Tesina para optar por el grado de Licenciado en Ciencias Biológicas

Profundización en Biología Celular

EFECTOS DEL CLORURO DE LITIO SOBRE LA LOCALIZACIÓN SUBCELULAR DE MARCKS DURANTE LA NEURULACIÓN EN

EMBRIONES DE POLLO

ANA MAITE FOLLE LOPEZ

Docente Orientador: Dr. Flavio R. Zolessi

Sección Biología Celular

Tribunal:

Dra. Cristina Arruti

Dra. Nibia Berois

Dr. Flavio R. Zolessi

Montevideo, Uruguay

Febrero 2012

A Josefina…

Agradecimientos __________________________________________________

A mi orientador, Flavio Zolessi, quién permitió que este trabajo fuera posible

A Cristina Arruti, por abrirme las puertas del laboratorio

A mi amigo y compañero de tesis, Gonzalo Aparicio, con el que compartimos

gran parte de este trabajo

A mis colegas, Andrea Toledo, Daniel Prieto y Lucía Ruiz por el buen humor y su

alegre compañía

A Luis, mi padre, mi madre y mi hermano por su apoyo incondicional

A avícola Prodhin, por proveernos de huevos embrionados

Indice __________________________________________________

I Resumen 1

II Introducción 2

i Origen del Sistema Nervioso: cerebro y médula espinal 2

ii Proceso de formación del tubo neural 2

iii Neurulación primaria 4

a - Formación de la placa neural 5

b - Modelado de la placa neural 5

c - Flexión de la placa neural 6

d - Cierre del tubo neural 6

iv Defectos en el cierre del tubo neural 9

v MARCKS 10

a - MARCKS en el desarrollo del sistema nervioso 11

b - MARCKS y defectos en el cierre del tubo neural 11

vi Efectos celulares del cloruro de litio 12

vii Nuestro estudio 13

III Objetivos 14

IV Resultados 15

i Neurulación en condiciones de cultivo 15

a - Distribución de MARCKS 18

ii Tratamientos farmacológicos de embriones en condiciones de

cultivo durante la neurulación 20

a - Tratamiento con 100 mM de cloruro de litio 21

b - Tratamiento con 60 mM de cloruro de litio 30

c - Tratamiento con 20 mM de cloruro de litio 33

iii Efectos del cloruro de litio sobre MARCKS 37

V Discusión 43

i Modelo de estudio y método de cultivo de embriones 43

ii Tratamientos farmacológicos de embriones en condiciones de

cultivo durante la neurulación 45

a - Efectos del cloruro de litio sobre la neurulación 47

b - Efectos del cloruro de litio sobre la muerte celular 48

c - Efectos del cloruro de litio sobre la somitogénesis 49

d - Efectos del cloruro de litio sobre MARCKS 49

e - Mecanismo de acción del cloruro de litio 50

VI Conclusiones 53

VII Materiales y métodos 54

i Obtención de embriones 54

ii Cultivo de embriones 54

iii Tratamiento farmacológico 57

iv Cortes a congelación 58

v Inmunodetección sobre cortes 58

vi Análisis de imágenes 60

VIII Apéndice 61

IX Bibliografía 63

1

I Resumen __________________________________________________

La construcción del sistema nervioso es uno de los eventos más fascinantes del

desarrollo embrionario. El proceso comienza con la formación, modelado y

flexión de la placa neural para dar lugar al cierre del tubo neural, a partir del cual

se formará el cerebro y la médula espinal. Las fallas durante este proceso se

conocen como NTDs y pueden ser influenciadas por factores genéticos y

ambientales. Dentro de los últimos se encuentran las drogas anti-depresivas y

para el tratamiento de trastornos bipolares, como el litio. Se estudió la acción del

cloruro de litio sobre el proceso de neurulación utilizando el embrión de pollo

como modelo experimental. Paralelamente, se intentó determinar una posible

correlación entre la localización subcelular de la proteína MARCKS y NTDs

producidos por exposición a este fármaco. Los tratamientos farmacológicos

incluyeron ensayos con 3 dosis de cloruro de litio (20, 60 y 100 mM) en

embriones tempranos de pollo en cultivo, utilizando el método EC y una nueva

forma de aplicación de la droga por disolución en el medio de cultivo. Los

resultados obtenidos muestran que el efecto del cloruro de litio es dosis-, tiempo-

y estadio-dependiente. El proceso de neurulación fue afectado por las dosis más

altas como también el proceso de gastrulación cuando los embriones fueron

tratados en etapas más tempranas del desarrollo. La dosis más alta provocó un

aumento significativo de muerte celular en el tubo neural. El cloruro de litio no

afectó la abundancia ni localización subcelular de MARCKS durante el cierre del

tubo neural con conservación de su apicalización en el neuroepitelio en los

tratamientos a corto plazo. Se observó un aumento en la inactivación por

fosforilación de la enzima GSK3β. Esta enzima es uno de los blancos propuestos

para el litio y mediaría su acción estabilizadora del ánimo. Actualmente los

mecanismos de acción del litio no se comprenden en su totalidad y es de suma

importancia profundizar su conocimiento debido al acotado rango que existe

entre dosis terapéuticas y teratogénicas.

2

II Introducción __________________________________________________

La vida de un animal comienza con una sola célula, el huevo fecundado. Durante

el desarrollo, las repetidas divisiones celulares producen células muy diferentes

entre sí hasta finalmente configurar un patrón de complejidad y precisión

espectaculares. En último término el genoma determina este patrón y el

rompecabezas de la biología del desarrollo consiste en entender cómo suceden

estos fenómenos (Alberts et al., 2003). Dentro de los temas más fascinantes en

la formación de un nuevo individuo se encuentra el nacimiento y la construcción

de lo que se convertirá en la red más compleja y completa que existe: el sistema

nervioso.

i Origen del Sistema Nervioso: cerebro y médula espinal

El sistema nervioso queda definido muy tempranamente en el desarrollo durante

un proceso conocido como neurulación. Tanto el cerebro como la médula espinal

derivan del tubo neural, una estructura que se forma durante la embriogénesis,

gracias a una secuencia muy coordinada de eventos morfogenéticos (Karfunkel,

1974; Schoenwolf, 1982, 1994; Gordon, 1985; Copp et al., 1990; Schoenwolf y

Smith, 1990; Jacobson, 1991). La formación del tubo neural es uno de los

primeros y más críticos eventos que suceden durante el desarrollo del sistema

nervioso central en los vertebrados (Sadler, 1998). Su precursor embriológico es

la placa neural, o neuroepitelio, una región más gruesa del ectodermo dorsal

ubicada en la superficie del embrión (Wallingford, 2005; Sanes et al., 2006).

ii Proceso de formación del tubo neural

Existen dos modos principales de convertir la placa neural en un tubo neural. La

neurulación primaria se produce en la porción anterior del embrión y permite la

formación del tubo neural que dará origen al cerebro y la mayor parte de la

médula espinal. En vertebrados este proceso involucra la formación y el plegado

del neuroepitelio dorsal. Las células que rodean a la placa neural estimulan a las

células de la misma a proliferar, invaginarse y separarse de la superficie por

fusión de los pliegues neurales, para formar un tubo hueco (Weil et al., 1997). De

esta manera se crean dos capas epiteliales: el ectodermo superficial y el tubo

3

neural (Copp et al., 1990; Colas y Schoenwolf, 2001; Copp et al., 2003b) (Figura

1).

Figura 1.- Imágenes de embriones de pollo in toto (derecha) y cortes transversales (izquierda) obtenidos con microscopía electrónica de barrido en diferentes etapas de la neurulación primaria. Los cortes transversales fueron realizados a nivel del futuro mesencéfalo; las imágenes B y C corresponden al mismo embrión pero a niveles distintos del eje céfalo-caudal. A. Etapa de modelado y flexión temprana de la placa neural. Se observa el punto bisagra medial (mhp). B. Estadio de surco neural. C. Estadio de tubo neural inicial, los pliegues neurales ya están en contacto pero no se han fusionado aún. D. Estadio de tubo neural definitivo; los pliegues neurales ya se han fusionado formando el techo del tubo neural, la cresta neural (flechas) y el ectodermo epidérmico dorsal medio. dlph, punto bisagra dorsolateral; e, endodermo: ee, ectodermo epidermal; fg, intestino anterior; hm, mesodermo de la cabeza; mhp, punto bisagra medial; n, notocorda; nf, pliegue neural; np, placa neural (Colas y Schoenwolf, 2001).

En la neurulación secundaria, que generalmente se produce en la porción

posterior del embrión, se forma el tubo neural que dará origen a la porción más

caudal de la médula espinal. En este caso el tubo neural se origina a partir de la

unión de células mesenquimáticas para formar un cordón sólido que

posteriormente se ahueca. Esta canalización del epitelio crea el tubo neural

secundario, cuyo lumen es continuo con el del tubo neural primario (Schoenwolf

y Franks, 1984; Copp y Brook, 1989) (Figura 2). De esta manera, el tubo neural

completo se forma por la unión de estos dos tubos formados separadamente

(Sanes et al., 2006; Gilbert, 2006).

4

Figura 2.- Micrografías electrónicas de un embrión de pollo in toto (A), corte parasagital (B), criofractura transversal (C, E) y sección transversal (D) ilustrando la neurulación secundaria. Las tres imágenes transversales muestran etapas progresivas en el desarrollo del tubo neural secundario. La línea en A indica la posición de los cortes parasagitales que se muestran en B. e, endodermo; ee, ectodermo epidérmico; ic, células internas del cordón medular que van a ser removidas durante la cavitación; mc, cordón medular sometido a cavitación; n, notocorda; oc, células externas del cordón medular que formarán el neuroepitelio secundario; p, lumen primario formado a partir del surco neural; pnt, terminación caudal del tubo neural primario; s, lumen secundario formado a partir de la cavitación del cordón medular; tb, botón de cola (Colas y Schoenwolf, 2001).

iii Neurulación primaria

A nivel tisular, la neurulación primaria consta de cuatro etapas: formación,

modelado y flexión de la placa neural sumado al cierre del tubo neural (Colas y

Schoenwolf 2001; Pulikkunnel y Thomas, 2005; Wallingford, 2005) (Figuras 1 y

3). La neurulación se inicia con la formación de la placa neural, gracias a un

proceso que se describe como inducción neural (Lemaire y Kodjabachian, 1996;

Tanabe y Jessell, 1996; Gould y Grainger, 1997; Hemmati-Brivanlou y Melton,

1997; Sasai y De Robertis, 1997; Weinstein y Hemmati-Brivanlou, 1999; Harland,

2000; Jessell y Sanes, 2000). Estudios recientes muestran que la inducción

neural involucra la supresión del destino epidérmico más que la inducción del

destino neural en sí. La señal de supresión es generada por el nodo de Hensen

(el equivalente en aves al organizador de Spemann) (Figura 3A) e involucra la

unión de moléculas inhibitorias a ligandos secretados, tales como BMPs o Wnts,

bloqueando la señal (Colas y Schoenwolf 2001; Stern, 2002).

5

a - Formación de la placa neural

En humanos, ratones, anfibios, aves y la mayoría de los vertebrados la

construcción de todo el sistema nervioso comienza con la formación de la placa

neural debido a un engrosamiento del ectodermo dorsal (Greene y Copp, 2009)

(Figura 3A). Esto sucede cuando el mesodermo dorsal subyacente (y el

endodermo faríngeo de la cabeza) señaliza a las células suprayacentes a fin de

elongar las células de la placa neural a columnares. Esta forma elongada

distingue a las células de la placa neural prospectiva de las células más planas

pre-epidérmicas que las rodean. Aproximadamente el 50% del ectodermo es

incluido en la placa neural (Wallingford, 2005) la cual se extiende a lo largo del

eje antero-posterior y se estrecha hacia el extremo caudal. Dicha placa se halla

constituida por células polarizadas, en las cuales la actina y la miosina se

acumulan en el borde apical del epitelio. Los movimientos coordinados de

invaginación, elevación y convergencia se deben a la acción de fuerzas

extrínsecas e intrínsecas, estas últimas dirigidas por el citoesqueleto de actina

(Schoenwolf, 1991; Smith y Schoenwolf, 1997).

b - Modelado de la placa neural

Durante el modelado, la placa neural continúa engrosándose a nivel ápico-basal.

Adicionalmente, se somete a movimientos de extensión convergente que

permiten que la placa se estreche a nivel medio-lateral y se alargue a nivel

céfalo-caudal (Figura 3B, C). Experimentos de aislamiento han demostrado que

el modelado está guiado por cambios en el comportamiento de las células del

neuroepitelio (Schoenwolf, 1988; Schoenwolf y Alvarez, 1989; Moury y

Schoenwolf, 1995). Aunque los procesos de neurulación y gastrulación pueden

ser experimentalmente desacoplados, la formación completa de la porción

rostro-caudal de la placa neural así como su extensión requieren movimientos de

gastrulación normales (especialmente la regresión de la línea primitiva) (Colas y

Schoenwolf, 2001).

6

c - Flexión de la placa neural

Para que el proceso de flexión se lleve a cabo debe ocurrir elevación y

convergencia de los pliegues neurales hacia la línea dorsal media (Figura 3B-D).

En un comienzo, las células de la línea media de la placa neural se anclan a la

notocorda por debajo de ellas, recibiendo el nombre de células del punto bisagra

medio. Su formación requiere una señal inductiva proveniente de la notocorda

subyacente (Smith y Schoenwolf, 1989; Nieuwkoop, 1999; Bachiller et al., 2000).

Esta señal, mediada por la proteína secretada Sonic hedgehog, también está

involucrada en la formación de la placa del piso del tubo neural, un importante

centro de señalización (Jessell y Sanes, 2000). Poco después, otras dos

regiones laterales denominadas puntos bisagra dorsolaterales forman surcos

cerca de la conexión de la placa neural con el resto del ectodermo. Las células

en estos tres puntos aumentan su altura y adquieren forma de cuña, permitiendo

que las bisagras actúen como un eje que dirige la rotación de las células

alrededor de éstas llevando a que la placa se flexione. La elevación en el punto

bisagra medio produce un espacio llamado surco neural, el cual se convertirá en

el lumen del tubo neural primitivo luego del cierre (Wallingford, 2005). Los

pliegues neurales también juegan un importante rol durante el plegado de la

placa neural. Cada pliegue es bilaminar y consiste en una capa de neuroepitelio

cubierta por una capa de ectodermo epidérmico (Colas y Schoenwolf, 2001).

Experimentos de aislación han demostrado que el plegamiento de la placa

neural no sólo es dirigido por cambios en el comportamiento en las células

neuroepiteliales (Schoenwolf, 1988; Moury y Schoenwolf, 1995). Las fuerzas que

dirigen el plegado son generadas, en gran medida, por el ectodermo epidérmico

y consisten en el aplanamiento, intercalación celular y orientación de las mitosis

(Schoenwolf y Alvarez, 1991; Sausedo et al., 1997) que permiten que el

ectodermo se expanda medialmente (Lawson et al., 2001).

d - Cierre del tubo neural

El tubo neural se cierra a medida que el par de pliegues neurales es llevado

hacia la línea dorsal media. Los pliegues se adhieren entre sí y las células a

partir de ambos pliegues se fusionan. El cierre no se produce simultáneamente a

7

lo largo de todo el ectodermo. Esto se observa mejor en aquellos vertebrados

(aves y mamíferos) cuyo eje corporal es alargado antes de la neurulación. En

amniotas, la inducción en la cabeza comienza antes que en el tronco. Por tanto,

en un embrión de pollo de 24 horas coexisten una avanzada neurulación en la

región cefálica con la gastrulación en la región caudal (Sadler, 2000). El tubo

neural finalmente forma un cilindro cerrado que se separa del ectodermo

superficial. Se piensa que esta separación está mediada por la expresión de

diferentes moléculas de adhesión (Gilbert, 2006). La fusión establece el techo

del tubo neural y lo separa del ectodermo epidérmico que lo cubre, el cual

contribuirá a formar la piel dorsal del embrión. Los dos extremos del tubo neural

que permanecen abiertos en esta etapa son denominados neuroporo anterior y

neuroporo posterior. Una tercera población de células ectodérmicas se forma a

medida que los pliegues neurales se elevan y convergen (en el ratón) o durante

la fusión (en el pollo). Estas son las células precursoras de la cresta neural que

se originan en la interfase entre la placa neural y la epidermis prospectiva y

provienen de ambos tejidos (Selleck y Bronner-Fraser, 1995). La cresta neural es

una importante población celular que contribuye a la formación del sistema

nervioso periférico y otras estructuras (células pigmentarias, esqueleto facial,

entre otras) (Anderson, 1999; García-Castro y Bronner-Fraser, 1999; Groves y

Bronner- Fraser, 1999; Hall, 1999; Le Douarin y Kalcheim, 1999).

8

Figura 3.- Embriones de pollo in toto durante la neurulación primaria, vistos desde la superficie dorsal del blastodermo. Los estadios que se muestran (HH4-11) fueron establecidos por Hamburger y Hamilton (1951) y representan 24 horas de desarrollo. A. La placa neural recién se ha formado. B. La placa neural durante el modelado. C. Comienzo de la flexión de la placa neural, simultánea al modelado, donde se establece el surco neural. D. Contacto entre los pliegues neurales a nivel de la región del futuro mesencéfalo del tubo neural (flecha). E. Se ha formado el tubo neural a nivel del futuro cerebro y mayor parte de la futura médula espinal. Se delinean los bordes aproximados de la placa neural para cada caso (A-C). hn, nodo de Hensen; n, notocorda; nf, pliegue neural; ng, surco neural; np, placa neural; nt/b, nivel del futuro cerebro en el tubo neural; nt/sc, nivel de la futura médula espinal en el tubo neural; ps, línea primitiva (Colas y Schoenwolf, 2001).

Figura 4.- Resumen del proceso de neurulación primaria en el pollo. A la izquierda se muestran cortes transversales y a la derecha se representa esquemáticamente la secuencia de eventos que suceden durante el cierre del tubo neural (Gilbert, 2006).

9

iv Defectos en el cierre del tubo neural

Cuando ocurren fallas en la neurulación se producen malformaciones a lo largo

del eje neural que pueden interrumpir la diferenciación del sistema nervioso

central y la inducción de los arcos vertebrales. Estas son colectivamente

conocidas como defectos en el cierre del tubo neural (NTDs) (Inagaki et al.,

2000; Pulikkunnel y Thomas, 2005). Con una incidencia aproximada de 1 en

1000 en humanos, es la segunda causa más común de defectos de nacimiento

luego de los defectos cardíacos congénitos (Afman et al., 2003; Detrait et al.,

2005). En humanos, los NTDs más frecuentes son anencefalia y

mielomeningocele (Wallingford, 2005). La anencefalia resulta de un defecto en el

cierre del extremo rostral del tubo neural y se caracteriza por una ausencia total

o parcial de la bóveda craneana y hemisferios cerebrales. El mielomeningocele

también es causado por el cierre defectuoso del tubo neural pero, en este caso,

a nivel de la columna vertebral. Los pacientes afectados pueden sufrir

consecuencias leves a severas, dependiendo del tamaño y localización del

defecto (Tolmie, 1996). La predisposición genética y los factores ambientales

juegan un rol importante en la etiología de los NTDs (Daly et al., 1997; Detrait et

al., 2005; Dhaulakhandi et al., 2010). Desórdenes genéticos asociados a NTDs

incluyen mutaciones en un único gen (ej: Síndrome de Meckel) y anomalías

cromosómicas (ej: trisomías 13 y 18). Sin embargo, los NTDs más comunes

tienen herencia multifactorial en la cual la predisposición genética es poligénica y

está influenciada por interacciones entre genes (Pulikkunnel y Thomas, 2005).

Como lo revelan varios estudios epidemiológicos, los factores ambientales

también pueden incidir y son numerosos los teratógenos y deficiencias

nutricionales que se han sugerido como posibles agentes causales (Afman et al.,

2003). Se ha descrito un aumento en el riesgo de NTDs en respuesta a

diferentes agresiones ambientales. Entre las más dramáticas, se encuentra el

uso de medicamentos anti-convulsivos o para tratamientos de desórdenes

bipolares (enfermedad maníaco-depresiva) por parte de la madre.

10

v MARCKS

MARCKS (Myristoylated Alanine-Rich C Kinase Substrate) es una proteína

perteneciente a una familia compuesta por dos miembros: MARCKS y MRP

(MARCKS Related Protein). Se trata de una proteína pequeña, intrínsecamente

desplegada, ácida, rica en alanina, glicina, prolina y ácido glutámico. Es un

sustrato mayor de la proteína quinasa C (PKC). Posee tres regiones altamente

conservadas, la región aminoterminal, la región MH2 de función desconocida, y

el dominio efector (DE), o dominio de fosforilación (Stumpo et al., 1989;

Blackshear et al., 1992). El dominio amino terminal está formado por los

primeros catorce aminoácidos que conforman la secuencia consenso para su

miristilación (modificación co-traduccional por la cual se adiciona un ácido

mirístico al grupo amino de la glicina en el extremo N-terminal mediante un

enlace amida) (Towler et al., 1988). El dominio MH2 posee el único sitio de

empalme del ARNm (Blackshear et al., 1992). Finalmente el DE es una

secuencia de 25 aminoácidos (Graff et al., 1989a; Graff et al., 1991), es

extremadamente básico a diferencia del resto de la proteína, y contiene las

serinas fosforilables por PKC. Esta proteína presenta un tamaño variable

dependiendo de la especie. En el pollo, la secuencia de MARCKS consta de 280

aminoácidos y un peso molecular de 27.8 kDa (Graff et al., 1989a; Zolessi et al.,

2004). Se trata de una proteína de membrana ubicua particularmente abundante

en el tejido nervioso (Albert et al., 1986). Su concentración también es alta en

bazo y pulmón, moderada en testículo, páncreas, glándula adrenal, riñón e

hígado, y muy baja en corazón y músculo esquelético (Albert et al., 1987).

Originalmente fue identificada como el principal sustrato de la proteína quinasa C

(PKC) (Albert et al., 1986) y desde entonces ha sido implicada en un gran

número de procesos celulares. Entre ellos, se destaca la regulación de la

dinámica del citoesqueleto cortical de actina en eventos como el desarrollo del

sistema nervioso, la coordinación de los eventos de señalización membrana-

citoesqueleto tales como la migración celular y la adhesión, así como en los

procesos de fagocitosis, endocitosis y exocitosis (revisión en Arbuzova et al.,

2002) y crecimiento de las neuritas en una amplia variedad de células (Aderem,

1992; Blackshear, 1993). MARCKS es sustrato de distintas quinasas de la familia

de la PKC y de quinasas dirigidas por prolina (MAPK y Cdks) e interacciona de

11

manera excluyente con varias moléculas tales como la calmodulina unida a

calcio (Ca-CaM), los fosfolípidos de membrana cargados negativamente y los

microfilamentos de actina. La proteína defosforilada entrecruza los filamentos de

actina, lo que puede ser inhibido por la unión de calmodulina o por la

fosforilación mediada por PKC. La fosforilación no impide la unión a la actina,

pero la torna más laxa lo cual impide el entrecruzamiento de los microfilamentos

(Hartwig et al., 1992) y provoca su translocación al citosol haciendo que

disminuya en la fracción particulada (Rosen et al., 1990).

a - MARCKS en el desarrollo del sistema nervioso

Análisis realizados en ratones knockout demostraron que se trata de una

proteína esencial en el desarrollo normal del sistema nervioso central así como

también en la formación de la retina (Stumpo et al., 1995; Blackshear, 1997). Si

bien está altamente expresada en el cerebro y en médula de animales adultos,

su expresión es aún mayor en cerebros de rata fetales (Blackshear et al., 1986;

Albert et al., 1986; Lobach et al., 1993). Se ha documentado que la disrupción

completa de la expresión de esta proteína (o de MRP) en el ratón, resulta en una

falla en el desarrollo del sistema nervioso central (NTDs) produciendo muerte

perinatal. Esto sugiere que la expresión de MARCKS durante la embriogénesis

en el ratón es necesaria para el desarrollo normal del sistema nervioso central

(Stumpo et al., 1995; Afman et al., 2003). Por otra parte, resultados previos

mostraron que MARCKS se acumula transitoriamente en la región apical de las

células neuroepiteliales durante el plegamiento del tubo neural (Zolessi y Arruti,

2001). Sin embargo, aunque se propone una posible regulación "upstream" por

MARCKS en algunas funciones del citoesqueleto cortical de actina, se

desconoce la función celular de la proteína en este proceso, así como los

mecanismos que llevan a su acumulación apical.

b - MARCKS y defectos en el cierre del tubo neural

Como mencionamos anteriormente, existe un incremento en el riesgo de NTDs

en respuesta a diferentes agresiones ambientales. Dentro de los numerosos

teratógenos estudiados se encuentran los medicamentos anti-convulsivos o

destinados al tratamiento de desórdenes bipolares. Se ha documentado que la

12

administración de estos medicamentos a madres embarazadas induce

malformaciones congénitas. Exposiciones al valproato (fármaco antiepiléptico)

durante el embarazo están asociadas a un aumento cercano al triple en la tasa

de anormalidades mayores, tales como espina bífida (llega a tener una

incidencia de hasta el 2%) y en casos raros anencefalia. El valproato funciona

como teratógeno en la mayoría de las especies estudiadas pero el embrión

humano parece ser el más susceptible (Ornoy, 2009; Watson et al., 1998). Se ha

demostrado que este teratógeno reduce la concentración de MARCKS en células

inmortales del hipocampo (Watson et al., 1998). Otro compuesto muy utilizado

para el tratamiento de desórdenes bipolares es el litio. Administraciones crónicas

de cloruro de litio (LiCl) en rata reducen marcadamente los niveles de MARCKS

de la porción soluble del hipocampo y este efecto persiste luego de terminado el

tratamiento. Sin embargo, no es claro aún si este cambio aparente en los niveles

de MARCKS se debe a una reducción de la concentración de la proteína o

simplemente a un cambio en la distribución subcelular de la misma (Lenox y

Watson, 1994). Aunque se desconoce el mecanismo exacto, algunas evidencias

indican que el efecto de estas drogas sobre MARCKS podría ser indirecto.

vi Efectos celulares del litio

A pesar de las importantes aplicaciones clínicas que posee el litio, todavía no ha

sido dilucidado el mecanismo molecular por el cual ejerce su efecto terapéutico

en humanos o modelos animales. A lo largo de los años se ha demostrado su

capacidad de inhibir varias enzimas, dentro de las cuales se encuentran

monofosfatasas de inositol (Berridge et al., 1989) y la glucógeno sintasa kinasa 3

(GSK3) (Stambolic et al., 1996; Klein y Melton, 1996). Sin embargo, debido a la

falta de modelos animales para trastornos bipolares, los efectos de la inhibición

enzimática en la acción terapéutica del litio no se conocen en profundidad

(Beaulieu y Caron, 2008).

13

vii Nuestro estudio…

En este trabajo nos enfocamos en el estudio de las fallas en la neurulación

primaria que resultan en defectos en el cierre del tubo neural (NTDs), en

particular al estudio del efecto del LiCl sobre este proceso en el embrión

temprano de pollo.

Se trata de un modelo experimental muy utilizado para el estudio de los procesos

tempranos del desarrollo (Darnell y Schoenwolf, 2000a), que se corresponde con

el primer mes del desarrollo embrionario de mamíferos (Dalgic et al., 2009). A su

vez, las zonas de neurulación primaria y secundaria se solapan en forma

bastante similar a los humanos (Schoenwolf y Delongo 1980; Kobus et al., 2009).

El desarrollo in ovo ocurre en ausencia de factores maternos, convirtiéndolo en

un modelo sencillo y especialmente adecuado para la investigación de fármacos

durante el desarrollo de los embriones. Los tejidos neurales en el embrión de

pollo muestran una variación en el grado de desarrollo a lo largo del eje céfalo-

caudal. Este hecho lo torna un muy buen modelo experimental para el estudio de

los efectos producidos por agentes químicos durante el proceso de cierre del

tubo neural (Dalgic et al., 2009). En este modelo se han logrado identificar

múltiples causantes de NTDs dentro de los cuales se encuentran la cotinina

(metabolito de la nicotina) (Dalgic et al., 2009), diazepam (Guney et al., 1999),

cadmio (Fernández et al., 2004), anestésicos (Lee y Nagele, 1985) altas dosis de

progesterona (Erdincler et al., 2009), entre otros.

14

III Objetivos __________________________________________________

El objetivo general de este proyecto es contribuir a la comprensión del proceso

de cierre del tubo neural en el embrión de pollo e intentar ahondar en las

funciones de la proteína MARCKS durante esta etapa.

Se intenta estudiar los posibles efectos del LiCl sobre la neurulación en

embriones de pollo. A su vez, veremos si es posible correlacionar la localización

subcelular de MARCKS con defectos en el cierre del tubo neural en embriones

tratados con este fármaco.

15

IV Resultados __________________________________________________

i Neurulación en condiciones de cultivo

En el comienzo de este trabajo pusimos a punto la técnica de cultivo de

embriones de pollo que utilizaríamos posteriormente en el laboratorio para

abordar los objetivos propuestos. Seleccionamos dos métodos de cultivo de la

bibliografía que podrían ser útiles: el cultivo de New y el cultivo EC. El primero

consiste en el crecimiento del embrión in vitro sobre la membrana vitelina

tensada en un anillo de vidrio y colocado sobre un sustrato de albúmina líquida

del propio huevo como medio nutritivo (New, 1955). El segundo utiliza un papel

de filtro para mantener el embrión bajo la tensión de la membrana vitelina, el cual

crece sobre un sustrato semisólido de agar-albúmina (Chapman et al., 2001).

Luego de realizar meticulosas pruebas con ambos métodos, decidimos utilizar el

método de cultivo EC (ver Materiales y Métodos para descripción de la técnica).

Este método permitió que los embriones de pollo continuasen su desarrollo

normal, hasta HH12 aproximadamente, una vez que fueron extraídos del huevo

(a partir de 12 horas de incubación). Observamos que la tasa de desarrollo de

los embriones en cultivo fue un poco más lenta que los embriones incubados in-

ovo. Las horas de incubación propuestas por Hamburger y Hamilton (1951) para

los estadios tempranos del desarrollo muchas veces no coincidieron con los

estadios alcanzados por los embriones en cultivo. También observamos

diferencias en la supervivencia de los embriones según el estadio de inicio del

cultivo. La supervivencia fue siempre mayor cuanto más avanzado el estadio.

Seguramente en los embriones más pequeños, al ser más frágiles y delicados,

aumenta la probabilidad de daño durante la manipulación que lleva al cultivo,

provocando mayor letalidad. A su vez, los cultivos realizados a partir de estadios

más avanzados resultaron técnicamente mucho más sencillos, probablemente

por el motivo mencionado anteriormente. En la Figura 5 mostramos una imagen

de embriones de pollo en cultivo utilizando el método EC. Como podemos

observar se trata de tres estadios distintos del desarrollo; los dos primeros

corresponden al proceso de neurulación (HH8 y HH9-) mientras que en el último

ya se ha formado completamente el tubo neural a lo largo de todo el eje céfalo-

16

caudal (HH11). En estos embriones podemos distinguir la región cefálica (arriba)

y la región caudal (abajo) así como también los somites que aumentan en

número a medida que el embrión avanza de estadio. En la Figura 5C el embrión

posee vesículas ópticas y cerebrales en formación y su corazón ya late aunque

recién comienza a tomar forma. Parte de la puesta a punto del método de cultivo

fue importante para observar y determinar los estadios implicados en el proceso

de neurulación en el pollo útiles para nuestra investigación. Utilizamos como

ayuda la tabla de estadios normales del desarrollo en el pollo de Hamburguer y

Hamilton (1951) para realizar las dataciones. El contacto entre los pliegues

neurales que lleva a la formación del tubo neural comienza en HH8, como

mostramos en la Figura 5A. Sin embargo, la formación de la placa neural junto

con el posterior modelado y flexión comienzan en etapas anteriores. Para HH9-

(Figura 5B) el cierre ha avanzado a lo largo de toda la región cefálica y parte del

tronco y para estadios posteriores (HH10 en adelante) ya se observa un cierre

casi total o total del tubo neural. Decidimos entonces realizar los tratamientos

farmacológicos con LiCl desde el inicio de la neurulación (HH6). También se

entendió pertinente realizar cultivos con el fármaco desde etapas anteriores

(HH3) para evaluar el efecto del tiempo en los tratamientos y una vez establecido

el contacto de los pliegues neurales (HH8). En todos los casos la incubación con

LiCl se extendió hasta aproximadamente HH9 o estadios más avanzados.

17

Figura 5

18

Figura 5.- Embriones de pollo in toto en cultivo EC. A. Embrión en HH8 con 4 pares de somites. El cierre del tubo neural está comenzado en la región cefálica mientras que en el resto del eje céfalo-caudal todavía se observa el surco neural. B. Embrión en HH9- con 6 pares de somites. El cierre del tubo neural ha avanzado hasta la región del tronco. Se observan los pliegues neurales muy próximos entre sí a la altura de los somites. C. Embrión en HH11 con 12 pares de somites. El cierre del tubo neural ya ha ocurrido a lo largo de todo el eje céfalo-caudal. Se observan las vesículas ópticas y cerebrales en formación y el codo de la arteria aorta hacia la derecha. Las imágenes fueron tomadas en microscopio compuesto (A) y lupa estereoscópica (B, C). Barra: 300 µm.

a - MARCKS en condiciones de cultivo

Con el objetivo de analizar la distribución subcelular de la proteína MARCKS

durante el proceso de neurulación en condiciones de cultivo, realizamos

inmunomarcaciones con el anticuerpo policlonal Polo52, dirigido contra la

proteína entera de pollo y marcadores para el neuroepitelio (N-CAM) y los

núcleos. En la Figura 6 se muestran los resultados obtenidos previamente en el

laboratorio (Zolessi y Arruti, 2001) y los logrados en nuestros ensayos. Como

podemos observar, la Figura 6A ilustra un corte transversal a nivel del tronco de

un embrión en HH8+. La neurulación se halla en proceso y se observa la flexión

de la placa neural, la cual ha adquirido forma de V. Los somites se evidencian a

ambos lados de la placa neural, entre el ectodermo y el endodermo. MARCKS se

observa apicalizada a lo largo del neuroepitelio durante esta etapa (Zolessi y

Arruti, 2001). En la Figura 6B se muestran cortes transversales de embriones en

HH8+ a nivel del tronco en condiciones de cultivo y extraídos directamente del

huevo. MARCKS se mantiene apicalizada entre los embriones cultivados en

comparación con los obtenidos directamente del huevo. En ambos casos se

observó una distribución apical de MARCKS durante HH8+ (neurulación) como

fuera descrito por Zolessi y Arruti (2001). Cabe mencionar que MARCKS

presenta una distribución homogénea en forma previa y posterior al cierre del

tubo neural. Los filamentos de actina se mantienen también en posición apical

durante y también luego del proceso de neurulación y muestran co-localización

con MARCKS en esa zona del neuroepitelio (Zolessi y Arruti, 2001).

19

A

B

Figura 6

20

Figura 6.- Cortes transversales de embriones de pollo en HH8+ a nivel del tronco. A. Se muestra la apicalización de la proteína MARCKS en el neuroepitelio que ya ha comenzado el proceso de modelado (Zolessi y Arruti, 2001). B. Embriones en condiciones de cultivo y extraído del huevo (in-ovo). Se observa la misma apicalización de MARCKS que en A. Se muestran la proteína MARCKS (verde), el marcador temprano de placa neural N-CAM (fucsia) y ambas imágenes superpuestas. En las últimas se agregan los núcleos celulares (azul). ec, ectodermo; en, endodermo; n, notocorda; s, somite. Las micrografías fueron tomadas en microscopio de fluorescencia. Barra: 50 µm.

ii Tratamiento farmacológico de embriones en condiciones de cultivo

durante la neurulación

Para abordar el objetivo planteado en este trabajo realizamos tratamientos con

LiCl en embriones en cultivo durante el período de neurulación. Como

mencionamos anteriormente, los cultivos fueron realizados principalmente a

partir de HH6, cuando el proceso de formación del tubo neural comienza, hasta

HH9, momento en el que el cierre ya se ha producido en la región cefálica y del

tronco. En algunos casos, los cultivos fueron iniciados desde estadios más

tempranos (gastrulación) y más tardíos (neurulación avanzada) para evaluar: i) la

existencia de un período crítico de acción del teratógeno y, ii) dependencia del

tiempo de exposición. Según Thomas y Collins (1987) se necesitan 3 dosis para

determinar la dosis teratogénica óptima de un fármaco: una dosis alta que sea

tóxica pero no letal, una dosis baja que se encuentre cercana al rango clínico y

que no cause efectos evidentes y una dosis intermedia. Utilizamos entonces 3

dosis distintas de la droga: 20, 60 y 100 mM, que de acuerdo a la bibliografía

causaban efectos desde escasos o nulos a severos, respectivamente (Giles y

Bannigan, 1999). El modo de aplicación de la droga fue por disolución en el

medio de cultivo (agar-albúmina). En este caso, la parte dorsal del embrión

permanece directamente en contacto con el sustrato y el LiCl actúa por difusión.

También se ensayó la aplicación directa de mínimos volúmenes de la droga

sobre el embrión. En este procedimiento el fármaco queda en contacto directo

con la parte ventral del embrión. A pesar de estas diferencias, ambos métodos

arrojaron los mismos resultados.

21

a - Tratamientos con 100 mM de cloruro de litio

Los cultivos de embriones tempranos de pollo a partir de HH3 tratados con una

concentración de 100 mM de LiCl hasta HH9, mostraron efectos muy severos del

fármaco. En este caso se aplicó la dosis más alta y el mayor tiempo de

exposición, por lo cual era de esperar dicho resultado. En HH3 el embrión inicia

la gastrulación, proceso que involucra movimientos celulares que darán origen a

las 3 capas embrionarias. Muchos de los embriones cultivados bajo estas

condiciones no sobrevivieron al tratamiento. Los embriones supervivientes

resultaron altamente afectados exhibiendo morfologías muy diferentes a los

individuos control, con mínimo desarrollo y ausencia de estructuras normales en

relación al tiempo de incubación. La Figura 7 muestra un corte transversal de un

embrión control y uno tratado bajo estas condiciones. En la primera se pueden

distinguir fácilmente las distintas estructuras del embrión. El tubo neural, formado

por el neuroepitelio plegado y la luz, se observa en la zona superior y se

encuentra casi cerrado. La apicalización de MARCKS ya ha desaparecido,

producto del cierre casi total del tubo neural. Se pueden distinguir el ectodermo

suprayacente, el mesodermo en la parte central y el endodermo por debajo. En

la imagen inferior se observan claramente los efectos del LiCl, el cual causó

importantes modificaciones en la morfología del embrión. No es posible distinguir

estructuras, ni capas embrionarias con certeza. El embrión presenta visibles

defectos en la neurulación con respecto al control. No cuenta con un

neuroepitelio definido, ni un tubo neural en proceso de formación (de hecho no

se logra visualizar ninguna estructura que se le asemeje). Tampoco es posible

diferenciar las regiones ventral y dorsal del embrión como consecuencia de los

drásticos cambios ocurridos. Además, no se observa apicalización de MARCKS

en ningún sector de la imagen, que podría constituir una guía para definir la

región dorsal. Los núcleos que se encuentran en la parte superior formando un

cordón (de izquierda a derecha de la imagen) podrían ser parte del neuroepitelio

que no llegó a plegarse. Una imagen del mismo corte del embrión con

inmunomarcación para actina filamentosa muestra una pequeña acumulación en

la parte superior, lo que sugiere que podría corresponder al lado dorsal, aunque

no podemos dar certeza de esto.

22

Figura 7

23

Figura 7.- Cortes transversales de embriones de pollo a nivel cefálico cultivados desde HH3 hasta HH9. La imagen superior corresponde a un embrión control. Ilustra el tubo neural en formación, con un neuroepitelio plegado bien definido. La imagen inferior es de un embrión tratado con una dosis de 100 mM de LiCl. Evidencia un drástico efecto del fármaco con pérdida de ejes corporales y de la morfología normal. Se muestra la distribución de la proteína MARCKS (verde) y los núcleos celulares (azul). ec, ectodermo; ne, neuroepitelio; n, notocorda. Las imágenes fueron tomadas en microscopio de fluorescencia. Barra: 50 µm.

Las dificultades en la identificación de los ejes corporales nos llevaron a utilizar

un marcador de placa neural en las inmunodetecciones para ubicar el

neuroepitelio. De esta manera es posible reconocer los lados dorsal y ventral del

embrión cuando los efectos de la droga modifican la morfología del embrión.

Esta estrategia es especialmente útil en los casos de afectación más leves

aunque de limitada aplicación en los tratamientos más severos (como el que

analizamos anteriormente). El anticuerpo que escogimos se denomina 5e y es

un marcador de las uniones intercelulares del neuroepitelio. Muestra la presencia

de la glicoproteína de unión celular N-CAM y se utiliza como marcador temprano

de placa neural (Sanes et al., 2006). Si bien se localiza preferentemente en el

neuroepitelio, observamos que también marca la notocorda y con menor

intensidad el mesodermo lateral. Antes de utilizarlo en nuestras

inmunomarcaciones realizamos ensayos con distintas diluciones del anticuerpo

para determinar la concentración más adecuada. Decidimos emplear una

dilución 1/400.

Cuando el tratamiento con 100 mM de LiCl se realizó en embriones de estadios

más avanzados (HH5 y 6 y hasta HH11) sometidos a la misma exposición, el

efecto de la droga fue menos severo. En la Figura 8A se muestra una imagen de

embriones in toto control y tratado. Como podemos observar, el embrión control

se ha desarrollado normalmente y ha llegado a HH11. Presenta una región

cefálica en formación, con las divisiones características del cerebro en esta

etapa (prosencéfalo, mesencéfalo y rombencéfalo), vesículas ópticas en

desarrollo, corazón en funcionamiento (podemos visualizar la aorta hacia el lado

derecho), 13 pares de somites y un tubo neural completamente cerrado desde el

extremo cefálico al caudal. Si se comparan el embrión control y el tratado se

evidencian claras diferencias. Este último presenta un tamaño mucho menor, la

24

distancia entre la región cefálica y caudal se ha reducido en forma notable y

muestra un importante retraso en el desarrollo. Si bien en este caso se

conservan los ejes corporales, el embrión carece de las estructuras indicadas

para el control. La región cefálica no presenta vesículas cerebrales ni ópticas, no

se observa el corazón y tampoco somites. Es posible observar un tubo neural en

proceso de formación con pocas zonas de contacto de los pliegues neurales. En

la mayor parte del eje antero-posterior el tubo neural permanece abierto. No se

ha producido un cierre normal del tubo neural que en el pollo transcurre desde la

región cefálica hacia la caudal. En la Figura 8B, se muestran cortes

transversales de los embriones de la parte A en dos posiciones distintas del eje

antero-posterior, una cefálica y otra más caudal, donde se utilizaron distintos

marcadores. Se observan las diferencias que mencionamos entre ambos

embriones. En el embrión tratado no se ha producido el cierre del tubo neural,

aunque es evidente que los movimientos de flexión de la placa neural han tenido

lugar considerando la cercanía de los pliegues neurales. En el estadio alcanzado

por el embrión control (HH11), MARCKS ha modificado su localización apical en

el neuroepitelio y muestra nuevamente una distribución homogénea.

Interesantemente, en el embrión tratado ocurre lo mismo pese a que el cierre del

tubo neural no se ha producido.

25

A

Figura 8

26

B

Figura 8

27

Figura 8.- Embriones de pollo en cultivo, control y tratado con una dosis de 100 mM de LiCl desde HH6 hasta HH11. A. Embriones in toto. El control ha alcanzado un desarrollo normal para el tiempo de incubación mientras que el tratado muestra defectos importantes: retraso en el desarrollo, largo reducido del eje céfalo-caudal, no presenta vesículas cerebrales ni ópticas, corazón ni tampoco somites; presenta un tubo neural en formación pero que permanece mayoritariamente abierto. B. Cortes transversales a la altura de la región cefálica y más caudales. Se muestra la proteína MARCKS (verde), el marcador temprano de placa neural N-CAM (fucsia) y los núcleos celulares (azul). El embrión control posee un tubo neural cerrado en las dos regiones ilustradas mientras que en el tratado se encuentra aún abierto. ec, ectodermo; en, endodermo; n, notocorda, s, somite. Las imágenes fueron tomadas en lupa estereoscópica (A) y microscopio de fluorescencia (B). Barra A: 300 µm; Barra B: 50 µm.

Analizando más detalladamente cortes finos transversales marcados para ADN

de los embriones de la Figura 8, corroboramos que el tubo neural se encuentra

prácticamente cerrado en el embrión control, mientras que en el tratado

permanece abierto con los pliegues neurales separados. Logramos determinar

que el embrión tratado presenta un importante incremento en la muerte celular a

lo largo del neuroepitelio, hecho que se manifiesta por el aumento de los núcleos

picnóticos en comparación con el control (Figura 9).

Finalmente realizamos tratamientos con la misma dosis de LiCl utilizada

anteriormente, 100 mM, pero esta vez a partir de un estadio más tardío y un

período de tiempo menor. Los embriones fueron cultivados a partir de HH8 y

hasta aproximadamente HH9. Los resultados obtenidos muestran algunas

diferencias entre embriones tratados y control, que podemos visualizar en la

Figura 10. El proceso de cierre del tubo neural se encuentra retrasado en el

embrión tratado; el contacto de los pliegues neurales se ha producido

únicamente en la región anterior, mientras que en todo el tronco y región

posterior los pliegues permanecen distantes. Los somites muestran una mayor

separación en comparación con el respectivo control.

28

Figura 9

29

Figura 10

30

Figura 9.- Cortes transversales de embriones de pollo a nivel cefálico cultivados desde HH6 hasta HH11. La imagen superior corresponde a un embrión control. Muestra el neuroepitelio plegado. Los pliegues neurales han hecho contacto y la luz del tubo neural se observa expandida hacia los lados, ya que pertenece a la región cefálica. La imagen inferior es de un embrión tratado con una dosis de 100 mM de LiCl. Se observa el neuroepitelio en forma de U. El tubo neural no se ha cerrado, los pliegues neurales permanecen distantes. Se observa un aumento en el número de núcleos picnóticos correspondientes a muerte celular. Se muestran los núcleos celulares (azul). ec, ectodermo; ne, neuroepitelio; n, notocorda. Las imágenes fueron tomadas en microscopio de fluorescencia. Barra: 50 µm.

Figura 10.- Embriones de pollo in toto en cultivo; control y tratados con una dosis de 100 mM de LiCl desde HH8 hasta HH8+. En el embrión control el cierre del tubo neural ha avanzado hasta el inicio de los somites, donde comienza el contacto entre los pliegues neurales. Los embriones tratados (i, ii) muestran un retraso evidente en el cierre del tubo neural y una mayor separación entre los pliegues neurales en gran parte del eje céfalo-caudal. Las imágenes fueron tomadas en lupa estereoscópica. Barra: 300 µm.

b - Tratamientos con 60 mM de cloruro de litio

Los embriones tratados con una dosis de 60 mM de LiCl (HH6 hasta

aproximadamente HH9) mostraron algunas diferencias en su desarrollo con

respecto a los controles. En la Figura 11A podemos observar un embrión control

en HH9- con 6 pares de somites en el cual el cierre del tubo neural abarca la

mayor parte del eje céfalo-caudal. Encontramos dos tipos de morfologías

características en los embriones expuestos a tratamientos con 60 mM de LiCl. El

embrión i muestra una longitud céfalo-caudal similar al control. Si bien el cierre

del tubo neural es similar al control en el sector anterior, se observa una

separación mayor de los pliegues neurales a nivel de los somites. El número de

somites se corresponde con el estadio alcanzado pero los mismos muestran un

aspecto menos definido que en el control. El embrión ii muestra una mayor

longitud del eje antero-posterior. Los pliegues neurales no han hecho contacto

aún a lo largo de este eje. Podemos observar un número menor de somites (3

pares) que no concuerda con el estadio del desarrollo en relación al tiempo de

incubación. Este embrión muestra una morfología poco común en la parte

posterior o caudal, donde se ha producido un plegamiento incorrecto de la placa

neural que se muestra expandida como lo evidencia el marcador N-CAM. La

31

placa contiene un surco mayor en el medio y dos surcos ectópicos más

pequeños a los costados que también son positivos para N-CAM (Figura 11B).

También realizamos tratamientos con una dosis de 60 mM de LiCl por un lapso

menor (HH8 hasta aproximadamente HH9). En la Figura 12 mostramos los

resultados macroscópicos obtenidos. Al momento de la fijación, el embrión

control y el tratado i habían alcanzado un HH8+ mientras que el tratado ii se

hallaba apenas más avanzado en su desarrollo (HH9). Si bien el cierre del tubo

neural avanza desde cefálico a caudal en el embrión tratado, el proceso parece

algo retrasado. En el embrión tratado ii el cierre ha llegado hasta la altura del

tronco, como en el control, aunque fue necesario un mayor tiempo de incubación

para lograrlo. Otra diferencia comprende al neuroporo anterior, que se encuentra

más abierto en los embriones que fueron expuestos al fármaco.

32

A

B

Figura 11

33

Figura 11.- Embriones de pollo en cultivo, control y tratados con una dosis de 60 mM de LiCl (desde HH6 hasta aproximadamente HH9). A. Embriones in toto control y tratados. Para el caso de los embriones tratados se muestran las dos morfologías obtenidas: i. El largo del eje céfalo-caudal es similar al control pero el cierre del tubo neural se encuentra retrasado en el tronco y los somites aparecen menos definidos; ii. El largo del eje céfalo-caudal se ha modificado, mostrando un aumento debido a la prolongación de los pliegues neurales posteriores y únicamente 3 pares de somites. B. Cortes transversales a nivel caudal de los embriones control y tratado II. Este último posee una placa neural expandida con dos surcos neurales ectópicos a los lados del surco principal. Se muestra la proteína MARCKS (verde), el marcador temprano de placa neural N-CAM (fucsia) y la imagen superpuesta. ec, ectodermo; ne, neuroepitelio; n, notocorda; s, somite. Las imágenes fueron tomadas en microscopio compuesto (A) y en microscopio de fluorescencia (B). Barra A: 300 µm. Barra B: 50 µm.

c - Tratamientos con 20 mM de cloruro de litio

Los tratamientos más leves fueron realizados con una concentración de 20 mM

de LiCl, dosis propuesta como aquella cercana al rango clínico y que no causa

efectos evidentes (Thomas y Collins, 1987; Giles y Bannigan, 1999). Los

embriones tratados con esta dosis fueron cultivados desde HH3 o HH6 hasta

HH9 y HH11. En este caso no fueron observados efectos a nivel macro- o

microscópico en comparación con el control. En la Figura 12A se ilustran 2

embriones obtenidos por cultivo desde HH6 hasta HH11, uno tratado con 20 mM

de LiCl y otro control. El grado de desarrollo alcanzado por el embrión tratado es

normal para el tiempo de incubación, así como también el número de somites y

la distancia céfalo-caudal. El cierre del tubo neural se ha completado en casi

toda la longitud del embrión, salvo en la región caudal como también ocurre en el

control. Las inmunomarcaciones sobre criocortes transversales caudales de

estos embriones (Figura 13B) confirman los resultados observados in toto. En

ninguno de los embriones expuestos a esta dosis detectamos efectos del LiCl

sobre las estructuras en formación, así como tampoco sobre el cierre del tubo

neural.

34

Figura 12

35

Figura 12. Embriones de pollo in toto en cultivo, control y tratados con una dosis de 60 mM de LiCl desde HH8 hasta aproximadamente HH9. En el embrión control (HH8+) se ha alcanzado el cierre del tubo neural hasta el inicio de los somites donde comienzan a establecer contacto los pliegues neurales. Para los embriones tratados se muestran un HH8+ (i) y HH9 (ii). Se observa un retraso en el cierre del tubo neural y una apertura mayor del neuroporo anterior en comparación con el embrión control. Las imágenes fueron tomadas en lupa estereoscópica. Barra: 300 µm.

36

A

B

Figura 13

37

Figura 13.- Embriones de pollo en cultivo, control y tratado con una dosis de 20 mM de LiCl. A. Embriones in toto cultivados desde HH6 hasta HH11. El embrión tratado no exhibe diferencias con respecto al control. Ambos muestran una morfología normal para el estadio del desarrollo alcanzado. El cierre del tubo neural está llegando a su fin. Los embriones presentan vesículas ópticas en formación y 13 pares de somites. B. Cortes transversales de embriones cultivados desde HH6 a HH9 a la altura de la región caudal. Se muestra la proteína MARCKS (verde), los núcleos celulares (azul) y la superposición de ambas imágenes. Tanto el embrión control como el tratado muestran una placa neural en etapa de modelado, donde MARCKS comienza a observarse en la región apical del neuroepitelio. ec, ectodermo; ne, neuroepitelio; n, notocorda; s, somite. Las imágenes fueron tomadas en lupa estereoscópica (A) y microscopio de fluorescencia (B). Barra A: 300 µm; Barra B: 50 µm.

iii Efectos del cloruro de litio sobre la localización subcelular de MARCKS

Luego de analizar los efectos generales que causó el tratamiento con LiCl sobre

embriones de pollo en cultivo, nos enfocamos en estudiar su acción sobre la

proteína MARCKS. Como mencionamos anteriormente, era de nuestro particular

interés observar si la proteína sufría algún cambio en su abundancia o

localización subcelular durante el proceso de cierre del tubo neural en

comparación con los respectivos controles. En la Figura 14 mostramos algunas

imágenes obtenidas al inmunomarcar MARCKS en embriones en cultivo control

y tratados con dos de la dosis utilizadas en nuestro trabajo: 20 y 60 mM. De

acuerdo a lo reportado por Zolessi y Arruti (2001) esta proteína posee un

particular comportamiento a medida que transcurre la neurulación en el pollo.

Durante el cierre del tubo neural adopta una posición apical en las células que

componen el neuroepitelio y una vez finalizado el proceso vuelve a adquirir una

distribución homogénea. Cuando comparamos la distribución de MARCKS

durante la neurulación en las distintas situaciones analizadas pudimos observar

que, al igual que mostramos en la Figura 6, el embrión control presenta una

apicalización de la proteína a nivel del neuroepitelio. Se evidencia una marcación

más intensa (verde) en la zona apical de las células que lo componen. Al

comparar la imagen control con las correspondientes a las distintas dosis de LiCl

se comprobó que ocurre el mismo fenómeno respecto a la localización

subcelular de MARCKS. La proteína se mantiene apicalizada durante el proceso

y no muestra una disminución en el sector apical ni aumento en el citoplasma

aparentes, incluso cuando el embrión ha experimentado modificaciones en su

38

morfología producto de las acción del litio (embrión tratado con LiCl 60 mM). No

llegamos a obtener imágenes de embriones tratados con 100 mM y cultivados

desde HH6 a HH9, lo cual nos impide realizar una comparación con las

imágenes de la Figura 14. Los cortes obtenidos para esta dosis pertenecían a

embriones más avanzados en el desarrollo (Figura 6) donde MARCKS ya no se

observa apicalizada y regresa a su distribución original. Si bien obtuvimos

embriones que fueron cultivados desde HH3 a HH9 con 100 mM con

inmunomarcación para este proteína (Figura 7), la severidad del efecto del LiCl

impidió la comparación con los otros experimentos.

39

Figura 14

40

Figura 14.- Cortes transversales de embriones de pollo a nivel caudal cultivados desde HH6 hasta HH9. Se muestran embriones control y tratados con 20 y 60 mM de LiCl marcados para la proteína MARCKS (verde). En todos los casos MARCKS se mantiene apicalizada en el neuroepitelio durante el modelado y flexión de la placa neural. El LiCl no afecta la abundancia ni localización subcelular de MARCKS. ec, ectodermo; ne, neuroepitelio; n, notocorda; s, somite. Las micrografías corresponden a las mostradas previamente en las Figuras 11B y 13B. Barra: 50 µm.

Debido a que no encontramos cambios en la abundancia y localización

subcelular de MARCKS durante la neurulación en embriones tratados, decidimos

verificar la acción del LiCl sobre los embriones en cultivo. Para corroborarlo

utilizamos cortes transversales de embriones control y tratado con una dosis de

20 mM de la droga sobre los cuales realizamos inmunodetecciones para la

enzima GSK3β. Stambolic y colaboradores y Klein y Melton demostraron en

1996 la capacidad del litio de inhibir esta enzima a través de su fosforilación. En

la Figura 15A se exponen los resultados obtenidos al inmunomarcar la forma

fosforilada de la enzima (pGSK3β) en cortes transversales cefálicos. También se

adjunta en la misma el promedio de la cuantificación de intensidad de

fluorescencia (Figura 15B). Se puede observar un aumento en la intensidad de

fluorescencia de la enzima pGSK3β en el embrión tratado con respecto al

control. No sólo se incrementa la intensidad en cada célula, sino también el

número de células marcadas. Si observamos las medidas promedio de

intensidad de fluorescencia obtenidas vemos que el aumento llega a ser casi el

doble en los embriones tratados. Se logra una importante inactivación de la

enzima por la exposición a la dosis más pequeña (20 mM) para la cual no

encontramos efectos del LiCl en el desarrollo embrionario.

41

A

B

Cuantificación de intensidad

de fluorescencia

Figura 15

Embriones

Promedio de intensidad de fluorescencia

(intensidad relativa)

Control 35,21 ± 3,8

LiCl 20 mM 69,10 ± 4,2

42

Figura 15.- A. Cortes transversales de embriones de pollo a nivel cefálico cultivados desde HH6 a HH9. Se muestran embriones control y tratado con una dosis de 20 mM de LiCl marcados para la forma inactiva de la enzima GSK3β (pGSK3β; verde). Las imágenes fueron tomadas en microscopio de fluorescencia. Barra: 50 µm. B. Cuantificación de la intensidad relativa de fluorescencia de pGSK3β para imágenes cefálicas, a nivel del tronco y caudales de un total de 4 embriones: 2 controles y 2 tratados con 20 mM de LiCl. El litio aumenta la proporción de la enzima fosforilada en el embrión tratado, aún a concentraciones bajas donde no se aprecian efectos del fármaco.

43

V Discusión __________________________________________________

i Modelo de estudio y método de cultivo de embriones

Como primera conclusión podemos afirmar que el embrión de pollo resultó un

excelente modelo para nuestra investigación. Durante muchos años numerosos

investigadores han optado por utilizarlo en diversos estudios gracias a las

ventajas que ofrece y su relativa sencillez de manipulación (Giles y Banning,

1999; Stern, 2002; Dalgic et al., 2009). Si bien las aves están alejadas

filogenéticamente de los mamíferos, los procesos que suceden durante el

desarrollo temprano son extrapolables de forma tal que pueden guiarnos hacia

un mejor entendimiento de lo que ocurre en estas fascinantes etapas de la vida.

A su vez, el método de cultivo elegido funcionó correctamente y resultó ser

adecuado para lograr los objetivos propuestos. El método EC, propuesto por

Chapman y colaboradores en 2001, es una simple pero poderosa herramienta

para el estudio del desarrollo embrionario temprano. A pesar de ser un sistema

in vitro, que puede no reproducir perfectamente la realidad, cuenta con

importantes ventajas. Cuando realizamos el procesamiento de embriones en

cultivo y los comparamos con las imágenes correspondientes a embriones

extraídos directamente del huevo en los mismos estadios, pudimos verificar que

se correlacionan. Estos primeros resultados mostraron que los cultivos

reproducen el desarrollo normal del pollo en su etapa temprana. Dicho método

mostró además ser práctico, efectivo y útil para el estudio del proceso de

neurulación, permitiendo la observación y el seguimiento continuo de los

embriones bajo condiciones controladas de temperatura y humedad. Esto último

posibilita realizar su fijación en el momento deseado para su posterior

procesamiento. Una ventaja adicional es que permite la realización de varios

cultivos simultáneos con diferentes situaciones problema y con un número

significativo de individuos para cada caso. Esta metodología ha demostrado

también ser apropiada para desarrollar ensayos con el propósito de evaluar el

efecto de sustancias nocivas para el desarrollo o teratógenos. Hemos

comprobado que resulta un excelente modelo para estudiar NTDs. La técnica

que ideamos de disolución de la droga en el medio semisólido de agar-albúmina

permite la implementación de estudios dosis-efecto y elimina a la vez la

44

necesidad de agregar volúmenes adicionales al cultivo del embrión. En el

método EC se realiza el cultivo en ausencia de líquido sobre el lado ventral del

embrión (sólo necesita el contacto con el medio por su lado dorsal) y agregados

externos, aunque pequeños, podrían influir en el desarrollo normal. Los retrasos

en el desarrollo observados en embriones en cultivo con respecto a los

incubados in ovo probablemente se deban a la manipulación para iniciar los

cultivos. Los embriones son sacados fuera de las condiciones óptimas para su

crecimiento (37°C y humedad constante), extraídos del huevo, lavados y

colocados sobre un sistema muy distinto al de origen. Todos estos cambios

afectan el crecimiento del embrión hasta que es colocado nuevamente en la

incubadora, bajo condiciones óptimas, donde puede continuar su desarrollo.

Como se describe en la Introducción, el proceso de neurulación primaria en el

pollo es ampliamente conocido en la actualidad y se ha descrito en forma

detallada la secuencia de eventos que llevan a la formación del tubo neural

(Colas y Schoenwolf, 2001). Las observaciones realizadas en el presente estudio

permitieron identificar con precisión esta secuencia y determinar con exactitud

los estadios correspondientes a cada fenómeno. En el embrión de pollo, los

eventos preparatorios de la neurulación primaria comienzan en HH4 cuando las

células de la placa neural se hacen distinguibles en la región del ectodermo

dorsal, adquiriendo una forma alargada. El plegamiento comienza alrededor de

HH6 a medida que las células del punto bisagra neural medial se anclan a la

notocorda y cambian su forma, mientras que las células epidérmicas presuntivas

se mueven hacia la línea media dorsal. Los pliegues neurales son elevados a

medida que la epidermis presuntiva continúa moviéndose hacia esta línea. Se

produce la convergencia de los pliegues neurales cuando nos acercamos a HH8

a medida que las células del punto bisagra dorsolateral adoptan forma de cuña y

las células epidérmicas empujan hacia el centro. Finalmente desde HH8 en

adelante los pliegues neurales se contactan y las células de la cresta neural, que

en un principio unen el tubo neural con la epidermis, se dispersan (Gilbert, 2006).

45

ii Tratamientos farmacológicos de embriones en condiciones de cultivo

durante la neurulación

La neurulación es uno de los procesos más relevantes del desarrollo. Una serie

de etapas consecutivas deben sucederse con precisión para que el sistema

nervioso pueda formarse y llegar a comandar las innumerables funciones de

todo un organismo (Wallingford, 2005). Pero como todo proceso biológico, puede

involucrar fallas que interfieran con su curso normal. Cuando falla el proceso de

cierre del tubo neural aparecen defectos conocidos como NTDs (Inagaki et al.,

2000; Pulikkunnel y Thomas, 2005). Los NTDs pueden originarse por factores

genéticos o ambientales (Daly et al., 1997; Detrait et al., 2005; Dhaulakhandi et

al., 2010). La droga que utilizamos durante este estudio, el LiCl, se administra

comúnmente para el tratamiento de trastornos bipolares y maníaco-depresivos.

A pesar de su conocida eficiencia clínica (Price y Henninger, 1994), su uso debe

ser controlado con precaución ya que existe un pequeño margen entre la dosis

terapéutica y la tóxica. La intoxicación por litio genera una toxicidad sistémica y

se ha visto que las manifestaciones clínicas características están directamente

correlacionadas con su concentración sérica (Kansagra et al., 2011). Los

tratamientos llevados a cabo con LiCl en este trabajo sobre embriones de pollo

en cultivo mostraron algunos efectos interesantes sobre los procesos tempranos

del desarrollo. Trabajos pioneros en este tema ya demostraban que en

vertebrados los efectos de la administración de litio dependen de la especie que

se emplea como modelo experimental y la dosis y duración del tratamiento. En

ensayos a corto plazo se pudo determinar que los niveles de LiCl que resultan

teratogénicos en el ratón son 6 veces superiores a los niveles terapéuticos de

litio en suero utilizados en humanos (Smithberg y Dixit, 1982). Incluso se han

documentado diferencias en la sensibilidad a la droga entre rata y ratón (Hansen

et al., 1990). Esta variación que parece existir en las dosis teratogénicas entre

diferentes especies nos impide generalizar resultados entre los distintos modelos

utilizados. Las tres dosis utilizadas en los cultivos de embriones de pollo

(seleccionadas según Thomas y Collins, 1987), si bien fueron algo superiores a

las alcanzadas en el suero humano bajo tratamiento terapéutico, mostraron

fenotipos correspondientes a los mencionados por estos autores para determinar

46

la dosis teratogénica óptima de un fármaco. El tratamiento con 100 mM de LiCl

resultó una dosis alta y tóxica pero no letal en la mayoría de los casos; la

administración de 20 mM de LiCl una dosis baja cercana al rango clínico sin

efectos evidentes mientras que la dosis de 60 mM de LiCl mostró efectos

intermedios.

A partir de los resultados obtenidos pudimos concluir que el efecto del LiCl

aumenta a medida que administramos cantidades crecientes de la droga.

Concentraciones altas (100 mM) de LiCl causaron importantes defectos en los

procesos tempranos del desarrollo de los embriones en cultivo y en algunos

casos la muerte. La dosis intermedia (60 mM) provocó efectos sobre la

neurulación sin afectar demasiado la morfología normal de los embriones ni los

ejes corporales. Por último, la concentración más baja (20 mM) no causó efectos

evidentes sobre los embriones expuestos comparados con los controles. Este

estudio demuestra entonces que el litio tiene un efecto teratogénico dependiente

de la concentración (dosis dependiente) como reportaron Giles y Bannigan

(1999) para el desarrollo vascular temprano en embriones de pollo en cultivo.

Además, se comprobó que los efectos provocados por el LiCl aumentan con el

tiempo de exposición en las diferentes etapas del desarrollo analizadas y son

dependientes del momento de administración. La primera conclusión se deduce

a partir de los resultados obtenidos para los tratamientos que difieren en el

tiempo de exposición al fármaco: los tratamientos más prolongados causaron

efectos mayores que los breves. Estos últimos, realizados desde HH8 hasta HH9

fueron los más leves para las dosis de 60 y 100 mM. Según Nokhbatolfoghahai y

Parivar (2008) uno de los factores críticos es el estadio del desarrollo en el cual

los embriones son expuestos a agentes teratógenos. En nuestro caso, pudimos

corroborar esta afirmación cuando la droga se empleó a iguales concentraciones

(100 mM) y tiempo de exposición pero comenzando su administración en

distintos momentos (estadios) del desarrollo. Concluimos que los efectos del LiCl

difieren según el momento de administración. Para los tratamientos realizados

con 100 mM iniciados desde los estadios más tempranos (HH3) los efectos

fueron drásticos. Los embriones mostraron fenotipos muy difíciles de interpretar

cuando sobrevivían al tratamiento. Observamos una pérdida casi completa de

los ejes corporales, no solo a nivel macroscópico sino también en

47

inmunomarcaciones. La aplicación de litio desde etapas muy tempranas parece

tener efectos sobre los procesos del desarrollo anteriores a la neurulación que

ocurren en ese momento. Este hecho puede observarse claramente en la Figura

8, donde los cortes transversales muestran que no se visualizan las tres capas

embrionarias resultantes del proceso de gastrulación. Un trabajo reciente,

llevado a cabo por Martin y colaboradores (2011) describe las malformaciones

causadas en embriones expuestos al litio desde el inicio de la gastrulación. Los

análisis histológicos muestran que ocurre una importante desorganización de

todos los tejidos internos a lo largo del eje antero-posterior. Estos resultados

concuerdan con los obtenidos en nuestro estudio. Pueden ser explicados por

cambios que se producen a nivel de la expresión proteica luego de la exposición

al litio durante la gastrulación y neurulación, como se ha reportado para

embriones de anfibio (Lazou y Beis, 1993). Por el contrario, cuando los

tratamientos fueron iniciados desde etapas más avanzadas (HH6; igual tiempo

de exposición), los embriones mostraron morfologías similares a los controles

aunque con defectos fácilmente detectables.

a - Efectos del cloruro de litio sobre la neurulación

Durante varias décadas, estudios clínicos y experimentales han demostrado que

la administración a largo plazo de sales de litio causa múltiples efectos

teratogénicos en embriones animales y humanos (Lewicki et al., 2006; Garcia et

al., 2007; Fujii et al., 2007). También se ha observado que el litio resulta

teratogénico y tóxico incluso en adultos (Sharma e Iqbal, 2005; Zarnescu y

Zamfirescu, 2006; Allagui et al., 2006; Tsaltas et al., 2007). Desde el inicio de

estos estudios se ha comprobado que su administración puede causar defectos

cardíacos y cardiovasculares durante el embarazo aún a niveles terapéuticos en

suero (Warkany, 1988; Cohen et al., 1994; Moore et al., 1995). Además, se ha

observado que el litio produce muerte fetal y defectos del esqueleto (Marathe y

Thomas, 1986), anomalías en ojos y oídos (Wright et al., 1971), paladar hendido

(Szabo, 1970) y NTDs (Jurand, 1988; Hansen et al., 1990) durante el desarrollo

de varios animales de laboratorio. En este trabajo pudimos verificar que el litio

causa defectos en la neurulación en el embrión de pollo. A partir de los

tratamientos con las concentraciones más altas utilizadas (60 y 100 mM)

48

logramos observar un desarrollo embriológico retardado con respecto al proceso

de cierre del tubo neural (Jurand, 1988). También ocurrieron malformaciones del

tubo neural presentando expansiones de la placa neural y surcos neurales

ectópicos. En algunos casos embriones cuyos pliegues neurales no lograban

contacto aún en estadios ya avanzados que debían mostrar tubos neurales ya

cerrados. Algunos embriones expuestos también mostraron el neuroporo anterior

más abierto que los embriones control (Grover y Gupta, 2005). Estos resultados

indican que el litio interfiere de alguna forma con el proceso de neurulación

normal (Hansen et al., 1990; Giles y Bannigan, 1997; Grover y Gupta, 2005).

b - Efectos del cloruro de litio sobre la muerte celular

Otro proceso que vimos afectado durante el tratamiento con LiCl fue la muerte

celular. Los embriones expuestos a concentraciones de 100 mM desde HH6 a

HH11 mostraron un aumento en el número de núcleos picnóticos en el

neuroepitelio. Si bien es sabido que el proceso de muerte celular es un requisito

esencial para que el desarrollo embrionario pueda ocurrir con normalidad,

nuestros resultados parecen indicar niveles anormales de este fenómeno que

afectan la neurulación (Greenblatt et al., 2010). Esta observación también es

apoyada por otros autores que afirman que la muerte celular en el neuroepitelio

inducida por litio puede causar NTDs en el ratón (Giles y Bannigan, 1997). Estos

autores observaron que la muerte celular se vuelve evidente en el tubo neural

incluso poco después de iniciado el tratamiento. Estudios similares muestran que

el valproato, otro fármaco utilizado como anti-convulsivo o para tratamiento de

desórdenes bipolares, también puede inducir mecanismos apoptóticos (Umur et

al., 2012). Por el contrario, numerosas investigaciones apoyan la acción

antiapoptótica y neuroprotectora de estos fármacos (Jorda et al., 2000; Hennion

et al., 2002) y trabajos recientes a nivel molecular indican que ambos

compuestos son inhibidores de los factores de stress que inducen apoptosis (Xu

et al., 2003; Zhong et al., 2006; Kappes et al., 2007). Los efectos antagónicos

pro y antiapoptóticos inducidos por este tipo de fármacos dependen, en último

término, de la dosis y del modelo experimental utilizados (Opiela y Ksiazkiewicz,

2006; Song et al., 2002; Zhang et al., 2005) Según estas dos variables el litio

puede ocasionar efectos muy distintos que incluso pueden llegar a ser

49

antagónicos. Por tal motivo es necesario conocer con exactitud los rangos

terapéuticos y tóxicos para cada modelo experimental al que se administren

estas drogas en función de los efectos que se intenten inducir.

c - Efectos del cloruro de litio sobre la somitogénesis

Algunos embriones tratados mostraron somites anómalos y/o en menor número

con respecto a los controles. Esta alteración fue previamente detectada por

Linask y colaboradores (1998) comprobando que la molécula de adhesión N-

cadherina y las cateninas intracelulares son importantes en la segmentación, la

formación de los somites y del compartimento del miótomo. Los embriones de

pollo y ratón que fueron expuestos a LiCl en dicho trabajo también desarrollaron

somites anómalos. En base a esto ellos sugirieron que la señalización mediada

por Wnt podría estar implicada en la formación de grandes clusters de N-

cadherina/catenina, un factor común en las vías de diferenciación del esqueleto

y el músculo cardíaco, donde interfiere el litio.

d - Efectos del cloruro de litio sobre la proteína MARCKS

Desde 1995 ya se había observado que la disrupción completa de la proteína

MARCKS, uno de los más destacados sustratos de PKC, impide el desarrollo

normal del sistema nervioso central en el ratón (Stumpo et al., 1995). A su vez,

se ha demostrado que exposiciones crónicas al litio producen una reducción

significativa de MARCKS en el cerebro (Lenox et al., 1992; Watson and Lenox,

1996). Esta alteración de la expresión de la proteína persiste aún cuando se ha

detenido la administración del mismo y no se observa luego del tratamiento

agudo con litio. Zolessi y Arruti (2001) demostraron que esta proteína posee un

comportamiento particular durante la flexión de la placa neural ya que adopta

una posición apical en las células del neuroepitelio durante este proceso. Si bien

nuestros resultados no muestran efectos del LiCl sobre la localización o

abundancia subcelular de MARCKS, algunos investigadores han documentado

su disminución en el hipocampo de la rata y en la línea celular inmortal de

hipocampo HN33 bajo tratamiento crónico. La disminución máxima se observó

recién a los 7 días de exposición al litio (Lenox et al., 1996). La exposición de

esta línea celular al litio produce una disminución tiempo y dosis dependiente de

50

MARCKS que a su vez depende de la concentración de inositol presente en el

medio (Watson and Lenox, 1996). Los tratamientos realizados en nuestro trabajo

muestran que la proteína se mantiene apicalizada durante la flexión de la placa

neural aún bajo tratamiento con LiCl. Sin embargo, considerando que la

exposición fue a corto plazo (el fármaco estuvo en contacto con los embriones

sólo durante algunas horas) es posible que el tratamiento no haya sido suficiente

para reproducir los efectos descritos por estos autores. Son numerosos los

estudios que han establecido las diferencias entre los tratamientos a corto y

largo plazo con litio. En 1991, Lenox y colaboradores detectaron una reducción

significativa de la fosforilación de MARCKS por parte de PKC en el hipocampo

luego de la exposición crónica al litio. Este fenómeno persistía incluso después

de finalizado el tratamiento pero no ocurría en las exposiciones a corto plazo. La

alteración en la fosforilación de MARCKS se refleja en una reducción en la

fracción soluble del hipocampo. Se plantea una inhibición transcripcional de los

genes Macs como posible explicación de estas observaciones (Wang et al.,

2001).

e - Mecanismo de acción del litio

Los resultados obtenidos en nuestro laboratorio muestran aumento en la

fosforilación de la enzima GSK3β en respuesta a la exposición con la menor

dosis de LiCl utilizada (20 mM). Si bien no llegamos a obtener mediciones de la

enzima para los tratamientos con dosis más altas (donde podría ser aún más

notorio este aumento), existen varios trabajos que reportan la presencia de esta

inhibición. Aunque hasta ahora no se ha dilucidado por completo el mecanismo

de acción del litio, se ha reunido una considerable evidencia acerca de la acción

de este fármaco y sus moléculas blanco. A dosis por encima del rango

terapéutico, los efectos teratogénicos del litio han sido una herramienta útil para

comprender las vías moleculares que regulan la embriogénesis (Martin et al.,

2011). Cabe destacar que la reducción de la proteína MARCKS producida por la

exposición al litio puede revertirse con la adición de inositol al medio (Lenox et

al., 1996). Por más de una década se sostuvo que el mecanismo de acción del

litio consistía en la inhibición de monofosfatasas de inositol y enzimas

relacionadas. Teóricamente, esta inhibición previene el reciclaje de inositol en el

51

cerebro, ya que secuestra el inositol libre requerido para cascadas de

señalización intracelular mediadas por fosfo-inositol (Gould y Manji, 2005). El

litio, al inhibir la enzima inositol-monofosfatasa provoca la depleción del inositol

libre en un sistema en el cual el inositol exógeno no está disponible fácilmente

(Berridge et al., 1989), situación que puede existir en el embrión temprano

debido a su alta tasa de proliferación y metabolismo. Las células que se

enfrentan a esta depleción no son capaces de responder a señales

extracelulares dependientes del ciclo fosfatidilinositol ya que no logran realizar la

transducción de estas señales (Giles y Bannigan,1999). En 1996 se descubrió

que el litio era capaz de inhibir a la enzima GSK3β (Klein y Melton, 1996;

Stambolic et al., 1996) y más tarde se identificó que el efecto ocurría a través de

la competencia por magnesio (Gurvich y Klein, 2002; Ryves y Harwood, 2001).

Este hallazgo llevó a pensar que la inhibición de esta enzima podría jugar un

papel importante en el tratamiento de trastornos bipolares. Desde hace algunos

años se sostiene la hipótesis que la inhibición de GSK3β constituye un blanco

terapéutico relevante en las propiedades estabilizadoras del ánimo del litio. Una

de sus cualidades más notables es la gran cantidad de vías de señalización que

convergen en esta enzima y, más llamativo aún, el número de blancos biológicos

que posee (Frame y Cohen, 2001; Grimes y Jope, 2001b). Las evidencias

reunidas hasta el momento sugieren que el litio reduce el inositol cerebral, inhibe

la actividad de la enzima GSK3β e interfiere en la formación del complejo

Akt·βArr2·PP2A en neuronas cerebrales dopaminérgicas (debido a la inhibición

de GSK3β) a través de la competencia por la unión al magnesio (Beaulieu y

Caron, 2008; O'Brien et al., 2011). Es posible que también afecte las funciones

de las proteínas G de una manera dependiente de magnesio (Srinivasan et al.,

2004). Se ha demostrado que la reducción de MARCKS debida a niveles

terapéuticos crónicos de litio, depende no solo de la concentración relativa de

inositol sino también del estado de activación del receptor, confiriendo la acción

selectiva del litio en el cerebro cuando el inositol es limitado (Watson y Lenox,

1996). Estudios preliminares de Watson y Lenox (1997) han aportado evidencias

que indican una reducción paralela de la proteína MARCKS inducida por litio y

los niveles de ARNm de MARCKS. Estos resultados, junto con otros que apoyan

lo antes mencionado, constituyen una sólida evidencia del rol que PKC juega a

52

largo plazo en la exposición crónica al litio y también sobre la desestabilización

del ARNm de MARCKS (Brooks et al., 1991, 1992; Lindner et al., 1992; Manji y

Lenox, 1994).

53

VI Conclusiones __________________________________________________

Finalmente, y a modo de conclusión, podemos afirmar que hemos puesto a

punto un método sencillo pero muy útil para el estudio de fármacos durante el

desarrollo temprano en el embrión de pollo. Particularmente establecimos una

nueva forma de aplicación de la droga por disolución en el medio de cultivo que

permitió evaluar los efectos del litio sobre el proceso de neurulación. Hallamos

que la acción de este fármaco es dosis, tiempo y estadio dependiente.

Detectamos diversos defectos en el cierre del tubo neural a concentraciones de

60 y 100 mM. También observamos que aparecen defectos en la gastrulación

cuando los embriones son tratados a altas dosis en etapas tempranas.

Asimismo, se detectó un aumento del porcentaje de muerte celular en el

neuroepitelio en ensayos realizados durante la neurulación (100 mM). Si bien ha

sido documentado que el litio reduce los niveles de MARCKS, no hallamos

diferencias en la localización ni abundancia de la proteína en los embriones

tratados con respecto a los controles. Este hecho podría explicarse por la

brevedad de los tratamientos aplicados de LiCl. A lo largo de los años se ha

reunido evidencia sobre los mecanismos que utiliza este fármaco para su acción.

Hoy en día sabemos que reduce el inositol cerebral, inhibe la actividad de la

enzima GSK3β e interfiere en la formación del complejo Akt·βArr2·PP2A a través

de la competencia por unión al magnesio. A partir de aquí debemos profundizar

el conocimento sobre los mecanismos de acción del litio y otras drogas de uso

médico a fin de dilucidar cómo contribuyen al tratamiento de trastornos

convulsivos o bipolares y logran afectar el desarrollo temprano aún a dosis

terapéuticas.

54

VII Materiales y métodos __________________________________________________

i Obtención de embriones

Los huevos de pollo embrionados, gentilmente donados por la avícola Prodhin,

fueron incubados a 37° C con humedad constante hasta los estadios deseados.

Las dataciones de los embriones fueron realizadas de acuerdo a la tabla de

estadios normales de desarrollo del pollo de Hamburger y Hamilton (1951).

ii Cultivo de embriones

Los embriones fueron cultivados, desde estadios tempranos (HH3) a más tardíos

(HH8) y luego del cultivo se volvieron a incubar bajo las mismas condiciones

iniciales hasta el cierre del tubo neural (HH9 a 11). El método de cultivo utilizado

se denomina “EC” (Chapman et al., 2001). Para llevarlo a cabo se retiran los

huevos de la incubadora y se dejan enfriar por 15-30 minutos (min). Luego se

sostiene el huevo con su eje mayor orientado perpendicularmente sobre el borde

de una placa de petri (100 mm) y se realiza una muesca dando golpecitos en la

parte inferior de la cáscara. Se vacía su contenido rompiendo la cáscara a partir

de la muesca. El blastodermo debe quedar posicionado hacia arriba y lo más

centrado posible en la yema; la membrana vitelina debe permanecer intacta. Se

remueve la albúmina gruesa que cubre el blastodermo con papel tisú plegado

apoyándolo sobre el borde del blastodermo y retirando suavemente hacia afuera.

Es crucial remover la albúmina gruesa ya que su presencia impide que la

membrana vitelina se adhiera correctamente al papel de filtro que este método

utiliza para mantener el embrión bajo tensión. La tensión del blastodermo

asegura un correcto desarrollo in vitro. Una vez retirada la albúmina gruesa se

coloca el papel de filtro con una abertura central (cuadrados de 2 x 2 cm con 4

orificios de perforadora parcialmente superpuestos y centrados; Figura 16) sobre

la membrana vitelina, de manera tal que el embrión quede centrado en el orificio.

Con la ayuda de una pinza se hace presión sobre el papel de filtro para lograr

que la membrana vitelina quede firmemente adherida al mismo. Utilizando una

tijera, se procede a cortar esta membrana alrededor del papel, teniendo cuidado

de cortar completamente por todo el perímetro. Se retira cuidadosamente el

55

papel de filtro de la yema en dirección oblicua con una pinza y se limpia la yema

y restos de albúmina que puedan haber quedado unidas. Para finalizar la

limpieza se sumerge y se retira el papel de filtro con el embrión adherido en una

placa de petri que contiene solución salina. Se repite cuidadosamente el

procedimiento las veces que sea necesario para lograr una limpieza óptima. El

paso siguiente consiste en secar el excedente de solución apoyando el papel de

filtro por sus bordes sobre un papel absorbente. Luego se coloca el mismo en

una placa de cultivo sobre un sustrato semi-sólido de agar-albúmina (ver

Apéndice) de forma tal que la parte ventral del blastodermo mire hacia arriba. Se

debe verificar que no haya burbujas entre el embrión y el medio. Las placas de

cultivo se colocan en una cámara húmeda y se llevan a la incubadora a 37° C

con humedad constante hasta que los embriones alcancen los estadios

deseados (Figura 16).

56

Figura 16

57

Figura 16.- Secuencia de eventos en la preparación de embriones para el cultivo EC. A. Se incuban los huevos hasta que alcancen al estadio deseado. Luego se llevan a temperatura ambiente por 15-30 min y se rompen en una placa de Petri. B. Se utiliza papel tisú para sacar cuidadosamente la albúmina gruesa que rodea la yema, dejando el blastodermo lo más limpio posible. C. Se centra el papel de filtro sobre el blastodermo, intentando alinearlo con el eje céfalo-caudal. D. Se corta la membrana vitelina alrededor del papel de filtro. E. Si la albúmina ha sido removida adecuadamente, el papel de filtro quedará pegado a la membrana vitelina luego del corte. F. Se levanta el papel de filtro fuera de la yema en dirección oblicua. G. Se elimina el exceso de yema del papel de filtro con pinzas desde adentro hacia afuera. H. Para remover la mayor cantidad de yema posible puede sumergirse el papel de filtro en solución salina. I. Se coloca el papel de filtro sobre el sustrato semi-sólido de agar albúmina y se cubre con una tapa (K). Se incuban las placas en un recipiente cerrado con humedad constante. J. Como método alternativo para limpiar la membrana vitelina se puede colocar el papel de filtro directamente sobre la placa con el medio de cultivo y lavar la yema con solución salina utilizando una pipeta Pasteur. Se debe eliminar todo el exceso de líquido al finalizar. L. Embrión cultivado 44 horas bajo el método EC, desde el estadio 4 (Chapman et al., 2001).

iii Tratamientos farmacológicos

Los tratamientos fueron realizados sobre embriones de pollo en cultivo utilizando

LiCl. Como control empleamos concentraciones equimolares de cloruro de sodio

en el vehículo correspondiente para esta droga, el agua. Los embriones fueron

fotografiados en microscopio compuesto o lupa estereoscópica una vez

alcanzados los estadios planificados.

Realizamos ensayos preliminares para ajustar el protocolo de tratamiento

farmacológico, particularmente en cuanto a dos parámetros: modo de aplicación

y dosis. Con respecto al modo de aplicación probamos realizarlo directamente

sobre el embrión, en el centro del blastodisco, con mínimos volúmenes (10-20

µL) así como mediante disolución en el sustrato semi-sólido de agar-albúmina

que el método EC utiliza. También ensayamos distintas dosis de LiCl en

embriones en cultivo y determinamos un rango para el cual se obtenían efectos

nulos o leves a severos. Finalmente decidimos realizar los tratamientos con 3

concentraciones distintas dentro de este rango: 20, 60 y 100 mM.

58

iv Cortes a congelación

Cuando los embriones en cultivo, tratados y control, llegaron a los estadios

planeados fueron procesados para la realización de criocortes. Primeramente

fueron fijados por inmersión con PFA al 4% en PBS para inmovilizar y preservar

la estructura interna del embrión. Luego se realizaron 3 lavados (1 h c/u) con el

fin de quitar por completo el fijador y se comenzó con la crioprotección del

material biológico, utilizando soluciones de sacarosa al 4% primero y más tarde

al 20% manteniendo allí los ejemplares hasta que se sumergieron por completo.

Logrado esto, se incluyeron las muestras en un medio de soporte apto para la

realización de criocortes. En esta ocasión se utilizó gelatina al 7.5% (Stern y

Holland, 1993) que luego se colocó en placas de petri de 35 mm junto con los

embriones (pese a ser un método más laborioso es mejor utilizar gelatina como

medio de inclusión para embriones pequeños ya que permite mejor resolución en

las técnicas de inmunomarcación). Los embriones fueron posicionados

correctamente a medida que la gelatina solidificaba y mantenidos a 4°C hasta su

utilización (máximo 6 días). Para los criocortes se tallaron pequeños bloques de

gelatina con una hoja de bisturí y se colocaron sobre la platina del crióstato

utilizando como pegamento el medio de inclusión por congelación OCT Jung.

Los bloques fueron finalmente congelados con nitrógeno líquido de forma

indirecta. El bloque y la platina fueron introducidos en el crióstato previo a la

realización de los cortes para nivelar la temperatura (-24º C). Se realizaron

cortes a congelación transversales de 5-7 μm de espesor en un crióstato

(Cryocut E, Reichert-Jung, Alemania) a -24º C. Los bloques fueron tallados para

que todas las superficies fueran paralelas, facilitando la obtención de cortes que

fueron levantados en portaobjetos previamente lavados y recubiertos con

gelatina crómica (ver Apéndice). Luego de secados, los cortes se almacenaron

en vasos Coplin a 4ºC hasta su posterior utilización para inmunofluorescencia

(máximo 6 días).

v Inmunodetección sobre cortes

Realizamos inmunodetecciones sobre criocortes con distintos marcadores para

observar el neuroepitelio y sus características.

59

Para comenzar la inmunofluorescencia se debe retirar el excedente de gelatina

sobre los portaobjetos que contienen los cortes. Para esto se lava el medio de

inclusión sumergiendo los portaobjetos en un Coplin con PBS durante 20-40 min

(la duración del lavado depende del tiempo de almacenamiento) en un baño a

37° C. A continuación se retiran los portaobjetos, se secan por sus bordes (sin

dejar secar los cortes) y se realizan separaciones con parafina para delimitar los

distintos grupos sobre los cuales se va a realizar la técnica. Luego de 3 lavados

con PBS (2 min c/u) se realiza una post-fijación, para adherir los cortes al

portaobjetos, colocando paraformaldehído al 4% en PBS por 10 min. Siguen 5

lavados con PBS (2 min c/u). Se bloquean los sitios inespecíficos con albúmina

sérica bovina (BSA) al 1% en PBS por 40 min en cámara húmeda a 37° C.

Posteriormente los cortes fueron incubados en presencia del anticuerpo primario

bajo las mismas condiciones. Los anticuerpos primarios utilizados y sus

respectivas diluciones (en BSA al 1% en PBS) se detallan en la Tabla 1. Para la

incubación se utilizaron entre 20 y 40 μL de las diluciones por grupo de cortes,

por encima de los cuales se colocó una lámina de Parafilm para lograr una

distribución homogénea del anticuerpo. En todos los casos se realizaron

controles negativos por omisión del anticuerpo primario. Los anticuerpos que

utilizamos fueron tanto mono- como policlonales. Cada uno cuenta con sus

ventajas y sus desventajas. La mayor ventaja de los primeros es el

reconocimiento monoespecífico, es decir que el anticuerpo reconoce un epítope

único, lo que permite analizar la presencia y la distribución de un antígeno con

gran precisión; los segundos, por el contrario, reconocen una gran multiplicidad

de epítopes. Las aplicaciones posibles también difieren a la hora de su

utilización. La gran desventaja que presentan los anticuerpos monoclonales del

mismo origen es que no permiten realizar dobles marcados en un mismo

preparado. En consecuencia, para analizar cortes con varios anticuerpos

monoclonales debemos realizar cortes seriados, y analizar con un anticuerpo

cada corte, para luego comparar los cortes adyacentes (Blottière et al., 1995;

Nelson et al., 2000).

60

Tabla1.- Anticuerpos primarios. Nombres, diluciones y estructuras que identifican.

Anticuerpos Dilución Estructura que identifican

Polo52 * 1:5000 MARCKS total

5e 1:400 Glicoproteína de unión celular N-CAM

GSK3β 1:10 Enzima GSK3β activa

pGSK3β 1:10 Enzima GSK3β inactiva (fosforilada) * El anticuerpo policlonal de conejo Polo52 fue producido previamente en el laboratorio en colaboración con el Polo Tecnológico de Pando, Facultad de Química, UdelaR y el Institut Pasteur de Montevideo, a partir de proteína MARCKS recombinante de pollo.

Pasado este tiempo se eliminó el excedente de anticuerpo primario realizando 5

lavados con PBS (2 min c/u) y se procedió a la incubación con el anticuerpo

secundario (diluido en BSA al 1% en PBS) en cámara húmeda a 37° C durante

40 min. Se utilizaron 2 anticuerpos secundarios (cabra): anti IgG de conejo

conjugado a Alexa 488 (1:2000) y anti IgG de ratón conjugado a Alexa 546

(1:2000). Luego se lavó el anticuerpo secundario realizando 5 lavados con PBS

(2 min c/u). La contratinción de los núcleos celulares (ADN) se realizó con

Hoechst 33342 (1:8000) en PBS por 10 min y en algunos casos con un marcador

fluorescente de actina F (Faloidina-Texas Red, o Faloidina-TRITC; 1:5000) en

PBS por 20 min. Por último se realizaron 3 lavados finales (2 min c/u) con PBS.

El montaje del cubreobjetos sobre los portaobjetos se realizó con una pequeña

cantidad de glicerol al 50% en PBS y esmalte de uñas incoloro para sellar. Las

preparaciones se almacenaron a -20° C. La observación de los preparados se

efectuó en un microscopio de fluorescencia Nikon Microphot FXA con los juegos

de filtros correspondientes y los mismos fueron fotografiados con una cámara

digital Nikon D70S.

vi Análisis de imágenes

Las imágenes obtenidas en el microscopio de fluorescencia a partir de los

preparados fueron procesadas en el programa Photoshop CS3. La cuantificación

de intensidad de fluorescencia para pGSK3β también fue realizada con este

programa. Las medidas fueron tomadas a partir de un total de 4 embriones (2

controles y 2 tratados con 20 mM de LiCl), utilizando 3 imágenes por embrión

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(cefálica, a nivel del tronco y caudal). Sobre cada imagen se realizaron 10

medidas al azar para un área cuadrada de 50 µm de lado. Se promediaron los

10 valores de intensidad para cada imagen y luego se obtuvo un valor promedio

por embrión. Los valores de intensidad de fluorescencia relativa mostrados en la

Figura 15 corresponden al promedio obtenido a partir de los 2 embriones

tratados con 20 mM de LiCl y los 2 embriones control. Se calculó el desvío

estándar para los dos grupos de embriones tomando todas las medidas

realizadas para cada uno.

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VIII Apéndice __________________________________________________

i Preparación de placas de cultivo EC control y con LiCl

Recolectar albúmina líquida en un vaso de bohemia (romper el huevo por su extremo cónico y eliminar la albúmina gruesa ayudados de una pinza). Preparar solución salina fisiológica para control (0,3 osmolar) y solución para tratamiento farmacológico (LiCl con concentraciones equimolares de sal), llevar a ebullición y colocar el agar agitando hasta que se disuelva. Llevar la albúmina líquida y las soluciones con agar a un baño a 49° C y dejar equilibrar esta temperatura. Mezclar iguales cantidades da ambas preparaciones, revolver y colocar 2 ml de la mezcla en placas de petri de 3,5 cm de diámetro. Dejar reposar a temperatura ambiente hasta que el agar solidifique. Guardar a 4° C hasta su uso (Para más detalles ver Darnell y Schoenwolf, 2000b). ii Soluciones PBS (Eisen): Cloruro de sodio 8 g

Cloruro de potasio 0,2 g Fosfato disódico anhidro 0,912 g Fosfato monopotásico 0,2 g Agua destilada csp 1 L

Paraformaldehído al 3,7 %: Paraformaldehído 7,4 g PBS 200 mL

Disolver el paraformaldehído en PBS y calentando entre 60 y 80°C (no debe

superar este valor) agitando hasta que se diluya por completo y quede transparente la solución. Dejar enfriar y enrasar. Alicuotar y mantener a -20° C hasta su utilización.

Gelatina crómica: Gelatina 0,5 g - Alumbre de cromo 50 mg - Agua destilada csp 100 mL

Diluir el alumbre de cromo en agua calentando sin superar los 60°C. Agregar

suavemente la gelatina con agitación y dejar disolver por completo. Filtrar y guardar a 4° C.

Glicerol al 50% en PBS: Glicerol 500 µL - PBS 5X 200 µL - Agua bidestilada 300 µL

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