EL SISTEMA REDOX DEL PLASMALEMA Y EL CRECIMIENTO POR … · 2017-04-25 · 3 3^ T-D UNIVERSITAT DE...
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3 3^ T-D UNIVERSITAT DE VALENCIA FACULTAT DE C.C BIOLOGIQUES EL SISTEMA REDOX DEL PLASMALEMA Y EL CRECIMIENTO POR ELONGACIÓN CELULAR Memoria presentada por el Licenciado D. JOAQUÍN CARRASCO LUNA para optar al grado de Doctor en Ciencias Biológicas I
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3 3 ^
T - D
UNIVERSITAT DE VALENCIA
FACULTAT DE C.C BIOLOGIQUES
EL SISTEMA REDOX DEL PLASMALEMA Y EL CRECIMIENTO
POR ELONGACIÓN CELULAR
Memoria presentada por el
Licenciado D. JOAQUÍN CARRASCO LUNA
para optar al grado de Doctor en Ciencias Biológicas
I
UMI Number: U607670
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UMI U607670Published by ProQuest LLC 2014. Copyright in the Dissertation held by the Author.
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DEPARTAMENT DE BIOLOGIA VEGETAL(FIS IO LOGIA VEGETAL)
FACULTAT DE CIÉNCIES BIOLÓGIQUES UNIVERSITAT DE VALÉNCIA
Doctor Moliner, 50 E-46100 BURJASSOT (Valéncia)
Teléfons 386 46 34 - 386 43 80 / Fax 386 43 72
Dr. D. Secundino del Valle Tascón, Catedrático de Fisiología Vegetal del
Departamento de Biología Vegetal de la Facultad de Ciencias Biológicas de la
Universitat de Valéncia y Dr. D. Julio Salguero Hernández, profesor ayudante L.R.U.
E.U. del Dpto. Biología y Producción de Vegetales de la Universidad de Extremadura.
CERTIFICAN:
Que la Memoria de Tesis Doctoral titulada: "El sistema redox del Plasmalema
y el crecimiento por elongación celular", que presenta D. Joaquín Carrasco Luna para
aspirar al grado de Doctor en Ciencias Biológicas, ha sido finalizada bajo nuestra
dirección.
Y para que conste a los efectos oportunos firman la presente en Burjassot a 21
de Enero de 1994.
Fdo. Secundino del Valle Tascón Fdo. Julio Salguero Hernández
II
AGRADECIMIENTOS
El presente estudio ha sido realizado bajo la dirección del Dr. Secundino del
Valle Tascón, sin cuyas orientaciones, consejos y enseñanzas no hubiera sido posible
la realización de esta Tesis Doctoral. Gracias por todo.
Al Dr. Julio Salguero por su dirección y asesoramiento en la realización de este
Estudio. Por su amistad y apoyo en el inicio de la tarea investigadora.
Mención especial para los Dres. Angeles Calatayud y Francisco González, que
además de compartir su amistad, también compartieron su tiempo en largas tertulias
de trabajo. Gracias por vuestro apoyo en todo momento. Por estar cuando os he
necesitado.
A la Dra. Dña. Felisa Puche por su asesoramiento en el tratamiento de las
muestras para la Microscopía electrónica y Optica.
Al Dr. D. Antonio Campos por su amistad, convivencia diaria y por compartir
inquietudes comunes.
A Jesús García y Juan Carlos Femenía por su amistad y por compartir tantas
cosas ....
A mis padres y toda mi familia por el apoyo incondicional en todo y en todo
momento.
A mis compañeros de trabajo en Medicina, muchísimas gracias por vuestro
apoyo incondicional.
A todos mis amigos por aguantarme durante tanto tiempo.
Y sobre todo a Anna, por tu apoyo y comprensión. Por estar siempre a mi lado
por tus continuos ánimos y servirme de estímulo.
III
A A n n a
m is padres.
ABREVIATURAS
ABA, ácido abcísico
CH, cicloheximida
DCCD, diciclohexilcarbodiimida
DCP, 2,4-diclorofenolindofenol
DES, dietilestilbestrol
DNP, 2,4-dinitrofenol
E, coeficiente de extinción
FC, fusicocina
HBIIV, Hexabromoiridato IV
HCF III, Hexacianoferrato III (ferricianuro)
HCF II, Hexacianoferrato II (ferrocianuro)
HCIIV, Hexacloroiridato IV
HEPES, ácido 2-(4-hidroxietil 1-piperacil) etano sulfonico
IAA, ácido indol-3-acético
KCN, cianuro potásico
PCIB, ácido p-clorofenoxiisobutirico
TIBA, ácido 2,3,6-triiodobenzoico
Vel, velocidad
2,4 D, ácido 2,4 diclorofenoxiacético
V
INECE
INDICE1. Introducción .............................................................................................................. 1
1.1. Elongación c e lu la r ....................................................................................... 2
1.1.1. Crecimiento inducido por a u x in a ............................................ 2
1.1.2. Mecanismo de acción de la auxina .......................................... 4
1.2. Sistema redox de la membrana plasmática en vegetales ................... 5
1.2.1. Actividad redox de la membrana p lasm ática ........................ 6
1.2.2. Reducción de HCF III .............................................................. 7
1.3. Extrusión de pro tones................................................................................ 8
1.3.1. Potencial de m em brana............................................................... 10
1.4. pH citosólico............................................................................................... 12
1.5. Sistema calcio-calmodulina..................................................................... 13
1.6. Sistema redox y elongación celular ...................................................... 14
1.7. Objetivos.................. 18
2. Materiales y m é to d o s ............................................... 19
2.1. Material vegeta l.......................................................................................... 19
2.1.1. Germinación ................................................................................ 19
2.1.2. Tratamiento de los segmentos de coleoptilos e hipocotilos . 20
2.1.3. Preincubación................................................................................. 21
2.2. Elongación .................................................................................................. 21
2.3. Extrusión de pro tones................................................................................ 22
2.3.1. Determ inación............................................................................ 22
2.3.2. Capacidad ta m p ó n ..................................................................... 23
2.3.3. Velocidad aparente de extrusión de p ro tones......................... 24
2.4. Reducción de HCF III ......................................................................... 24
2.4.1. Velocidad de reducción de HCF I I I ....................................... 26
VI
Indce
2.4.2. Recuperación HCF III reducido mediante peróxido de
hidrógeno..................................................................................... 26
2.5. Microscopía electrónica ........................................................................... 26
2.6. Calmidazolium ........................................................................................... 28
2.7. Estadística..................................................................................................... 30
3. Resultados.................................................................................................................. 31
3.1. Crecimiento por elongación . . . ..................................... .. , 31
3.1.1. Elongación inducida por au x in a ................................................ 31
3.1.1.1. Efecto del HCF III y HCF I I ...................................... 31
3.1.1.2. Adición de HCF III en la fase I I .............................. 37
3.1.1.3. Readicion de HCF III al cabo de 30 minutos . . . . 40
3.1.2. Elongación basal del co leo p tilo ................................................ 40
3.1.2.1. Efecto de HCF III y HCF I I ....................................... 40
3.1.3. Abrasión . ; ................................................................................... 47
3.1.4. Inhibidores ................................................................................... 52
3.1.4.1. A teb rin a ......................... 52
3.1.4.2. DCCD ........................................................................... 59
3.1.4.3. C iclohexim ida............................................................... 59
3.1.5. Elongación en coleoptilos de avena e hipocotilos de soja . . 59
3.1.5.1. Efecto HCF III en la elongación de los coleoptilos
de a v e n a ............................................................................ 61
3.1.5.2. Crecimiento por elongación en hipocotilos de
soja ................................................................................... 61
3.1.5.3. A brasión......................................................................... 61
3.1.6. Efecto del ión Ca2+ en el crecimiento inducido por IAA y
HCF III........................................................................................... 68
3.2. Reducción de HCF III .............................................................................. 72
3.2.1. Cinética de reducción ................................................................ 72
VII
M C E
3.2.2. Estimulación de la reducción del HCF III por calcio..... 72
3.2.3. Reducción en ausencia de aux ina ..................................... 76
3.2.4. Efecto de los antibióticos en la reducción de HCF III . . . . 76
3.3. HCF III estimula la extrusión de protones..................................... 80
3.3.1. Dosis respuesta de HCF III en presencia de IA A .......... 80
3.3.2. Efecto del calcio en la extrusión de protones inducida por
HCF I I I .................................................... 83
3.3.3. Extrusión de protones en ausencia de IAA ............................ 83
3.3.4. Efecto de los antibióticos en la extrusión de protones . . . . 83
3.4. La extrusión de protones inducida por HCF III se realiza a través de
la atpasa del p lasm alem a...................................................................... 88
3.4.1. Estequiometria H7e- ................................................................. 88
3.4.2. Efecto del catión Ca2+ en la estequiometria H+/ e - ................... 92
3.4.3. Estequiometria como cociente de velocidades....................... 93
3.4.4. Efecto del dccd en la extrusión de protones y reducción de
HCF I I I . . 93
3.5. El sistema redox acidifica el c itop lasm a................................................ 99
3.5.1. Efecto del NH4C1 en el crecimiento por e longación 99
3.5.2. Efecto de la atebrina en el crecimiento inducido por
NH4C 1 .............................................................................................102
3.6. Participación del sistema calcio calmodulina en el mecanismo de
acción del HCF III ...................................................................................102
3.6.1. Efecto antagonistas de calmodulina............................................ 104
4. Discusión ...................................................................................................................... 108
5. C onclusiones................................................................................................................. 118
6. B ib liografía................................................................................................................... 119
VIII
------------------------------------------------------------------------------------------------------------ INIKXKJCQÓN
1. INTRODUCCIÓN
El sistema redox del plasmalema, transfiere electrones desde donadores
citosólicos de electrones, NADH o NAD(P)H, posiblemente hasta aceptores de
electrones fisiológicos como el oxígeno o semidihidroascorbato. Oxidantes
impermeables en la superficie externa de la membrana plasmática actúan como
aceptores artificiales de electrones (HCF III, HCI IV, HBI IV, DCIP, etc) (Craig y
Crane, 1985b; Crane et al., 1985a; Morré et al.t 1987a).
Se han considerado como aceptores fisiológicos determinados iones, los cuales
deben ser reducidos antes de ser incorporados en la célula, como por ejemplo el ión
férrico, cúprico o nitrato (Bienfait, 1985; Castignetti y Smarrelli, 1986; Jones et al.,
1987).
El transporte de electrones del plasmalema interviene en el control de la
elongación, incrementa la extrusión de protones, modifica el potencial de membrana
y participa en la proliferación celular en células animales (Crane et al., 1991).
Las hormonas de crecimiento regulan el transporte de electrones en el sistema
redox del plasmalema (Referencias en Crane et al., 1991). La naturaleza de la
interacción entre el sistema redox y las hormonas o factores de crecimiento no es
conocido todavía.
En células vegetales las evidencias de la participación del sistema redox en el
control de la elongación celular son todavía contradictorias (Taiz, 1984; Silk, 1984).
El objetivo de esta Memoria de Tesis Doctoral es el estudio de la participación del
sistema redox en células vegetales en la elongación celular. Los resultados
experimentales obtenidos demuestran que en células vegetales, el sistema redox del
plasmalema participa en el crecimiento por elongación (Carrasco-Luna et al., 1993).
N iro d u o ciím
1.1. ELONGACIÓN CELULAR
El crecimiento por elongación celular, es un proceso esencial en las plantas. La
elongación celular es la consecuencia de varios procesos interrelacionados:
a) entrada de agua a través de la membrana plasmática impulsada por el
gradiente de potencial hídrico (Cosgrove, 1986; Van der Volkenburg y Cleland, 1986;
Hoson et al., 1992; Cosgrove, 1993a y 1993b).
b) aumento en la cantidad de solutos (Kutschera y Fróhlich, 1992).
c) extensión de la pared celular y otros procesos de biosintesis (Cleland, 1971;
Cleland, 1981; Nakajima et al., 1981).
d) transporte continuo de solutos hacia las zonas de extensión celular (Boyer,
1985; Stendle, 1985; Cosgrove, 1986; Schmalsting y Cosgrove, 1988).
1.1.1. CRECIMIENTO INDUCIDO POR AUXINA
Masuda en 1990, determinó que uno de los efectos de la auxina sobre el
crecimiento era el incremento de la capacidad autolítica de la pared celular,
estimulando la actividad de enzimas específicos tales como hidrolasas (Seara et al.,
1988; Hoson et al., 1992; Inouhe y Nevins, 1991).
Hohl observó, que la adición exógena de la hormona auxina a tejidos sensibles,
produce una extrusión de protones al apoplasto; esta acidificación, activa distintos
procesos hidrolíticos que conducen a la expansión de la pared celular mediante el
aumento de la presión de turgencia (Hohl et al., 1991). Otros autores (Vesper y Evans,
1978; Carrington y Esnard, 1988; Brevario et al., 1992) observaron que la auxina
provoca un rápido crecimiento por elongación.
La adición de la hormona auxina a tejidos vegetales, estimula el crecimiento por
elongación (Brummer y Parish, 1983; Altabella et al., 1990). Esta estimulación
presenta dos fases:
a) Fase I: se observa una estimulación del crecimiento que presenta un máximo,
tras un período de latencia variable, entre 10-30 minutos tras la adición de la auxina.
2
In ir o d u o o Sn
Estas características varían dependiendo del tipo de tejido y de las condiciones
experimentales.
Durante la fase I se observa una activación de la ATPasa que requiere síntesis
de ATP (Penny y Penny, 1978; Evans, 1985). Respuestas similares se obtienen en
presencia de soluciones ácidas (pH 5.0-3.5)(Hager et a i , 1971; Cleland, 1977; Rayle
y Cleland, 1977).
b) Fase II: Se alcanza un segundo máximo de crecimiento que corresponde a la
fase II de crecimiento o fase estacionaria que puede durar entre 12-48 horas (Cosgrove
y Cleland, 1983).
La fase II, se caracteriza por el aporte de sustancias en la pared celular, la
activación de la transcripción de genes, síntesis de proteínas, y un incremento en el
aporte exógeno de azúcares y sales (Stevenson y Cleland, 1981).
La fase I del crecimiento es el resultado de la extrusión de protones, mientras
que la fase II es debida a la síntesis de pared celular. Dos observaciones apoyan esta
hipótesis de trabajo; la primera es la similitud entre la cinética de la fase I y el
crecimiento inducido por tampones ácidos (Vanderhoef y Stahl, 1975) y la segunda es
que se ha encontrado una correlación temporal entre el incremento de la extrusión de
protones y el crecimiento (Cleland, 1987).
Este tipo de cinética se ha obtenido en diversos tejidos vegetales (Vanderhoef
y Stahl, 1975; Bouchet et al., 1983; Nissen, 1985; Sasse, 1990).
Una teoría sometida a controversias para explicar el mecanismo de acción en
la auxina sobre la elongación celular es la hipótesis de crecimiento ácido (crecimiento
por acidificación de la pared celular) establece que el crecimiento por elongación
inducido por auxina es debido al flujo de protones desde el citoplasma hacia la pared
celular (Brummell, 1986). El descenso de pH en la pared celular lleva consigo una
modificación de las propiedades de la pared que estimulan el crecimiento por
elongación (Hager et al., 1971; Rayle y Cleland, 1992).
3
N ir o d u d o ín
1.1.2. MECANISMO DE ACCIÓN DE LA AUXINA
El efecto de la fitohormona auxina, se ha estudiado en diferentes tejidos
vegetales y está asociado a numerosos procesos fisiológicos (Aloni, 1980; Trewavas,
1981; Hein et al., 1984). Los dos procesos más estudiados son la extrusión de protones
(Cleland, 1975; Marré et al., 1989; Schopfer, 1989) y la elongación celular (Cleland,
1981; Cosgrove, 1986; Masuda, 1990).
El mecanismo de acción de la auxina en el crecimiento por elongación no es
conocido todavía. Se han propuestos diferentes modelos:
1- Incremento del calcio citosólico:
Mediante diversos mecanismos:
a) El aumento de calcio citosólico produce la fusión de vesículas del aparato de
Golgi con el plasmalema (Morris y Northcote, 1977); de esta manera, se incorporan
nuevos materiales a la pared celular y se estimula el crecimiento (Buckhout et al.,
1981; Hertel, 1983).
b) Los iones calcio son intercambiados por protones en la mitocondria y la
salida de H+ al citoplasma disminuye el pH citosólico que a su vez estimula la
extrusión de protones mediante la ATPasa (Brummer y Parish 1983; Brummer et a i,
1984).
c) La acción primaria de la auxina es la liberación de Ca2+ desde los orgánulos
citoplasmáticos, aumentando los niveles de calcio citosólicos que activan a la
calmodulina (Evans, 1985). El crecimiento y la extrusión de protones son mediados por
proteínas quinasas dependientes de calmodulina que activarían la fosforilación de la
ATPasa (Ragothama et al., 1985).
d) La acidificación inducida por la hormona auxina en células vegetales parece
estar mediada por el sistema calcio-calmodulina. Antagonistas del sistema calcio-
calmodulina, inhiben la extrusión de protones y el crecimiento por elongación inducido
por auxina (González-Darós et al., 1993).
4
NlRODUOCtóN
2- Transcripción de genes específicos:
La auxina estimula la transcripción de genes específicos e induce la síntesis de
ARNm; el crecimiento y la extrusión de protones se derivan de la acción de los
polipéptidos sintetizados por el ARNm (Theologist, 1986).
El crecimiento es regulado por proteínas que facilitan la fusión de vesículas
secretoras con la membrana plasmática e incorporan nuevos materiales a la pared
celular (Scherer, 1984; Gabathuler y Cleland, 1985).
1.2. SISTEMA REDOX DE LA MEMBRANA PLASMÁTICA
EN VEGETALES
Bóttger et al., han demostrado la existencia de actividad oxidasa en células
vegetales con una baja afinidad por el oxígeno que está asociada a una extrusión de
protones inducida por auxina; ellos proponen que esta actividad oxidasa pertenece al
sistema de transporte electrónico transmembrana que utiliza el NADH citosólico como
sustrato (Bóttger et al., 1985a y 1985b; Bóttger y Lüthen, 1986; Bóttger, 1986). Se ha
encontrado también actividad NADH oxidasa inducida por IAA en la membrana
plasmática relacionada con el crecimiento rápido de hipocotilos de soja (Brightman et
al., 1987a).
Los cultivos de células, protoplastos y tejidos intactos reducen el HCF III
exógeno y oxidan el NADH citosólico mediante una NADH HCF III óxido-reductasa
(Crane et al., 1985a).
Aunque las funciones realizadas por el sistema redox del plasmalema no son
todavía bien conocidas, se tienen evidencias de su participación en los siguientes
procesos:
a) Oxidación de compuestos con bajo potencial redox, estos compuestos
incluyen principalmente, NADH, NADPH, Glutatión y Ascorbato (Crane et a i , 1985).
b) Control del crecimiento por elongación mediante la estimulación del sistema
redox por la luz, (Briggs y lino, 1983; Schmidt, 1984; Elzenga y Prins, 1987;
ÍNTIRXJUOCJÓN
Dharmawardhane et a l., 1989).
c) Liberación de segundos mensajeros (Crane, 1989).
d) Acidificación del citoplasma (Rubinstein y Stem, 1986; Marré et al., 1988a;
Morré et al., 1988a).
e) Modificación del potencial de membrana (Novak y Ivankina, 1983; Doring
et al., 1990).
1.2.1. ACTIVIDAD REDOX DE LA MEMBRANA PLASMÁTICA
Los diferentes enzimas redox del plasmalema se pueden agrupar según su
actividad redox en:
a) NAD(P)H oxido-reductasa. Reducción de aceptores de electrones externos con
un alto potencial redox (Ivankina y Novak, 1981; Crane et al., 1982; Crane et al.,
1988; Lüthen y Bóttger, 1988; Morré et al., 1988b). Este sistema utiliza el oxígeno
como aceptor terminal del electrones (Mpller y Bérczi, 1986; Morré et al., 1986;
Bóttger, 1989). Este sistema actúa como una NADH: oxígeno-oxido-reductasa.
b) NADH-oxidasa Tipo I. Oxida el NADH o NAD(P)H exógenos en presencia
de oxígeno (Morré et al., 1988c). La fitohormona auxina es un estimulador de este
enzima (Federico y Giartosio, 1983; Brightman et al., 1988). Insensible a cianuro
potásico y catalasa.
c) NADH-oxidasa Tipo II. Esta enzima oxida el NADH produciendo
superóxidos y peróxidos (Chai y Doke, 1987; Ullrich-Eberius et al., 1988; Crane y
Barr, 1989).
d) NAD(P)H-oxido-reductasa inducida por deficiencia en hierro. (Chaney et al.,
1972). También llamado sistema turbo está considerado como uno de los mas
importantes complejos enzimáticos relacionados con el transporte de iones hacia el
interior de la célula (Bienfait, 1985; Bienfait, 1988).
e) Semidehidroascorbato óxido-reductasa. Este sistema está considerado como
un posible aceptor natural de las NADH deshidrogenasas. El ascorbato formado por la
acción reductasa puede ser reoxidado para formar de nuevo semidehidroascorbato a
6
In t ro duc ció n
través de una ascorbato oxidasa (Morré et al., 1986; Navas, 1991).
f) Variación de absorción inducida por luz. Fotorreducción de un citocromo tipo
b a través de los cambios inducidos en la absorción de la luz. Esta reacción alcanza su
óptimo en la luz azul a 450 nm (Briggs y limo, 1983; Schimdt, 1984). Esta luz induce
cambios que han sido relacionados con las respuestas fotoírópicas (Shinkle et al., 1992;
Caubergs et al., 1988).
1.2.2. REDUCCIÓN DE HCF III
La actividad oxido-reductasa en la membrana plasmática ha sido estudiada tanto
en células animales como en células vegetales. La reacción redox más estudiada en
todo tipo de tejido vegetal ha sido la reducción de HCF III (Ivankina y Novak, 1981;
Sandelius et al., 1987) u oxidación de NAD(P)H mediante actividad deshidrogenasa
en el citosol u oxidasa en la superficie de las células (Chalmers et a i , 1984; Rubinstein
et al., 1984; Lüthen y Bóttger, 1988; Morré et al., 1988b) en preparaciones aisladas del
plasmalema (M0ller y Bérczi, 1986; Brightman et al., 1987b; Askerlund et al., 1988).
El sistema de transporte de electrones transmembrana lleva a cabo la reducción del
HCF III externo mediante la oxidación de NADH o NAD(P)H citosólicos. Esta
actividad HCF III NAD(P)H-reductasa se encuentra localizada en la membrana
plasmática, con actividad deshidrogenasa en la parte interna y actividad reductasa en
la cara externa, actuando siempre en presencia de donadores y aceptores impermeables.
Otras evidencias de la relación entre la actividad NADH oxidasa y la reducción
del HCF III se determina por el efecto del HCF III sobre el consumo de oxígeno
(Polevoy y Salamatova, 1977), que demostraron que el consumo de oxígeno es inhibido
en presencia de HCF III en coleoptilos de maíz.
Tanto el NADH como el NADPH pueden actuar como sustratos de las enzimas
del transporte electrónico. (Sijmons et al., 1984; Qiu et al., 1985).
La hormona sintética 2,4 D, estimula la oxidación del NADH, en cambio, la
auxina no tiene ningún efecto sobre la NADH-HCF III-reductasa (Brightman et al.,
1987b).
7
iNnraxraóN
En tejidos con capacidad de fotosíntesis, en presencia de la luz, estimulan la
reducción de HCF III, estimulación atribuida al incremento en el suministro de
NAD(P)H en el cloroplasto, así mismo, la reducción de HCF III se ve inhibida en
presencia de DCMU que es un inhibidor de la formación de NAD(P)H fotosintético
(Dharmawardhane et al., 1987; Neufeld y Bown, 1987).
Antimicina A, inhibidor del complejo I, inhibe la reducción de HCF III por el
sistema redox del plasmalema (Barr et al., 1985a; Dharmawardhane et al., 1987).
También se han encontrado otros donadores de electrones citosólicos tales como
el Ascorbato, Glutatión, Tioredoxina y Xantina (Crane et al., 1979).
La reducción del HCF III en células vegetales es estimulada por los iones
(Crane, 1989). El efecto de los cationes bivalentes Ca2+ y Mg2+ es mucho mayor que
el de los cationes monovalentes (Federico y Giartosio, 1983; Rubistein et al., 1984).
Este efecto es debido a la neutralización de las cargas negativas de la superficie
celular. El efecto del calcio externo, además, puede ser explicado mediante la
regulación de los niveles de calcio citosólico (Crane, 1989; Dharmawardhane et al.,
1988).
1.3. EXTRUSIÓN DE PROTONES
La extrusión de protones es un proceso muy importante en la regulación del
metabolismo celular, es realizado por la ATPasa localizada en la membrana plasmática
(Poole, 1978; Serrano, 1989; Palmgren, 1991).
El sistema ATPasa del plasmalema acopla la hidrólisis de ATP a un bombeo de
protones a través de la membrana (Palmgren, 1990), que genera un potencial eléctrico
y un gradiente de pH a través de la membrana plasmática debido a la extrusión de
protones desde el citoplasma a la pared celular (Sze, 1985; Cooper et al., 1991).
La energía producida por el gradiente electroquímico es la fuerza conductora
para la entrada de solutos, absorción de nutrientes, mantenimiento de la turgencia
celular etc, (Nelson, 1988; Sanders y Slayman, 1990; Lin y Randall, 1991; Briskin y
8
M ro d uooón
Hanson, 1992). Durante el período de extrusión de protones el pH del medio de
incubación disminuye hasta alcanzar un pH estacionario de 4.8-4.4 (Cleland, 1976). En
el tejido vegetal se dan simultáneamente dos flujos de protones. El flujo de salida o
extrusión de protones es un proceso activo y dependiente de auxina. El flujo de entrada
es un proceso pasivo. Los flujos de entrada y salida están regulados por el pH de la
solución externa; la entrada de protones aumenta al disminuir el pH de la solución
externa (Cleland, 1975). La extrusión de protones es inhibida por un gran numero de
compuestos, CH, un inhibidor de la síntesis proteica, inhibe la extrusión de protones
(Bates y Cleland, 1971; Cleland, 1976; Lado et al., 1977; Pope, 1983). Otros
inhibidores metabólicos como son el KCN, dinitrofenol, antiauxinas (PCIB y TIBA)
y la fitohormona ácido abscísico (ABA) inhiben también la extrusión de protones
(Cleland, 1973; Rayle, 1973).
El transporte de electrones del plasmalema está relacionado con la extrusión de
protones, pero todavía no están claras las bases para el movimiento de protones
asociado al sistema redox ni la vía por la que los protones son liberados. El HCF III
como oxidante externo, estimula la liberación de protones, esta extrusión de protones
es inmediata tras la adición (Craig y Crane, 1985b; Bóttger, 1986), o con una fase de
latencia de pocos minutos (Chalmers et al., 1984; Rubinstein y Stem, 1986).
Por otra parte se ha propuesto que la cadena de transporte electrónico podría
activar una ATPasa transmembrana mediante la acidificación de un sitio alostérico de
la ATPasa (Morré et al., 1986).
Se han planteado numerosas hipótesis para explicar la relación entre la actividad
del sistema redox y la modificación del pH externo. Marré (Referencias en Crane et
al., 1991), distingue 3 modelos conceptuales: (Figura 1) (Marré et al., 1987; Marré et
al., 1988a; Marré et al., 1988b; Trockner y Marré, 1988)
Modelo A. Donador de electrones citosólico y aceptor de electrones extracelular.
El transporte de protones a través de la membrana se realiza por el sistema redox.
Modelo B. Donador y aceptor de electrones citosólicos. El transporte de
protones lo realiza el sistema redox.
9
Introducción
Modelo C. Donador de electrones citosólico, aceptor de electrones extracelular.
El transporte de protones se produce mediante un sistema diferente al sistema redox
del plasmalema.
1.3.1. POTENCIAL DE MEMBRANA
La auxina produce un aumento de la hiperpolarización de la membrana
plasmática, pero la auxina estimula el crecimiento en ausencia de una hiperpolarización
(Senn y Goldsmith, 1984); este hecho sugiere que la hiperpolarización de la membrana
no participa en la respuesta de la auxina en el crecimiento por elongación.
La adición de aceptores de electrones externos a tejidos vegetales inducen un
descenso en el potencial de membrana. Este cambio es consistente con un descenso de
los iones de carga negativa y un incremento de los cationes en el citoplasma (Novak
y Ivankina, 1983; Ivankina et al., 1984). La reducción de HCF III está acompañada por
una extrusión de protones con una relación estequiométrica, el transporte de electrones,
por tanto, debería ser no electrogénico. Se ha propuesto que el descenso del potencial
de membrana inducido por HCF III está basado en un bombeo de protones por la
NADH oxidasa en la membrana plasmática, el cual transfiere electrones al oxígeno
interno mientras libera protones al exterior, este bombeo de protones participaría en el
mantenimiento del potencial de membrana (Novak y Miklasevich, 1984; Bóttger et al.,
1985a y 1985b; Bóttger y Lüthen, 1986).
10
Introducción
2eNADH
NAD
2H
2 acc (ox)
2 acc (red)
NADH
NAD
2 acc (ox) 2H
2e
2 acc (red)
NADH2 acc (ox)
2e*
2 acc (red)
Figura 1. M odelos para el acoplamiento entre la actividad oxido-reductasa y la m odificación del pH.
M odelos conceptuales (Marré el al., 1988a y 1988b).
11
Introducción
1.4. pH CITOSÓLICO
El pH celular regula la actividad de muchos enzimas y proteínas y controla
diversos procesos metabólicos que se efectúan en las células (Gillies y Deamer, 1979;
Gillies et al., 1981; Gross et al., 1983). Así mismo, la actividad metabólica (Raven,
1986), el transporte de solutos (Leonard, 1984; Marschner, 1986) o la variación de los
factores ambientales (Roos y Boron, 1981; Felle y Bertl, 1986a y 1986b) inciden y
modifican el pH citoplasmático.
Estas variaciones en el pH citoplasmático pueden efectuarse a través de la
producción o consumo de equivalentes de protones intracelulares o mediante el
intercambio de equivalentes de protones a través de las membranas (Smith y Raven,
1979; Raven, 1986).
Los protones podrían actuar como mensajeros intracelulares mediante: la
variación del pH citoplasmático, la acidificación de la pared celular, variaciones
intramoleculares de protones dentro de las membranas y por último variaciones muy
localizadas de pH en ciertas regiones del citoplasma (Poole, 1978; Felle, 1981;
Spanswick, 1982).
La acidificación de la pared debida a la extrusión de protones es un requisito
imprescindible para promover el crecimiento por elongación (Rayle y Cleland, 1977).
La adición de IAA a coleoptilos de maíz produce una variación del pH
citosólico que oscila con el mismo período encontrado en las variaciones del potencial
de membrana (Referencias en Felle, 1989).
Todas estas características coinciden en determinar el pH citosólico como
segundo mensajero en las plantas; capaz de regular numerosas actividades metabólicas
entre ellas su participación en la regulación del crecimiento por el sistema redox del
plasmalema (Felle 1988a y 1988b).
12
iNIEODUOOÓN
1.5. SISTEMA CALCIO-CALMODULINA
El aumento del calcio intracelular incrementa el transporte de electrones a través
de la membrana plasmática hacia los aceptores de electrones tales como el HCF III:
a) El ionóforo A-23187 y el compuesto 202-791 estimulan la reducción de HCF
III en células de mesófilo de avena (Barr et al., 1990).
b) El compuesto TMB-8 (Quelante de calcio impermeable) inhibe la reducción
de HCF III (Crane et al., 1984; Barr et al., 1990).
c) Antagonistas de calcio-calmodulina tales como clorpromafina, trifluoperacina,
calmidazolium y pimocida, inhiben la reducción del HCF III a bajas concentraciones
(Barr y Crane, 1985b).
La función del calcio citoplasmático está regulada por su unión a la
calmodulina. El complejo calcio-calmodulina regula la actividad de varias enzimas.
Este efecto depende de la edad de las células y del tiempo de incubación (Barr
y Crane, 1985a). Los antagonistas de calmodulina también inhiben el crecimiento
inducido por auxina del mismo modo que inhiben la actividad oxido-reductasa del
plasmalema (Barr y Crane, 1985a y 1985b), así como la extrusión de protones inducida
por auxina (González-Darós et al., 1993).
Los antagonistas de calmodulina presentan varios efectos laterales y por
consiguiente el empleo de los antagonistas debe ser realizado de forma cuidadosa.
Estos resultados sugieren que el efecto de la auxina es transmitido a través de
una oxido-reductasa sensible a calmodulina (Elliott et al., 1983; Raghothama et al.,
1985; Crane et al., 1986).
En esta Memoria de Tesis Doctoral se han contrastado los resultados del
antagonista del sistema calcio-calmodulina calmidazolium, tanto en la extrusión de
protones como en la reducción de HCF III.
13
ÍNTRXXXX3ÓN
1.6. SISTEMA REDOX Y ELONGACIÓN CELULAR
El transporte de electrones del plasmalema está relacionado con la función de
segundo mensajero mediante dos tipos de acciones (Referencias en Crane et al., 1991):
a) Una acción directa sobre los componentes citosólicos mediante modificación
en la composición del citoplasma que pueden incluir cambios en el pH y en la relación
redox (NAD-NADH, GSH-GSSH, ascorbato-deshidroascorbato), variaciones en el
potencial de membrana por flujo electrogénico de electrones o producción de
superóxidos o peróxido de hidrógeno.
b) Una acción indirecta por modificación de la actividad de otros enzimas de
membrana que están directamente involucrados en la formación de segundos
mensajeros.
Evidencias posteriores han demostrado un papel muy importante de la actividad
oxidasa en el control del crecimiento. Mediante la inhibición de la NADH oxidasa se
observa un descenso del crecimiento inducido por auxina en hipocotilos de soja. Estos
inhibidores de NADH-oxidasa incluyen, actinomicina D, nitrofenil-acetato, adriamicina
y cis-diaminodicloroplatinum-II, que inhiben la elongación de los hipocotilos de soja
(Morré et al., 1987). El compuesto acetato de nitrofenilo, en una concentración de 200
pM, inhibe al 100 % la actividad NADH-HCFIII reductasa en membranas aisladas por
el procedimiento de flujo libre.
La liberación de protones en células en crecimiento inducido por auxina parece
estimular la elongación celular (Cleland, 1971). Esta extrusión de protones depende de
la acción de una ATPasa de membrana (Marré y Balarin-Dentí, 1985; Sze, 1985). Se
ha propuesto que la acidificación de un sitio interno de la membrana podría activar la
extrusión de protones mediante ATPasa (Brummer y Parish, 1983). Este tipo de
activación no requeriría la acidificación del citoplasma. La activación puede también
llevarse a cabo por la transferencia directa de un protón mensajero desde el sitio redox
en la superficie de membrana (Williams, 1983; Dilley et al., 1987).
Otra hipótesis alternativa es la acidificación del citoplasma que se desarrollaría
14
N ncoxnóN
más lentamente tras el tratamiento con auxina y dependería de la activación de la
ATPasa, generando liberación de protones internos por la oxidación de NADH,
transporte de protones a través de membrana y variación de la actividad de los enzimas
glicolíticos (Felle, 1989).
El transporte de electrones a través de la membrana puede variar el estado redox
de la mayoría de los transportadores del citoplasma, por la oxidación NAD(P)H (Navas
et al., 1986). El flujo de electrones es máximo durante el proceso de mayor
crecimiento en células de zanahoria (Barr y Crane, 1985; Crane et al., 1988), o en
porciones de raíces de máximo crecimiento (Qiu et al., 1985), lo cual coincide justo
cuando el efecto de la auxina es máximo.
El estado redox de los enzimas de la membrana plasmática controlan la
fosforilación de enzimas de membrana mediante la activación de proteína quinasa
(Malviya y Anglund, 1986).
La liberación de protones en un sitio localizado de la membrana puede activar
la fosfolipasa c, este proceso incrementa la hidrólisis de fosfatidilinositol con la
consecuente activación de una proteína quinasa c y la liberación de calcio (Pfaffmann
et al., 1987).
El sistema redox del plasmalema controla también los canales de calcio. La
apertura de un canal de calcio incrementa la concentración de calcio citosólico, lo cual
activa la proteínas quinasas y otras enzimas dependiente de la actividad calcio
calmodulina (Houslay, 1987).
En células animales, la proliferación celular y la actividad del sistema redox de
la membrana plasmática están correlacionados (Crane et a l 1985). Sin embargo, en
células vegetales las evidencias de esta correlación son todavía escasas. En vesículas
aisladas de membrana plasmática los compuestos auxínicos naturales (IAA) así como
sus análogos (2,4-D, 1-NAA) estimulan la actividad NADH oxidasa con una rápida
estimulación (fase de latencia inferior a un minuto) y este efecto se observa durante
30 minutos (Brightman et al., 1987b).
Las concentraciones de auxina que estimulan la actividad oxidasa se encuentran
15
1NIR0DU0C3ÓN
en el mismo intervalo que las que promueven las respuestas fisiológicas (Morré et al.,
1988b y 1988c). La estimulación de la oxidación del NADH por la auxina sugiere que
esta oxidación puede ser un proceso limitante en la respuesta hormonal.
En segmentos de tallo de soja los inhibidores del sistema standard, cis-platinum,
adriamicina y acetato de p-nitrofenol inhiben la elongación (Morré et al., 1988c). Por
el contrario, la presencia de oxidantes externos poseen poco efecto (Morré et al.,
1988a) o incluso inhiben el crecimiento celular (Crane et al., 1984).
En células animales la estimulación del crecimiento en presencia de HCFIII ha
sido considerada como la única demostración de la regulación del crecimiento por el
sistema redox (Ellen y Kay 1983), por tanto las evidencias presentadas anteriormente
(estimulación de la NADH oxidasa por auxinas e inhibición del crecimiento por
inhibidores del sistema redox) están, por el momento, poco contrastadas. Por otra parte,
si la actividad del sistema redox controla la elongación, los aceptores de electrones
deben estimular el crecimiento. En cambio en hipocotilos de soja el HCF III (0.001 a
500 mM) tienen muy poco efecto en la elongación celular (endógena y estimulada por
2,4-D)(Crane et al 1984, Morré et al., 1988a).
La extrusión de protones es considerada como un factor muy importante en el
control del crecimiento celular vegetal. La hormona auxina estimula el crecimiento por
elongación celular mediante un aumento en la extrusión de protones del plasmalema.
El HCF III estimula la extrusión de protones dependiente de auxina y en términos de
la teoría del crecimiento ácido, se debería esperar un aumento en la elongación; por el
contrario Bottger y Lüthen observaron una inhibición en el crecimiento por elongación
en raíces de maíz (Bottger y Lüthen, 1986).
Otros aceptores externos de electrones tales como el Hexabromoiridato (HBIIV)
y el Hexacloroiridato (HCIIV) incrementan la elongación en raíces de maíz (Hassidim
et al., 1987).
La regulación del crecimiento celular por el sistema redox del plasmalema ha
sido estudiada bajo el modo de acción de dos herbicidas (Blein et al., 1986). El
herbicida phemmediphan inhibe la reducción del HCF III y la acidificación del
16
INIRDDUCOÓN
citoplasma en células de Sicamoro. El herbicida Sethoxydim despolariza
reversiblemente el potencial de membrana sin afectar a la actividad ATPasa.
Existe una buena correlación sobre la inhibición de la NADH oxidasa y el
crecimiento por elongación en hipocotilos de soja (Crane et a i , 1991).
Por otra parte se ha determinado que el sistema calcio-calmodulina representa
un paso regulador en la actividad redox del plasmalema (Barr et al.t 1985).
La adición de auxina produce una extrusión de protones y una bajada de pH en
la pared celular, como consecuencia aparecen dos procesos coordinados que son el
ablandamiento de esta pared y la síntesis de nueva pared celular que constituyen el
crecimiento por elongación. La adición de activadores del sistema redox, en presencia
de IAA, produce un aumento notable en la extrusión de protones, en cambio sus
efectos sobre el crecimiento por elongación no están todavía claros.***
Se ha puesto de manifiesto, una serie de hipótesis sobre la posible relación del
sistema redox del plasmalema y el crecimiento por elongación que presenta grandes
contradicciones. El objeto de estudio de esta Tesis Doctoral, es el establecimiento del
mecanismo de acción del sistema redox del plasmalema y su posible regulación de la
elongación celular con el fin de aportar y clarificar algunas de las controversias aquí
detalladas.
17
Introduoción
1.7. OBJETIVOS
En esta memoria de Tesis Doctoral se propone el estudio de la regulación del
crecimiento por elongación celular a través del sistema redox del plasmalema mediante:
1- Estudio del efecto de activadores del sistema redox del plasmalema. Efecto
del HCF III sobre la extrusión de protones y la elongación celular.
2- Efecto de inhibidores del sistema redox del plasmalema. Efecto sobre el
crecimiento por elongación.
3- Estudio de la actividad de los antagonistas calcio-calmodulina sobre la
actividad redox del plasmalema.
4- Regulación del crecimiento mediante el pH citoplasmático. Efecto de las
bases permeantes (NH4C1).
18
M ateriales y M étodos
2. MATERIALES Y METODOS
2.1. MATERIAL VEGETAL
La especies vegetales utilizadas en la realización de este trabajo de investigación
han sido Zea mays L., Avena sativa L. y Glycine max M. Los cultivares utilizados han
sido: maíz, INRA 5a (semillas tratadas con Reldan-48-E, antifúngico protector),
suministrado por LYRA. S. A. (Madrid); avena, VICTORY I (Svalov Ab, Svalóv,
Suecia) y soja, MERR. (semillas suministradas por ASGROW (Barcelona).
El peso medio de las cariopsides de maíz es de 0.023 gr. (n=128). El porcentaje
de germinación aproximadamente 95 %. El peso medio de las semillas de avena es de
0.012 gr. (n=400); El porcentaje de germinación es 97.3 %. El peso medio de los
semillas de soja es de 0.009 (n=250); El porcentaje de germinación es 96.2 %.
2.1.1. GERMINACIÓN
Previamente a la germinación, las semillas son sometidas a los procesos de
lavado, esterilización e imbibición sucesivamente.
a) El lavado con abundante agua destilada elimina los restos vegetales y de
fungicida. Después del lavado, se desechan las semillas dañadas y aquellas de tamaño
muy inferior a la media.
b) La esterilización permite evitar la posible contaminación por
microorganismos. La esterilización de la superficie se realiza mediante la inmersión de
las semillas en una solución de 1 mM CaCl2-lejía (50 gr. cloro activo/litro) al 9 % v/v
durante 15 min, transcurrido este tiempo, las semillas son de nuevo lavadas con una
solución 1 mM CaCl2.
c) La imbibición se lleva a cabo sumergiendo completamente las semillas en la
solución de 1 mM CaCl2 durante dos horas en completa oscuridad en un armario
germinador Selecta modelo S.484 a temperatura constante 30 °C.
19
M ateriales y Métodos
Tras este último proceso, se realiza la siembra en cajas de plástico (30 x 13 x
8 cm) sobre tres hojas de papel de filtro. En cada caja se depositan 90 semillas (orden
15 x 6) con 90 mi de solución 1 mM CaCl2. Las cajas se cierran herméticamente,
mantienen una humedad relativa de aproximadamente 95 % y se incuban en completa
oscuridad en el armario germinador.
Después de 3 días en estas condiciones, se obtienen coleoptilos de maíz y de
avena de tamaño comprendido entre 20 y 40 mm de longitud, e hipocotilos de soja
entre los 20 y 60 mm. Los segmentos de tamaños superior o inferior y aquellos
coleoptilos en los que se aprecia la hoja primaria no son utilizados.
2.1.2. TRATAMIENTO DE LOS SEGMENTOS DE COLEOPTILOS E
HIPOCOTILOS
La preparación de los segmentos se lleva a cabo mediante dos procesos:
eliminación del ápice del coleoptilo y el tratamiento de la cutícula por abrasión.
El ápice del coleoptilo es la principal fuente de auxina endógena y su
eliminación evita el aporte de la hormona a la zona basal del coleoptilo (Went y
Thimann, 1937).
La cutícula que recubre al coleoptilo es impermeable a los protones (Rayle,
1973) y por lo tanto se hace necesario eliminarla parcialmente para poder observar la
extrusión de protones en la fase externa (Cleland, 1976a; Rayle y Cleland, 1977).
Los segmentos se obtienen cortando los coleoptilos que reúnen todas las
características anteriormente citadas con una cuchilla y sometiéndolos posteriormente
a abrasión, mediante el giro de los coleoptilos entre los dedos impregnados con una
pasta de alúmina (Aluminium oxid 150 basish Type T de Merck) y agua destilada en
proporción 1:1 (p/v). Los segmentos se lavan con abundante agua destilada para
eliminar completamente los restos de alúmina.
Posteriormente se secciona el ápice, 2-3 mm del extremo apical, se elimina la
hoja primaria localizada en el interior del coleoptilo y se obtienen segmentos de 10
mm de longitud.
20
M ateriales y M étodos
Los hipocotilos de soja se obtienen en idénticas condiciones, y se elimina el
ápice de unos 20 mm a partir de los cotiledones y cortando segmentos de 10 mm que
son sometidos al mismo proceso de abrasión y lavado que los coleoptilos de maíz y
avena.
2.1.3. PREINCUBACIÓN
Los segmentos apicales se incuban en una solución 1 mM HEPES 4 mM ó 1
mM CaCl2 (pH = 6.0). Las condiciones de la incubación son:
a) Temperatura 30 °C.
b) Agitación mediante una barra y agitador magnético.
c) Aireación por gaseo con una bomba de acuario acoplada a una pipeta Pasteur.
d) El volumen del medio de incubación es aproximadamente 10 mi por
segmento.
e) La duración de la preincubación es de 1 hora.
Este proceso se realiza con el fin de eliminar la auxina endógena y los restos
de células muertas y componentes celulares producidos por el tratamiento de los
segmentos.
2.2. ELONGACIÓN
El crecimiento por elongación se determina mediante la variación de la longitud
de los segmentos de 1 cm, en un transductor de proximidad Phillips (modelo PR 9373).
El transductor mide la distancia entre dos superficies metálicas en forma de diferencia
de potencial que se mide en un voltímetro Hung Chang (modelo HC-5010 C). Este
método permite una medida continua.
Estas medidas se realizan en una cubeta especialmente diseñada que posee un
filamento metálico en el centro que permite la introducción de 4 segmentos de
coleoptilos o bien un tubo de plástico cuyo diámetro interno permite la introducción
de 4 hipocotilos de soja. Se localiza una caperuza metálica de 200 mg sobre el último
21
M ateriales y M étodos
segmento, que se dispone de forma paralela al transductor. El voltaje obtenido y la
distancia son linealmente dependientes en un intervalo (2-8 voltios). La relación
matemática entre voltios y distancia se realizó entre 1.0 y 2.0 mm en incrementos de
0.1 mm. La mezcla de reacción está formada por 43 mi Hepes 10 mM CaCl2 1 mM
(pH 6.0).
Las medidas de crecimiento se realizan cada 0.5 min ó 2 min a lo largo de toda
la cinética de crecimiento.
La velocidad de elongación se obtiene mediante diferenciación numérica. Se
emplea una fórmula de cinco puntos centrada (Persaud y Virden, 1984)
V(I)= (-2N(t-2) - N(t-l) + N(t+1) + 2N(tH-2))/t3k 10* ns segmentos
V(I)= pm/minuto*segmento,
t= intervalo de tiempo constante
N(t)= elongación en pm para cada intervalo de tiempo.
Los cálculos se realizan en el programa Lotus Qpro.
2.3. EXTRUSIÓN DE PROTONES
2.3.1. DETERMINACIÓN
La medida de la extrusión de protones se efectúa mediante la determinación del
pH y la titulación del medio, que se detallará en la sección 2.3.2.
La mezcla de reacción se incuba en una cubeta de vidrio marca Vidrafoc
(Modelo E -11830), termostatizada a 30 °C. La oxigenación del medio se lleva a cabo
por gaseo, mediante una bomba de acuario. La homogenización del medio se consigue
mediante un agitador magnético Selecta (Modelo 242) y una barra magnética Sigma
de 8 x 1.5 mm.
22
M ateriales y M étodos
La variación de pH del medio de reacción se mide con un pH-metro Crison
(Modelo 2002), que permite detectar variaciones de 0.001 pH y los electrodos
combinados INGOLD (n 0-9314 y n V-9331). Las variaciones de pH son seguidas de
forma continua en un registrador HITACHI (Modelo 561). La conexión entre el pH-
metro y el registrador se lleva a cabo mediante un potenciómetro, que permite regular
la escala del registrador al intervalo de pH medido.
La mezcla de reacción está formada por 10 mi HEPES 1 mM CaCl2 4 mM. Lá
adición de CaCl2 en esta mezcla de reacción es debida a la mejora de la permeabilidad
celular, mantiene la capacidad tampón (Van der Volkenburg y Cleland, 1980) y
aumenta la relación señal a ruido durante la medida (González-Darós et al., 1993). El
empleo de sustancias reguladoras o inhibidoras del crecimiento (en ausencia de material
vegetal), no modifican la titulación del medio.
2.3.2. CAPACIDAD TAMPÓN
La medida de extrusión de protones, se realiza en una mezcla de reacción
débilmente tamponada.
El cálculo de la extrusión de protones se suele realizar mediante la
determinación de la capacidad tampón al final del periodo de medida y se admite que
esta capacidad tampón es constante en el intervalo de pH (Vesper y Evans, 1979).
La capacidad tampón de la mezcla de reacción (Figura 2 A), no es constante en
el intervalo de pH empleado. Por lo tanto, se hace necesario calcular la relación entre
los nmoles de protones en el medio y el valor de pH. La titulación del medio de
reacción se obtiene mediante las adiciones de cantidades conocidas de HC1 ó NaOH
mediante el siguiente protocolo:
a) Medida del pH inicial
b) Adición de HC1 o NaOH
c) Medida del pH final
d) Cálculo de la relación entre los nmoles H+ añadidos y el pH externo.
23
M ateriales y Métodos
Esta relación se calcula mediante el ajuste polinomial (grado 1 a 5),
considerándose en cada caso el mejor ajuste, mediante el programa Poly del paquete
estadístico BIOM Sokal-Rohlf (1981).
El polinomio obtenido:
nmoles H+= + a^pH) + a2(pH)2 + a3(pH)3 + a4(pH)4 + a^pH)5.
permite calcular la extrusión de H+ para cada valor de pH, tomando como cero el pH
inicial y la capacidad tampón (Figura 2 A). La diferenciación de este polinomio
permite calcular la capacidad tampón (Figura 2 B).
La presencia de material vegetal (60 coleoptilos ó la adición de diferentes
compuestos) puede modificar la titulación del medio de reacción, por tanto se calcula
la capacidad tampón para cada experimento mezcla de reacción.
2.3.3. VELOCIDAD APARENTE DE EXTRUSIÓN DE PROTONES
La velocidad de extrusión de protones se expresa como neq HVunidad de tiempo
* segmento. Se calcula mediante diferenciación numérica empleando el algoritmo de
la sección 2.2. (Persaud y Virden, 1984).
2.4. REDUCCIÓN DE HCF III
La reducción de HCF III se realiza simultáneamente en la misma mezcla de
reacción empleada en la extrusión de protones (apartado 2.3.1). La A420_500 nm se
realiza en un Espectrofotómetro Spectronic modelo 2000 Beckmann.
Cada cinco minutos se extrae 3 mi de la mezcla de reacción, se mide su
absorción y se reemplazan en la cubeta de medida inmediatamente.
24
Materiales y M étodos
ÍT LxJ — IO
1 6 0 0
1 4 0 0
1200
1000
8 0 0
6 0 0
4 0 0
200
04.5 5.04.0 5.5 6.0 6.5
pH2000
1750
E 1500
* 1250
+ 1000 x
6.5
Figura 2. A): Curva de titulación de una m ezcla de reacción compuesta por 10 mi HEPES 1 mM CaCl2
4 mM 10 pM IAA y 60 segmentos de coleoptilos. B): Capacidad tampón de la m ezcla de reacción
en función del pH.
25
M ateriales y M étodos
2.4.1. VELOCIDAD DE REDUCCIÓN DE HCF III
La velocidad de reducción de HCF III se calcula mediante el siguiente
algoritmo:
A A420 ,00 * 10000V(R) - 4 2 0 ~ S 0 ° ____________________
60 * At
V(R) = nmoles HCF III reducidos / segmento * minuto.
A t = incremento de tiempo (minutos).
Cálculos realizados en el programa Lotus Qpro.
2.4.2. RECUPERACIÓN HCF III REDUCIDO MEDIANTE PERÓXIDO
DE HIDRÓGENO
Las muestras tratadas con HCF III, han sido posteriormente reoxidadas mediante
la adición de alícuotas de peróxido de hidrógeno (1.63 M) en ausencia de coleoptilos.
La tabla I presenta la recuperación del HCF III reducido. Se observa que la
recuperación es próxima al 100 % y por tanto se demuestra que el HCF III no es
transportado al interior celular.
2.5. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
La preparación de las muestras, se ha realizado mediante el siguiente protocolo:
a) La muestra hidratada se sumerge en solución tamponada de glutaraldehído
(25 %).
b) Al cabo de 2 horas la muestra se lava abundantemente con el tampón y se
deshidrata con etanol en concentraciones crecientes: 30-50-70-96 y 100 % a intervalos
de 30 minutos; posteriormente, se incuba en una solución de acetato de iso-amilo, y
se sustituye en el punto crítico por C 0 2 (Critical Point Dryer modelo autosamdri-814).
26
Tabla I. R ecuperación H CF III reducido. R eoxidación m ediante alícuotas de peróxido de hidrógeno 1.63 M
HX>. ímMI0.5 mM HCF III 0.75 mM HCF III 1.0 mM HCF III 1.25 mM HCF III
A420-500 % Recuperado A420-500 % Recuperado A420-500 % Recuperado A420-500 % Recuperado
0 0.297 0 0.483 0 0.771 0 0.798 0
1.08 0.372 79.65 0.560 82.96 0.809 92.35 0.858 81.79
2.71 0.430 92.07 0.600 88.88 0.843 96.23 0.950 90.56
5.43 0.459 98.28 0.667 98.81 0.864 98.63 1.044 99.52
8.15 0.459 98.28 0.670 99.26 0.863 98.63 1.060 101.04
10.86 0.459 98.28 0.670 99.26 0.864 98.63 1.065 101.52
nmoles iniciales 4670 6750 8760 10490
nmoles
recuperados4590 6700 8640 10650
M ateriales y M étodos
2.6. CALMIDAZOLIUMEl compuesto calmidazolium también llamado R-24571 es un derivado del
antimicótico miconazol (Gietzen et al., 1983). ES un antagonista del sistema calcio-
calmodulina mediante la unión especifica a la Calmodulina (Tuana & Mclennan, 1984).
La adición del compuesto calmidazolium en etanol a la mezcla de reacción
HEPES 1 mM CaCl2 4 mM 10 pM IAA y 1 mM HCF III, produce un aumento de la
turbidez. El calmidazolium aumenta la absorción del HCF III debido al aumento de la
dispersión de la luz (Figura 3). Se han utilizado filtros opalescentes para evitar este
problema en la determinación de la reducción de HCF III.
La Tabla II muestra el efecto de los filtros opalescentes en la medida de
absorción a 420 y a 500 nm del medio en presencia de diferentes concentraciones de
HCF III. El ajuste lineal entre la absorción obtenida en presencia de filtros frente a la
absorción obtenida en su ausencia, presenta una pendiente de 1.0006 (c.c.= 0.9999),
demostrando que las absorciones obtenidas son iguales.
TABLA II. Efecto de la utilización de filtros opalescentes en la absorción del HCF III
a 420 y 500 nm. Mezcla de reacción: 10 mi HEPES 1 mM CaCl2 4 mM 10 pM
IAA y 60 segmentos de coleoptilos.
HCF III
[mM]
+ FILTROS OPALESCENTES - FILTROS OPALESCENTES
A420 STD 0vn
<
STD > K>
O STD 8<
STD
0.50 0.562 0.001 0.039 0.0005 0.549 0.0005 0.033 0.0005
0.75 0.802 0.0015 0.034 0.0005 0.810 0.0009 0.040 0.0004
1.00 1.070 0.0012 0.040 0.0004 1.075 0.0008 0.041 0.0005
28
M ateriales y M étodos
2.0
cooA_oen-O<
0 . 5
0.6
.9 0 . 3oc<D<DV4—Q
0.03 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0
Longitud onda (nm)
Figura 3. A): Espectro de absorción del com puesto 1 mM HCF OI en presencia de 30 yM calmidazolium
(a) y 1 mM HCF III (b). B):Espectro de la diferencia. Mezcla de reacción: 10 mi 1 mM HEPES.
4 mM CaCl2, 10 yM IAA y 60 segmentos de coleoptilos.
2 9
M ateriales y M étodos
2.7. ESTADÍSTICA
Las diferencias entre distintos tipos de tratamiento, se ha realizado mediante el
análisis de la varianza. Las diferencias significativas se han calculado mediante la
menor diferencia significativa (Factor LSD).
30
Resultados
3. RESULTADOS
3.1. CRECIMIENTO POR ELONGACIÓN
3.1.1. ELONGACIÓN INDUCIDA POR AUXINA
La velocidad de crecimiento inducido por auxina presenta la típica cinética
bifásica (Figura 4). La fase I alcanza el máximo aproximadamente a los 18-20 minutos.
La segunda fase de elongación se observa a partir del minuto 35, aumentando su
velocidad hasta el minuto 120 donde la velocidad de crecimiento alcanza un valor
aparentemente estacionario. La elongación total y la velocidad de crecimiento son
similares a otros datos ya publicados.
3.1.1.L EFECTO DEL HCF III Y HCF II
En este sección, se presenta el efecto del HCF III (aceptor exógeno del sistema
redox del plasmalema), frente al HCF II (forma reducida del HCF III) en el
crecimiento por elongación inducido por auxina.
La adición exógena de 1 mM HCF III, en presencia de IAA, produce una
estimulación de la elongación. Esta estimulación es estadísticamente significativa y
además no modifica la respuesta bifásica del crecimiento por elongación. El HCF III
aumenta la velocidad de crecimiento de la fase I, en cambio el máximo de la fase II
no presenta diferencias significativas. Por el contrario, la adición de 1 mM HCF II a
la mezcla de reacción, no produce ningún efecto estadísticamente significativo en la
velocidad de crecimiento en ninguna de las dos fases (Figura 4).
Estos datos indican que el efecto del HCF III no es debido a la presencia en el
mezcla de reacción de los iones K+, ya que la forma reducida de HCF III no tiene
ningún efecto.
31
Resultados
en<Den
E3c:o’uoenco
1200
1000
9
0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0
Tiempo (min)1 4
12
10c£*en 8<DenE 6
34
Lü>
2
0
0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0
Tiempo (min)
Figura 4. A): Efecto adición de 1 mM HCF III (#.0) y 1 mM HCF II (7 ,0 ) sobre el crecimiento
inducido por 10 pM IAA (O)- B): Efecto sobre la velocidad de crecimiento. Mezcla de reacción:
43 mi de HEPES 10 mM CaCL 1 mM 10 pM IAA (pH 6.0) y 4 segmentos de coleoptilos.
32
Resultados
El efecto estimulador del HCF III en el crecimiento por elongación es
dependiente de la concentración; en efecto, la adición de diferentes concentraciones de
HCF III (0.5-10 mM) estimulan el crecimiento (Figuras 5 A y 6 A).
La estimulación del crecimiento por HCF III no modifica la respuesta bifásica
de la auxina (Figura 5 B). El HCF III aumenta la velocidad de crecimiento de la fase
I y se observa una pequeña inhibición inicial para la concentración de 10 mM, (fase
de latencia de aproximadamente 18 minutos). La velocidad de crecimiento presenta el
máximo de la fase I en todas las concentraciones. El máximo efecto se obtiene con 5
mM HCF III. La velocidad disminuye para volver a aumentar a partir del minuto 40
(Fase II) (Figura 5 B).
La estimulación relativa del HCF III del crecimiento inducido por IAA presenta
un máximo inicial de hasta 5 veces el valor del control entre los 6-12 minutos (Figura
6 A). 10 mM HCF III presenta una inhibición en los primeros minutos, y se recupera
a partir del minuto 18 con una clara estimulación. Esta estimulación disminuye
progresivamente hasta alcanzar un valor aparentemente estacionario dependiente de la
concentración de HCF III (Figura 6 A).
La Figura 6 B presenta la dosis-respuesta del HCF III para diferentes tiempos
de incubación. En la fase I, la velocidad de crecimiento presenta un máximo para la
concentración de 5 mM HCF III; concentraciones superiores disminuyen su efecto
estimulador. La fase II, por el contrario, presenta una estimulación dependiente de la
concentración, siendo mayor la estimulación para 10 mM HCF III.
33
Resultados
cCL)
Een<uco
E
c:2’ooencO
1 4 0 0
1200 -
1000 -
0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0
Tiempo (min)
•*en (D cn
E
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20
15 -
10 -
5 -
0 -
0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0
Tiempo (min)
Figura 5. A): Efecto de la adición de diferentes concentraciones de HCF IH sobre el crecimiento por
elongación. B): Efecto sobre la velocidad de crecimiento por elongación. La m ezcla de reacción:
43 mi de HEPES 10 mM CaCL 1 mM 10 |uM IAA (pH 6.0) y 4 segm entos de coleoptilos (O
. V . T . D ) ; 0.5 mM HCF III (#); 1.0 mM HCF III (V); 5 mM HCF DI (▼); 10 mM HCF ID (□).
34
Resultados
£
E
oo13EÍO
6
5
4
3
2
1
00 20 40 60 80 100 120 140
Tiempo (min)20
B
1 5 -
10 -
min 120
▼ $
£*CT>03en
E3.
> 5 -
V
▼▼ ^ V, /
rV' •i /m o' /*o
O
min 90
O rnin 30
'O
O min 6 O
00 2 4 6 8 10 12
[HCF III mM]
Figura 6. A): Efecto estimulador HCF m. Normalización para el control. B): Efecto dosis respuesta HCF
ID en la velocidad máxima de crecimiento para distintos tiempos de incubación. Datos de la Figura
5.
35
Resultados
La adición de 50 mM HCF III, produce una inhibición casi completa del
crecimiento, con un aumento de la fase de latencia (60 minutos) y disminución de la
elongación (Tabla III).
Tabla III. Efecto de 50 mM HCF III en el crecimiento y velocidad de elongación. Los
coleoptilos son incubados en 43 mi HEPES 10 mM CaCl2 1 mM (pH 6.0) y 10
pM IAA. Adición IAA y HCF III a t=0 minutos. Valores promedio (n=4).
Tiempo Elongación (pm/segmento) Velocidad (pm/seg*min) Inhibición(min) 10 pM IAA 50 mM HCF III 10 pM IAA 50 mM HCF III (%)
10 14 0 2,99 0 100
20 41,2 0 4,05 0 100
30 71,6 0 3,7 0 100
40 104 0 5,32 0 100
50 149 0 6,67 0,05 100
60 205 0,47 7,94 0 99,76
70 267 1,89 8,97 0,27 99,29
80 339 3,78 9,04 0,2 98,88
90 408 5,67 9,8 0,35 98,61
100 486 8,27 10,2 0,34 98,3
110 568 11,3 10,9 0,33 98
120 651 14,4 10,4 0,43 97,8
Los resultados experimentales obtenidos (Figuras 4-6, Tabla III) demuestran que
la adición de HCF III produce una estimulación significativa de la elongación. El
efecto estimulador es dependiente de la concentración y el tiempo de incubación en
HCF III. Las concentraciones de HCF III de 10 mM o superiores aumentan la fase de
36
Resultados
latencia y disminuyen el crecimiento; estos efectos están posiblemente asociados a
efectos osmóticos y/o concentración de potasio. Por tanto, se concluye que el HCFIII,
aceptor del sistema redox del plasmalema, estimula la elongación observada en
presencia de IAA.
3.1.1.2. ADICIÓN DE HCF III EN LA FASE II
Una vez determinado el efecto de HCF III en la fase I de crecimiento,
estudiamos el efecto de HCF III en la fase estacionaria de crecimiento (Fase II).
La adición de 5 mM HCF III al cabo de 120 minutos de incubación en IAA
estimula la elongación del coleoptilo (Figuras 7 A y 8 A). La velocidad de elongación
presenta un máximo en el minuto 128. La velocidad de elongación disminuye
continuamente a partir de ese momento y tiende a un valor estacionario al cabo de 120
minutos de incubación (Figura 7 B).
La velocidad relativa aumenta hasta tres veces y presenta un máximo al cabo
de 8 minutos de incubación, a continuación disminuye de forma continua (Figura 8 B).
37
Resultados
2 7 0 0
2 4 0 0
<? 2 1 0 0 </)
£ 1 8 0 0
•o 1 5 0 0 ’u
? 1200 oLü
9 0 0
6 0 0
1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0
Tiempo (min)3 0
2 5
cES, 20<uV)
E:L
Cl)>
1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0
TIEMPO (min)
Figura 7. A): Efecto adición de 5 mM HCF UI (# .0) en el t = l20 sobre el crecimiento inducido por 10
pM IAA (O). B): Efecto en la velocidad de crecimiento por elongación. La flecha indica adición.
La m ezcla de reacción: 43 mi de HEPES 10 mM CaCl2 1 mM 10 ,uM IAA (pH 6.0) y 4 segmentos
de coleoptilos.
38
Resultados
E
E
c:2’ooDE*00
6
4
2
.0 mmmmmimomommD
100 1 5 0 200
Tiempo (min)2 5 0
5 . 0
2 . 5QJ>
C:o’ooDE
Lü
vsyyy$yvmyT_inofinnrinn ^
100 1 5 0 200 2 5 0
Tiempo (min)
Figura 8. A): Efecto estimulador 5 mM HCF III sobre el crecimiento por elongación. B): Efecto
estimulador sobre la velocidad de crecimiento. Datos Figura 7.
39
Resultados
3.I.I.3. READICION DE HCF III AL CABO DE 30 MINUTOS
La readición de HCF III al cabo de 30 minutos de incubación con 10 pM IAA
y 1 mM HCF III, produce un aumento en la elongación del coleoptilo (Figura 9 A).
Esta estimulación se observa a los 2 minutos de la readición, produciendo un nuevo
máximo en la velocidad de crecimiento al cabo de 12 minutos, con una cinética similar
al primer máximo; la estimulación total es menor para esta segunda adición (Figuras
9 y 10).
La readición de HCF III es capaz de estimular de nuevo el crecimiento, aunque
la magnitud de esta estimulación es menor que la obtenida a la adición a tiempo cero.
3.1.2. ELONGACIÓN BASAL DEL COLEOPTILO
3.I.2.I. EFECTO DE HCF III Y HCF II
La elongación basal del coleoptilo (Figura 11 A) representa aproximadamente
el 8 % del crecimiento obtenido en presencia de IAA a lo largo de 120 minutos de
incubación (Figuras 11 y 4). La adición de HCF III produce un incremento en la
elongación del coleoptilo de casi cuatro veces el crecimiento basal (Figuras 12 y 13).
La adición de HCF II no produce efecto significativo alguno en la elongación total
(Figura 11).
El crecimiento basal del coleoptilo no presenta fases de crecimiento
diferenciadas; la velocidad de crecimiento se caracteriza por un aumento casi lineal
durante todo el período de medida. La adición de HCF III incrementa la velocidad de
crecimiento desde el momento de la adición. La adición de 1 mM HCF II no produce
ningún efecto significativo en el crecimiento (Figura 11).
La adición de concentraciones crecientes de HCF III, producen un incremento
de la elongación del coleoptilo (Figura 12 A y 13 A). Este incremento es dependiente
de la concentración.
40
Resultados
1000
| 8 0 0 <DEen
% 6 0 0
E=L
4 0 0
HCFc
:ouoenco 200
Ld
0 3 0 6 0 9 0
Tiempo (min)20
HCF
E
CD>
0 3 0 6 0 9 0
Tiempo (min)
Figura 9. A): Efecto de la readición de 1 mM de HCF III (# .0) 1=30 minutos en la elongación celular
inducida por l mM HCF III y 10 pM IAA (O) a 1=0 minutos. B): Efecto de la readición en la
velocidad de crecimiento. Mezcla de reacción: 43 mi de HEPES 10 mM CaCI2 1 mM 10 pM LAA
(pH 6.0) y 4 segm entos de coleoptilos.
41
Resultados
1 .
E\E=ic:2ooDEen
ÜJ
c'OooDE(n
1 .
1 .
0 20 4 0 6 0 8 0 100
2.2
2.0
1.8
1.6
1 .4
1.2
1 .0
Tiempo (min)
i i i0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0
Tiempo (min)
Figura 10. A): Cinética de la estimulación de la elongación por la readición de 1 mM HCF HI a t=30
minutos. B): Efecto en la velocidad de elongación. Datos figura 9.
4 2
Resultados
400
. *
^ 200
en 1 0 0
enO)en
£
O 20 40 60 80 100 120 140
Tiempo (min)0
8
6
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0
0 20 40 60 80 100 120 140
Tiempo (min)
Figura 11. A): Efecto de los compuestos HCF Iíl y HCF II en la elongación basal del coleoptilo. B):
Efecto en la velocidad basal de crecimiento. Mezcla de reacción: 43 mi de HEPES 10 mM CaCl2
1 mM (pH 6.0) y 4 segmentos de coleoptilos (0 .#< V ); 1 mM HCF DI ( • ) , 1 mM HCF II (V),
Control sin adición (O).
43
Resultados
6 0 0
5 0 0
! 4 0 0
3 3 0 0cOg 200encO
100Ld
0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0
Tiempo (min)
*en<L>en
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o>
10
8
6
4
2
0
0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0
Tiempo (min)Figura 12. A): Efecto del com puesto HCF ID en la elongación basal del coleoptilo. B): Efecto en la
velocidad de elongación. Mezcla de reacción: 43 mi de HEPES 10 mM CaCl2 1 mM 10 pM IAA
(pH 6.0) y 4 segm entos de colcoptilos. (O) y 0.5 mM HCF OI ( • ) , o 1 mM HCF III (V), 5 mM
HCF AI (▼) y 10 mM HCF n i (□>.
4 4
Resultados
A5 -
E
E 4
I 3_o□
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1 -
/ i w ? 7
sUUULSJ
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0 20 40 60 80 100 120 140
Tiempo (min)
cE*enCDen\E
<D>
10
min 120y8
min 906
min 604
min 302
0
0 2 6 8 10 124
[HCF III mM]
Figura 13. A): Efecto estimulador del compuesto HCF d i en la elongación celular. Normalización del
control. B): Efecto dosis respuesta HCF III en la velocidad de elongación a diferentes tiempos de
incubación. Datos figura 12.
45
Resultados
Este efecto estimulador del HCF III se observa en las Figuras 12 B y 13 B, la
velocidad de crecimiento, aumenta sin observarse ninguna de las dos fases del
crecimiento inducido por auxina (Figuras 12 y 13 B). El tratamiento con 25 mM HCF
III produce un aumento de la fase de latencia (40 minutos) y una posterior
recuperación de la elongación (Tabla IV).
La adición de 50 mM HCF III produce una inhibición total del crecimiento
(Tabla IV).
Tabla IV. Efecto de la adición de HCF III (25 mM y 50 mM) en el crecimiento. Los
coleoptilos son incubados en 43 mi HEPES 10 mM CaCl2 1 mM (pH 6.0).
Adición HCF III a t=0 minutos. Valores promedio (n=4).
TiempoElongación
(pm/segmento)Velocidad (pm/seg*min) % Inhibición
(min) Basal 25 mM HCF III
50 mM HCF III
Basal 25 mM HCF III
50 mM HCF III
25 mM HCF III
50 mM HCF III
10 1,42 0 0 0,29 0 0 100 100
20 5,32 0 0 0,69 0 0 100 100
30 10,5 0 0 0,71 0 0 100 100
40 15,9 0 0 0,75 0 0 100 100
50 22,1 3,78 0 0,91 1,02 0 83,03 100
60 29,7 13,2 0 1,19 1,49 0 55,55 100
70 39,9 26,9 0,236 1,48 1,83 0 32,4 99,4
80 52,7 44,4 0,47 1,94 2,41 0,106 15,7 99,1
90 67,5 59,8 2,13 1,96 2 0,16 11,5 96,85
100 84,1 78,7 2,84 2,5 2,5 0,023 6,4 96,63
110 104 100 2,84 2,65 3,08 0,07 3,6 97,3
120 125 122 4,02 2,7 2,67 0,106 2,2 96,78
46
Resultados
Los resultados experimentales obtenidos en la sección anterior (3.1.2.) (Figuras
4-13), demuestran que las concentraciones de HCF III empleadas como aceptor de
electrones del sistema redox estimulan significativamente, tanto la elongación basal
como la elongación en presencia de IAA e coleoptilos de maíz.
3.1.3. ABRASIÓN
La abrasión puede modificar la elongación celular y por ello es posible que el
efecto estimulador del HCF III sea debido a la abrasión. Sin embargo, esta hipótesis
de trabajo se rechaza ya que el efecto estimulador del HCF III es observado en
coleoptilos intactos (no sometidos a abrasión con alúmina). En efecto, como se observa
en las Figuras 14 y 15, la abrasión no afecta significativamente el crecimiento basal.
De igual modo, tampoco afecta el crecimiento inducido por 5 mM HCF III en
presencia y ausencia de IAA.
Este método de abrasión no produce daños mecánicos importantes en el
coleoptilo. El corte transversal del coleoptilo de maíz muestra dos grupos de haces
vasculares longitudinales y completamente opuestos.
47
Elon
gació
n (/
xm/s
eg)
Resultados
1400Mil 1 0/xM IAA Abrasión \\M 1 0/xM IAA Sin Abrasión
IAA + HCF III Abrasión I Mi IAA+ HCF III Sin Abrasión
1200
000
800
600
400
2 00
00 30 60 90 120 150
Tiempo (min)
Figura 14. Efecto del proceso de la abrasión en el crecimiento por elongación inducido por 10 pM IAA
o 10 pM IAA y 5 mM HCF III.
48
Resoltados
600Z¡Z[j basal Abrasión \sSN basal Sin Abrasión
5005 mM HCF III Sin Abrasión
ST 400
'O
CT>o 200
100
01501209030 600
Tiempo (min)
Figura 15. Efecto del proceso de la abrasión en el crecimiento basal por elongación del coleoptilo y por
5 mM HCF DI.
4 9
Resultados
Fotografía 1. Detalle de haz vascular. Coleoptilo de 7.ea mays.
La estructura de los haces vasculares presenta la disposición típica de los vasos
de xilema y floema, propia de monocotiledoneas.
Se observa también la presencia de hasta 7 niveles de células parenquimáticas,
la epidermis y la cutícula.
Las observaciones microscópicas del coleoptilo presentan la cara externa con
una alta densidad de estomas (Fotografía 2 A). Su cara interna de estructura diferente,
presenta muy pocos estomas o casi ninguno debido sobre todo a que no está en
contacto con el medio externo y no puede realizar sus funciones; transpiración e
intercambio gaseoso (Fotografía 2 B).
5 0
Resultados
fo togra fía 2. Observación m icroscopía electrónica del coleoplilo de Zea mays.A): Cara externa; detalle
de los estomas. B): Cara interna. La barra representa 10 uní.
51
resultados
La abrasión manual sólo muestra daños en las células epidérmicas de una forma
ocasional permaneciendo intactas la mayor parte de las células.
En las fotos 3 A y B, se observa como el coleoptilo permanece íntegro, no se
observa daños, excepto en el aspecto externo de la cutícula (Fotos 4 A y B).
Estos resultados experimentales demuestran que la abrasión manual con óxido
de aluminio, es un método que disminuye el espesor de la cutícula sin destruir las
células.
El efecto estimulador del HCF III no está asociado por el efecto de la abrasión,
obteniéndose resultados similares tanto en coleoptilos con abrasión como en segmentos
intactos (Figuras 14 y 15).
3.1.4. INHIBIDORES
Se ha estudiado el efecto de diferentes inhibidores específicos tanto en presencia
como en ausencia de auxina, en el crecimiento por elongación estimulado por HCF III.
La utilización de inhibidores específicos, permite caracterizar el crecimiento observado
en presencia de HCF III. Los inhibidores utilizados han sido: atebrina, DCCD y CH.
3.I.4 .I. ATEBRINA
La atebrina es un inhibidor específico de la NADH-oxidasa tipo I del
plasmalema (Crane y Lów, 1976; Blein et al., 1986; Brightman et al., 1987b). La
adición de diferentes concentraciones de atebrina produce una inhibición de la
elongación del coleoptilo y de la velocidad de crecimiento dependiente de la
concentración de atebrina y del tiempo de incubación tanto en presencia como en
ausencia de IAA. El mayor efecto se observa para 100 pM atebrina (Figuras 16-19).
52
Resultados
Fotografía 3. Observación al m icroscopio electrónico del coleoptilo de Zea mays. A): Superficie extem a
sometida a abrasión. B): Superficie extema intacta. La barra representa 100 pm.
53
Resultados
B
Fotografía 4. Observación por m icroscopía óplica. Corle transversal ilcl colcoplilo de Zea mays. A):
Superficie sometida a abrasión. B): Superficie intacta.
54
Resultados
300
250
8 200E
3 150c'O8 100 en c o
Ld 50
0 5 10 15 20 25 30 35
cE*en<Dcr
E
■Oo"O’o_o<D>
Tiempo (min)18
15
12
9
6
3
0
5 10 15 20 25 30 350
Tiempo (min)
Figura 16. A): Efecto de la adición de diferentes concentraciones de atebrina sobre el crecimiento por
elongación. B): Efecto sobre la velocidad de elongación. Mezcla de reacción: 43 mi de HEPES 10
M m CaCl2 1 Mm 10 pM IAA (pH 6.0) y 4 segmentos de coleoptilos (O , V , □ ); 10 pM
atebrina ( • ) , 50 pM atebrina (V), 75 pM atebrina (▼) y 100 pM atebrina O ).
55
resultados
| 0.8
E>5 0.6c'O‘y 0 .4’-Qc 0.2
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (m in)
1 .2
1.0
vel)
0 .8
<00.6
c:2[o 0 .4A'szc
0.2
0 .0
B
• *
/S
j____ i J L
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (m in)
Figura 17. A): Efecto inhibidor de la elongación del compuesto atebrina. B): Inhibición relativa de la
velocidad de crecimiento. Datos de la figura 16.
56
Resultados
40
30
E
c:2 ’o o cr> c o
LO
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (min) 2 .5 ----------------------------------------
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (min)
Figura 18. A): Efecto de la adición de diferentes concentraciones de atebrina sobre el crecimiento basal
por elongación. B): Efecto sobre la velocidad basal de elongación. Mezcla de reacción: 43 mi de
HEPES 10 Mm CaCK 1 Mm (pH 6.0) y 4 segmentos de coleoptilos (O); 10 pM atebrina ( • ) , 50
pM atebrina (V), 75 pM atebrina (▼) y 1 (X) uM atebrina (O .
57
resultados
1. 2
1.0
| 0.8 \ E
3 0.6c‘O’o 0 .4 'n
1 0.2
0.0
0 5 10 15 20 25 30 35
1.2
1.0
5 0.8 <D
- i 0.6C
'2.'y 0.4_o’-Cc
“ 0.2
0.0
0 5 10 15 20 25 .30 35
Tiempo (min)
Figura 19. A): Efecto inhibidor de la elongación basal por el compuesto atebrina. B): Inhibición relativa
de la velocidad basal de crecimiento. Datos de la figura 18.
58
Tiempo (min)
B
i± "L
1 IIXIIITuiJ L
m m m m im m im x m n m iw
□ X T E
Resultados
3.1.4.2. DCCD
El DCCD es un inhibidor especifico del sistema ATPasa de la membrana
plasmática (Cleland, 1973; Rayle, 1973; Solioz, 1984). La adición de DCCD 100 pM
en presencia de HCF III, produce una disminución tanto del crecimiento basal como
del inducido por IAA (Tabla V). Este efecto inhibidor es prácticamente constante
durante todo el período de incubación (Tabla V).
3.I.4.3. CICLOHEXIMIDA
La cicloheximida es un inhibidor de la síntesis de proteínas en el citosol (Marré
et al., 1973; Dostrom et al., 1980). La adición de 35 pM cicloheximida tanto en
presencia como ausencia de IAA inhibe totalmente el crecimiento por elongación en
coleoptilos de maíz inducido por HCF III, (Tabla V).
Se concluye por tanto, que el crecimiento estimulado por HCF III al igual que
el observado tanto en presencia de auxina como el crecimiento endógeno, es
dependiente de la actividad de el sistema redox del plasmalema y está asociado a la
actividad ATPasa y biosintesis de proteínas.
3.1.5. ELONGACIÓN EN COLEOPTILOS DE AVENA E HIPOCOTILOS
DE SOJA
El efecto estimulador del HCF III sobre el crecimiento por elongación se estudia
también en otras especies y en otro tipo de tejido (coleoptilos de avena e hipocotilos
de soja), con el fin de poder caracterizar si el efecto del HCF III en el crecimiento es
compartido por otras especies vegetales y no es una característica propia de los
coleoptilos de maíz.
59
Resultados
Tabla V. Efecto de los compuestos CH (35 pM) y DCCD (100 pM) en el crecimiento
por elongación, inducido por 5 Mm HCF III, tanto en presencia como en
ausencia de 10 pM IAA. Los coleoptilos son incubados en 43 mi HEPES 10
Mm CaCl2 1 Mm 5 Mm HCF III (pH 6.0). Adición inhibidor a tiempo cero.
Valores promedio (n=6).
Tiempo (min)
10 15 20 25 30
Elongación (pm/seg) en 10 pM IAA
+ 5M m HCF 24,62 69,64 121 176,7 226,9 276,5
" + 100 pM DCCD 0 1,02 3,38 7,01 11,42 15,76
" + 35 pM CH 0 1,18 2,6 5,04 7,8 9,29
% Inhibición
100 pM DCCD 100 99,5 97,2 96,1 95 95
35 pM CH 100 98,4 97,9 97,3 96,6 96,7
Elongación (pm/seg) Basal
+ 5 Mm HCF 0,27 3,07 9,49 16,3 24,14 33,48
" + 100 pM DCCD 0 0,7 1,4 1,4 1,8 2,36
" + 35 pM CH 0 0,23 2,36 4,25 4,96 5,67
% Inhibición
100 pM DCCD 100 99,5 98 99 94 92,95
35 pM CH 100 99,8 93,4 87,5 87,5 86,2
Resultados
3.1.5.1. EFECTO HCF III EN LA ELONGACIÓN DE LOS
COLEOPTILOS DE AVENA
El crecimiento inducido por auxina en los coleoptilos de avena se presenta en
la Figura 20. La adición de HCF III produce una estimulación significativa de la
elongación.
La velocidad de crecimiento inducida por IAA en coleoptilos de avena se
presenta en la Figura 20 B. La velocidad de crecimiento se incrementa por la adición
de 1 mM HCF III, El HCF III produce una estimulación del crecimiento sin modificar
la cinética de la IAA.
La adición de 5 mM produce un aumento de la fase de latencia sin modificar
de manera importante el resto de la cinética. (Figura 21).
3.1.5.2. CRECIMIENTO POR ELONGACIÓN EN HIPOCOTILOS DE
SOJA
La cinética de crecimiento por elongación inducida por auxina en segmentos de
hipocotilos se muestra en la Figura 22. La adición de HCF III produce un claro
aumento de la elongación total de los segmentos para una concentración de 5 mM y
1 mM HCF III.
Los hipocotilos de soja (Figura 22) presentan una velocidad basal constante, la
adición de IAA produce un descenso de la velocidad que rápidamente se recupera
alcanzando un máximo en el minuto 16 (Fase I de crecimiento).
Las diferentes adiciones de HCF III, estimulan el crecimiento, aumentan el
máximo de velocidad sin modificar la cinética de crecimiento (Figuras 22 y 23).
3.1.5.3. ABRASIÓN
La abrasión de los coleoptilos de avena e hipocotilos de soja, no modifican la
estimulación del crecimiento inducido tanto por IAA como por HCF III (Figuras 24
y 25).
61
Resultados
en<Den
E3c;0UOenco
8 00
6 00 -
4 0 0 -
200 -
0
E*en<L>en
\E
3TDO*o
’u_o<D>
9
0 20 40 60 80 100
Tiempo (min)1 4
12
10
8v„..; V7
6
4
2
0 w
0 20 40 60 80 100
Tiempo (min)
Figura 20. A): Efecto de la adición del compuesto HCF III sobre el crecimiento inducido por 10 uM
IAA en los coleoptilos de Avena sativa. B): Efecto sobre la velocidad de elongación. Mezcla de
reacción: 43 mi de HEPES 10 mM CaCI2 1 mM 10 pM IAA (pH 6.0) y 4 segmentos de coleoptilos
(O . « . V ) ; 1 mM HCF HI <•> y 5 mM HCF III (V).
62
Resultados
E\E
c:o‘oo13
EM
4
3
2
0
80 1000 20 40 60
Tiempo (min)
y v v
\ J
0 80 10020 40 60
Tiempo (min)
Figura 21. A): Estimulación relativa del crecimiento por elongación en coleoptilos de avena por HCF
III. B): Estimulación relativa de la velocidad de crecimiento. Datos Figura 20.
63
Resultados
8 7 5
750
? 625
E 500
3 7 5'O
g, 2 5 0
25LxJ
0 20 40 60 80
Tiempo (min)24
B20 -
cEoo 16oen
V
E3-oo■OCJ_o0>
^ v v - v v v v w1 2 -
8 -
4 -
A
00 60 8020 40
Tiempo (min)
Figura 22. A): Efecto de la adición del compuesto HCF in sobre el crecimiento inducido por 10 uM
IAA en los hipocotilos de Glycine max. B): Efecto sobre la velocidad de elongación. Mezcla de
reacción: 43 mi de HEPES 10 mM CaCl2 1 mM 10 uM IAA (pH 6.0) y 4 segmentos de coleoptilos
(O . V ); 1 mM HCF III ( • ) y 5 mM HCF III (V).
64
Resultados
E\E
3c‘O
’o_oDEco
2.5
y v W V W W - V
2.0
.5
0
0 20 40 60 80
Tiempo (min)3.5
CU>
CU>
c:o'oo13E</)
L ü
- • - • • • 8 oc)ooooooo8 8 o8 :» «
o 20 40 60 80
Tiempo (min)
Figura 23. A): Estimulación relativa del crecimiento por elongación en hipocotilos de soja por HCF IH.
B): Estimulación relativa de la velocidad de crecimiento. Datos figura 23.
65
Elon
gació
n (/
xm/s
eg)
Resultados
1000 ,1 1 0 /xM IAA Sin Abrasión
| [10 /xM IAA + 1mM HCF III Sin Abrasión[\V 11 0 /xM IAA Abrasión
800 h F991 " + 1 mM HCF III Abrasión
600 -
400 -
2 0 0 -
0 \
30 60 90
Tiempo (min)
Figura 24. Efecto del proceso de la abrasión en el crecimiento por elongación inducido por 10 pM IAA
o 10 pM IAA y 5 mM HCF III en coleoptilos de avena.
66
Elon
gació
n (/
xm/s
eg)
Resultados
1200
1000
800
600
400
2 0 0
0
Figura 25. Efecto del proceso de la abrasión en el crecimiento por elongación inducido por 10 pM IAA
o 10 pM LAA y 5 mM HCF III en hipocotilos de soja.
1 1 0 /xM IAA Sin Abrasiónl [10 /xM IAA -i- 1mM HCF III Sin AbrasiónKVl 1 0 / l ¿ M IAA AbrasiónfWI " + 1 mM HCF III Abra sion r ~
\
30 60
Tiempo (min)
90
67
Resultados
3.1.6. EFECTO DEL ION Ca2+ EN EL CRECIMIENTO INDUCIDO POR
IAA Y HCF III.
La reducción de HCF III aumenta en presencia de cationes bivalentes (Sección
3.2.2.).
Si el efecto estimulador del HCF III es debido a su reducción por el sistema
redox, en presencia de cationes bivalentes (Ca2+), se esperaría una mayor estimulación.
La Figura 26 demuestra que en presencia de 4 mM Ca2+ el crecimiento estimulado por
IAA se inhibe, sin manifestarse la cinética bifásica.
Este efecto inhibidor probablemente está asociado al aumento de la rigidez o la
modificación de la estructura de la pared en presencia de calcio (Prat et al., 1984). El
mecanismo de esta inhibición está todavía sujeto a controversia.
La adición de diferentes concentraciones de HCF III a la mezcla de reacción con
4 mM CaCl2 produce una estimulación de la elongación total del coleoptilo (Figuras
26 y 27). La estimulación máxima se observa en presencia de 5 mM HCF III. Se
recupera, aparentemente, la cinética bifásica, con un aumento progresivo de la fase de
latencia (Figura 28).
En la dosis respuesta del HCF III se observa que la máxima velocidad de
crecimiento se obtiene para 1 mM HCF III en los primeros 30 minutos. La
concentración 5 mM HCF III presenta el máximo de velocidad a partir del minuto 40
de incubación, (Figura 28).
La estimulación máxima del HCF III es dependiente del período de incubación
y de su concentración (Figura 28).
Estos resultados indican que el HCF III estimula la elongación incluso en
presencia de concentraciones relativamente altas de Ca2\ y por tanto el sistema redox
puede revertir la inhibición del calcio.
68
Resultados
2500
2 0 0 0en0)oo 1500
c 1000 :o*uoen§ 5 0 0
L Ü
0 20 40 60 80 100 120 140Tiempo (min)
- 2 — i____ i i i i i i_____0 20 40 60 80 100 120 140
Tiempo (min)
Figura 26. A): Efecto de la adición de diferentes concentraciones de HCF III sobre el crecimiento
inducido por 10 pM IAA en presencia de 4 mM CaCl2. B): Efecto sobre la velocidad de
crecim iento. Mezcla de reacción: 43 mi de HEPES 10 mM CaCl2 4 mM 10 pM IAA (pH 6.0) y
4 segm entos de coleoptilos (O .# .v . ); I mM HCF III (#); 5 mM HCF ni (v); 10 mM HCF III
(▼)•
69
Resultados
E:i
E
c:o*oDEcn
</)
6
5
4
3
2
0
0 20 40 60 80 100 120 140
<d 5> J
ü A> 4c
o£ 2
Tiempo (min)i r
v b F * 7
0 20 40 60 80 100 120 140
Tiempo (min)
Figura 27. A): Estimulación relativa del crecimiento por elongación por HCF HI en presencia de 4 mM
CaCl2. B): Efecto estimulador de la velocidad de crecimiento. Datos de la Figura 26.
7 0
Resultados
E*en0enXE
3 .*ooT3<JO0>
0"O0(f)O
10
8
6
2
0
- 2
A^ v x rnin 120
min 1 0
- 2 0 2 4 6 8
[mM] HCF III
10 12
2 5
20
5
10
5
010 128- 2 0 2 64
[mM] HCF III
Figura 28. A): Efecto dosis respuesta de HCF ÍTI en la velocidad de elongación celular en presencia de
4 mM CaCl2 a distintos tiempos de incubación. B): Efecto de HCF III en la fase de latencia del
crecim iento por elongación.
71
Resultados
3.2. REDUCCIÓN DE HCF III
En este sección, se estudia la reducción del HCF III como consecuencia de la
estimulación de la actividad NADH-HCF III-oxido-reductasa de la membrana
plasmática.
3.2.1. CINÉTICA DE REDUCCIÓN
La A420_500 presenta dos fases, una fase muy rápida (2 primeros minutos) y una
fase lenta (hasta el final de la incubación) (Figura 29 A). El HCF III no se reduce en
ausencia de coleoptilos en la mezcla de reacción, y la A420_500 permanece constante
(Datos no presentados).
En la figura 29 B se observa la liberación de nmoles de HCF II en la mezcla
de reacción como consecuencia de la reducción de HCF III por los coleoptilos durante
la fase II. La velocidad de reducción de HCF III es aparentemente constante. Esta
reducción es dependiente de la concentración (Figura 30).
3.2.2. ESTIMULACIÓN DE LA REDUCCIÓN DEL HCF III POR
CALCIO.
En este sección, se estudia el efecto de los cationes bivalentes sobre la reducción
de HCF III en presencia de 10 pM IAA.
El calcio estimula la reducción de HCF III en presencia de 10 pM IAA, (Figura
31), el máximo efecto se obtiene para 4 mM Ca2+.
72
Resultados
Ec
ooLOIo
CN
c:o’ooen-Q<
Adic ión
0.9
0.8
0 .0 OOO
0 10 20 30 40 50Tiempo (min)
1750
1500
1250Adic ión
O 1000X
(/)<DOEc 500
750
250
0 10 20 30 40 50 60 70
Tiempo (min)
Figura 29. A): Variación en la absorción a 420-5ÍX) nm del compuesto HCF III en presencia de 60
segm entos de coleoptilos de maíz. B): Cinética de reducción del HCF ID (nmoles HCF II liberados
al m edio de reacción). Mezcla de reacción: 10 mi HEPES 1 mM CaCl2 4 mM 10 pM IAA y 60
segmentos de coleoptilos.
73
nmol
es
HCF
III re
duci
dos
Resultados
1500
1400
1300
1200
1 100
1000
900 -
800
700
600
5000.50 0.75 1.00 1.25
[HCF III] mM
Figura 30. D osis respuesta en la reducción del compuesto HCF III. M ezcla de reacción: 10 mi HEPES
1 mM CaCl2 4 mM 10 pM IAA y 60 segmentos de coleoptilos.
74
Resultados
1600
1400
* 12 000 ■O
1 1000
800ü_OX
2 600oEc 400
200
0
Figura 31. Efecto del catión Ca:+ en la reducción de 1 mM HCF ID. Cinéticas de 1 hora de duración.
M ezcla de reacción: 10 mi HEPES 1 mM 1 mM HCF III, 10 ^M IAA y 60 segmentos de
coleoptilos.
75
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1
[CaC 12 mM]
Resultados
3.2.3. REDUCCIÓN EN AUSENCIA DE AUXINA
En ausencia de auxina, la reducción de HCF III presenta cinéticas de reducción
con fase I (proceso rápido) y fase II (proceso lento)(Figura 32). La reducción es
dependiente de la concentración y presenta valores muy parecidos a los obtenidos en
presencia de 10 pM auxina (Figura 32); por ello se obtienen valores similares en la Km
y la Vmax (Figura 33).
La fase II de reducción presenta una cinética micaeliana (representación
Lineweaver-Burk Figura 33)
3.2.4. EFECTO DE LOS ANTIBIÓTICOS EN LA REDUCCIÓN DE HCF
III
La reducción de HCF III puede ser realizada por los microorganismos presentes
en la mezcla de reacción.
En presencia de 150 pM cloranfenicol y 5 mM penicilina, la A420.5oo nm no
presenta diferencias significativas en la velocidad de reducción de HCF III, ni en la
magnitud total (Figura 34).
Estos resultados experimentales demuestran que la reducción de HCF III se
realiza exclusivamente por los coleoptilos en el medio de incubación.
76
Resultados
1200
1000cn o ■o'uD■o<D
800
600Li_
0 10 20 30 40 50 60 70Tiempo (min)
15001400
o 1300’ ( J D
S 1 100
1200
1000
x 900 v 800o| 700
600
Ll.
5000.50 0.75 1 .00 1 .25
[HCF III mM]
Figura 32. A): Cinética de reducción de 1 mM HCF III en ausencia de IAA. B): Dosis respuesta de la
reducción del compuesto HCF III en ausencia de IAA. Cinéticas de 1 hora de duración. Mezcla de
reacción: 10 mi HEPES 1 mM CaCl2 4 mM 10 uM IAA y 60 segmentos de coleoptilos.
77
Resultados
-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
1 / [ H C F III ]
Figura 33. Representación del Lineweaver-Burk para la reducción de HCF III tanto en presencia como
en ausencia de L \A . Mezcla de reacción: 10 mi HEPES 1 mM CaCl2 4 mM y 60 segmentos de
coleoptilos. 10 pM IAA (Km = 2.79 mM y Vmax = 70.69 nmoles/min); sin LA A (Km = 2.59 mM
y Vmax = 69.35 nmoles/min).
78
Resultados
1.0
Ec 0.9ooin
s ° - 8
c'Ou 0.7oen
.o<
0.1
0.0
0 10 20 30 40 50 60 70
Tiempo (min)
Figura 34. E fecto de los antib ióticos C loranfenicol y Penicilina en la reducción de HCF ID. M ezcla de
reacción: 10 mi HEPES 1 mM C aC l2 4 mM 10 ,uM IA A y 60 segm entos de co leop tilos (O .# ); 1
m M H CF m (O) o 150 pM C loranfenicol + 5 mM Penicilina y 1 mM HCF III (# ) .
79
Resultados
3.3. HCF III ESTIMULA LA EXTRUSION DE PROTONES
El HCF III estimula la extrusión de protones en un gran número de tejidos
vegetales (Referencias en Crane et al., 1991).
La adición de auxina a la mezcla de reacción en presencia de coleoptilos
produce una rápida extrusión de protones con una fase de latencia de 8 minutos
externa. Este flujo de protones no aparece en ausencia de coleoptilos (Datos no
presentados).
En ausencia de auxina el pH de la mezcla de reacción con coleoptilos,
permanece prácticamente constante (pH = 6.0) durante 60 minutos (Figura 35). La
adición de lmM HCF II no produce variaciones en el pH del medio significativamente
diferentes a la obtenida para las muestras incubadas con IAA (Figura 35). Por el
contrario la adición de 1 mM HCF III produce una rápida acidificación (fase de latencia
inferior a 1 minuto) y se estimula la extrusión de protones.
Al igual que ocurre en otros tejidos vegetales, el tratamiento con HCF III
estimula la extrusión de protones en coleoptilos de maíz.
3.3.1. DOSIS RESPUESTA DE HCF III EN PRESENCIA DE IAA
La extrusión de protones inducida por HCF III es dependiente de la
concentración, (Figura 36). La estimulación del flujo de protones inducida por IAA es
máxima para la concentración de 1 mM HCF III, concentraciones superiores no
aumentan la acidificación del medio (Figura 36).
80
Resultados
6 . 2 5 A d ic ió n
6.00
5 . 7 5oc<L>X <L>
5 . 2 5
5 . 5 0
5 . 0 0
4 . 7 5
0 10 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0
Tiempo (min)
eno~o
x<D+X
en
O£c
1000
s /
0 10 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0
Tiempo (min)Figura 35. A): Acidificación del medio cxiem o dependiente de HCF IH. B): Cinética de extrusión de
protones dependiente de HCF III. Mezcla de reacción: 10 mi HEPES 1 mM CaCI2 4 mM y 60
segmentos de coleoptilos (O . # , V .▼); 10 ¡uM IAA (O V); HCF II ( • ) ; HCF OI ( v ) -
81
Resultados
1200
1000Cflo"O
’uX0+ 800 x(flQ)OEc
600
400
Figura 36. Efecto dosis respuesta del HCF III en la extrusión de protones inducida por IAA. Cinéticas
de 1 hora. M ezcla de reacción: 10 mi HEPES 1 mM CaCI2 4 mM 10 pM IAA y 60 segm entos de
coleoptilos.
*' :■ ! i
!► - -.1— 1!... - .... . ...* .... .... 1'
» -•-« LiL i: T
... T
1
—u4 “4~ J T-
-j1 ■
I -1 ... "I-■ :
0.50 0.75 1.00 1.25
[HCF III mM]
82
Resultados
3.3.2. EFECTO DEL CALCIO EN LA EXTRUSIÓN DE PROTONES
INDUCIDA POR HCF III
El catión Ca2+ es un inhibidor de la extrusión de protones inducida por IAA
(Cohén y Nadler, 1976; Cleland y Rayle, 1977; Rubinstein et al., 1977; Matsumoto
1988). La adición de diferentes concentraciones de Ca2+ a la mezcla de reacción con
HCF III, produce una estimulación del flujo de protones. El máximo efecto se observa
para 4 mM calcio, (Figura 37). Concentraciones superiores disminuyen su efecto
estimulador, Por consiguiente el catión Ca2+ es un estimulador de la extrusión de
protones en presencia de HCF III.
3.3.3. EXTRUSIÓN DE PROTONES EN AUSENCIA DE IAA
La adición de HCF III en ausencia de IAA estimula el flujo de protones (Figura
38). La estimulación es dependiente de la concentración de HCF III y del tiempo de
incubación (Figura 38). La extrusión de protones es menor en ausencia de IAA que
para las mismas concentraciones de HCF III en presencia de IAA. Estos datos
experimentales indican que el IAA es un estimulador de la extrusión de protones
inducida por HCF III.
3.3.4. EFECTO DE LOS ANTIBIÓTICOS EN LA EXTRUSIÓN DE
PROTONES INDUCIDA POR HCF III
La figura 39, muestra la extrusión de protones inducida por HCF III en
presencia de 150 pM cloranfenicol y 5 mM penicilina. No se observan variaciones
significativas con respecto al control, por consiguiente la extrusión de protones es
debida únicamente a los coleoptilos.
La extrusión de protones al igual que la reducción de HCF III es debida
únicamente a los coleoptilos sin que la presencia de microorganismos tenga ningún
efecto (Figuras 34 y 39).
83
Resultados
1400
1200eno~o’dX<D4- 1000 xenQ)oEc
800
600
Figura 37. Efecto dosis respuesta de CaCL en la extrusión de H+ inducida por 1 mM HCF 01 en
presencia de 10 pM IAA. Mezcla de reacción: 10 mi HEPES 1 mM CaCl2 4 mM 10 pM IAA y 60
segm entos de coleoptilos.
8 4
Resultados
700
600
0 10 20 30 40 50 60 70
enO"O'l3
v_
X<U+X(O<DOEc
Tiempo (min)700
600 -
500 -
400 -
3000.50 1.250.75 1.00
[HCF III mM]
Figura 38. A): Cinética de extrusión de protones inducida por 1 mM HCF III en ausencia de IAA. B):
D osis respuesta de HCF III en la extrusión de protones en ausencia de IAA. M ezcla de reacción:
10 mi HEPES 1 mM CaCl2 4 mM y 60 segmentos de coleoptilos.
85
Resultados
ino•a’d
X<D+Xco<D
1200
1000 -
800 -
600 -
■2* 400 -
200 -
0
/
0 10 20 30 40 50 60 70
Tiempo (min)
Figura 39. Efecto de los antibióticos Cloranfenicol y Penicilina en la extrusión de protones inducida por
1 mM HCF III en presencia de 10 pM IAA. Mezcla de reacción: 10 mi HEPES 1 mM CaCl2 4 mM
10 pM IAA y 60 segmentos de coleoptilos 1 mM HCF III ( O .# ) ó 150 pM Cloranfenicol y 5 mM
Penicilina (# ).
86
Resultados
Los resultados experimentales obtenidos muestran, (Figuras 30-39) que el HCF
III es reducido por los coleoptilos y estimula la extrusión de H+ (Tabla VI) y la
elongación tanto en presencia como en ausencia de auxina. Estos resultados sugieren
que ambos procesos podrían ser independientes y estar regulados por el sistema redox
del plasmalema.
Tabla VI. Efecto de 10 pM IAA en la extrusión de H+ y reducción de HCF III. La
mezcla de reacción está formada por 10 mi HEPES 1 mM CaCl2 4 mM y 60
segmentos de coleoptilos. La velocidad de reducción se expresa en nmoles HCF
III reducidos/seg*min. (n= 4).
[HCF III]
0.5 mM 0.75 mM 1.25 mM
+ IAA - IAA + IAA - IAA + IAA - IAA
nmoles H+ extruidos 592.84 395.27 730.50 553.54 985.50 610.55
nmoles HCF III reducidos 700 700 1110 920 1300 1330
pH inicial 6.013 6.005 6.001 6.009 6.008 6.002
pH final 5.554 5.706 5.377 5.563 5.259 5.610
Velocidadreducción 10.72 10.54 17.80 14.90 20.36 22.50
std 2.24 1.57 2.27 3.01 4.27 1.77
87
Resultados
3.4. LA EXTRUSIÓN DE PROTONES INDUCIDA POR HCF
III SE REALIZA A TRAVÉS DE LA ATPasa DEL
PLASMALEMA
3.4.1. ESTEQUIOM ETRIA H+/e-
La relación entre la actividad del sistema redox y la acidificación del pH externo
no es conocida todavía. La medida de la estequiometría H+/e- y el efecto del DCCD
ha permitido contrastar las diferentes hipótesis (Sección 1.3)(Marré et a l 1988)
La relación H+/e- ha sido estudiada en diferentes tejidos vegetales (Tabla VII).
Excepto Rubinstein y Stern 1986 que han medido los valores H+/e- frente al tiempo;
el resto de valores H+/e-se han medido durante diferentes tiempos y representan valores
promedio. La relación H+/e- es muy variable (0.3-1.21) según los diferentes autores.
88
Resultados
T abla VII. Estequiometría H+/e- ( nmoles H+ extruidos/nmoles HCF III reducidos),
calculada en diferentes tejidos. Valores promedio H+/e- durante el tiempo de
incubación.
Célula o Tejido H+/e- ReferenciaMaíz (Raíz) 1.00 Federico & Giartosio 1983Maíz 1.21 Neufeld & Bown, 1987Maíz 0.58 Lass et al., 1986Maíz 1.00 Crane et al., 1985aMaíz (Raíz) 0.40 Federico & Giartosio, 1983Maíz 0.73-0.47 Rubinstein & Stern 1986Asparagus (Oscuridad) 1.00 Neufeld & Bown 1987Asparagus (Luz) 1.10 Neufeld & Bown 1987Acer sp. 0.93 Blein et al 1986Maíz 0.39 Rubinstein & Stem 1986Phaseolus (Raíz) 0.50 Sijmons et al 1984Elodea (Hojas) 1.10 Ivankina et al 1984Maíz (Aerobio - FC) 0.40 Federico & Giartosio 1983Maíz (Anaerobio - FC) 0.03 Federico & Giartosio 1983Maíz (Aerobio + FC) 0.48 Federico & Giartosio 1983Maíz (Anaerobio + FC) 0.25 Federico & Giartosio 1983Saccharomyces cerevisiae 0.75 Crane et al 1985Zanahoria 1.10 Craig & Crane 1985
89
Resultados
La estequiometría H+/e- varía a lo largo del tiempo de incubación y no es
constante en presencia de diferentes concentraciones de HCF III, como en presencia
o ausencia de auxina (Tabla VIII).
T abla VIII. Estequiometría H+/e para diferentes concentraciones de HCF III tanto en
presencia como en ausencia de 10 pM IAA. Mezcla de reacción: 10 mi HEPES
1 mM CaCl2 4 mM (pH 6.0) y 60 segmentos de coleoptilos. Valores promedio
(n=4).
[HCF III]Tiempo(min) 0.5 mM 0.75 mM 1.25 mM
+ IAA - IAA + IAA - IAA + IAA - IAA5 0.44 0.69 0.58 0.85 0.65 0.6510 0.52 0,78 0.60 0.80 0.66 0.6515 0.56 0.80 0.67 0.79 0.73 0.7320 0.63 0.82 0.66 0.72 0.74 0.6625 0.68 0.83 0.76 0.67 0.76 0.6430 0.63 0.80 0.73 0.64 0.75 0.5935 0.68 0.74 0.75 0.63 0.75 0.5640 0.75 0.68 0.79 0.57 0.75 0.5545 0.78 0.68 0.78 0.53 0.75 0.5350 0.80 0.63 0.79 0.50 0.75 0.5055 0.84 0.61 0.80 0.50 0.74 0.4960 0.84 0.56 0.79 0.49 0.74 0.46
La estequiometría H+/e- no es constante cuando se tienen en cuenta los protones
liberados al medio en ausencia de HCF III (Figura 40).
90
Resultados
1.00
0.75
0.50
0.25
0.000 10 20 30 40 50 60 70
Tiempo (min)
Figura 40. Relación H 7e- com o cociente entre los nmoles de H+ exiruidos y los nmoles de HCF III
reducidos. M ezcla de reacción: 10 mi HEPES 1 mM CaCl2 4 mM 10 pM IAA y 60 segmentos de
coleoptilos (O .#); 1 mM HCF III (O) o 1 mM HCF III ( • ) descontando los protones exiruidos en
presencia de 10 pM IAA.
91
Resultados
3.4.2. EFECTO DEL CATIÓN Ca2+ EN LA ESTEQUIOM ETRIA H+/e-
La variación de la estequiometría H+/e- dependiendo de la variación de la fuerza
iónica del medio se ha estudiado en la Tabla IX. El calcio favorece la reducción de
HCF III así como la extrusión de protones inducida por 1 mM HCF II. Este efecto es
máximo para la concentración de 4 mM Ca2+. Las estequiometrías dependientes de la
fuerza iónica no son constantes a lo largo del tiempo de incubación y son
independientes de la concentración del ión Ca2+ (Tabla IX).
Tabla IX. Efecto de diferentes concentraciones de CaCl2 en la relación H+/e- (nmoles
de H+/nmoles HCF III reducidos). Mezcla de reacción 10 mi HEPES 1 mM 10
pM IAA 1 mM HCF III y 60 segmentos de coleoptilos. Adiciones a tiempo cero
minutos. Valores promedio (n=4).
Tiempo (min)[CaClJ
1 mM 2.5 mM 4 mM 5 mM 10 mM
5 1.38 0.49 0.41 0.51 0.50
10 1.64 0.58 0.54 0.65 0.62
15 1.44 0.77 0.60 0.65 0.63
20 2.07 0.75 0.74 0.74 0.66
25 1.75 0.86 0.77 0.75 0.62
30 1.73 0.89 0.88 0.84 0.65
35 1.97 0.90 0.86 0.76 0.69
40 2.23 0.95 0.91 0.81 0.72
45 2.28 0.99 0.92 0.74 0.71
50 2.37 0.96 0.89 0.76 0.71
55 2.36 1.00 0.87 0.72 0.70
60 2.67 0.97 0.81 0.71 0.68
92
Resultados
3.4.3. ESTEQUIOM ETRÍA COMO COCIENTE DE VELOCIDADES
La velocidad aparente de protones representa el flujo neto de protones, como
resultado de dos procesos opuestos; extrusión de protones al medio externo y entrada
de protones en la célula.
La velocidad de liberación de protones y reducción de HCF III varía con el
tiempo de incubación de la muestra( Figura 41 A). La velocidad de reducción de HCF
III a HCF II presenta dos fases (Fase I, rápida) y Fase II.
El cociente entre estas dos velocidades nos determina la estequiometría H+/e-
instantánea (Figura 41 B) esta relación no es constante en todo el período de
incubación.
3.4.4. EFECTO DEL DCCD EN LA EXTRUSIÓN DE PROTONES Y
REDUCCIÓN DE HCF III
El DCCD es un inhibidor específico de la ATPasa del plasmalema (Cleland,
1973; Rayle, 1973). El crecimiento inducido por HCF III se inhibe por 100 pM DCCD
(Tabla V). En la Figura 42 se observa el efecto inhibidor de la extrusión de protones
a diferentes concentraciones de DCCD.
La adición de DCCD presenta una fase de latencia en la extrusión de protones
de 25 minutos. Añadido a tiempo cero 25 pM DCCD no inhibe totalmente la extrusión
de protones, se observa un flujo neto positivo (salida de protones al medio externo);
30, 40 y 50 pM DCCD inhiben totalmente la extrusión de protones (Figura 42).
La concentración de 30 pM DCCD se utiliza para determinar la acidificación
del medio externo en presencia de HCF III.
La acidificación del medio se inhibe tanto en presencia de IAA como en HCF
III y IAA. La adición de DCCD se ha realizado a pH 5.7 (con una extrusión de
protones importante) (Figura 43).
93
Resultados
en<Den*CE+
en_CDOEC
<u>
60 60
45 45
30 30
15
0
0 15 30 45 60Tiempo (min)
l<D 0.9
LU>+X_ lLü>
0.0
o 15 30 45 60
encuen*c
(_)X
en0)oEc
<D>
Tiempo (min)
Figura 41. A): Cinética de la velocidad de extrusión de protones inducida por 1 mM HCF III (O),
cinética de la velocidad de reducción de 1 mM HCF III (#). B): Relación H 7e- com o cociente de
velocidades. Estequiometría instantánea. Mezcla de reacción: 10 mi HEPES 1 mM CaCl2 4 mM 10
pM IAA y 60 segmentos de coleoptilos.
94
nmol
es
H+ ex
truid
osResultados
300
200
100
0
- 1 0 0
- 2 0 0
-300
-400
-500
-600-10 0 10 20 30 40 50 60 70
Tiempo (min)
Figura 42. Efecto del compuesto DCCD a t=() en la extrusión de H+ inducida por 10 pM IAA. Mez.cla
de reacción: 10 mi HEPES 1 mM CaCU 4 mM 10 pM IAA y 60 segmentos de coleoptilos (O ,# ,
V,T); 25 pM DCCD (O); 30 pM DCCD # ) ; 40 pM DCCD (V) y 50 pM DCCD (▼).
95
V—V—7—V
>
I I
Resultados
6 .0 2 0
30 a¿M DCCD e
<uL ü
Ql
0.2 pH
40 -20 O 20 40 60 80 100 120 140 160
Tiempo (min)
Figura 43. Efecto adición 30 uM DCCD a pH 5.7 en: A): Acidificación inducida por 10 pM IAA. B):
Acidificación inducida por 1 mM HCF Iíl en presencia de 10 pM IAA. M ezcla de reacción: 10 mi
HEPES 1 mM CaCl2 4 mM 10 uM IAA y 60 segmentos de coleoptilos.
96
Resultados
La adición de DCCD 20 minutos antes del tratamiento con IAA o IAA y HCF
III inhibe la acidificación del medio. (Datos no presentados).
Por el contrario, la reducción de HCF III no se afecta por la adición de DCCD
cuando es añadido 20 minutos antes del tratamiento o 30 minutos después del
tratamiento con HCF III (Figura 44).
Estos resultados experimentales (Figuras 42-44) demuestran que el HCF III
induce la extrusión de protones mediante el sistema ATPasa.
La estequiometría H+/e- es variable (Tablas VIII y IX) y la acidificación del
medio se inhibe por DCCD (Figura 43) sin que se afecte la reducción de HCF III, por
consiguientes estas evidencias experimentales permiten rechazar las hipótesis A y B
(Marré et al., 1988b) y aceptar la hipótesis C. (Sección 1.3).
El sistema redox del plasmalema durante la reducción de HCF III no está
acoplado directamente a la liberación de protones sino que ésta se realiza por una vía
independiente como es la ATPasa del plasmalema.
97
Resultados
Ec
'ooiD I
OCN,s}-C;0’oOenn<
1.0
0.9
0.8
30 a¿M DCCD
0.1
0.0 9 Q 9
0 15 30 45 60Tiempo (min)
75 90
Ec
OO 0.9inlo
CN"3-0.8c
:2’ooco —L< 0.1 - r
0.0
0 15 30 45 60 75 90Tiempo (min)
Figura 44. A): Efecto de la adición de 30 mM DCCD t=3() minutos en la reducción inducida por 1 mM
HCF III a t=0 minutos. B): Efecto de la adición de 30 pM DCCD a t=0 (O) en la reducción de 1
mM HCF III a t=30 minutos (# ). Mezcla de reacción: 10 mi HEPES 1 mM CaCl2 4 mM 10 pM
IAA y 60 segm entos de coleoptilos.
98
Resultados
3.5. EL SISTEMA REDOX ACIDIFICA EL CITOPLASMA
El sistema redox y la ATPasa del plasmalema participan en el crecimiento por
elongación.
La interacción entre el sistema redox y la ATPasa del plasmalema no es
conocida.
La ATPasa del plasmalema puede estar regulada por el valor del pH citosólico.
La oxidación de NADH citosólico por la actividad redox libera protones que acidifican
el citosol. El pH citosólico podría ser uno de los sistemas de regulación, por lo tanto
es interesante estudiar si la interacción del sistema redox y la ATPasa se produce
mediante variaciones del pH citosólico.
El método utilizado en esta Memoria de Tesis Doctoral es el tratamiento con
C1NH4. El NH4C1 es una base fuerte que a pH 6.0 se encuentra disociada casi en su
totalidad en la forma ionizada NH4+. El transporte del ión NH4+ al citosol y su posterior
disociación libera protones que acidifican el citosol.
3.5.1. EFECTO DEL NH4C1 EN EL CRECIM IENTO POR ELONGACIÓN
La adición de diferentes concentraciones de NH4C1 produce un aumento de la
elongación total del coleoptilo, (Figura 45). El máximo efecto se obtiene para una
concentración de 2.5 mM NH4C1. El NH4C1 aumenta la velocidad de elongación en la
fase I del crecimiento inducido por 10 (uM IAA; y se obtiene una velocidad máxima
para 2.5 mM NH4C1 en el minuto 15 (Figura 45). En la Figura 46 se observa la
estimulación relativa del NH4C1.
99
Resultados
225
200
175en<Dcn\ 150E
co<joenco
00
75
50Ü J
25
2.5 10[C1NH4 m M ]
c
E*en<DU)
E
*0O■Ouo0)>
1 4
12
10
8
6
4
2
0
0 5 10 15 20 25 50 35
Tiempo (min)
Figura 45. A): D o sis R espuesta del com puesto N H 4C1 el crecim iento por elon gación inducido por 10 uM
IA A . B): E fecto en la velocidad de elon gación celular. M ezcla de reacción: 10 mi HEPES 1 mM
C aC l2 4 m M 10 pM IA A y 60 segm entos de co leop tilos (0.#.V,V); 1 m M NH4C1 ( • ) , 2.5 mM
N H 4CI (V) ó 15 mM N H 4CI (▼).
100
Resultados
*w " a » l l I I I I I M I M l I ’0
<D>
0 5 10 15 20 25 30 35Tiempo (min)
3.5
3.0 -
ü 2.5 >
2.0 -
:o 1.50 _o1 1 -0(j) 0.5 -
0.0 -
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (min)
Figura 46. A): Estimulación relativa del crecimiento por elongación por el compuesto NH4C1. B): Efecto
estimulador de la velocidad de crecimiento. Mezcla de reacción: 10 mi HEPES 1 mM CaCl2 4 mM
10 pM LAA y 60 segm entos de coleoptilos (O . # .V • Y); 1 mM NH4CI (# ); 2.5 mM NH4C1 (V)
y 15 mM NH4CI (Y).
101
Resultados
3.5.2. EFECTO DE LA ATEBRINA EN EL CRECIM IENTO INDUCIDO
POR NH4CI
La adición de 100 pM atebrina inhibe el crecimiento por elongación (Figura 47).
Por contra, la adición de 5 mM NH4C1 revierte el efecto inhibidor de la atebrina y
produce incluso una estimulación del crecimiento inducido por 10 pM IAA.
La acidificación del citoplasma con NH4C1 estimula el crecimiento. En presencia
de atebrina que inhibe la NADH oxidasa y el crecimiento, el NH4C1 revierte este efecto
inhibidor por lo tanto la interacción del sistema redox y la ATPasa está mediada
aparentemente por el pH del citosol. Aunque no se pueden excluir otros tipos de
interacciones.
3.6. PARTICIPACIÓN DEL SISTEMA CALCIO
CALMODULINA EN EL MECANISMO DE ACCIÓN
DEL HCF III
El sistema calcio-calmodulina regula una gran variedad de actividades
enzimáticas tanto en células animales como vegetales entre ellas se encuentran enzimas
tales como ATPasas, NAD quinasas etc (Dieter y Marmé, 1980; Dieter y Marmé, 1984;
Sane et al., 1984). En esta sección vamos a tratar de relacionar el sistema calcio-
calmodulina con la actividad del sistema redox y el flujo de protones a través de
ATPasas (Gietzen et al, 1983).
La extrusión de protones es regulada por el sistema calcio-calmodulina. La
reducción de HCF III es dependiente de calmodulina. (Gietzen, 1983; Referencias en
Crane et al., 1991)
102
Resultados
100
80enO)en
60fc
c:oooenco
Lü
40
20
0 5 10 15 20 25 30 35Tiempo (min)
1.4
1 . 2 -
E
E* 1 . 0
•o 0.8 ' o O
N I
'o 0 .6E
V v v;;W 'A A A TV
- OOCX30COOOC)CXDOOOOOOOO
Oz 0.4
0.20 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (min)
Figura 47. A): Efecto del compuesto NH4CI en el crecimiento por elongación inhibido por atebrina. B):
Estimulación relativa de la velocidad de elongación. Mezcla de reacción: 43 mi HEPES 10 mM
CaCl2 1 mM 10 pM LAA y 4 segmentos de coleoptilos (O . # . V): 100 pM Atebrina ( • ) y 5 mM
NH4C1 (V).
103
Resultados
3.6.1. EFECTO ANTAGONISTAS DE CALMODULINA.
Los antagonistas de calmodulina presentan efectos laterales y por tanto es
interesante completar el estudio de la participación del sistema calcio-calmodulina en
la reducción de HCF III y extrusión de protones mediante un antagonista con pocos
efectos laterales. El antagonista que reúne estas condiciones es el calmidazolium
(González-Daros et al., 1993)
El calmidazolium, también llamado compuesto R-24571, es un inhibidor de la
calmodulina por unión especifica que a concentraciones bajas no afecta a la
permeabilidad de la membrana (Bjórkman y Leopold, 1987). El calmidazolium inhibe
el crecimiento por elongación en coleoptilos de maíz.
La adición de 30 pM calmidazolium produce una inhibición de la extrusión de
protones en presencia de HCF III (Figura 48); esta inhibición aumenta con el tiempo
de incubación y concentración de calmidazolium (Datos no presentados).
La inhibición de la extrusión de protones medida en presencia de HCF III es
similar a la observada en coleoptilos de avena en presencia de IAA (González-Daros
et al., 1993).
La inhibición máxima alcanza valores de 98.2 % al cabo de 60 minutos de
incubación (Figura 48).
El compuesto calmidazolium también afecta a la reducción de 1 mM HCF III.
La cinética de reducción se presenta en la Figura 49.
La dosis respuesta del Calmidazolium en la inhibición de la reducción del HCF
III se representa en la Figura 50.
La inhibición aumenta con la concentración de inhibidor alcanzando un IC50 de
aproximadamente 10 pM.
Estos resultados parecen indicar que el sistema redox del plasmalema podría
estar regulado por el sistema calcio-calmodulina.
104
Resultados
300
250en
2 200
" 150+ xs 100o
Í 50
0 3015 45 60Tiempo (min)
120
100
80c'O<J’-Q’-Cc
60
40
20
0 15 30 45 60
Tiempo (min)Figura 48. A): Efecto del compuesto Calmidazolium en la extrusión de protones inducida por 1 mM
HCF m en presencia de 10 pM IAA. B): Cinética de Inhibición del compuesto calmidazolium.
M ezcla de reacción: 10 mi HEPES 1 mM CaCI2 CaCl2 4 mM 10 pM IAA y 60 segmentos de
coleoptilos (O .#); 1 mM HCF III (O) y 30 pM Calmidazolium ( • ) .
105
Resultados
250
200
v)o*ooa 150"O<D
& 100(/)_0)oEc 50
0
Figura 49. Efecto del compuesto Calmidazolium en la reducción de 1 mM HCF OI en presencia de 10
pM LAA. M ezcla de reacción: 10 mi HEPES 1 mM CaCI2 4 mM 10 pM IAA y 60 segm entos de
coleoptilos (O ,#); 1 mM HCF III (O) y 30 pM Calmidazolium ( • ) .
r •
o 15 30 45 60
Tiempo (min)
106
Resultados
100
7 5
c;0OO= 3
-o<Dcr
5 0
2 5
0 5 10 15 20 2 5 30 3 5
Calmidazolium (¿¿M)
Figura 50. D osis respuesta del compuesto Calnnda/olium en la reducción de 1 mM HCF III. Mezcla de
reacción: 10 mi HEPES 1 mM CaCI2 4 mM 10 uM IAA y 60 segmentos de coleoptilos.
107
D s c u s iín
4. DISCUSION
En el estudio de la actividad del sistema redox del plasmalema se han empleado
diferentes aceptores exógenos de electrones (Crane et al., 1985). En esta Memoria de
Tesis Doctoral se ha utilizado el compuesto HCF III, ya que, no es transportado al
citosol (Tabla I) y por ello no afecta la actividad NAD(P)H-HCF III oxido reductasa
de la cara interior del plasmalema (Crane et al., 1991). Su reducción es determinada
por el incremento de A420_500 (Figura 29), la forma reducida (HCF II) es incolora y por
tanto no interfiere en las determinaciones espectrofotométricas y finalmente su
reducción no implica la liberación de protones.
Los efectos del HCF III en la elongación celular y la extrusión de protones se
ha realizado en coleoptilos de maíz y avena e hipocotilos de soja.
Se han elegido estos tejidos, porque son unos sistemas en los que el efecto del
IAA ha sido relativamente bien estudiado (p.e. Kutschera y Schopfer, 1985a; Lüthen
et al., 1990; Cleland, 1987; Brightmann et al., 1987a y 1987b).
El enfoque utilizado en esta Memoria de Tesis Doctoral difiere de los estudios
realizados anteriormente en dos aspectos fundamentales:
1.- Se ha estudiado la cinética a tiempos cortos (0.5-4 horas) frente a valores de
medida de 15-48 horas (Rubinstein y Stern, 1986; Craig y Crane, 1985b; Federico y
Giartosio, 1983).
2.- Se ha utilizado un medidor de desplazamiento que permite determinaciones
inferiores a 1 pm/segmento, por el contrario las determinaciones realizadas hasta ahora
emplean la medida directa de la longitud del tejido y su sensibilidad es inferior a 500
pm.
Este enfoque experimental ha permitido observar, por primera vez, que el
tratamiento con HCF III estimula significativamente el crecimiento por elongación
celular en presencia y ausencia de IAA (Figuras 5, 6, 12 y 13). Esta estimulación se
observa en la fase I y en la fase II (Figuras 4, 5 y 7).
108
Db c u s iín
La estimulación óptima se ha observado a concentraciones entre 5 mM y 10
mM. Concentraciones superiores tienen un efecto inhibidor ya que aumentan la fase
de latencia y además disminuyen el crecimiento total (Tablas III y IV).
Aparentemente el efecto inhibidor observado a concentraciones superiores 10
mM de HCF III puede estar relacionado con un efecto osmótico o bien un aumento de
la concentración de iones potasio en la mezcla de reacción. No obstante, no pueden
excluirse otros efectos laterales. Es necesario destacar que las concentraciones de HCF
III que estimulan la elongación son las que se utilizan como aceptor de electrones del
sistema redox en células, protoplastos y vesículas de plasmalema (Crane et al., 1984;
Bóttger y Lüthen, 1986; Buckhout y Luster 1990).
La estimulación del crecimiento no tiene lugar cuando los coleoptilos se tratan
con HCF II (Figuras 4 A y B). Por lo tanto, la presencia de HCF II ó iones potasio no
son necesarios para la estimulación del crecimiento por elongación.
La estimulación del crecimiento se observa tanto en la fase I (adición t=0 min)
(Figuras 4 y 5) como en la fase II (adición t= l20 min) del crecimiento dependiente de
IAA (Figura 7).
La readición de 1 mM HCF III al cabo de 30 minutos, produce una estimulación
transitoria y rápida del crecimiento (Figura 9). Esta concentración se ha elegido porque
es una concentración subóptima, de forma que la readición no aumente la
concentración de HCF III ya existente (t=0) hasta concentraciones con efecto inhibidor.
Posteriores adiciones al cabo de 60 minutos producen una menor estimulación
del crecimiento (datos no presentados).
Estos datos experimentales sugieren que el efecto estimulador puede ser
producido por readiciones sucesivas del aceptor de electrones, HCF III.
La abrasión del coleoptilo puede producir modificaciones importantes en la
cinética de crecimiento y magnitud de la elongación (Kutschera y Schopfer, 1985b).
El efecto de la abrasión ha sido estudiado mediante: la observación microscópica
con el fin de identificar posibles daños en la cutícula por fricción mecánica y el estudio
109
D sc u siín
comparativo de la elongación en coleoptilos intactos y sometidos a abrasión con
alúmina.
La abrasión con óxido de alúmina produce únicamente una disminución del
espesor de la cutícula externa sin que se aprecien daños en las células epidérmicas
(Fotos 3 y 4). De modo similar, la abrasión con CSi produce escasos daños en los
coleoptilos de maíz (Lüthen et al., 1990). Este resultado contrasta con los obtenidos
en otros métodos de abrasión que producen daños importantes en las células de los
coleoptilos.
En coleoptilos intactos de maíz (sin abrasión) la adición de HCF III estimula el
crecimiento (Figuras 14, 15, 24 y 25). Aunque se aprecian diferencias en la fase de
latencia y elongación, se concluye que la estimulación de la elongación en presencia
de HCF III no es debida a la abrasión.
Este efecto estimulador del crecimiento ha sido estudiado también en coleoptilos
de avena e hipocotilos de soja (Figuras 20, 21, 22 y 23). La cinética de la elongación
es dependiente del tejido y de la especie vegetal (Vesper y Evans, 1987; Brummer et
al.y 1984). En ambos tejidos estudiados (coleoptilos de avena e hipocotilos de soja),
el HCF III estimula significativamente el crecimiento. Por consiguiente se concluye que
el efecto estimulador del HCF III se observa en los tejidos estudiados que presentan
un tipo de crecimiento rápido. Es de destacar que el efecto estimulador en estos tejidos
se observa también en ausencia de IAA (datos no presentados).
Por otro lado, otros aceptores de electrones del sistema redox del plasmalema
como el 2,4 DCP, también han sido estudiados observándose una estimulación del
crecimiento, indicando que los efectos estimuladores no son exclusivos del HCF III.
El efecto estimulador del HCF III en células vegetales no ha sido observado
hasta ahora. El tratamiento con HCF III por el contrario inhibe el crecimiento en
Lemna gibba (Thanaka y Cleland, 1980), en células aisladas de raíz de zanahoria y
ápices de raíz de maíz (Crane et al., 1989). Las razones de la discrepancia con los
resultados de esta Memoria de Tesis Doctoral no se conoce todavía, pero
probablemente son debidos a que el crecimiento es medido al cabo de un período de
110
D s c u s ó n
tiempo que va desde horas a días o a la falta de precisión en la medida de la longitud
así como a la concentración de HCF III empleada.
Por otra parte Polevoy y Salamatova (1977) han observado que el tratamiento
de coleoptilos de maíz con HCF III (50 mM) durante 5 horas inhibe el crecimiento
endógeno y el estimulado por IAA. Estos resultados están de acuerdo con los datos de
la Tablas III y IV, en el que se aprecia que el crecimiento se inhibe por esta
concentración de HCF III. Este efecto inhibidor solamente se observa a altas
concentraciones y posiblemente es debido a un efecto de la concentración o a otros
efectos laterales del HCF III, como ya se ha discutido anteriormente.
Morré et a i (1988c), han observado que el HCF III (0.01 a 500 mM) durante
16 horas de incubación no afecta al crecimiento en hipocotilos de soja. Estos resultados
contrastan con los datos de las figuras 23 y 24 en los que se aprecia una estimulación
significativa del crecimiento en presencia de 5 mM HCF III, en este mismo tipo de
tejido.
Las motivos de esta discrepancia posiblemente es debida al método empleado
para medir el efecto estimulador del HCF III. En presencia de IAA el efecto
estimulador del HCF III disminuye con el tiempo de incubación (Figura 6 A) y por
tanto es posible que la estimulación de crecimiento al cabo de 15 horas no pueda ser
detectada por la medida de la longitud total del segmento de hipocotilo.
Recientemente Lüthen y Bóttger (1993) han observado que en ausencia de IAA
y medio de reacción sin tamponar, el HCI IV y el HBIIV aceptores de electrones del
sistema redox estimulan el crecimiento en coleoptilos de maíz al cabo de una fase de
latencia de 40 minutos. En presencia de IAA ó medio débilmente tamponado no se
observa este efecto estimulador. Dado que el HCI IV y HBI IV solamente estimulan
el crecimiento al cabo de 40 minutos de incubación y en ausencia de IAA, es difícil
concluir que el sistema redox de la membrana esté implicado en la regulación del
crecimiento.
De todos estos resultados se puede concluir que en esta Memoria de Tesis
Doctoral se presenta la primera demostración de la estimulación del crecimiento por
111
Dbcusjón
elongación celular por parte de un aceptor de electrones externo e impermeable del
sistema redox de la membrana plasmática.
La estimulación del crecimiento inducido por la adición de HCF III exógeno
puede estar mediada por un mecanismo diferente e independiente del crecimiento
observado en presencia o ausencia de IAA. Si esta hipótesis de trabajo es correcta, el
crecimiento observado en presencia de HCF III debe ser insensible a CH y DCCD,
inhibidores del crecimiento por elongación. No obstante, esta posibilidad se ha
rechazado, dado que en presencia de HCF III el crecimiento es completamente inhibido
por DCCD y CH tanto en presencia como en ausencia de IAA (Tabla V). Estos4
resultados, y el hecho que el HCF III no afecta a la cinética de elongación (Figuras 4,
5, 11 y 12) sugieren que el HCF III estimula la magnitud de un crecimiento que ya
tiene lugar en su ausencia.
La estimulación del crecimiento está acompañada por la reducción de HCF III
(Figuras 5 y 29). La reducción de HCF III se realiza por el sistema redox del
plasmalema (HCF III óxido-reductasa) que utiliza NADH (Lin, 1984; Morré et al.,
1988b) o NAD(P)H (Krüger y Bottger, 1988) como donador citosólico de electrones.
La reducción de HCF III indica que este proceso es limitante y su actividad regula el
crecimiento. Esta interpretación está de acuerdo con los resultados del grupo de Bottger
en los que la extrusión de protones está mediada a por una NADH-oxidasa que posee
una baja afinidad por el oxígeno (Bottger y Lüthen, 1986).
La hipótesis de la regulación del crecimiento por la actividad NAD(P)H-HCF
III oxido-reductasa, se puede contrastar mediante el empleo de inhibidores específicos
de este proceso.
La atebrina inhibe la reducción de HCF III (Blein et al., 1986) y la NADH-
oxidasa de tipo I (Brightman et a i , 1988). El tratamiento con atebrina inhibe la
elongación tanto en presencia como en ausencia de IAA (Figuras 16 y 18). La
inhibición causada por el tratamiento de atebrina, disminuye con el tiempo de
incubación (Blein et al., 1986), que es el resultado de la inactivación progresiva del
compuesto cuando es transportado al interior de la célula.
112
D b c u s ó n
De igual modo el inhibidor de la actividad NAD(P)H-HCF III oxido-reductasa,
acetato de p-nitrofenilo, disminuye el crecimiento inducido por IAA (Morré et al.,
1989).
En coleoptilos de maíz la reducción de HCF III produce una estimulación de la
acidificación de la mezcla de reacción (Figuras 35 y 36). Este efecto ya ha sido
observado en diferentes tejidos vegetales (Rubinstein y Stem, 1986; Craig y Crane,
1985). Esta acidificación comienza inmediatamente tal como se ha observado en
células cultivadas de zanahoria y coleoptilos de avena (Rubistein y Stem, 1986). El
mecanismo de la acidificación de la fase externa en presencia de HCF III está sujeto
a controversias. Dos hipótesis de trabajo han sido propuestas para explicar el origen
de esta acidificación:
a) El flujo de electrones en la membrana plasmática durante la reducción de
HCF III, está asociado a una bomba o canal de H+ que es independiente de la ATPasa
del plasmalema (Bottger y Lüthen, 1986).
b) La reducción del HCF III está asociada a la acidificación del citosol y
posterior activación de la ATPasa del plasmalema (Rubinstein y Stern, 1986; Morré et
al.y 1986).
La contrastación de esta hipótesis de trabajo se ha realizado en esta Memoria
de Tesis Doctoral mediante el estudio de la estequiometría H+/e- (Figura 40) (Tabla
VIII) y el efecto del inhibidor de la ATPasa del plasmalema DCCD en la reducción
del HCF III (Figura 44).
Si el sistema redox del plasmalema acidifica la mezcla de reacción durante la
reducción de HCF III por un mecanismo independiente de la ATPasa del plasmalema,
la estequiometría H+/e-, debe ser constante, y nulo el efecto del DCCD.
Por el contrario, si la acidificación es realizada por la ATPasa del plasmalema,
la estequiometría H+/e- debe ser variable y el tratamiento con DCCD debe inhibir la
acidificación.
Los resultados obtenidos (Figuras 43 y 44) demuestran que el tratamiento con
DCCD inhibe la acidificación y la estequiometría H+/e-, no es constante (Figuras 40
113
D iscusió n
y 41). Estas evidencias experimentales permiten concluir que la acidificación producida
durante la reducción de HCF III está realizada por la ATPasa del plasmalema, y por
tanto, se confirma la hipótesis de trabajo (Rubinstein y Stem, 1986; Morré et al.,
1986). La estequiometría H+/e-, es calculada como el cociente entre los protones
extruidos y el HCF II formado (Tabla VIII) y por ello difíciles de comparar con los
datos presentados en esta memoria (Tablas VII y VIII, Figuras 40 y 41). Sin embargo
resultados similares han sido obtenidos en raíces de maíz por Rubistein y Stem (1986).
Por otro lado, la discrepancia en la estequiometría H+/e- puede resolverse mediante el
estudio de la relación H+/e- durante la incubación con HCF III.
El mecanismo de interacción entre el sistema redox y la ATPasa del plasmalema
no es conocido. Se ha propuesto la participación del pH citoplasmático en esta
interacción (Rubinstein y Stem, 1986; Morré et al., 1986).
La modificación del pH citosólico, mediante el NH4C1, ha permitido comprobar
la participación del pH citosólico en la regulación del crecimiento por elongación.
Se admite actualmente que el crecimiento por elongación inducido por auxina
es debido al flujo de protones desde el citoplasma hasta la pared celular (Hager y
Moser, 1985). El descenso del pH en la pared celular lleva consigo una modificación
de las propiedades que conduce a una aceleración del crecimiento (hipótesis de
crecimiento ácido).
Las células vegetales poseen un transportador de NH4+ (Raven y Farquhar,
1981), mientras que la forma neutra NH3, difunde libremente a través de la membrana
plasmática. A pH 6.0, el ión NH4+ se encuentra disociado en NH4+ (99.94 %) y NH3
(0.0562 %). Estos datos indican que en las condiciones experimentales empleadas (pH
6.0, 5 mM NH4C1) la forma neutra NH3 no es transportada debido a su baja
concentración.
Por el contrario el trasporte de NH4+ y su disociación en el citosol (pH
aproximado 7.5), da lugar a una acidificación del citoplasma.
La estimulación del crecimiento en presencia de NH4C1 (Figura 45) sugiere la
que la acidificación del citosol es un proceso esencial en el crecimiento. Posiblemente
114
D b c u s ó n
la estimulación de la elongación en presencia de ácidos permeantes puede ser debida
a la acidificación del citosol (Hager y Moser, 1985). Aunque también puede ser debida
a un crecimiento ácido (Hager et al., 1971).
En presencia 100 pM de atebrina, que inhibe la oxidación de NADH y por tanto
la actividad del sistema redox, se inhibe el crecimiento por elongación celular. La
adición de NH4C1 a una muestra incubada en presencia de atebrina, revierte la
inhibición de la elongación (Figura 47). Se concluye que la interacción entre el sistema
redox de la membrana plasmática y la ATPasa aparentemente es debido a la
acidificación del citosol.
Por otra parte, se ha determinado la existencia de una óxido-reductasa sensible
a calmodulina (Elliott et al., 1983; Crane et al., 1986). Los antagonistas de calcio-
calmodulina inhiben la extrusión de protones (González-Darós et al., 1993) y la
elongación (en presencia de IAA, datos no presentados)(Ragothama et al., 1985) sin
embargo, presentan otros efectos laterales como son el aumento de la permeabilidad
de membrana, aumento de la capacidad tampón (González-Darós et al., 1993).
El compuesto calmidazolium a concentraciones inferiores a 20 pM presenta
estos efectos negligibles, por este motivo, ha sido empleado para estudiar si la
reducción de HCF III es un proceso dependiente de calmodulina.
La reducción de HCF III se inhibe por tratamiento con calmidazolium (IC50= 10
pM) (Figura 50). Estos resultados indican que la reducción de HCF III es dependiente
del sistema calcio-calmodulina. La inhibición de la actividad NAD(P)H-HCF III oxido-
reductasa por calmodulina permite explicar que los efectos sobre la extrusión de
protones y la elongación celular aparentemente están asociados a la inhibición del
sistema redox del plasmalema.
Los resultados obtenidos en esta Memoria de Tesis Doctoral, demuestran que
el sistema redox de la membrana plasmática regula el crecimiento por elongación y se
propone la hipótesis de trabajo que se resume en el esquema de la Figura 51.
En este esquema se representa el medio externo, la pared celular, la membrana
plasmática y el citosol.
115
D b c u s ó n
En la membrana plasmática se incluye el sistema redox y el sistema ATPasa.
El HCF III acepta los electrones del sistema redox mediante la oxidación del NAD(P)H
citosólico. Este proceso, da lugar a una liberación de protones al citoplasma que
produce un descenso en el pH citoplasmático que activa el sistema ATPasa de la
membrana plasmática y como consecuencia el crecimiento por elongación (hipótesis
crecimiento ácido).
La adición de HCF III estimula el sistema de crecimiento ya existente debido
a un incremento de la acidificación del citosol.
El compuesto atebrina inhibe la elongación celular y su efecto se revierte por
la adición del compuesto NH4C1. El NH4+ es transportado al interior de la célula, y su
disociación produce una acidificación del citosol que estimula el crecimiento por
elongación.
Este modelo actualmente está en fase de contrastación. Sin embargo, son
también posibles otras interacciones entre el sistema redox y el sistema ATPasa de la
membrana plasmática.
1 1 6
D isc u sió n
CITOSOL PLASMALEMA PARED MEDIOCELULAR EXTERNO
>>
¡¡
Figura 51. Esquema de la hipótesis propuesta: El sistema redox del plasmalema regula
el crecimiento por elongación en células vegetales.
117
C onclusiones
5. CONCLUSIONES
1. La adición de HCFIII exógeno estimula significativamente el crecimiento por
elongación celular en coleoptilos de maíz y avena y en hipocotilos de soja.
2. La atebrina, inhibidor de actividad NADH-oxidasa tipo I, bloquea la
elongación celular, tanto en presencia como en ausencia de HCF III.
3. La estimulación de la elongación celular está asociada a la estimulación del
sistema ATPasa de la membrana plasmática.
4. La acidificación del citoplasma mediante el tratamiento con NH4C1 produce
la recuperación de la inhibición observada en presencia de atebrina y un aumento del
crecimiento por elongación.
5. La actividad del sistema redox, modulada por el sistema calcio-calmodulina,
regula la elongación celular.
118
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