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SUPLEMENTO. PORCINO

Limitaciones en eldiagnóstico del SRRP (y II)

Cinta Prieto SuárezDpto. de Sanidad Animal.Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense de Madrid

En nuestra anterior entrega (Mundo Ganadero n°198, mayo 2007), se repasó en quésituaciones era recomendable para el diagnóstico del SRRP en una explotación, optar por ladeterminación de la presencia del agente causal (diagnóstico etiológico) o bien por ladetección de los anticuerpos específicos inducidos por éste (diagnóstico serológico). Acontinuación, se abordan las limitaciones de cada uno de estos métodos.

A

grandes rasgos podemos hacer, tal y como sedescribió en la primera parte de este artículo, unadivisión entre los sistemas de diagnóstico quedeterminan la presencia del agente causal delSíndrome Reproductor y Respiratorio Porcino

(SRRP), el virus SRRP (VSRRP) o diagnóstico etiológico, ylos sistemas que detectan la infección de forma indirecta,midiendo el desarrollo de anticuerpos específicos frente alvirus o diagnóstico serológico.

¿Qué limitaciones tiene el diagnóstico etiológicodel SRRP?La determinación de la presencia del VSRRP en muestras clí-nicas puede aportar información valiosa, pero hay que tenerpresente que existen distintos métodos y que todos ellos tie-nen ventajas e inconvenientes.

Una forma irrefutable de diagnosticar la enfermedad con-siste en realizar el aislamiento e identificación del agente cau-sal. Sin embargo, este sistema no se utiliza más que con finesexperimentales dado que es necesario un equipamiento y unaexperiencia de la que no disponen la mayoría de los laborato-rios de diagnóstico.

Otra forma de determinar la presencia del virus en mues-tras clínicas consiste en el empleo de tinciones inmunológicasque se pueden utilizar para determinar la presencia del virusen cortes histológicos de tejidos como el pulmón o distintosórganos linfoides. Aunque existen distintos procedimientos,las técnicas más utilizadas son la inmunohistoquímica y lahibridación in situ. Estas dos técnicas tienen la ventaja deque permiten evaluar la presencia de lesiones histológicas ala vez que se determina la presencia del virus, además de

poder utilizarse en estudios retrospectivos al realizarse sobretejidos fijados con formalina y embebidos en parafina. Suprincipal limitación es la sensibilidad, que es relativamentebaja, sobre todo en el caso de la inmunohistoquímica.Además, es necesario contar con un equipamiento específicoy experiencia para interpretar los resultados de las tinciones.Esta circunstancia, unida al hecho de que no es posible auto-matizar, ni simplificar la lectura de las tinciones, limita consi-derablemente su utilización en la práctica.

La técnica más utilizada en los laboratorios de diagnósti-co, y sin lugar a dudas la más familiar para los veterinarios decampo, es la transcripción inversa (RT) y reacción en cadenade la polimerasa (PCR), primero sencilla y posteriormenteanidada (RT-nPCR). Sin embargo, a pesar de utilizarse deforma rutinaria en el diagnóstico, en muchos casos se desco-nocen las utilidades, y sobre todo las limitaciones, reales dela técnica. Para obtener resultados fiables y aplicativos debe-mos tener en cuenta una serie de condicionantes entre losque destacan los relacionados con la patogenia de la infec-ción y la selección de las muestras, y los relacionados con lascaracterísticas inherentes a la técnica, fundamentalmente lasensibilidad y la especificidad.

Patogenia de la infecciónEn primer lugar, para obtener unos resultados adecuados,debemos conocer la patogenia de la infección por este virus yla distribución del mismo en los diferentes órganos y tejidos,ya que la selección de las muestras inadecuadas nos puedellevar a un diagnóstico incorrecto. La muestra más fácil deobtener, y sobre la que se realiza esta técnica con mayor fre-cuencia, es el suero. Sin embargo, es evidente que la determi-

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Un resultado negativocon RT-PCR debe tomarse conprecaución ya que, aunque elvirus no esté presente en elsuero, puede encontrarse en

otras localizaciones

nación del virus sobre estamuestra se limitará al perio-do de viremia, que tiene unaduración media de 2-3 sema-nas en los animales adultos y4-5 semanas en los animalesen crecimiento (Prieto yCastro, 2005). Pasado estetiempo, las muestras de suerodarán un resultado negativosin que esto signifique que elvirus no está presente en losanimales estudiados. Por elcontrario, la presencia delVSRRP en distintos órganosserá posible durante periodosmás prolongados de tiempo,sobre todo si consideramosmuestras de órganos del sistema I infoide y particularmentenódulos linfáticos o tonsilas. En estas localizaciones se ha lle-gado a determinar la presencia del virus durante periodos demás de 8 meses (Wills et al, 2003). Esta dinámica de infec-ción ha planteado importantes problemas de diagnósticopara la determinación de los animales portadores ya que,pasado el periodo inicial de viremia, que por otra parte esrelativamente corto en los animales adultos, se hace práctica-mente imposible determinar si un animal vivo es portador delvirus o no.

En su conjunto, todos estos datos indican que la obtenciónde un resultado positivo mediante RT-PCR indicará que unanimal está infectado, mientras que la obtención de un resul-tado negativo debe tomarse con mucha precaución ya que,aunque el virus no esté presente en el suero de los animales,puede encontrarse en otras localizaciones y, potencialmente,eliminarse e infectar a otros animales. Es decir, un resultado

negativo no garantiza que losanimales estudiados esténlibres del virus. La únicaexcepción la constituirían losanimales seronegativos pro-cedentes de granjas libres dela enfermedad. Por el contra-rio, los animales seronegati-vos procedentes de granjaspositivas podrían ser porta-dores, ya que se ha descrito lapresencia del virus en losórganos linfoides después deldescenso de los anticuerpospor debajo de los nivelesdetectables por ELISA.Aunque este fenómeno esinfrecuente, ya que normal-

mente los anticuerpos tienen una duración superior al perio-do en que los animales son portadores, hay que tener encuenta que es posible y que puede tener implicaciones epide-miológicas importantes.

Selección de muestras para realizar la técnicade RT-PCR

• Enfermedad reproductiva. Cuando se quieren diagnosti-car brotes de la enfermedad en su forma reproductiva lasmejores muestras son las procedentes de animales naci-dos débiles, ya que este tipo de animales suelen nacerinfectados, portan en virus en distintos órganos y perma-necen virémicos durante periodos prolongados de tiem-po. Por el contrario, no es conveniente utilizar muestrasprocedentes de fetos abortados ya que la muerte de losfetos tras la infección hace que comiencen los procesosde autolisis, los cuales conducen rápidamente a la degra-

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dación del virus y su ácido nucleico, lo que puede darlugar a un falso negativo en los análisis.

• Muestras de semen. El virus se puede eliminar en elsemen durante periodos muy prolongados de tiempo,habitualmente de forma intermitente. El problema es queesta eliminación no se puede prever, ni hay ningún indi-cador fiable de la misma, de forma que sólo la determina-ción directa del virus en cada eyaculado permite descar-tar la presencia del VSRRP. Por tanto, un resultado nega-tivo en un verraco seropositivo, sólo indica que esa mues-tra probablemente está libre del virus, pero no indica loque pueda pasar con otros eyaculados de ese mismoverraco.

Características de la RT-PCRAunque generalmente se admite que una de las principalesventajas de la RT-PCR es su elevada sensibilidad, se trata deuna técnica que no está estandarizada entre laboratorios. Esdecir, cada laboratorio hadesarrollado una técnica deforma independiente a otros yesto hace que tanto la sensibi-lidad como la especificidadsean muy variables. En la sen-sibilidad intervienen distintosaspectos, entre los que desta-can el sistema de aislamientodel ARN a partir de la mues-tra biológica, el diseño de loscebadores que se utilizanpara la amplificación delácido nucleico y las condicio-nes de la reacción. Esto haceque existen diferencias muysignificativas en la sensibili-dad que obtiene cada laboratorio. Sirva como ejemplo un tra-bajo muy reciente en el que se han comparado los resultadosobtenidos sobre las mismas muestras en distintos centros dediagnóstico (Truyen et al, 2006). En conjunto, sólo el 80% delas muestras fueron diagnosticadas correctamente, variandola frecuencia de falsos resultados entre el 0% y el 43,33% conuna mayor incidencia de problemas de sensibilidad que deespecificidad. Estos datos son bastante reveladores e indicanque un resultado negativo no siempre es garantía de la ausen-cia del virus. Además, la costumbre de mezclar varias mues-tras en un solo análisis para abaratar los costes hará máspatente la falta de sensibilidad ya que partimos de una canti-dad menor de cada una de las muestras en origen. Por tanto,un resultado negativo indica que el laboratorio no ha determi-nado la presencia de virus en la muestra, lo cual no garantizatotalmente que la muestra esté libre de virus.

¿Qué limitaciones tiene el diagnóstico serológicodel SRRP?La alternativa al diagnóstico etiológico es el serológico. Sinembargo, también en este caso hay limitaciones que se debentener en cuenta.

Dinámica de aparición de anticuerposDado que vamos a determinar la presencia de anticuerposespecíficos debemos saber cuál es la dinámica de aparición de

los mismos, que dependerá del tipo de anticuerpo que estemosdetectando. Las IgM son inmunoglobulinas de aparición rápi-da pero que se mantienen durante periodos cortos de tiempo.Así, es posible determinar su presencia desde aproximada-mente el día 5 post-infección (pi) y hasta la tercera o cuartasemana pi. De aparición algo más tardía son las IgG, que sonel tipo de inmunoglobulinas que detectan la mayoría de loskits empleados rutinariamente en los laboratorios de diagnós-tico. Estas inmunoglobulinas pueden detectarse en un númerosignificativo de animales a partir del día 9-10 pi en infeccionesexperimentales, siendo todos los animales seropositivos a par-tir del día 20-21 pi. Sin embargo, hay indicios de que los ani-males infectados de forma natural en el campo pueden tardaralgo más en desarrollar anticuerpos específicos y se consideraque la seroconversión se produce entre 2 y 3 semanas despuésde la exposición al virus. La duración de estos anticuerpos esmuy variable ya que dependerá de factores individuales y de latécnica de diagnóstico que se utilice. Como media, se puede

considerar que el título máxi-mo de anticuerpos se alcanza-rá aproximadamente 3-4semanas después de la sero-conversión y que los animalesserán seropositivos duranteun periodo de al menos 4-6meses. Finalmente, la apari-ción de cantidades significati-vas de anticuerpos neutrali-zantes es más tardía y, aunqueen títulos muy bajos, se pue-den detectar a partir del día 9pi en infecciones experimen-tales. El título máximo sealcanza como media en tornoa los dos meses pi, deseen-

diendo después paulatinamente y detectándose títulos muybajos durante periodos prolongados.

En el diagnóstico, la utilización conjunta de técnicas quepermitan la detección de distintos tipos de anticuerpos puedeayudar a determinar en qué momento pi nos encontramos(Kolb, 1996). Por ejemplo, la determinación conjunta de IgMe IgG nos puede ayudar a determinar si estamos ante unainfección aguda, que se caracterizará por la presencia de IgMo ante una infección más antigua, en la que sólo detectaremosIgG.

Sensibilidad y especificidad de las técnicasLa limitación más importante de la serología guarda relacióncon la sensibilidad de las distintas técnicas. Para el diagnósti-co de la infección por el VSRRP se han desarrollado distintossistemas que incluyen la inmunofluorescencia indirecta, muyutilizada en Estados Unidos, sobre todo en los primeros añostras la aparición de la enfermedad, la inmunoperoxidasa enmonocapa, utilizada en Europa de la misma forma que lainmunofluorescencia indirecta en Estados Unidos, y técnicasinmunoenzimáticas (ELISA).

Tanto la inmunofluorescencia como la inmunoperoxidasaen monocapa tienen como principal limitación la capacidadpara detectar anticuerpos frente a cepas distintas de aquellaque provocó su desarrollo. Es decir, la alta variabilidad delvirus hace que exista poca reactividad cruzada entre cepas.

La serología tiene valor paradeterminar si una granja está

infectada o no, pero tiene escasovalor para predecir qué

individuos dentro de una granjaestán infectados

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Esto tiene implicaciones prácticas muy importantes en eldiagnóstico ya que podemos obtener falsos negativos conmucha frecuencia en un virus como éste, que presenta unaelevada variabilidad antigénica.

En el caso de las técnicas de ELISA, éstas están estandari-zadas y comercializadas, de forma que los resultados que sepueden obtener con el mismo kit en diferentes laboratorios seasume que son similares. Sin embargo, como cada kit de diag-nóstico utiliza diferentes antígenos para tapizar las placas,existen diferencias importantes en los resultados obtenidoscon los distintos kits disponibles en el mercado, aún en elmismo laboratorio, como el mismo personal y las mismasmuestras. Mateu et al (2007) han determinado recientementela existencia de diferencias significativas en la clasificación delos sueros como positivos o negativos a título individual,hasta el punto de oscilar el porcentaje de positividad entre el36,3% y el 63,9% en un estudio en el que se comparaban tresELISA comerciales para determinar la presencia de anticuer-pos frente al VSRRP.

Como resumen, se puede decir que la serología tiene valorpara determinar si una granja está infectada o no, pero tieneescaso valor para predecir qué individuos dentro de una gran-ja están infectados. Además, cuando se quiere hacer un segui-miento de una granja o grupo de animales se debe utilizarsiempre el mismo kit de diagnóstico.

Aún más conflictiva es la determinación de IgM ya que eneste caso unimos a las diferencias individuales y entre reacti-vos, el hecho de que las IgM tienen de forma natural una

especificidad mucho menor que las IgG, por lo que existe unriesgo elevado de resultados erróneos, tanto por falsos positi-vos como por falsos negativos.

Además, otro error muy frecuente consiste en la "sobrein-terpretación" de los resultados de la serología. Hay que tenerclaro que un valor de S/P ratio (Sample to Positive ratio) noindica el título de anticuerpos presente en un suero en parti-cular, por lo que la utilización de este valor para determinar eltítulo de anticuerpos e incluso para "adivinar" el momento enque se ha producido la infección es un error, ya que por unlado existe una gran variabilidad individual en la capacidad derespuesta de los animales a la infección por este virus, y porotro, los resultados del propio análisis pueden variar en lasdistintas determinaciones y los distintos lotes del kit comer-cial, lo que invalida la comparación de muestras obtenidas enmomentos diferentes y analizadas en días distintos.

Otras limitacionesOtras dos limitaciones importantes de la serología son quepor un lado no nos permite determinar el grado de protecciónque tienen los animales, ya que se ha demostrado que no exis-te ninguna correlación entre la cantidad de anticuerpos tota-les que presenta un individuo y su protección frente a reinfec-ciones y por otro no nos permite diferenciar los animalesvacunados de los animales infectados, ya que no existen vacu-nas marcadas en el mercado. Ambas cosas en conjunto limi-tan el valor de la serología para determinar el grado de protec-ción de una población. •

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