El Laboratorio en la Evaluación de las Inmunodeficiencias Primarias
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El Laboratorio en la Evaluación de las Inmunodeficiencias Primarias
El Laboratorio en la Evaluación de las Inmunodeficiencias Primarias
Evaluación de la Inmunidad CelularEvaluación de la Inmunidad Celular
Laboratorio de Inmunología CelularServicio de Inmunología y Reumatología
Hospital Nacional de Pediatría “Prof. Dr. Juan P. Garrahn”
Laboratorio de Inmunología CelularServicio de Inmunología y Reumatología
Hospital Nacional de Pediatría “Prof. Dr. Juan P. Garrahn”
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Mecanismos de defensa
Mecanismos de defensa
Mecanismos Innatos
Mecanismos Innatos
Barreras físicas
Barreras químicasBarreras físicas
Barreras químicas
Celulares: Macrófagos,
Cel Dendríticas, linfocitos NK
Factores solubles ComplementoCitoquinas, Proteínas de fase aguda
Celulares: Macrófagos,
Cel Dendríticas, linfocitos NK
Factores solubles ComplementoCitoquinas, Proteínas de fase aguda
Mecanismos adquiridos
Mecanismos adquiridos
Celulares: Linfocitos T y B
Moleculares: AnticuerposCelulares: Linfocitos T y B
Moleculares: Anticuerpos
Carecen de memoria inmunológica Generan memoria inmunológica
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Células responsables de la inmunidad
innata
Monocito/ Macrófago
Células
natural killer
-Fagocitosis.
-Activación de los linfocitos T
Citotóxicas.
Neutrófilo
Fagocitosis Eliminación de microorganismos: moléculas tóxicas intracelulares
Células Dendríticas
Interdigitadas
-Fagocitosis.
-APC
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Receptor B Receptor T
Respuesta Inmune Específica
Linfocito B Linfocito T
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Bases del Reconocimiento TBases del Reconocimiento T
MHC Class I MHC Class II
Respuesta Inmune EspecíficaRespuesta Inmune Específica
T citotóxicos T colaboradores TH1: IL2, IFN TH2: IL4, IL5
MHCClase I
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Ag
T efectoras T Memoria
Expansión Clonal
Diferenciación
T activadas
Respuesta T
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Inmunodeficiencias PrimariasRelación Deficiencia /Germen
Bact. Virus Parásitos Hongos Micobact.Sistema T X X X X XSistema B X X
Sistema NK XFagoc. PMN X X XFagoc. MN X X XSistema C’ X
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Clasificación de las IDP*
*International Union of Immunological Societies Primary Immunodeficiecy
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Estudio de la Inmunidad CelularEstudio de la Inmunidad Celular
Evaluación cuantitativa y funcional de las distintas células del sistema
inmune.
Nivel INivel I: screening
sencillos.
definir tipo y grado de ID y orientar a la conducta terapéutica
Nivel IINivel II: complejos
requieren especialización en su realización e interpretación
muchos pueden definir el diagnóstico
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Evaluación de la Inmunidad Celular Evaluación de la Inmunidad Celular
Hemograma Recuento linfocitario
Evaluación de sub-poblaciones linfocitarias (Citometría de Flujo)
Evaluación de la respuesta proliferativa in vitro
Determinación de citoquinas ( IL2, IFN, IL4, IL12) Post cultivo con distintos estímulos (ELISA, Citometría de Flujo)
Up-regulación de proteínas post estímulo CD40 L, CD25, ICOS , etc. Citometría de Flujo
Estudios Complementarios
Estudio de señalización intracelularFosforilación proteínas. WB, Citometría de Flujo
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Citometría de Flujo:
permite la medida simultánea de múltiples parámetros de células en suspensión cuando estas encolumnadas en un flujo son incididas por un láser
LASER
Celda de Flujo
Células en suspensión
Células pasan en fila
Punto de interacción
FSCSSC
Fluorescencia emitida de células marcadas
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FSC (Forward scatter) : relacionado con el tamaño de la célula
SSC (Side Scatter) : relacionado con la complejidad interna (granularidad) de la célula
Parámetros de dispersión de luz
Datos obtenidos del Citómetro de Flujo
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FITC
PE
PercP
LáserParámetros de Fluorescencia
Señales emitidas por fluorocromos(Anticuerpos conjugados , colorantes)
Datos obtenidos del Citómetro de Flujo
Total de parámetros por célula: 5 (FSC, SSC, FL1, FL2, FL3)
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SSC (granularidad)
FL1
FL2
FL3
FSC (tamaño)
Láser
Citómetro de Flujo
convertidas en señal electrónica
Procesadas por unsoftware
Señales detectadaspor detectores
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Análisis de datos: Análisis de datos: gráfico de puntos gráfico de puntos
(+ ) verde(- ) rojo
(+ ) verde(+) rojo
(- ) verde(-) rojo
(- ) verde(+) rojo
% de células que expresan un marcador “X”en cada uno de los cuadrantes
I II
III IV
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Leucocitos normales SP
R1
R2
R3
CD45 FITC
PMN
Mo
Lin
Lin
Leucocitos normales SP
Análisis de leucocitos de Sangre Periférica
FSC vs SSC SSC vs CD45
Eo
CD45: Antígeno Común Leucocitario
BasS
SC
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T°amb
oscuridad
Incubación 15´
AdquisiciónLavados Resuspender
Muestra
Técnica estándar de marcacióncon anticuerpos monoclonales
Anticuerpos Monoclonales
Lisante
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MarcadoresTubo FITC PE PerCP
1 CD4 CD8 CD3
2 CD3 CD19 CD45
3 CD3 CD56 CD45
4 CD3 HLA-DR CD45
Panel de anticuerpos monoclonales para identificar
sub poblaciones linfocitarias
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R2
CD3
CD56
CD19
B:24%
T:68%
NK:6%
T:68%
T+ B+ NK 100%
Sub - poblaciones linfocitarias
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R3
56%
39%
37%
CD3:70%
31%
Sub - poblaciones TSeguimiento de pacientes coninfección por VIH
CD4CD4 CD8CD8
CD4CD4
CD3CD3
CD8CD8
DN
DP
Gate de linfocitos
CD3CD3
%CD4 + %CD8 %T%CD4 + %CD8 %T
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Activación T: CD45RO, CD62L, CD95, CD25, CD44Linfocitos T Naive: CD45 RA, CD31Linfocitos T CD8/CD4 memoria / efectores: CD27, CD28, CCR7, CD45RA
Estudio fenotípico de linfocitos T
HLA-DR CD95 CD 25
CD45RO CD45RA CD62L
49% 94% 30%
38%92%78%
LinfocitosT
Linfocitos T CD4+
Características fenotípicas de linfocitos hiper- activados
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Valores normales en pediatríaSub poblaciones linfocitarias
PoblaciónLinfocitaria
Grupo Etario
Cordón 2-6m 6-12m 12-24m 24-36m 36-80m 80-120m
% Linfocitos 66.5(58.5-72.5)
59.8(50.0-64.5)
64.5(59.0-78.0
71.0(62.0-73.5)
67.8(62.5-73.0)
71.5(67.0-75.0)
68.5(65.0-72.0)
% Linfocitos T CD4+ 48.0(40.0-52.0)
48.0(34.5-43.0)
39.5(33.0-47.5)
40.3(32.0-47.5)
37(30.0-40.5)
38.5(33.0-29.5)
34.8(32.0-38.5)
% Linfocitos T CD8+ 27.8(24.3-35.5)
17.0(16.0-20.5)
18.5(16.0-29.0)
20.8(18.0-26.0)
22.8(21.0-24.5)
26.0(22.5-29.5)
28.8(25.0-32.5)
% Linfocitos T CD19+
10.0(8.0-13.0)
28.0(23.0-32.0)
18.0(15.0-30.0)
18.0(15.0-24.0)
16.5(14.0-22.0)
13.5(11.0-18.0)
13.5(10.0-16.0)
% Células NK CD3-/DC16-56+
15.0(8.0-24.0)
11.0(7.0-13.0)
9.0(6.0-14.0)
8.0(5.0-13.0)
10.0(9.0-12.0)
10.0(6.0-14.0)
12.5(10.0-19.0)
%Linficitos TCR + 67.5(56.5-71.5)
57.0(48.5-60.0)
60.0(50.0-75.0)
65.0(59.0-69.0)
62.0(60.0-67.0)
66.0(63.0-68.0)
63.0(54.0-66.0)
%Linficitos TCR + 1.36(1.0-2.0)
2.5(2.0-3.5
2.78(2.0-3.0)
3.52.5-5.5)
4.5(3.0-7.0)
5.0(4.0-7.0)
6.0(5.0-8.0)
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Población
Linfocitaria
Cordón (n=39)
2-6 m (n=16)
6-12 m (n=15)
12-24 m (n=22)
24-36 m (n=14)
36-80 m (n=47)
80-210 m
(n=26)
% Linfocitos CD3/HLA-DR+
1.5
(1.2-3.0)
12.2
(7.9-16.7)
10.8
(5.2-22.2)
14.0
(9.7-22.1)
12.5
(11.1-30.0)
14.9
(9.7-20.6)
12.9
(9.7-17.6)
% CD4/CD45RA+
88.4
(84.7-91.0)
88.6
(84.3-90.2)
85.1
(79.2-91.1)
84.7
(77.1-90.6)
78.5
(75.0-83.3)
73.0
(65.0-80.6)
64.2
(54.8-73.3)
% CD4/CD45RO+
26.5
(16.7-35.0)
21.4
(15.8-31.2)
27.8
(18.2-47.1)
32.2
(21.9-47.4)
34.8
(30.0-41.4)
41.4
(31.8-51.4)
46.4
(39.0-57.1)
% CD8/CD45RA+
93.3
(90.0-95.6)
92.5
(86.0-94.3)
92.3
(86.9-94.4)
92.1
(88.9-95.5)
90.9
(88.0-94.1)
88.9
(81.3-93.1)
84.0
(76.7-90.9)
% CD8/CD45RO+
9.52
(5.3-14.2)
24.3
(13.5-31.5)
17.6
(9.1-38.9)
31.0
(18.8-47.6)
23.8
(16.7-40.0)
36.1
(26.8-43.5)
31.5
(25.0-44.4)
% CD8/CD38+
95.2
(93.1-96.8)
100.0
(100.0-100.0)
96.8
(93.3-100.0)
100.0
(92.0-100.0)
95.5
(92.3-100.0)
94.1
(89.3-100.0)
79.7
(70.1-88.2)
Se muestra mediana % (p25-75)
Hospital de Pediatría Dr. Juan P. Garrahan
activación
memoria
naive
Grupo etario
Valores normales en pediatríaAntígenos de diferenciación/activación
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![Page 25: El Laboratorio en la Evaluación de las Inmunodeficiencias Primarias](https://reader036.fdocuments.co/reader036/viewer/2022081511/568146c6550346895db4025f/html5/thumbnails/25.jpg)
Etiologías de Inmunodeficiencia Combinada Severa
T- B + NK+
T- B + NK-
T- B- NK+
T- B - NK -
Cadena Rc IL7 Cadena CD3Cadena CD3
Cadena c Rc IL2Jak 3CD45
RAG1/ RAG2ArtemisLigasa IV
ADA
Proteína Fenotipo
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Familia de receptores de la cadena común
T- B+ NK-
![Page 27: El Laboratorio en la Evaluación de las Inmunodeficiencias Primarias](https://reader036.fdocuments.co/reader036/viewer/2022081511/568146c6550346895db4025f/html5/thumbnails/27.jpg)
R1 R2
% T : neg % NK: <1%
% B: 99% cultivos linfocitarios: PHA: no prolifera PHA+IL2: no prolifera
paciente SCID con deficiencia de cadena gamma del Receptor de IL2
poblaciones linfocitarias al diagnostico
Proliferaciones linfocitariasPHA: no proliferaPHA +IL2: no prolifera
NK: 0%Linf T: 0%
Linf B: 98%
IDCS : T- B+ NK-
Paciente con deficiencia en la cadena c Paciente con deficiencia en la cadena c
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Diferenciación B: defectos genéticos que la bloquean Diferenciación B: defectos genéticos que la bloquean
X recesivaAR
![Page 29: El Laboratorio en la Evaluación de las Inmunodeficiencias Primarias](https://reader036.fdocuments.co/reader036/viewer/2022081511/568146c6550346895db4025f/html5/thumbnails/29.jpg)
R1 R2
91%
0% 8% 32%
90%
56%
38%
CD3
HL
A-D
R
CD
16&
56
CD
19C
D8
CD4
Fenotipo de paciente con A-gammaglobulinemia de Bruton
Mutaciones en Btk
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Evaluación de la Inmunidad Celular Evaluación de la Inmunidad Celular
Hemograma Recuento linfocitario
Evaluación de sub-poblaciones linfocitarias (Citometría de Flujo)
Evaluación de la respuesta proliferativa in vitro
Hemograma Recuento linfocitario
Evaluación de sub-poblaciones linfocitarias (Citometría de Flujo)
Evaluación de la respuesta proliferativa in vitro
Determinación de citoquinas ( IL2, IFN, IL4, IL12) Post cultivo con distintos estímulos (ELISA, Citometría de Flujo)
Up-regulación de proteínas post estímulo CD40 L, CD25, ICOS , etc. Citometría de Flujo
Estudios Complementarios
Estudio de señalización intracelularFosforilación proteínas. WB, Citometría de Flujo
![Page 31: El Laboratorio en la Evaluación de las Inmunodeficiencias Primarias](https://reader036.fdocuments.co/reader036/viewer/2022081511/568146c6550346895db4025f/html5/thumbnails/31.jpg)
Cultivo de LinfocitosMitógenos: estimulantes policlonales
PHA linfocitos TCon A
PWM linfocito T y BPMA/Io
LPS linfocito BAnticuerpos:Anti-CD3, Anti-CD2: linfocitos TAnti- cadena : linfocitos B
Super Antígenos: 1/5 – 1/50SEB, SEA
Células Alogeneicas: Cultivo Mixto Linfocitario 1/500
Antígenos: 1/10000 – 1/100000Toxoide TetánicoPPDCandidina
Evaluación de la respuesta proliferativa in vitro
72 hs
6 días
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IL2 exógenaFOS
JUN
Activación in vitro del linfocitos T
Anti CD3PHA
Entrecruzamiento de distintos ligandos de superficie por su unión a carbohidratos
PMA
Ionomicina Acciónintracelular
Anti- CD28
SEB /SEAAntígenos
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TIMIDINA 3H Cosechar
incubar 72 hs mitógenos( 6 días Antígenos)
a 37ªC en 5% CO2
5 horas finales del cultivo
Estudio de la proliferación de linfocitos por incorporación de Timidina Tritiada
Obtener CMT a partir de SP por gradiente de Ficoll Hypaque
CMT lavar y ajustar concentración
2 x 106 cel /mlMuestra Ficoll- Hypaque
CMT +Mitógenos/Antígenos
Leer en contador βCuentas emitidas /min
(cpm)Paciente
Control normal
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Valor normal
(cpm) IL2 (cpm)
Medio 2590 15062 150-5851
PHA 53137 54001 93235-186129
SEB 57392 50149 117599*
OKT3 42565 48843 85038-176294
PMA/Io 71611 nr 80223-238517
Medio 2178 nr up to 5000
Candida 709 nr 14850-61814
TT 554 nr 15190-56558
PPD 397 nr 13080-56558
Antígenos
PacienteEstímulo
Mitógenos
Valor normal
(cpm) IL2 (cpm)
Medio 2590 15062 150-5851
PHA 53137 54001 93235-186129
SEB 57392 50149 117599*
OKT3 42565 48843 85038-176294
PMA/Io 71611 nr 80223-238517
Medio 2178 nr up to 5000
Candida 709 nr 14850-61814
TT 554 nr 15190-56558
PPD 397 nr 13080-56558
Antígenos
PacienteEstímulo
Mitógenos
Proliferaciones linfocitarias in vitroExpresión de resultados
Proliferación a Mitógenos alteradasProliferación a Antígenos ausente
![Page 35: El Laboratorio en la Evaluación de las Inmunodeficiencias Primarias](https://reader036.fdocuments.co/reader036/viewer/2022081511/568146c6550346895db4025f/html5/thumbnails/35.jpg)
Evaluación de la Inmunidad Celular Evaluación de la Inmunidad Celular
Hemograma Recuento linfocitario
Evaluación de sub-poblaciones linfocitarias (Citometría de Flujo)
Evaluación de la respuesta proliferativa in vitro
Hemograma Recuento linfocitario
Evaluación de sub-poblaciones linfocitarias (Citometría de Flujo)
Evaluación de la respuesta proliferativa in vitro
Determinación de citoquinas ( IL2, IFN, IL4, IL12) Post cultivo con distintos estímulos (ELISA, Citometría de Flujo)
Up-regulación de proteínas post estímulo CD40 L, CD25, ICOS , etc. Citometría de Flujo
Estudios Complementarios
Estudio de señalización intracelularFosforilación proteínas. WB, Citometría de Flujo
![Page 36: El Laboratorio en la Evaluación de las Inmunodeficiencias Primarias](https://reader036.fdocuments.co/reader036/viewer/2022081511/568146c6550346895db4025f/html5/thumbnails/36.jpg)
Caso clínico: paciente femenina de 16 añosCaso clínico: paciente femenina de 16 años
Eczema generalizadoEczema generalizado•Infecciones respiratorias bajas severas Infecciones respiratorias bajas severas recurrentes / enfermedad pulmonar recurrentes / enfermedad pulmonar crónicacrónica•Diarrea crónica recurrenteDiarrea crónica recurrente•Varicela prolongada / Queratitis por Varicela prolongada / Queratitis por herpes zosterherpes zoster
Endocrinológico: Resistencia a GH. Sindrome tipo LaronResistencia a GH. Sindrome tipo Laron
Inmunológico:
Sospecha diagnóstica: deficiencia de Stat 5bSospecha diagnóstica: deficiencia de Stat 5b
![Page 37: El Laboratorio en la Evaluación de las Inmunodeficiencias Primarias](https://reader036.fdocuments.co/reader036/viewer/2022081511/568146c6550346895db4025f/html5/thumbnails/37.jpg)
Jak2 Jak2 Jak1 Jak3
IL -2GH
ISRE/GAS
EXPRESIÓN GÉNICA
RESPUESTA BIOLÓGICA
Stat5a/b
Stat5a/b
Stat5a/b
P
P
P
Vía de señalización de GH e IL2 Vía de señalización de GH e IL2
Stat5a/b
Stat5a/b
P
![Page 38: El Laboratorio en la Evaluación de las Inmunodeficiencias Primarias](https://reader036.fdocuments.co/reader036/viewer/2022081511/568146c6550346895db4025f/html5/thumbnails/38.jpg)
Fosforilación de Stat 5 a/b mediada por IL2 Fosforilación de Stat 5 a/b mediada por IL2
Fosfo-Stat5
Paciente Normal
M1 M1
51%
MCFI: 20671%
MCFI: 434
![Page 39: El Laboratorio en la Evaluación de las Inmunodeficiencias Primarias](https://reader036.fdocuments.co/reader036/viewer/2022081511/568146c6550346895db4025f/html5/thumbnails/39.jpg)
M1 M1
MCFI: 291MCFI: 443
Stat5
Paciente Normal
Expresión de proteínas Stat 5 a/bExpresión de proteínas Stat 5 a/b
STAT5b
Actina
Normal Paciente
Western Blottcon anti-Stat5b
ausencia
![Page 40: El Laboratorio en la Evaluación de las Inmunodeficiencias Primarias](https://reader036.fdocuments.co/reader036/viewer/2022081511/568146c6550346895db4025f/html5/thumbnails/40.jpg)
Células responsables de la inmunidad
innata
Monocito/ Macrófago
Células
natural killer
-Fagocitosis.
-Activación de los linfocitos T
Citotóxicas.
Neutrófilo
Fagocitosis Eliminación de microorganismos: moléculas tóxicas intracelulares
Células Dendríticas Interdigital
-Fagocitosis.
-APC
8-10% de linfocitos
![Page 41: El Laboratorio en la Evaluación de las Inmunodeficiencias Primarias](https://reader036.fdocuments.co/reader036/viewer/2022081511/568146c6550346895db4025f/html5/thumbnails/41.jpg)
Estudio de las células Natural Killer (NK) en IDP
Cuantificación: citometría de flujo (CD3-CD56+)
Funcionalidad: actividad Citotóxica
Estudio de proteinas citoplasmáticas: perforina, granzimas
Estudio de la degranulación por Citometría de flujo
Búsqueda de mutaciones
![Page 42: El Laboratorio en la Evaluación de las Inmunodeficiencias Primarias](https://reader036.fdocuments.co/reader036/viewer/2022081511/568146c6550346895db4025f/html5/thumbnails/42.jpg)
Célula NK
Célula normal
Célula anormal(maligna /virus)
Célula alogeneica
Perforina granzimas
Sistema de Reconocimiento de la Célula NKReceptores inhibitorios (Killer- inhibitory Rc: KIR)Receptores activadores (Killer activating Rc)
Propio
Pérdida de lo propio
No propio
![Page 43: El Laboratorio en la Evaluación de las Inmunodeficiencias Primarias](https://reader036.fdocuments.co/reader036/viewer/2022081511/568146c6550346895db4025f/html5/thumbnails/43.jpg)
Medida de la Actividad Citotóxica de Células NK
Ensayo de liberación de Cr51
Célula Target: K562 (línea derivada de leucemia mieloide crónica en crisis blástica)
Células Efectoras: Células Mononucleares Totales (CMT)
+ Cr51 Incubar 1 hora a 37°C
K562
a)
b) Se enfrentan cantidades constantes de K562 con cantidades variables de CMT
K562 K562
50:1 25:1 12.5:1 medio tritón
Rel CMT: K562 Liberaciónespontánea
Liberacióntotal
Incubar 4 horas a 37°C
Leer sobrenadante en contador Cpm exp-cpm espontánea Cpm máx- cpm espontánea
x100
K562K562 K562 K562
![Page 44: El Laboratorio en la Evaluación de las Inmunodeficiencias Primarias](https://reader036.fdocuments.co/reader036/viewer/2022081511/568146c6550346895db4025f/html5/thumbnails/44.jpg)
Caracteristicas clínicas
Pt 1 Pt 2 Pt 3 Pt 4 Pt 5 Pt 6
Age (months) 13 35 1 4 3 120
Sex F F F F F M
Fever + + + + + +
Splenomegaly + + + + + +
Liver function Cholestasis, altered
enzymes, hepathomegal
y
hepathomegaly Altered enzymes,
hepathomegaly
hepathomegaly
Cholestasis,hepathomeg
aly
Cytopenia + + + + + +
HypertriglyceridemiaHypofibrinogenemia
+182
++
++
ND+
Hemophagocytocis
ND ND + + ND +
Other CNS involvement
Cervical lymphadenopat
hy
CNS involvement, Adenopathy
CNS involvement
CMV infection
EBV infection
Treatment BMT BMT HLH-2004 HLH-2004 HLH-2004 HLH-2004.
NK leukemia
Outcome Alive Alive Dead Alive Alive Alive
Linfohistiocitosis Hemofagocítica
Fiebre-hepato-esplenomegalia-pancitopenia- hemofagocitosis
![Page 45: El Laboratorio en la Evaluación de las Inmunodeficiencias Primarias](https://reader036.fdocuments.co/reader036/viewer/2022081511/568146c6550346895db4025f/html5/thumbnails/45.jpg)
Linfo-histiocitosis hemofagocítica familiar
PerforinaDeficiencia Munc 13-4
Sintaxina 11 STXBP2
![Page 46: El Laboratorio en la Evaluación de las Inmunodeficiencias Primarias](https://reader036.fdocuments.co/reader036/viewer/2022081511/568146c6550346895db4025f/html5/thumbnails/46.jpg)
Eventos de señalización :
De-granulación en linfocitos T citotóxicos
Perforina
![Page 47: El Laboratorio en la Evaluación de las Inmunodeficiencias Primarias](https://reader036.fdocuments.co/reader036/viewer/2022081511/568146c6550346895db4025f/html5/thumbnails/47.jpg)
% liberación de Cr
Relación CMT : K562
25 : 1 12,5 : 1 Control Normal 24% 20%
Paciente 1% 2%
Cpm experimento - cpm espontánea Cpm máxima - cpm espontánea
x100
Paciente con Clínica de Síndrome Hemofagocítico
Células NK:5% (en total de CMT)
Búsqueda expresión de perforina. (CF) defectos de degranulación (CF)
defecto molecular (Biol. Mol.)
Actividad NK ausente
![Page 48: El Laboratorio en la Evaluación de las Inmunodeficiencias Primarias](https://reader036.fdocuments.co/reader036/viewer/2022081511/568146c6550346895db4025f/html5/thumbnails/48.jpg)
Células responsables de la inmunidad
innata
Monocito/ Macrófago
Células
natural killer
-Fagocitosis.
-Activación de los linfocitos T
Citotóxicas.
Neutrófilo
Fagocitosis Eliminación de microorganismos: moléculas tóxicas intracelulares
Células Dendríticas Interdigital
-Fagocitosis.
-APC
Mecanismos independiente del O2
Mecanismos dependiente del O2
Mecanismos de defensa bacterias intracelularesdependiente de IFN gamma
![Page 49: El Laboratorio en la Evaluación de las Inmunodeficiencias Primarias](https://reader036.fdocuments.co/reader036/viewer/2022081511/568146c6550346895db4025f/html5/thumbnails/49.jpg)
Estudio de la respuesta inmune innataEstudio de la respuesta inmune innata
Nivel I:Nivel I:
Estudio cuantitativo: - Granulocitos y monocitos/mm3.
- Moléculas de adhesión : CD11, CD15, CD18.
Estudio funcional: Mecanismos microbicidas O2 dependientes: NBT, DHR, Quimioluminiscencia.
Nivel II:Nivel II:
Estudio funcional: - movilidad de fagocitos (leucotaxis)
- actividad bactericida.
- evaluación de la vía de transducción de señales del IFN- e IL-12.
Estudio cuantitativo-funcional: Actividad enzimática de MPO, G6PD.
Estudio molecular: búsqueda de mutaciones en genes asociados con IDP de fagocitos (je.: CYBB, CYBA, p47phox, p67phox, elastasa,
etc.)
FagocitosFagocitos
![Page 50: El Laboratorio en la Evaluación de las Inmunodeficiencias Primarias](https://reader036.fdocuments.co/reader036/viewer/2022081511/568146c6550346895db4025f/html5/thumbnails/50.jpg)
CD 18 CD11b
CD15
pacientepaciente
normalnormal
Expresión de moléculas de adhesión en neutrófilos
Deficiencia de moléculas de Adhesión
Gate en neutrófilos
CD18 / CD11aDeficiencia de integrina β2 CD18 / CD11b CD18 / CD11c
Deficiencia de moléculas CD15 fucosiladas (Sialil- Lewis X)
LAD 1
LAD 2
![Page 51: El Laboratorio en la Evaluación de las Inmunodeficiencias Primarias](https://reader036.fdocuments.co/reader036/viewer/2022081511/568146c6550346895db4025f/html5/thumbnails/51.jpg)
Enfermedad Granulomatosa CrónicaEnfermedad Granulomatosa Crónica
Enfermedad genéticamente heterogénea Infecciones recurrentes por bacterias y hongos y formación desregulada de granulomas. Defecto en la NADPH oxidasa responsable en los fagocitos del estallido respiratorio y la generación productos microbicidas.
gp91
gp 22
P67
phox
rac1
P47phox
Complejo NADPH oxidasa
Lig X60%
Aut Rec
~5%
~30%
<5%
p40
![Page 52: El Laboratorio en la Evaluación de las Inmunodeficiencias Primarias](https://reader036.fdocuments.co/reader036/viewer/2022081511/568146c6550346895db4025f/html5/thumbnails/52.jpg)
gp91Citocromo b558
gp 22
Bacteria
FagosomaFagosoma
Citoplasma
Señal de Activación
P47phox P67
phoxrac1
gp91
gp 22
P67
phox
rac1
P47phox
Complejo NADPH oxidasaComplejo NADPH oxidasa
NADPH+2
NADP + 2 H+
2e
Membrana plasmática
O2
Anión superóxido
Mecanismo de muerte bacteriana por activación de NADPH oxidasa Mecanismo de muerte bacteriana por activación de NADPH oxidasa
O2 -
p40
p40
H2O2 + Cl- HOClMPOMPO
![Page 53: El Laboratorio en la Evaluación de las Inmunodeficiencias Primarias](https://reader036.fdocuments.co/reader036/viewer/2022081511/568146c6550346895db4025f/html5/thumbnails/53.jpg)
gp91Citocromo b558
gp 22
Señal de Activación Estímulo con PMA
P47phox P67
phoxrac1
gp91
gp 22
P67
phoxrac1
P47phox
Complejo NADPH oxidasa
NADPH+2
NADP + 2 H+
2eO2
Anión superóxido
O2 -
H2O2
DHR RodaminaMPO?
p40
p40
Medida del Estallido Respiratorio en Neutrófilospor Citometría de Flujo
Medida del Estallido Respiratorio en Neutrófilospor Citometría de Flujo
![Page 54: El Laboratorio en la Evaluación de las Inmunodeficiencias Primarias](https://reader036.fdocuments.co/reader036/viewer/2022081511/568146c6550346895db4025f/html5/thumbnails/54.jpg)
CONTROL NORMAL PACIENTE
RodaminaRodamina
Estallido respiratorio en neutrófilos medido por oxidación de dihidrorodamina123 (DHR) a rodamina
Estallido respiratorio en neutrófilos medido por oxidación de dihidrorodamina123 (DHR) a rodamina
Diagnóstico de EGCmutación en gp91 fox
Ausencia de Estallido Respiratorio
Estallido Respiratorionormal
Muestra
SE
Lisante
CLNH4
Lavar DHRDHR
5’ 37°C
Tubo basalPBS
Tubo basalPBS
Tubo estimuladoPMA
Tubo estimuladoPMA
20’ 37°C
BasalEstimulado
![Page 55: El Laboratorio en la Evaluación de las Inmunodeficiencias Primarias](https://reader036.fdocuments.co/reader036/viewer/2022081511/568146c6550346895db4025f/html5/thumbnails/55.jpg)
AislamientoAislamiento
EvoluciónEvolución
TratamientTratamientoo
Infección Infección diseminadadiseminada
PresentacióPresentaciónn
Enf. Enf. RegionalRegional
Edad / SexoEdad / Sexo
P3P3
Biopsia axilar, Biopsia axilar, hemocultivo, hemocultivo, coprocultivocoprocultivo
Lav. gástricoLav. gástrico
Ganglio distalGanglio distal
Biopsia Biopsia axilar, axilar,
Lav. gástricoLav. gástrico
Ganglio Ganglio distaldistal
Ganglio Ganglio regional regional Ganglio distalGanglio distal
Secr. Secr. bronquialbronquial
Sin Sin enfermedadenfermedad
InfecciónInfección
persistentepersistente
Infección Infección
persistente persistente por 13 años. por 13 años. Actualmente Actualmente sin sin enfermedadenfermedad
Anti TBCAnti TBC
IFNIFNrr
Anti TBCAnti TBC
IFNIFNrr
Anti TBCAnti TBC
IFNIFNrr
8 meses8 meses 17 meses17 meses2 años2 años
1 mes1 mes 3 meses3 meses6 meses6 meses
4 años/ fem4 años/ fem 3 años/ 3 años/ femfem
15 15 años/mascaños/masc
P2P2P1P1
Pacientes con infección por BCG o MNTPacientes con infección por BCG o MNT
![Page 56: El Laboratorio en la Evaluación de las Inmunodeficiencias Primarias](https://reader036.fdocuments.co/reader036/viewer/2022081511/568146c6550346895db4025f/html5/thumbnails/56.jpg)
Monocito – MacrófagoCel Dendrítica
Linfocito Th1Célula NK
IFN
IL12
p35p40
Bacteria
IFN R1
IFN R2
IL 12 R1
IL 12 R2
Inmunidad mediada por células contra bacterias intracelularesVía IFN / IL12
TNF
TLR
Tyk2
Stat1
Jak2
![Page 57: El Laboratorio en la Evaluación de las Inmunodeficiencias Primarias](https://reader036.fdocuments.co/reader036/viewer/2022081511/568146c6550346895db4025f/html5/thumbnails/57.jpg)
Rc. de IL12 (IL23 ) R 1
Stat 1
IL12 p40 (IL23)
R1 Rc. de IFN
R2
Defectos moleculares del eje IFN - IL12/23que dan susceptibilidad a Micobacterias
Nemo (LZ)
![Page 58: El Laboratorio en la Evaluación de las Inmunodeficiencias Primarias](https://reader036.fdocuments.co/reader036/viewer/2022081511/568146c6550346895db4025f/html5/thumbnails/58.jpg)
TyK2
Vía de señalización del Receptor de IL12Vía de señalización del Receptor de IL12
IL12
R2
IL12
R1
p35 p40
Jak2
Stat 4P
Stat 4
Stat 4PP
Stat 4
Stat
4
P
núcleo
IFN
IL12
IFN
![Page 59: El Laboratorio en la Evaluación de las Inmunodeficiencias Primarias](https://reader036.fdocuments.co/reader036/viewer/2022081511/568146c6550346895db4025f/html5/thumbnails/59.jpg)
M1M1
negative
+ IL12 + IL12 + IFN alpha + IFN alpha
M1M1 M1
Funcionalidad del Receptor de IL12:Fosforilación de Stat4
Funcionalidad del Receptor de IL12:Fosforilación de Stat4
Control NormalControl Normal
Paciente con función alteradaPaciente con función alterada
Stat 4-PStat 4-P
![Page 60: El Laboratorio en la Evaluación de las Inmunodeficiencias Primarias](https://reader036.fdocuments.co/reader036/viewer/2022081511/568146c6550346895db4025f/html5/thumbnails/60.jpg)
Expresión de CD 212 ( cadena 1 Rc. IL12) blastos PHA de 72hs
Expresión de CD 212 ( cadena 1 Rc. IL12) blastos PHA de 72hs
CD 212CD 212
70%
R1
M1
0%0%
Paciente
Normal
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Muchas Gracias….
Laboratorio de Inmunología CelularServicio de Inmunología y Reumatología
Hospital Nacional de Pediatría “Prof. Dr. Juan P. Garrahn”
Laboratorio de Inmunología CelularServicio de Inmunología y Reumatología
Hospital Nacional de Pediatría “Prof. Dr. Juan P. Garrahn”
Dr. Jorge RossiBioq. Andrea Bernasconi
Tec. Marianela Sanz