Fernando A. Osorio Nebraska Center for Virology and School of Veterinary

Medicine and Biomedical Sciences University of Nebraska-Lincoln

“El PRRSV vs. el Cerdo: Dinámica de la Infección Individual"

“Simposio Internacional de PRRS México 2012, Ayer, Hoy y Mañana”

Octubre 1y 2, 2012 FMVZ-UNAM

Tony Goldberg William L Laegreid Osvaldo Lopez Fernando Osorio Asit Pattnaik Federico Zuckermann

Esta plática incluirá trabajos resultantes de colaboración entre dos ó más de los siguientes laboratorios:

Vacunas PRRSV:

•  Vacunas muertas •  Vacunas a virus vivo modificado (MLVs)

Son el tipo de vacuna contra PRRSV más eficaz

Buena protección contra infección homologa

( ~ 100%, “inmunidad esterilizante”)

Menor eficacia en caso de infección heterologa (50 al 80%)

• Aislamientos iniciales de PRRSV:1991/1992 • Vacunas de PRRSV han estado en uso desde1994!

ineficaces

•  Dos genotipos: I: Europeo II: Norte Americano

•  Gran diversidad intra-genotipo

•  Multiple variantes de PRRSV •  Dentro de una misma granja •  Dentro de un mismo animal

Stadejek et al., 2006; Goldberg et al. 2003; Kapur et al. 1996.

El Mayor Obstáculo para el Desarrollo de Vacunas Eficaces X PRRSV :

Diversidad Genetica /Antigenica del PRRSV

1.0E+03

1.0E+04

1.0E+05

1.0E+06

4dpi 7dpi 10dpi 14dpi

Vir

al lo

ad (c

opie

s/m

l)

Days of experiment

MLV KV/ADJ Control

MLV

Ctrl

KV/ADJ

(Zuckermann et al 2007)

Detection level qPCR 103RNA mols per ml

Ejemplo de la eficacia de una MLV X PRRSV, desafio homologo Viremia post-desafio, PRRSV Tipo I

Esto significa inmunidad esterilizante Generada por la MLV

Viremia en el grupo vacuna muerta

Viremia en los controles

Viremia Treatment Animal Day 32 Day 35 Day 38 Day 42

21817 7.20E+03 8.40E+03 2.90E+04 2.14E+04 61212 7.16E+02 7.60E+03 5.19E+04 1.66E+03 61127 5.38E+04 0 1.77E+04 0 11679 1.95E+03 5.03E+04 4.71E+05 1.62E+04 61151 1.95E+04 9.66E+04 7.29E+04 6.49E+04 21828 4.56E+04 1.25E+03 2.50E+05 0 11633 2.80E+04 6.61E+06 1.12E+05 0 11677 4.00E+05 8.36E+03 4.13E+05 0 21839 1.69E+04 4.78E+04 7.71E+03 4.54E+02

KV/ADJ

61136 5.35E+04 1.33E+04 0 0 61126 0(*) 0 0 0 21826 0 0 0 0 21827 0 0 0 0 21815 0 0 0 0 11680 0 0 0 0 61150 0 0 0 0 21816 0 0 0 0 21823 0 0 0 0 61154 0 0 0 0

MLV

21814 0 0 0 0 61137 1.39E+06 1.55E+04 4.74E+04 4.60E+03 11676 7.75E+04 2.41E+06 5.28E+05 2.10E+03 21813 1.32E+06 2.59E+03 0 3.81E+05 61124 8.89E+04 1.80E+04 1.25E+05 1.21E+03

Control

21864 8.49E+04 3.95E+04 2.27E+04 2.57E+04

2006 Prueba de eficacia vacunas PRRSV : Carga viral(viremia) post-desafio

(PRRSV-Lelystad)

Inmunidad Esterilizante

muerta

MLV

controles

V IRAL BURDEN IN TISSUES (RNA copies/g ) Treatment Animal

Lung Tonsil 21817 9.80E+06 1.23E+06 61212 2.36E+03 1.26E+06 61127 2.86E+03 2.09E+07 11679 4.64E+06 1.74E+07 61151 5.20E+07 5.04E+07 21828 8.10E+07 2.65E+06 11633 1.90E+05 2.38E+07 11677 0 7.66E+06 21839 5.38E+03 3.81E+04

61136 2.50E+07 1.97E+06 61126 2.50E+03 4.79E+05 21826 0 0 21827 0 0 21815 0 0 11680 0 8.36E+04 61150 0 1.96E+06 21816 1.03E+03 3.57E+05 21823 0 2.68E+03 61154 0 9.42E+05

21814 0 0 61137 0 4.16E+05 11676 1.30E+07 0 21813 1.35E+05 3.30E+06 61124 8.50E+07 0

Control 21864 2.80E+07 1.13E+07

KV

MLV

inmunidad esterilizante

inmunidad esterlizante

2006 Prueba de eficacia vacunas PRRSV :

Carga viral (tejidos) post-desafio (PRRSV-Lelystad)

muerta

MLV

controles

(Lopez  &  Osorio  2004)  

El  PRRSV  ha  desarrollado,  evolu=vamente,  mecanismos  específicos  para  modular  la  respuesta  inmune  porcina  

0   1  mo.   2  mos.   +/-­‐  5  mos.   +1  yr  

Infeccion  con  PRRSV  

Viremia  

Respuesta  total  de  An@cuerpos  (ELISA  

Idexx)  

Respuesta  de  an@cuerpos  neutralizantes    

Celulas  secretoras  de  IFN  γ        

Carga  viral  en  tejidos  

La respuesta inmune X PRRSV en un cerdo infectado naturalmente

El animal convalesciente adquiere una sólida

inmunidad de protección (predominantemente

homóloga)

0 15 30 60 91 122 111 118

1.0

2.0

3.0

Seña

l ELI

SA

Idex

x (

S/P)

Dias

Figura 1. Vacunacion con PRRSV MLV y desafio con cepa wt PRRSV(heterologa): Se observa una respuesta anamnesica de anticuerpos

neutralizantes heterologos despues del desafio, exclusivamente en los animales con proteccion clinica

Desafio con cepa heterologa

1:2

1:4

1:8

1:16

Titulo seroneutralizante

No protegidos (viremicos y abortados)

Protegidos (sin viremia y nacidos

normales)

AC ELISA

AC SN

vacunacion

Desafio con PRRSV Virulento

87o. Dia de Gestacion

90o. Dia de Gestacion

Osorio et al. Virology (2002)

Anticuerpos Neutralizantes

X PRRSV

Inmunidad de Protección contra PRRSV Obtenida por Transferencia Pasiva de Anticuerpos Neutralizantes

Desafio con PRRSV Virulento

Proteccion Total Por Antic. Neutralizantes

X PRRSV

Desafio con PRRSV Virulento

Protección Total Por Antic. Neutralizantes

X PRRSV

Protección Nula Por Antic. no Relacionados

a PRRSV

“Los anticuerpos neutralizantes X PRRSV son un parámetro comprobado de inmunidad protectora” (Osorio 2002)

1)  Nuestro experimento de transferencia pasiva fue hecho con IgGs homologas al virus de infección

2) Niveles protectores de anticuerpos neutralizantes en sangre (ejo. 1:8 to 1:32) son difíciles de obtener con una sola dosis de las vacunas actuales 3) La mayor parte de los anticuerpos neutralizantes son producidos en respuesta a la cepa homóloga que los induce. Titulos neutralizantes contra cepas heterologas son mas modestos. Anticuerpos de “neutralización cruzada” ( neutralización entre distintas cepas) son infrecuentes

Pero… debemos tener presente que:

No obstante…. aunque infrecuentes, anticuerpos de neutralizacion cruzada ( “Antic. Pan-neutralizantes”)

existen en el caso de PRRSV

o 15 30 60 91 122 111 118

0.4

1.0

2.0

3.0 ELISA

Days

challenge

1:2

1:4

1:8

1:16

NAb Titer

Protected (49%)

Unprotected(51%)

vaccination

Evidencia 1:

Los anticuerpos pan-neutralizantes son llamados en Ingles bNAbs (broadly-neutralizing antibodies)

Sub-tipificacion de aislados

PRRSV de campo por neutralizacion cruzada

Vu, Osorio, unpubl

Evidencia 2:

53%

47%

0%

1403

25%

71%

4%

VR2332

19%

79%

2%

Lelystad

10%

71%

19%

MN148a

6%

37%

57%

97-­‐78953%

38%

59%

5424-­‐00a

1:  64  – 1:  512

1:  8  – 1:  32

< 1:8

1403-­‐02 VR2332

≥  1:64

1:8  – 1:32< 1:8

53%

47%

0%

1403

25%

71%

4%

VR2332

19%

79%

2%

Lelystad

10%

71%

19%

MN148a

6%

37%

57%

97-­‐78953%

38%

59%

5424-­‐00a

1:  64  – 1:  512

1:  8  – 1:  32

< 1:8

1403-­‐02 VR2332

≥  1:64

1:8  – 1:32< 1:8

53%

47%

0%

1403

25%

71%

4%

VR2332

19%

79%

2%

Lelystad

10%

71%

19%

MN148a

6%

37%

57%

97-­‐78953%

38%

59%

5424-­‐00a

1:  64  – 1:  512

1:  8  – 1:  32

< 1:8

1403-­‐02 VR2332

≥  1:64

1:8  – 1:32< 1:8

53%

47%

0%

1403

25%

71%

4%

VR2332

19%

79%

2%

Lelystad

10%

71%

19%

MN148a

6%

37%

57%

97-­‐78953%

38%

59%

5424-­‐00a

1:  64  – 1:  512

1:  8  – 1:  32

< 1:8

1403-­‐02 VR2332

≥  1:64

1:8  – 1:32< 1:8

53%

47%

0%

1403

25%

71%

4%

VR2332

19%

79%

2%

Lelystad

10%

71%

19%

MN148a

6%

37%

57%

97-­‐78953%

38%

59%

5424-­‐00a

1:  64  – 1:  512

1:  8  – 1:  32

< 1:8

1403-­‐02 VR2332

≥  1:64

1:8  – 1:32< 1:8

53%

47%

0%

1403

25%

71%

4%

VR2332

19%

79%

2%

Lelystad

10%

71%

19%

MN148a

6%

37%

57%

97-­‐78953%

38%

59%

5424-­‐00a

1:  64  – 1:  512

1:  8  – 1:  32

< 1:8

1403-­‐02 VR2332

≥  1:64

1:8  – 1:32< 1:8

Analisis de la actividad de neutralizacion cruzada por seis sueros de refencia contra 68 cepas de campo

El patrón de reactividad del suero

X PRRSV referencia 1403-02

seria un ejemplo de pan-neutralización X PRRSV

Respuesta de inmunidad innata deficiente –  Supresión de la inducción de IFN tipo I –  Supresión de la inducción de TNF-α

Uso de epitopos “señuelo” o “de distracción” para prevenir la neutralización por anticuerpos

Utilización de escudos de glúcidos(carbohidratos) para prevenir la neutralización por anticuerpos

El PRRSV ha desarrollado mecanismos patogénicos para alterar (a su favor )la respuesta

inmune del cerdo

Respuesta inicial de anticuerpos (estos son No-neutralizantes)

Respuesta de anticuerpos neutralizantes

La existencia de epitopos “señuelo” en las proteína GP5 del PRRSV explicaría el retraso en establecerse

la protección por anticuerpos neutralizantes

C

N

GP5

Membrana externa del PRRSV (envoltura)

Exterior del GP5

Epitopo “señuelo”

Epitopo neutralizante

Interior del GP5

(Ostrowski et al. 2002)

Escudos de carbohidratos en la proteínas externas de PRRSV (GP5 y GP3)    

Hyper-­‐glycosylatedprotein

Epitope

YY Y

Glycan

Hypo-­‐glycosylatedprotein

Epitope

Este escudo o protección por azúcares se ha verificado en los siguientes virus:

HIV(SIDA) Influenza virus Hepatitis C Ebola virus PRRSV

Beneficios de la proteccion u ocultamiento de las glicoproteinas por los azucares: -  Evasion de la neutralización por anticuerpos

- Impedir la respuesta de anticuerpos

Y

Y

Y

Y

Y

Y Y Y

Y Y

Y

Y Y Y

Y

Una partícula viral sin residuos hiperglicosilados en sus proteínas de envoltura es perfectamente susceptible a neutralización por anticuerpos    

Y

Y Y

Y

Y

En cambio…Una partícula de PRRSV ,(superglicosilada ),está perfectamente “acorazada” para resistir los anticuerpos

y reducir la inducción de anticuerpos neutralizantes a un mínimo    

Busqueda de una vacuna a subunidad “ideal” para PRRSV: Vacunas usando una combinacion GP5/M

Adenovirus

Vaccinia

TGEV

Fowlpox

Pseudorabies

M.BCG

VSV-Baculovirus Pseudotype

Jiang et al. 2008 & 2007 Gp5/M, Deglyc GP5, Gp3,GP4

Zheng et al 2007, r MVA, GP5/M

Cruz et al 2010, GP5/M

Wang et al, 2007 GP5 & M

Shen et al. 2007 GP5/GP3 + IL-18

Qiu et al, 2005, GP5

Bastos et al. 2004 GP5/M

DNA vaccination Jiang et al 2005, Gp5/M & 2004 Salmonella, Barfoed et al. 2004, ORF1-ORF7 , Dea et al. 1998/99 GP5 & M, Kwang et al. ORF4-7, 1999

Genetic adjuvants and other immunostimulants Hou et al, Ubiquitin + GP5, Linghua et al., 2007, CpG + KV , Fang et al. 2005,Padre Epitope , Meier et al 2004,IFNά + IL12, Foss et al. 2002, Zuckermann 1999 IL12

Alphaviruses Harris Vaccines labs, abstract # 298 2008 PRRS symposium, Jung et al. 2003 ORF5

Candidatos a vacuna subunidad de PRRSV

• GP5 and M son inmunogenos aceptables , pero no suficientes para conferir inmunidad efectiva • La protección otorgada por las vacunas experimentales en base a GP5/M es incompleta. Alcanza sólo a la mitad de la protección que se obtiene cuando se aplica una dosis de MLV

•  Otras subunidades immunogenas del PRRSV deben ser investigadas y agregadas a la formulación:GP2, GP3, GP4

• Como expandir la cobertura inmunologica de las vacunas PRRSV?

• Alternativa 1: Secuenciamiento de genomas completos y ensayos funcionales

• Alternativa 3: Descubrir e implementar epitopos y anticuerpos de neutralizacion cruzada

El mayor problema en immunizacion de PRRSV es expandir la cobertura de proteccion

• Alternativa 2: Descubrir e implementar epitopos de celulas T altamente conservados

C

GP3

GP4

GP5

M 2b

GP2a

PRRSV envelope

Host cell plasma membrane

CD163

(Das et al JVI 2010)

(T Dokland et al JGV 2009)

GP2 y GP4 son las dos estructuras en PRRSV que interactuan con el receptor viral CD163

A la busqueda de “anticuerpos pan-neutralizantes”(bNAbs)

Model of Multi-protein Complex Los epitopos de contato directo con el receptor CD163(areas de las GP2 y GP4 altamente conservadas ) son los candidatos logicos a inducir anticuerpos pan-neutralizantes

•  PRRSV establece una solida inmunidad de proteccion

•  Vacunas que replican en el animal (MLVs, vivas) son las mas efectivas •  PRRSV ha desarrollado mecanismos patogenicos para evasion de inmunidad tales como : antagonismo de la inmunidad innata, epitopes de distraccion o escudos de azucares en sus proteinas

•  Tanto evidencias campo como pruebas de eficacia de vacunas indican que los anticuerpos”pan-neutralizantes” existen

•  El desarrollo de una vacuna de amplia proteccion puede concebirse en funcion de estimular el sistema inmunologico del cerdo a producir ,en forma preferencial, dichos anticuerpos pan-neutralizantes

Resumen de esta platica

R. Bastos

University of Illinois F. Zuckermann

E. Alvarez Garcia Univ. Complutense, Madrid

Iowa State U. K. Yoon

University of Nebraska

USDA-NRICGP , USDA-CAP2, NPB Proyectos

M. De Lima

F. Osorio

O. Lopez M. Ostrowski

A. Pattnaik

B.J. Kwon

I. Ansari Universitat Autonoma, Barcelona

I.  Diaz

W. Laegreid

T. Goldberg University of Wisconsin

F. J. Martinez L H. Vu P.Das

R. Allende

L. Beura

Reconocimientos

S. Subramaniam R. Parida J. Galeota Px Dinh

South Dakota St U J. Christopher Hennings

E. Nelson Y Fang

.

RW Meier

E. Mateu

CIAD, Mexico J. Hernandez

Type II PRRSV Complete Genome Sequences

A

A

A

B

B

A

B

B

Immunize                Challenge  

?  

?  Type II PRRSV Gp5 Nucleotide Sequence Diversity

Goal:  Clustering  of  strains  By  cross-­‐immunity  (“protecto-­‐types”)  

1.Genomic approach: Increase the number of whole PRRSv genomes to obtain a true picture of strain diversity

Our Strategy for T-Cell Mapping in NSPs

(Parida et al 2011,Poster 077) 17-mer synthetic peptides

Pools PBMNCs

T-cell proliferation

ELISPOT

Bioinformatics Prediction Analysis for Binding MHC I & II

1α 2 3 4 5

RdRP 10 11 12

GP2

GP3

4

GP5

M

N E

1β 6 7 8

3. Identification of cross-reactiveT cell epitopes in PRRSV (Wang , 2011)

(Diaz 2009)

(Vashisht 2008)

Conserved T-cell epitopes of nonstructural proteins throughout North American PRRSV Isolates

NSP9

NSP10

NSP11

119 135 151 167

1 17 9 25

57 73

209 225 217 233