas en hidroponía tienen los mismos compuestos que

las plantas silvestres, desatacando la presencia de acido ursólico y de una

gran variedad de flavonoides

En tanto a la evaluación el efecto de los extractos de Bouvardia ternifolia en la

inhibición de la enzima acetilcolinesterasa

Se estableció una capacidad inhibitoria de magnitud similar en el material

vegetal cultivado como en el silvestre.

El tipo de inhibición enzimática presentado por el extracto hidroalcohólico

de la planta cultivada obedece a un sistema de inhibición mixta tipo C5,

mientras que el mismo extracto de la planta silvestre presentó un tipo de

inhibición que se ajusta mas a un sistema de inhibición simple del tipo

DD

Conclusiones

59

competitivo, por lo que a pesar de tener un perfil cromatográfico similar,

tienen diferente comportamiento cinético, por lo que puede presentar

sutiles diferencias en la proporción de los compuestos activos.

Perspectivas

60

9. PERSPECTIVAS

os resultados obtenidos en este trabajo han respondido a las preguntas

planteadas al inicio pero a su vez ha generado otras que podrán ser

resueltas con otros estudios a partir de este trabajo como:

El cultivo de la planta en invernadero a escala industrial mediante las

técnicas establecidas en este trabajo.

Determinar el o los compuestos con actividad farmacológica de la planta

cultivada.

Realizar estudios toxicológicos de los extractos de la planta.

Obtención de los metabolitos secundarios activos mediante otras técnicas

como el cultivo de células en suspensión.

Evaluación del efecto de la administración de los extractos obtenidos de la

planta cultivada en modelos conductuales y de memoria.

Evaluación del efecto atioxidante de los extractos.

Sentar las bases para la producción de un fitofármaco.

LL

Literatura citada

61

8. LITERATURA CITADA

.

Aguilar-Contreras A., Camacho-Pulido J. R., Jacquez-Ríos P., López-

Villafranco M. E. 1998. 1ª edición. Plantas Medicinales del Herbario IMSS,

Su Distribución por Enfermedades; pp 94.

Argueta A., Cano L., Rodarte M. 1994. Atlas de las Plantas de la Medicina

Tradicional Mexicana, Instituto Nacional Indigenista. México; 3: 1362-1363.

Bardford K. J, Trewavas A. J. 1994. Sensitivity threshold and variable time

scale in plant hormone action. Plant Physiol; 105: 1029-1036.

Bazaldúa C., Ventura E., Maldonado U. López A. 2008. Densidad

estomatal y potencial hídrico, en plantas de tomate (Physalis ixocarpa

Brot.) propagadas por cultivo de meristemos. Chapingo, Serie Horticultura;

14(2): 147- 150.

Boutherin D., Bron G. 2005. Reproducción de las plantas hortícolas.

Omega S. A. España.

Chung Y. K., Heo H. J., Kim E. K., Kim H. K., Huh T. L., Lim Y., Kim S. K.,

Shin D. H. 2001. Inhibitory effect of ursolic acid purified from Origanum

majorana L on the acetylcholinesterase. Mol Cells; 11:137-143.

Claassens M. M. J., Vreugdenhil D. 2000. Is dormancy breaking of potato

tubers the reverse of tuber initiation?. Potato Research; 43: 347-369.

Di Giovanni S., Borloz A., Urbain A., Marston A., Hostettmann K., Carrup P.

A., Reist M. 2008. In vitro screening assay to identify natural or synthetic

acetylcholinesterase inhibitors: Thin layer chromatography versus

microplate methods. Eur J Pharm Sci; 33:109-119.

Diamond B. J., Shiflett S. C., Feiwel N. 2000. Ginkgo biloba extract:

mechanisms and clinical indications. Arch Phys Med Rehabil; 81:669-678.

Duyckaerts C., Hauw J. J., Bastenaire F., Piette F., Poulain C., Rainsard V.

1986. Laminar distribution of neocortical senile plaques in senile dementia

of the Alzheimer type. Acta Neuropathol; 70:249-256.

Farlow M. R., Cummings J. L. 2007. Effective pharmacologic management

of Alzheimer’s disease. Am J Med.; 120: 388-97.

Literatura citada

62

Flores-Escobar G., Legaria-Solano M., Gil-Vázquez L., Colinas-León M. T.

2008. Propagación in vitro de Oncidium stramineum Lindl. Una orquídea

amenazada y endémica de México. Chapingo Serie Horticultura. 14(13):

347-353.

Fodale V., Quattrone D., Trecroci C., Caminiti V., Santamaria L. B. 2006.

Alzheimer´s Disease and anaesthesia: implications for the central

cholinergic system. British Journal of Anaesthesia; 97 (4): 445-452.

García M. G. 2008. Evaluación Farmacológica de la Actividad Anti-

Alzheimer de Bouvardia ternifolia. Tesis de licenciatura, Facultad de

Ciencias Biologicas, Universidad Autónoma del Estado de Morelos.

García S., Coral V. R. M., Meza D. E., Lucino C. J. 2009. Enfermedad de

Alzheimer: una panorámica desde su primera descripción hacia una

perspectiva molecular. Medicina Interna de México; 25(4):300-312.

Gilsanz J. C. 2007. Hidroponía. [en línea].

<http://www.inia.org.uy/publicaciones/documentos/ad/ad_509.pdf [consulta:

16 octubre 2009].

Grant W. B. 2004. Year 2000 prevalence of Alzheimer disease in the United

States. Arch Neurol; 61: 802-803.

Griffin W. S. 2006. Inflammation and neurodegenerative diseases. Am J

Clin Nutr.; 83: 470-474.

Guyton A. C., Hall J. E. 2001. 10ª edición. Tratado de Fisiología Médica.

Mexico. Mc Graw Hill. pp: 844-846.

Hebert L. E., Scherr P. A., Bienias J. L., Bennett D. A., Evans D. A. 2003.

Alzheimer disease in the US population: prevalence estimates using the

2000 census. Arch Neurol; 60:1119-1122.

Hemberg T. 1970. The action of some cytokinins on the rest-period and the

content of acid growth-inhibiting substances in potato. Physiologia

Plantarum; 23:850-58.

Heneka M. T., O’Banion M. K. 2007. Inflammatory processes in Alzheimer’s

disease. J Neuroimmunol; 184: 69-91.

Hernán A., Martínez S. L., Cristhian J., Mosquera T. 2007. Evaluación de

diferentes concentraciones de algunos reguladores de crecimiento en la

Literatura citada

63

multiplicación y enraizamiento in vitro de Limonium var. Misty blue.

Agronomía Colombiana; 25(1): 47-53.

Hoagland D. R., Arnon D. I. 1950. The water culture method of growing

plants without soil. Agricultue Experiment Station Circular; pp 347.

Ingelsson M., Fukumoto H., Newell K. L., Growdon J.H., Hedley-Whyte E.

T., Frosch M. P. 2004. Early Ab accumulation and progressive synaptic

loss, gliosis, and tangle formation in AD brain. Neurology; 62:925-931.

Jiménez-Ferrer E., Reynosa-Zapata I., Perez-Torres Y., Tortoriello J. 2005.

The secretagogue effect of the poison from Centruroides limpidus limpidus

on the pancreas of mice and the antagonistic action of The Bouvardia

ternifolia extract. Phytomedicine; 12:65-71.

Johnson A. K. Chitnis M. P. 1978. Antineoplastic and Biochemical Effects in

Murine Tumors of Bouvardin, A Cyclic Hexapeptide from Bouvardia

terniflora. Proc. Am. Assoc. Cancer Aes; 19: 218.

Jolad S. D., Hoffman J. J., Torrance J., Wiedhopf A. M., Cole J. A., Arora S.

K., Bates A. B., Gargiulo A. L., Kriek G. A. 1977. Bouvardin and

Deoxybouvardin, Antitumor Cyclic Hexapeptides from Bouvardia ternifolia

(Rubiaceae). J. Am. Chem. Soc.; 99: 8040-8044.

Kandel E. R. 2001. Principios de Neurociencias. Madrid: McGraw-Hill. pp

135-138.

Katalinic M., Rusak G., Domac´inovic´ J., S´inko G., Jelic´ D., Antolovic´ R.,

Kovarik Z. 2009. Structural aspects of flavonoids as inhibitors of human

butyrylcholinesterase. European Journal of Medicinal Chemistry; 1-7.

Lara A. 2000. Manejo de la solución nutritiva en la producción de tomate en

hidroponía. Terra. 17(3); 221-229.

Magally S. 2002. cimac | México, DF. ciacnoticias.com Periodismo con

perspectiva de género.

Martínez M. 1979, 1ª edición. Catalogo de Nombres Vulgares y Científicos

de Plantas Mexicanas; pp 590.

Martínez-Flórez S., González-Gallego J., Culebras J. M. Tuñón M.ª. J.

2002. Los flavonoides: propiedades y acciones antioxidantes. Nutrición

Hospitalaria; 6:271-278.

Literatura citada

64

Massoulié J., Millard C. B. 2009. Cholinesterases and the basal lamina at

vertebrate neuromuscular junctions. Curr Opin Pharmacol; 9(3):316-25.

Mathews C. K., Van Holde K. E., Ahern K. G. 2002. 3ª edición. Bioquímica

pp 876-880.

Matsuoka N., Maeda N., Yamazaki M., Ohkubo Y., Yamaguchi I. 1992.

Effects of FR121196, a novel cognitive enhancer, on the memory

impairment of rats in passive avoidance and radial arm maze tasks. J

Pharmacol Exp Ther.; 263:436–44.

Mesulam M. 2004. The cholinergic lesion of Alzheimer´s disease: pivotal

factor or side show? Cold Spring Harbor Laboratory Press; 11: 43-49.

Murillo E., Sánchez de Jiménez E. 1984. Glutamate synthase in greening

callus of Bouvardia ternifolia Schlecht. Biomedicina y ciencias biológicas;

448-452.

Nelson D. L., Cox M. M. 2004. 4ª Edición. Leningher Principles of

Biochemistry. W.H. Freeman; pp 1100.

Osuna T. L., Mora A. I., Ventura Z. E., Jiménez-Ferrer E, Bazaldúa M. C.,

Jiménez A. A. 2007. Micropropagation of Aristolochia elegans (Mast.).

Electronic Journal of Biotechnolgy. J. Crop Sci. Biotech; 10 (3): 141-146.

Pearson R. C., Esiri M. M., Hiorns R. W., Wilcock G. K., Powell T. P. 1985.

Anatomical correlates of the distribution of the pathological changes in the

neocortex in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci USA.; 82:4531-4534.

Pérez E. M., Ramírez R., Núñez H. G., Ochoa N. 1999. Introducción al

Cultivo de Tejídos Vegetales. Mexico; pp 71.

Pérez G. R. M., Perez G. C., Perez G. S., Zavala S. 1998 Effect of

triterpenoid of Bouvardia ternifolia in blood sugar levels of normal and

alloxan diabetic mice. Phytomedicine; 5:475-478.

Ponce M., Videla E., Fioreti S., Galat E. 2006. Propagación de

Lecanophora heterophylla. Especie nativa con potencial ornamental

Purves D., Augustine G. J., Fitzpatrick D., Hall W. C., Lamantia A. S.,

Mcnamara J. O., Williams S. M. 2004. Neuroscience Third edition, U. S. A.:

Sinauer Associates, Inc. pp 129.

Raskind M. A., Barnes R. F. 2002. 5th Ed. Alzheimer Disease: Treatment of

Noncognitive Behavioral Abnormalities In: Neuropharmacology. The fifth

Literatura citada

65

generation of progress. American College of Neuropharmacology. Williams

and Wilkins Publishers.; 931-952.

Reuter A. P., Branco I., Lopes R.G., Justino J., Silva F. V., Noronha J. P.,

Cabrita E. J., Brouard I., Bermejo J. 2007. A new lupene triterpenetriol and

anticholinesterase activity of Salvia sclareoides. Fitoterapia; 78:474-481.

Reddy P. H., Beal M. F. 2005. Are mitochondria critical in the pathogenesis

of Alzheimer's disease?. Brain Res. Rev.; 49:618–632.

Reddy P. H. McWeeney S. 2005. Mapping cellular transcriptosomes in

autopsied Alzheimer's disease subjects and relevant mouse models.

Neurobiol; 27(8):1060-1077.

Robertson L.T. 2002. Memory and the Brain. J Dent Educ.; 66: 30-42.

Rogers J., Morrison J. H. 1985. Quantitative morphology and regional and

laminar distributions of senile plaques in Alzheimer’s disease. J. Neurosci.;

5:2801-2808.

Romero-Tirado R., Barbara S., Luna R., Amadeo B. A. 2007. Uso de

complejos comerciales como sustitutos de componentes de médios de

cultivo em la propagación in vitro de Laelia anceps. Lankasteriana; 7 (1-2):

353-356.

Rzedowski G. C., Rzedowski J. 2001. 2a Edición. Flora fanerogámica del

Valle de México. Instituto de Ecología y Comisión Nacional para el

Conocimiento y Uso de la Biodiversidad, Pátzcuaro, Michoacán, México.

Salisbury F. B., Ross C. W. 1994. "Fisiología Vegetal". Grupo Editorial

Iberoamericana S. A. México.

Satyabrata K., Stephen P. M., Slowikowski B., Westaway D., Howard T. J.

2004. Intereactions between -amyloid and central cholinergic neurons:

implications for Alzheimer. Canadian Medical Association; 29(6): 427-441.

Secretaría de Desarrollo Rural, Gobierno del Estado de Puebla 2005-2011.

Cultivo de plantas medicinales. [en línea]. <

http://www.puebla.gob.mx/docs//gobiernocampo/202250.pdf>. [consulta

1agosto 2009].

Segretin M. E. 2007. Los cultivos celulares y sus aplicaciones II (Cultivos

de células vegetales). Consejo Argentino para la información y el desarrollo

de la biotecnología. Argentina.

Literatura citada

66

Selkoe D. J. 2001. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy.

Physiol. Rev.; 81: 741-766.

Shivanand D., Hoffman J. J., Torrence S. J., Wiiedhopf R. M., Cole J. R.,

Arora S. K., Bates R.B., Gargiudo R. l., Kierk G. R. 1977. Bouvardin y

deoxybouvardin, antitumor cyclic hexapeptides from Bouvardia ternifolia

(Rubiaceae). J Am Chem Soc; 99:8040-8044.

Siegel I. H. 1975. Enzyme kinetics. Behavior and analysis of rapid

equilibrium and steady-state enzyme systems. Willey Interscience. USA.

976 pp.

Silman I., Sussman J. L. 2008. Acetylcholinesterase: how is structure

related to function? Chem Biol Interact; 175(1-3): 3-10.

Smissaert H. R. 1981. Acetylcholinesterase: evidence that sodium ion

binding at the anionic site cause inhibition of second-order hydrolysis of

acetylcholine and decrease of its pKa as well as of deacetylation. Biochem

J; 197:163-173.

Taiz L., Zeiger E. 1998. Plant physiology. 2.a edición. Sunderland: Sinauer

Associates. 792 pp.

Tobey R. A., Orlicky D. J., Deaven L. L., Rall L B., Kissane R. J. 1978.

Effects of Bouvardin (NSC 259968), a Cyclic Hexapeptide from Bouvardia

ternifolia, on the Progression Capacity of Cultured Chinese Hamster Cells.

Cancer Resarch.; 38:4415-4421.

Vázquez Y. C., Orozco M., Rojas M., Sánchez M. E., Cervantes V. 1997.

La reproducción de las plantas: semillas y meristemos. Fondo de Cultura

Económica. México, D. F.

Ventura Z. E., Guadalupe S. M., Ana N. H. L., Blanca P. M. B., Antonio J.

A., Gabriela T. T., Antonia De J., Miguel V. V. 2003. In vitro regeneration

and acclimatization of plants of Tumeric (Curcuma longa L.) in a

hydroponic system. Biotecnología Aplicada; 20(1): 25-31.

Villaseñor R. J. L., Espinosa G. F. J. 1998. Catálogo de malezas de

México. Universidad Nacional Autónoma de México, Consejo Nacional

Consultivo Fitosanitario y Fondo de Cultura Económica, México, D.F.

Wilkinson D. G. 1999. The pharmacology of donepezil: a new treatment of

Alzheimer’s disease. Expert Opin Pharmacother; 1:121-135.

Literatura citada

67

www.cyta.com.ar/semilla [consulta 13 de diciembre de 2009].

www.salud.gob.mx/unidades/dgcs/sala_noticias/campanas/2001-09-

21/presentacion.htm [consulta 21 de septiembre de 2001]

www.santjoandalacant.es/epifitarium/ORQUID-2.HTM, [consulta 13 de

diciembre de 2009]

Anexos

68

9. ANEXOS

Anexo 1. Composición química de la solución nutritiva de Hoagland y Arnon

1950.

Sustancia Concentración Molar de la solución patrón

Alícuota (ml) para un litro de solución al 100%

NH4H2PO4 0.2 5 Ca(NO3)2.4H2O 1.15 5

CaCl2 0.26 5

MgSO4.7H2O 0.40 5 KNO3 1.2 5

Oligoelementos H3BO3 CuCl2 H2O ZnCl2 MnCl2.4H2O NaMoO4.H2O

1.2x10-2 1.2x10-4 2.3x10-3 4.4x10-4 6.0x10-6

2

Fe-EDTA 2

Anexo 2. Deducción de la ecuación de Henri-Michaelis-Menten. (Siegel 1975).

71

Figura 28. Representación gráfica de la transformación de Lineweaver Burk (expresiones 18 y 19) de la ecuación de Michaelis-Menten.

73

Figura 29. Representación gráfica de la transformación de Lineweaver Burk de una cinética enzimática en presencia de un inhibidor competitivo. Las concetraciones crecientes, incrementa el valo de la pendiente en un factor de (1+ [I]/Ki). Es notable que no cambia el valor de Vmax, que corresponde al inverso de la ordenada al origen b = 1/Vmax.

75

Figura 30. Representación gráfica de la transformación de Lineweaver Burk de una cinética enzimática en presencia de un inhibidor no competitivo. Las concetraciones crecientes, incrementa tanto el valor de la pendiente en un factor de (1+ [I]/Ki), como el valor de Vmax, que corresponde al inverso de la ordenada al origen b = 1/Vmax, en un factor de (1+ [I]/Ki).

77

Figura 31. Representación gráfica de la transformación de Lineweaver Burk de una cinética

enzimática bajo una inhibición mixta bajo el sistema C1. Este se caracteriza por < 1 y = 0. Es

notable que debido a = 0, la vo tiende a cero conforme [I] tiende a ∞.

78


enzimática bajo una inhibición mixta bajo el sistema C2. Donde 1 < < ∞, 0 < < 1, por lo que ESI es catalíticamente activo por lo que cuando [ I ] = ∞, la pendiente de la recta es finta y positiva.

79


enzimática bajo una inhibición mixta bajo el sistema C5. Este se caracteriza por < 1, < 1 y >

ejemplo representando = 0.2 y =0.5). Es notable que la intersección con el eje “x” de la reacción inhibida presenta una disminución del valor de KS (similar a KM).

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