Electroforesis, nb, sb y wb.
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Amanda Sánchez López
23/04/2014
TÉCNICAS INTRUMENTALES BÁSICAS
ESQUEMA
1- TECNICAS ELECTROFORÉTICAS • Fundamento físico-químico • Ventajas • Factores que afectan a la electroforesis • Tipos de electroforesis
2- WESTERN BLOT
3- SHOUTHERN BLOT
4- NORTHEN BLOT
ELECTROFORESIS
FUNDAMENTO FISICO-QUIMICO
DEFINICIÓN: Técnica utilizada para la SEPARACIÓN, PURIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN de partículas. Basada en la migración de las misma por la acción de un campo eléctrico.
CÁTODO ÁNODO
FUNDAMENTO FISICO-QUIMICO
q
E
L
FE Ff
CÁTODO ÁNODO
μ
r f Ff
FUNDAMENTO FISICO-QUIMICO
Las biomoléculas se separan en función de: - Carga electrica - Tamaño y forma
• A mayor carga, mayor movilidad • A mayor tamaño, menor movilidad • A mayor viscosidad del medio, menor movilidad
U Movilidad electroforérica. Velocidad de la particular por unidad de campo
VENTAJAS DE LA TÉCNICA
• Sensibilidad
• Elevado poder de resolución
• Versatilidad
• Posibilidad de separar mezclas complejas
• Aporta potente criterio de pureza
• Posibilidad de determinar otros parámetros: Pm, pI, nºde
cadenas polipeptídicas
FACTORES QUE AFECTAN A LA ELECTROFORESIS
CAMPO ELECTRICO / FUENTE DE ALIMENTACIÓN
•Diferencia de potencial entre los electrodos (Voltios)
•Intensidad de corriente (Amperios) [Ley de Ohm(V = i x R)]
•Resistencia (Ohmios)
•Temperatura (efecto Joule)
MUESTRA
• Carga, forma y tamaño de la molécula
TAMPÓN
• Fuerza iónica, pH
FACTORES QUE AFECTAN A LA ELECTROFORESIS
SOPORTE
• NO RESTRICTIVO
Permite el paso de la muestra. No supone un impedimento para la misma.
Proteinas.
La muestra se separa en función de la densidad de carga (relación masa y carga)
• RESTRICTIVO
Por su composición ofrecen un impedimento al paso de las muestras.
En condiciones generals, la separación dependerá de la forma, tamaño y carga
TIPOS DE ELECTROFORESIS
1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS 2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS 2.A. NO DESNATURALIZANTE 2.B. DESNATURALIZANTE
B.1. ISOELECTROENFOQUE B.2. BIDIMENSIONAL
TIPOS DE ELECTROFORESIS
1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS 2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS 2.A. NO DESNATURALIZANTE 2.B. DESNATURALIZANTE
B.1. ISOELECTROENFOQUE B.2. BIDIMENSIONAL
TIPOS DE ELECTROFORESIS
1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS
Separar, identificar y purificar moléculas o fragmentos de DNA o RNA
MIGRACIÓN • ÁNODO (+) • Relación carga-masa igual • Tamaño y forma Soportes restrictivos Agarosa disuelta en un buffer
Agarosa Tamaño poros
Mejor separación fragmentos grandes
TIPOS DE ELECTROFORESIS
1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS
Separar, identificar y purificar moléculas o fragmentos de DNA o RNA
MIGRACIÓN • ÁNODO (+) • Relación carga-masa igual • Tamaño y forma
Soportes restrictivos DETECCIÓN Bromuro de etidio. Agente intercalante fluorescente
TIPOS DE ELECTROFORESIS
1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS
TIPOS DE ELECTROFORESIS
1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS
TIPOS DE ELECTROFORESIS
1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS
EtBr
Tª
TIPOS DE ELECTROFORESIS
1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS
EtBr
Tª
TIPOS DE ELECTROFORESIS
1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS
EtBr
Tª
Glucosa/glicerol y colorante
TIPOS DE ELECTROFORESIS
1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS
MARCADOR DE PESO MOLECULAR (PM) ESTIMACIÓN DE PM
TIPOS DE ELECTROFORESIS
1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS 2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS 2.A. NO DESNATURALIZANTE 2.B. DESNATURALIZANTE
B.1. ISOELECTROENFOQUE B.2. BIDIMENSIONAL
TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
• La acrilamida polimeriza por la acción del TEMED y el PSA (persulfatoamónico) • La metilen-bis-acrilamida forma enlaces cruzados entre los polímeros de acrilamida • En conjunto se forma una especie de malla cuyo diámetro de poro viene determinado por la concentración de acrila-mida/bis-acrilamida (%)
TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
Uniformidad del gel
Conformación de la proteína
Gel uniforme
Gel discontinuo
NO Desnaturalizante
Desnaturalizante
TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
Uniformidad del gel
Conformación de la proteína
Gel uniforme Gel discontinuo
NO Desnaturalizante
Desnaturalizante NO
Desnaturalizante Desnaturalizante
TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
GEL DISCONTINUO
GEL “STACKING”(EMPAQUETADOR) •Menor concentración de acrilamida •Tamaño de poro
Función: Acumular las proteínas a la entrada del gel separador para que salgan al mismo tiempo
GEL “RUNNING”(SEPARADOR) •Mayor concentración de acrilamida •Tamaño de poro menor
Función: separar las proteínas
STACKING
RUNNING
TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
Las proteinas se pueden separar por: Tamaño, forma y carga eléctrica
La mayoría de las proteínas estarán cargadas negativamente
TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
Puentes disulfuro
TIPOS DE ELECTROFORESIS
1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS 2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS 2.2.A. NO DESNATURALIZANTE 2.2.B. DESNATURALIZANTE
B.1. ISOELECTROENFOQUE B.2. BIDIMENSIONAL
TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
CONDICIONES NO DESNATURALIZANTES
TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
CONDICIONES NO DESNATURALIZANTES
A igual tamaño migra más la de
mayor carga
A igual carga migra más la de menor tamaño
TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
CONDICIONES NO DESNATURALIZANTES
80KDa 40KDa
80KDa
40KDa
TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
CONDICIONES NO DESNATURALIZANTES
80KDa 40KDa
TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
CONDICIONES NO DESNATURALIZANTES
VENTAJAS • Separa proteínas en estado nativo • Las proteínas siguen siendo funcionales • Permite separar complejos proteicos o proteínas multiméricas como una unidad • Excelente herramienta para detectar cualquier proceso que altere la carga o la conformación de una proteína INCONVENIENTES • Muchas proteínas no migran por no tener carga neta o por poseer carga neta positiva • El proceso de separación es muy lento debido a la debilidad de la carga neta de las proteínas • El proceso de separación no sólo estáafectado por el tamaño sino también por la forma de la proteína
TIPOS DE ELECTROFORESIS
1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS 2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS
2.A. NO DESNATURALIZANTE 2.B. DESNATURALIZANTE
B.1. ISOELECTROENFOQUE B.2. BIDIMENSIONAL
TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
CONDICIONES DESNATURALIZANTES: SDS-PAGE
Las proteínas pierden su conformación nativa 1. Se emplean AGENTES DESNATURALIZANTES (urea, detergentes), el SDS
(sodiumdodecylsulfate) es el de mayor uso
2. Se emplea un AGENTE REDUCTOR de puentes –s–s– generalmente β-mercaptoetanol o DTT (ditiotreitol)
¿QUE CONSEGUIMOS CON ESTO?
La cantidad de SDS unido a la proteína es proporcional a su tamaño, de tal forma que la relación carga/tamaño entre todas las proteínas va a ser aprox. la misma
TIPOS DE ELECTROFORESIS
¿QUE CONSEGUIMOS CON ESTO?
CONDICIONES DESNATURALIZANTES: SDS-PAGE
El β-mercaptoetanol va a “romper” los enlaces –S–S– tanto inter-como intramoleculares mediante una reacción redox. (El β-mercaptoetanol reduce los puentes disulfuro)
DTT
TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
CONDICIONES DESNATURALIZANTES: SDS-PAGE
80KDa 40KDa
TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
CONDICIONES DESNATURALIZANTES: SDS-PAGE
60KDa
40KDa
20KDa
80KDa 40KDa
TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
NO DESNATURALIZANTE
DESNATURALIZANTE SDS-PAGE
TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
VENTAJAS •Separación rápida de las proteínas •La separación no depende de la forma de la proteína nativa
•Se puede estimar el peso molecular de las proteínas •Aunque desnaturalizadas, las proteínas pueden usarse para la fabricación de anticuerpos (en la mayoría de los casos) INCONVENIENTES •Las proteínas separadas están desnaturalizadas por tanto no son funcionales
CONDICIONES DESNATURALIZANTES: SDS-PAGE
PARA LA DETERMINACIÓN DEL PESO MOLECULAR: 1. Necesitamos un marker 2. Necesitamos normalizar
ELECTROFORESIS GEL POLIACRILAMIDA
Azul de coomassie
DETECCION DE PROTEINAS - Azul de Coomassie - Todas las proteinas
TIPOS DE ELECTROFORESIS
1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS 2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS 2.A. NO DESNATURALIZANTE 2.B. DESNATURALIZANTE
B.1. ISOELECTROENFOQUE B.2. BIDIMENSIONAL
TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. ISOLELECTROENFOQUE
Las proteínas se separan por: PUNTO ISOELÉCTRICO Las proteínas se moverán de acorde con su carga neta hacia el ánodo o el cátodo hasta que alcancen un valor de pH = pI donde su carga neta es neutra (y ya no se mueven)
TIPOS DE ELECTROFORESIS
1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS 2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS
2.A. NO DESNATURALIZANTE 2.B. DESNATURALIZANTE
B.1. ISOELECTROENFOQUE B.2. BIDIMENSIONAL
TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. BIDIMENSIONAL
• Técnica de alta resolución cuyo objetivo es la separación de mezclas de proteínas altamente complejas •La base de su elevado poder de resolución está precisamente en la bidimensionalidad, es decir, en que las proteínas son separadas secuencialmente por dos criterios físicos •Debido a su elevada resolución, ha sido una técnica ampliamente utilizada en la confección de mapas de referencia, es decir, en la disección de la composición proteica de un determinado orgánulo o tipo celular (metabolómica)
TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. BIDIMENSIONAL
En realidad son dos proteinas con identico peso molecular o punto isoeléctrico!
SOLUCION:
Electroforesis Bidimensional
TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. BIDIMENSIONAL
Peso molecular
Punto isoeléctrico
TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. BIDIMENSIONAL
WESTERN BLOT
WESTERN BLOT
Gel de proteínas Membrana tras WB
WESTERN BLOT
● ELECTROTRANSFERENCIA
● Mejor y más tiempo
● TECNICAS DE INMUNODETECCIÓN
WESTERN BLOT
La MEMBRANA de NITROCELULOSA se puede teñir a su vez con un colorante (ROJO PONCEAU) que pone de manifiesto el total de proteínas que se han transferido desde el gel
WESTERN BLOT
DETECCIÓN
•Autorradiografía •Precipitación de un cromógeno insoluble por la acción de una actividad enzimática •Fluorescencia •Quimioluminiscencia
WESTERN BLOT
DETECCIÓN
WESTERN BLOT
DETECCIÓN
NORTHERN/SOUTHERN BLOT
MUCHAS GRACIAS
TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
GEL UNIFORME
Concentración de poliacrilamida uniforme Función: separar las proteínas: Tamaño y densidad de carga
Ventajas: • Rápido • Sencillo • Puede estudiarse la funcionalidad de las proteínas separadas
Desventajas: •Menor resolución