Electroforesis de protenas

INTRODUCCION

Las protenas son sustancias formadas por componentes bsicos ms pequeos llamados aminocidos los cuales le confieren una carga elctrica a la protena que puede ser positiva o negativa. Gracias a estas cargas las protenas se movern en un lquido (medio) cuando se coloquen en un campo elctrico.

La electroforesis de protenas es un mtodo de laboratorio que generalmente se realiza en suero para la determinacin y medicin de protenas especficas contenidas en la parte liquida de la sangre, con la finalidad de pesquisar enfermedades.

La electroforesis de protenas sricas usa un campo elctrico para separar las protenas en el suero sanguneo en grupos de tamao, forma y carga similares.

La magnitud y direccin del desplazamiento est influida por el pH y fuerza inica del buffer, el voltaje, peso molecular, carga elctrica, tamao de la protena y tipo de soporte a utilizar, entre los que encontramos gel de poliacrilamida, agarosa, acetato de celulosa.

ELECTROFORESIS DE PROTEINAS

La electroforesis es un mtodo de laboratorio en el que se utiliza una corriente elctrica controlada, con la finalidad de separar biomolculas segn su tamao y carga elctrica a travs de una matriz gelatinosa.La electroforesis de protenas separa las protenas en 5 clases segn su carga elctrica: Albumina; Alfa-1 globulina; Alfa-2 globulina; Beta globulina y Gamma globulina.

Para la interpretacin de la electroforesis se utiliza trazado electrofortico en el cual se consigue visualizar claramente los niveles de cada protena especfica y as poder interpretar si los niveles de protenas son normales o son indicativas de alguna patologa.

El suero sanguneo contiene dos grupos principales de protenas: albmina y globulina las cuales transportan sustancias por el torrente sanguneo. Con la electroforesis de protenas, estos dos grupos se pueden separar en cinco grupos ms pequeos (fracciones) los cuales son identificados en este trazado electrofortico:

Albmina: Las protenas de albmina impiden que la sangre se escape de los vasos sanguneos. La albmina tambin ayuda a transportar algunos medicamentos y otras sustancias por la sangre, y es importante para el crecimiento de tejidos y la curacin. Ms de la mitad de la protena del suero sanguneo es albmina.

Alfa-1 globulina: La lipoprotena de alta densidad (HDL, por sus siglas en ingls), el tipo "bueno" de colesterol, se incluye en esta fraccin.

Alfa-2 globulina: Una protena llamada haptoglobina, que se une con la hemoglobina, se incluye en la fraccin de alfa-2 globulina.

Beta globulina: Las protenas beta globulina ayudan a transportar sustancias, como el hierro, por el torrente sanguneo y ayudan a combatir las infecciones.

Gamma globulina: Estas protenas tambin son llamadas anticuerpos. Ayudan a prevenir y combatir infecciones. Las gamma globulinas se adhieren a sustancias extraas, como bacterias o virus, haciendo que sean destruidas por el sistema inmunitario.

Trazado electrofortico normal de electroforesis.

Los materiales y reactivos que se utilizan para la realizacin de esta tcnica son los siguientes:

Materiales Placa de gel de agarosa para protenas sricas. Plantillas para aplicacin de la muestra. Secantes A y C. Cmara de electroforesis Micropipetas Puntillas para micropipetas

Reactivos Muestra a analizar. Tampn Tris-Barbital concentrado. Colorante azul cido concentrado. Solucin decolorante concentrada.La muestra que se utiliza para la realizacin de la electroforesis es suero, el cual se obtiene a travs de una puncin venosa; el tubo a utilizar en la toma de muestras es aquel que tiene tapa roja. Otras muestras que pueden utilizarse son orina y LCR (lquido cefalorraqudeo), se debe tomar en cuenta que si se usan estos tipos de muestras, se debe realizar una previa fase concentracin (50 100X). El empleo de plasma tendr como resultado la aparicin de una banda de fibringeno entre las fracciones beta y gamma.

Las muestras y/o controles se deben diluir en proporcin 1:4 (1+3) con tampn antes de aplicar al gel.

Factores de interferencia:1. La hemolisis de la muestra puede causar una falsa elevacin de las fracciones alfa-2 y beta.2. Las muestras que se han dejado sin cubrir pueden causar una imprecisin en los resultados debido a la evaporacin de est.

Protocolo a realizar para la tcnica de Electroforesis de protenas.

1) Sacar la placa con agarosa del envase y colocarlo sobre una toalla de papel. Quitar la lmina protectora y secar la superficie del gel con un secante C, para que de esta manera las gotas que tiene la placa no interfieran en el siguiente paso del procedimiento. Luego de secar la placa, desechar el secante.

2) Alinear la plantilla de aplicacin de la muestra con las flechas existentes en el borde del gel, la plantilla se utiliza como gua para que al momento de colocar la muestra en la placa de agarosa, est quede en el lugar correcto. Colocar un secante A encima de la plantilla y presionar con un dedo a lo largo de las ranuras para asegurar un buen contacto, de esta manera, la plantilla queda fijada en la placa. Retirar el secante A y conservarlo para utilizarlo luego en el paso 5.

3) Aplicar 3 l de la muestra en cada ranura y dejar que sea absorbida durante 4 minutos. La aplicacin de 3 l de muestra es para que as no se sobrepase el espacio que corresponde a cada muestra.

4) Mientras la muestra es absorbida, verter aproximadamente 25 ml del tampn diluido en cada hueco interior de la cmara SAS-MX. El tampn a utilizar sirve como conductor de la electricidad y controlador del pH, lo cual es importante para la estabilidad de las molculas biolgicas, adems tambin sirve para el arrastre de las protenas.

5) Tras la absorcin de la muestra, secar ligeramente la plantilla con el secante A (conservado desde el paso 2) para as retirar el excedente de muestra que queda en la plantilla. Luego retirar el secante y la plantilla. 6) Colocar el gel en la cmara con la agarosa hacia arriba, alineando los lados positivo (ctodo) y negativo (nodo) con las posiciones correspondientes en la cmara. La utilizacin de est campo elctrico es para que las protenas migren hacia sus polos respectivos, dependiendo de la carga elctrica que posean.

7) Aplicar la electroforesis al gel: 80 V, 30 minutos. La aplicacin de 80 V es para separar las protenas, las cuales decantaran por la placa de agarosa y el tiempo es para que las protenas puedan polimerizar.

8) Al finalizar la electroforesis, secar el gel a 60 -70C para as fijar las protenas ya decantadas y no destruir la muestra temporadas muy elevadas.

9) Sumergir el gel seco en la solucin colorante durante 10 minutos, de esta manera las protenas se teirn y podrn ser observadas de mejor forma.

10) Decolorar el gel mediante 2 lavados de 60 segundos cada uno con la solucin decolorante, o hasta que el fondo est limpio, para as eliminar el exceso de colorante de la placa.

11) Lavar brevemente en agua destilada para retirar cualquier resto de solucin utilizada en los pasos anteriores. Luego secar.

Los controles a utilizar son de tipo comerciales, los cuales ayudan a la verificacin de cada una de las fases del procedimiento y tambin pueden ser utilizados en cada placa. Otros tipos de controles que se pueden usar son los hechos de manera interna en un laboratorio. Estos son realizados con sueros de pacientes, los que pueden ser normales o patolgicos.

PATOLOGIAS ASOCIADAS

Suero normal

Los rangos de los valores normales son:

Protena total: 6.4 a 8.3 g/dL (gramos por decilitro) Albmina: 3.5 a 5.0 g/dL Alfa-1 globulina: 0.1 a 0.3 g/dL Alfa-2 globulina: 0.6 a 1.0 g/dL Beta globulina: 0.7 a 1.2 g/dL Gammaglobulina: 0.7 a 1.6 g/dL

Los rangos de los valores normales pueden variar ligeramente entre diferentes laboratorios.

Las variaciones que generan patologas son: Disminucin de la protena total: Indica desnutricin, sndrome nefrtico, enteropata por prdida de protenas gastrointestinales.

Aumento de protenas alpha-1 globulina: Esta indica enfermedad inflamatoria crnica, Malignidad, Enfermedad inflamatoria aguda.

Disminucin de las protenas alfa-2 globulinas: Indica hemlisis.

Aumento de las protenas beta globulinas: Puede indicar Hiperlipoproteinemia, Terapia de estrgenos.

Disminucin de las protenas beta globulinas: Indica trastorno de coagulacin congnito, Coagulopata de consumo, Coagulacin intravascular diseminada.

Aumento de las protenas gama globulinas: Puede indicar Mieloma mltiple, Enfermedad inflamatoria crnica, Hiperinmunizacin, Infeccin aguda, Macroglobulinemia de Waldenstrom, Enfermedad heptica crnica.

INFLAMACION Inflamacin aguda asociada con:-aumento de a1 y a2 globulinas

Inflamacin crnica asociada con:- Aumento de la alfa-1, alfa-2 globulinas y un aumento policlonal de las gammaglobulinas- Disminucin de la albmina, globulinas beta (debido a una disminucin de la transferrina.)

SINDROME NEFROTICOEsta enfermedad est asociada con:- Una disminucin de la albmina, alfa-1 globulinas- Un aumento de la alfa-2 globulinas (debido a un aumento de la macroglobulina alfa-2).

CIRROSISEsta enfermedad est asociada con:- Una disminucin de la albmina, alfa-1 y globulinas alfa-2 (debido a la insuficiencia hepatocelular)

HIPOGAMMAGLOBULINEMIA

Disminucin de las inmunoglobulinas policlonales en la zona gamma

Se asocia con:- Parcial o total de la inmunodeficiencia- El tratamiento inmunosupresor- Enfermedad de las cadenas ligeras libres o mieloma no secretor

HIPERGAMMAGLOBULINEMIAAumento de las inmunoglobulinas policlonales en la zona gamma

Se asocia con:- Inflamacin- Cirrosis- Infecciones subaguda y crnica

VOLTAJES Y MEDIOSVoltajesLa gradiente de voltaje afecta positiva y directamente a la movilidad inica. Si aplicamos un muy alto voltaje esto origina un calor excesivo, provocando fenmenos indeseables tales como evaporacin y gradientes de temperatura irregulares que afectan a la separacin, por eso cuando se aplican altos voltajes se debe trabajar en cmaras de frio Se mide en voltios y es lo que define el campo elctrico. Cuanto mayor sea, mayor ser la velocidad de migracin. Las electroforesis se consideran de bajo voltaje si se realizan entre 10-500 voltios (la mayora) y de alto voltaje si se realizan entre 500-10,000 voltios, el voltaje aplicado.1. Realizar la electroforesis a 110 volts por 15 minutos (este voltaje y tiempo puede ser variable de acuerdo a las condiciones del laboratorio)1. Para la inmunoelectroforesis realizar separacin electrofortica a 220 V por 60 minutos.El voltaje no se puede incrementar indiscriminadamente porque se genera un excesivo calor. En contraste, al aplicar bajo voltaje puede ocurrir una pobre separacin, por causa de la difusin por tiempo muy prolongado de la corrida electrofortica.

Medios de electroforesis Papel filtroRpido y sencillo, se usa para separar protenas, oligonucletidos carbohidratos y lpidos, pero con elevada adsorcin debido a los grupos hidroxilo de la celulosa. Acetato de celulosa Se usa para anlisis de fluidos biolgicos, el tiempo de anlisis es corto y la tcnica es sencilla, los grupos OH estn acetilados, lo que reduce la adsorcin; baja tincin de fondo; es posible transparentarla o disolverla para detectar y recuperar los componentes separados, pero tiene dbil resolucin.

GelesSon polmeros de red tridimensional, el uso de estos como medio de soporte en electroforesis constituye una alternativa para solucionar algunos problemas asociados con el uso de el papel y de acetato de celulosa como la adsorcin, la difusin y poca resolucin de los compuestos separados. Hay factores que influyen en la migracin de la muestra en los geles como el tamao del poro y el radio de la molcula, hay tres tipos de geles: Almidn El almidn es una pasta de almidn cuyos granos se han disgregado en un tampn caliente (se hinchan), es una tcnica barata, fcil y rpida pero que actualmente se utiliza poco, ha sido sustituido por la poliacrilamida. PoliacrilamidaEs qumicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rpida y reproducible. Forma, adems, geles transparentes con estabilidad mecnica, insolubles en agua, relativamente no inicos y que permiten buena visualizacin de las bandas durante tiempo prolongado. Adems tiene la ventaja de que variando la concentracin de polmeros, se puede modificar de manera controlada el tamao del poro. AgarosaLa agarosa es un polisacrido (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, pero de composicin homognea), cuyas disoluciones poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50C y formar un gel, semislido al enfriarse. Este esta constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras polimricas embebida en gran cantidad de medio lquido, que retarda el paso de las molculas, se usa usualmente para separar molculas grandes de alrededor 20.000 nucletidos.

INMUNOFIJACION

Muestras- Suero fresco o refrigerado a en un tiempo igual o menor a 72hrs (a 2 8 C).- Liquido Cefaloraqudeo(LCR).- Orina.Espectro clnicoSe utiliza cuando hay un aumento de las regiones beta o gamma en la electroforesis de protenas en suero, o cuando se sospecha de la presencia de mieloma mltiple.FundamentoLa inmunofijacin es una tcnica que tiene como funcin, que una protena quede anclada al sitio donde migr en la electroforesis, esto se lleva a cabo por medio de un complejo insoluble con anticuerpos. Se puede dividir en 4 fases:- Separacin de las protenas mediante electroforesis en gel de agarosa - Fijacin e inmunoprecipitacin de las protenas: se adicionan los antisueros respectivos y las soluciones fijadoras sobre la superficie del gel para identificar las protenas especficas y precipitarlas. - Remocin de protenas solubles que no se precipitaron ni se unieron a los antisueros. - Tincin de las protenas precipitadas para permitir su visualizacin. Las bandas que se inmunoprecipitan se comparan con las bandas anormales observadas inicialmente en la electroforesis de protenas y segn la reaccin con los antisueros se define su naturaleza y si corresponden o no a un componente monoclonal.

Interpretacin

Se espera una tincin difusa y politpica de las inmunoglobulinas y de las cadenas livianas, lo cual se puede notar en la primera imagen.

La presencia de una protena monotpica, se identifica por una banda muy definida y delimitada que reacciona con un anticuerpo contra cadena pesada, y con uno contra cadenas livianas; migrando las dos a la misma distancia.

CONCLUSIONLa electroforesis en gel de agarosa es un mtodo de laboratorio normalizado que se utiliza para separar e identificar distintos tipos de protenas, con el fin de revelar distintas patologas mediante la interpretacin de un trazado electrofortico que deriva de esta electroforesis.Derivada de esta electroforesis tambin encontramos la inmunofijacin, la cual solo se inclina a la identificacin de inmunoglobulinas.Esta tcnica debe realizarse siempre en el orden que se establece ya que un solo error u omisin puede implicar una falla en el procedimiento al igual que en la lectura del resultado y obtener un diagnstico errneo.