ENSAMBLAMIENTO DE FRAGMENTOS DE ADN

Matías Brunstein Macri

Alejandro Pedraza

Jimena Rinaldi

2004Introducción a la Biología Computacional

Departamento de Computación-FCEN-UBA.

Primera Parte

Biological Background

Genoma. Complemento genético entero y haploide de un organismo. Es decir toda la secuencia de ADN, codificante o no codificante y su posición en los cromosomas.

Genómica. Disciplina que se ocupa de la caracterización de los genomas. Se encuentra dividida en Genómica Estructural y la Genómica Funcional.

Objetivo de la Genómica Estructural es conocer el/los genoma/s de una especie en particular/diferentes especies.

.

Genoma y Genómica

Aplicaciones delestudio de los genomas Predecir genes, secuencias promotoras y

reguladoras de la transcripción. Comparar genomas de diferentes

individuos de la misma especie para detectar variaciones o polimorfismos a nivel poblacional. Estas variaciones pueden ser sustituciones, deleciones/inserciones, o rearreglos cromosómicos (cambio de posición en el genoma).

Aplicaciones delestudio de los genomas Comparar genomas de diferentes

especies. Esto permite hacer inferencias acerca de los procesos evolutivos de remodelación de genomas.

Otras.

Genomas eucarióticos y procarióticos

Genomas animales y vegetales

Sizes of eukaryotic genomes

Species Genome size (Mb)

Fungi Saccharomyces cerevisiae 12.1Aspergillus nidulans 25.4

Protozoa Tetrahymena pyriformis 190

Invertebrates Caenorhabditis elegans 97

Drosophila melanogaster 180Bombyx mori (silkworm) 490Strongylocentrotus purpuratus (sea urchin) 845Locusta migratoria (locust) 5000

Vertebrates Takifugu rubripes (pufferfish) 400

Homo sapiens 3200Mus musculus (mouse) 3300

Plants Arabidopsis thaliana (vetch) 125Oryza sativa (rice) 430Zea mays (maize) 2500Pisum sativum (pea) 4800Triticum aestivum (wheat) 16000Fritillaria assyriaca (fritillary) 120000

Paradoja del valor C

Secuencias repetitivas Distintos tipos de secuencias repetitivas

se encuentran en muchos organismos y ocupan gran parte de los genomas: Satélites Pseudogenes Transposones y retrotransposones

Pueden estar esparcidas por el genoma o en tandem y varían mucho en tamaño.

¿Cómo se estudian los genomas? Mapeo genético Mapeo físico Secuenciación exhaustiva

El mapeo genético

El mapeo genético está basado en la utilización de técnicas genéticas para construir mapas que muestran la posición de marcadores genéticos o de marcadores moleculares. Las técnicas genéticas incluyen experimentos de recombinación y estudio de pedigrees en humanos.

El mapeo físico

El mapeo físico utiliza técnicas de Biología Molecular para examinar directamente las moléculas de ADN para la construcción de mapas que muestran la posición de fragmentos de ADN (en general de secuencia desconocida) en el genoma.

Secuenciación automáticaFragmentos de hasta 700 pb

Bibliotecas genómicas Como no es posible secuenciar un genoma

en una sola reacción de secuenciación se lo divide en fragmentos, los cuales se almacenan en clones bibliotecas genómicas.

Una biblioteca genómica es un conjunto de clones, cada uno de los cuales contiene un fragmento de un genoma de un organismo dado.

Las bibliotecas genómicas se consiguen clonando los fragmentos en vectores.

Clonado de fragmentos

Vectores de clonado utilizados para secuenciación de genomas

Fago λ

Cósmido

YAC

Vectores de Clonado

Problema de los YACs

Vectores de Clonado Otros vectores que incluyen insertos

de gran tamaño: Bacteriógafos P1 BACs PACs Fósmidos

Sizes of human genomic libraries prepared in different types of cloning vector

Number of clones*Type of vector Insert size (kb)

P = 95% P = 99%

replacement 18 532 500 820 000

Cosmid, fosmid 40 240 000 370 000

P1 125 77 000 118 000

BAC, PAC 300 32 000 50 000

YAC 600 16 000 24 500

Mega-YAC 1400 6850 10 500

* Calculated from the equation:where N is the number of clones required, P is the probability that any given segment of the genome is present in the library, a is the average size of the DNA fragments inserted into the vector, and b is the size of the genome.

Ensamblado:Shotgun approach

Consiste en ensamblar directamente los fragmentos de ADN secuenciados por superposición.

Haemophilus influenzae

19951830 kb, biblioteca genómica

18.638 clones,

insertos de 1,6-2 kb.

Resolución de gaps

Los contigs se pueden construir por chromosome walking

Ensamblado:Clone Contig Approach Se clonan fragmentos de hasta 1,5

Mb en YACs o BACs. Se construye un contig identificando

los clones que contienen fragmentos superpuestos, los cuales se secuencian por el método de shotgun.

Whole genome shotgun sequencing La experiencia con el método de shotgun en

genomas chicos mostró que si el largo total de la secuencia que se genera es 6,5-8 veces el largo de la secuencia total del genoma estudiado, entonces los contigs resultantes ocuparan el 99,8% de la secuencia del genoma, con unos gaps tales que se pueden resolver facilmente.

70 millones de fragmentos de 500pb resolverían el genoma humano en 3 anos con 75 secuenciadores, cada uno de los cuales puede secuenciar 1000 secuencias de esas por días.

Ejemplo de genomas de los cuales se ha publicado la secuencia en versión completa o borrador

Especie Tamaño del genoma (Mb) Nro de genes estimados

Eukarya

Arabidopsis thaliana (plant) 125 25 500

Caenorhabditis elegans (nematode) 97 19 000

Drosophila melanogaster (fruit fly) 180 13 600

Homo sapiens (human) 3200 30 000 - 40 000

Saccharomyces cerevisiae (yeast) 12.1 5800

Eubacteria

Escherichia coli K12 4.64 4400

Mycobacterium tuberculosis H37Rv 4.41 4000

Mycoplasma genitalium 0.58 500

Pseudomonas aeruginosa PA01 6.26 5700

Streptococcus pneumoniae 2.16 2300

Vibrio cholerae El Tor N16961 4.03 4000

Yersinia pestis CO92 4.65 4100

Archeae

Archaeoglobus fulgidus 2.18 2500

Methanococcus jannaschii 1.66 1750

Complicaciones Instancias reales del problema muy

largas Errores

Inserciones Deleciones sustituciones

Fragmentos quiméricos Orientación desconocida Regiones repetidas Pérdida de cobertura (gaps)

Segunda Parte

Modelos

¿Qué es un modelo? Es una abstracción de la realidad

que nos facilita el estudio de un fenómeno o problema.

Un modelo no es un algoritmo Como veremos más adelante, para un

mismo modelo pueden plantearse varios algoritmos.

Modelos para el ensamblamiento de ADN

Plantearemos tres modelos teóricos.1. Shortest Common Superstring2. Reconstruction3. Multicontig

Cada uno plantea distintas restricción sobre los fragmentos.

Se asume que las muestras están libres de contaminación.

Primer Modelo:Shortest Common Superstring

Tiene principalmente interés teórico pues no es muy útil en la realidad.

Plantea muchas restricciones: Los fragmentos no deben tener errores Deben estar orientados correctamente La secuencia buscada no debe tener

repeticiones

SCS: Definición

Dado un conjunto de strings F, hallar un string S de longitud mínima tal que para todo string f en F, f es substring de S.

Notar que S debe ser un superstring perfecto, por lo que no permites errores experimentales.Se debe conocer la orientacíon de cada string f.

SCS: Ejemplo

F = {ACT, CTA, AGT}

S = ACTAGT

A C T

C T A

A G T

S = A C T A G T

SCS: Repeticiones

Supongamos que secuenciamos la siguiente cadena de nucleótidos

S = ACTTGTAAGGTTGTTAAG

de la cual obtenemos los siguientes fragmentos

F = {ACTT, TTGTAA, AAGGT, TTGT, GTT, TTAG}

SCS: Repeticiones (Cont.)Según este modelo, el resultado de hallar el SCS de F sería:

A C T T

T T G T A A

A A G T

T T G T

G T T

T T A G

S’ = A C T T G T A A G T T A G

SCS: Resumen No admite repeticiones No admite errores experimentales Se debe conocer la orientación de

los fragmentos. Es un problema NP-Hard. No resulta práctico para aplicaciones

reales debido a la gran cantidad de restricciones y limitaciones.

¿Qué significa NP-Hard? NP-Completo se refiere a una familia

de problemas de decisión para los cuales no se conoce una solución polinomial.

Los problemas de decisión son aquellos para los que se espera una respuesta del tipo “sí” o “no”.

¿Qué significa NP-Hard? En el caso del TSP, el problema

sería:¿Existe un camino que pase por todas las ciudades exactamente una vez recorriendo una distancia menor a 500 Km.?

La respuesta esperada es simplemente “sí” o “no”.

¿Qué significa NP-Hard? Un problema HP-Hard es el problema

de optimización asociado a un problema NP-Completo.

En nuestro caso:¿Cuál es el camino más corto que pasa exactamente una vez por cada ciudad?

Segundo Modelo:Reconstruction

Este modelo tiene en cuenta: Errores. Orientación desconocida

Pero no modela: Repeticiones Falta de cubrimiento

Reconstruction: Definiciones

Para entender como este modelo considera los errores debemos contar con algunas definiciones previas. Distancia de edición (o edit distance) Distancia de edición de substrings (o substring edit distance) Substring aproximado

Distancia de Edición

Dadas dos cadenas a y b, llamaremos distancia de edición, y lo notaremos d(a, b), a la cantidad de inserciones, deleciones y/o substituciones que deben realizarse sobre las cadenas para que valga a = b.Ejemplo: d(ACTGT, AGGT) = 2

pues ACTGT = ACTGT

Substitución Inserción

Distancia de Edición de Substrings

Dadas dos cadenas a y b, llamaremos distancia de edición de substrings a:

),(min),()(

sadbadbSs

s

donde S(b) es el conjunto de los substrings de b. Ejemplo: ds(ACT, GATTACA) = 1Pues d(ACT, ACA) = 1 y ACT S(b)

Substring AproximadoSea un número real entre 0 y 1. Un string f es un substring aproximado de S con error cuando

fSfd s ),(

donde |f| es la longitud del string f.Por ejemplo: si = 0.05, permitiremos que f difiera en a lo sumo un 5% con el substring màs cercano en S.

Reconstruction: Definición

fSfdSfd ss ),(),,(min

Dado un conjunto de strings F y una cota de error entre 0 y 1, hallar un string S de longitud mínima tal que para todo string f en F

donde f es el string reverso y complementario a f.

Reconstruction: Resumen No admite repeticiones ni espacios

no cubiertos Admite errores experimentales Modela la orientación desconocida Es un problema NP-Hard. SCS es un caso particular de este

modelo.

Tercer Modelo:Multicontig:

Introduce la noción de buen enlace. Este modelo tiene en cuenta:

Errores. Orientación reconocida Falta de cubrimiento En algunos casos, repeticiones

Multicontig: DefinicionesLlamaremos layout a un alineamiento múltiple de un conjunto de secuencias.El siguiente layout será utilizado como ejemplo en varias definiciones:

f1: C T T G T A

f2: T G T A G T T

f3: C T A T

f4: T A T T

f5: G T A G T

Multicontig: Definiciones (cont.)Diremos que dos fragmentos f y g se solapan (y lo llamaremos overlap) si comparten una o más columnas en el layout. Es decir, si ambos string se intersecan.

f1: C T T G T A

f2: T G T A G T T

f3: C T A T

f4: T A T T

f5: G T A G T

Multicontig: Definiciones (cont.)

Podemos separar los overlaps en dos categorías: Los que producen un enlace. (f3 – f4)

y los que no lo producen. (f2 – f5)

f1: C T T G T A

f2: T G T A G T T

f3: C T A T

f4: T A T T

f5: G T A G T

Multicontig: Definiciones (cont.) El enlace más débil (weakest link) es

aquél overlap con menor longitud que produce un enlace.

Diremos que un layout es un t-contig si el enlace más débil que posee tiene longitud t.

Si es posible obtener un t-contig de un conjunto de fragmentos F, diremos que F admite un t-contig.

Multicontig: Definición ILibre de Errores

Dado un conjunto de strings F y un entero t, particionar F en el mínimo número de subconjuntos Ci, 1 ≤ i ≤ k, tal que cada Ci admita un t-contig.

Multicontig: EjemplosDado F = {GTAC, TAAG, TGTAA}

Si t = 3T A A T G G T A C

T G T A A

Si t = 2T A A T G G T A C

T G T A A

Si t = 1T G T A A

T A A T G

G T A C

Multicontig: Contemplando errores

Si se admiten errores en el acoplamiento, se debe obtener una cadena por consenso que será el resultado del ensamblamiento.

Diremos que S es una cadena -consensuada de F si, para cada cadena f en F, la distancia de edición entre f y su imagen en S es ≤ | f |.

Multicontig: Contemplando errores

Por ejemplo: S es una cadena 0.20 – consensuada con respecto a F.

f1: C T T C T A

f2: T G T T G T T

f5: G T A G T

S C T T G T A G T T

Multicontig: Definición IIAdmitiendo de Errores

Dado un conjunto de strings F, un entero t ≥ 0 y una tolerancia de error entre 0 y 1, particionar F en el mínimo número de subconjuntos Ci, 1 ≤ i ≤ k, tal que cada Ci admita un t-contig con un consenso .

Multicoting: Resumen Admite repeticiones en algunos

casos. Admite errores experimentales Modela la orientación desconocida Es un problema NP-Hard.

Tercera Parte

Algoritmos

Repaso de Grafos Los grafos son artefactos

matemáticos que permiten expresar de una forma visualmente sencilla y efectiva las relaciones que se dan entre elementos de muy diversa índole.

Repaso de Grafos Un grafo simple está formado

por dos conjuntos: Un conjunto V de puntos

llamados vértices o nodos. Un conjunto E de pares de

vértices que se llaman aristas o arcos y que indican qué nodos están relacionados.

Notación: G(V,E)

x

x y

Repaso de Grafos A los ejes se les puede asignar

un peso. Notación: w(x,y) Si hay más de un arco

hablamos de un multigrafo Si los arcos se recorren en una

en una dirección concreta pero no en la contraria lo llamamos grafo dirigido o dígrafo y los arcos son aristas

x y8

x y

x y

x y

Repaso de Grafos Un Camino es una secuencia de

vértices V1, V2, V3, ... , Vn, tal que cada para uno de estos V1->V2, V2->V3, V1->V3

Un Camino Simple es cuando todos sus vértices, excepto tal vez el primero y el último son distintos.

Un Ciclo Simple es un camino simple de longitud por lo menos de uno que empieza y termina en el mismo vértice.

Se dice que un grafo es aciclíco cuando no contiene ciclos.

v1

v2

v3

v4

v1

v2

v3

v4

v1

v2

v3

v1

v2

v3

Representado el problema como un grafo Se representa con un grafo ya que

resulta mas amigable para verlo visualmente, y se le esta aportando al problema, todo un conjunto de herramientas matemáticas para resolverlo.

Representado el problema como un grafo Datos del problema:

Un conjunto de fragmentos F F = {ACTT, TTGTAA, AAGGT, TTGT, GTT, TTAG}

Un string S S = ACTTGTAAGGTTGTTAAG

El overlap de los fragmentos ACTT TTGTAA

Representado el problema como un grafo Datos del problema:

El orden en que se hace el overlap ACTT TTGTAA TTGTAA ACTT

La cantidad de nucleotidos que están en el overlap ACTT TTGTAA 2 nucleótidos

Representado el problema como un grafo Fragmentos son representados por los

nodos o vértices. Los overlap’s son representados por los

ejes que unen a los nodos. El orden del overlap de dos fragmentos,

esta dado por la dirección del eje o arista. La cantidad de nucleótidos que estan en

el overlap de dos fragmentos, esta representado por el peso de los ejes.

El string s se representa como un camino en el grafo.

Representado el problema como un grafo Ejemplo:

F={TACGA, ACCC, CTAAAG, GACA} a b c d

a

dc

b

200

0

0

0

0

0

1

1

1

1

Representado el problema como un grafo Ejemplo:

F={TACGA, ACCC, CTAAAG, GACA} a b c d

a

dc

b

2

1

1

1

1

Representado el problema como un grafo Ejemplo:

F={TACGA, ACCC, CTAAAG, GACA} a b c d

S1= TACGACCCCTAAAGACAS2= TACGACACCCTAAAG

a

dc

b2

1

1

1

1

a

dc

b2

1

1

1

1

Representado el problema como un grafo Problema:

Encontrar el superstring mas corto. Esto es equivalente a encontrar un camino hamiltoniano máximo dentro del grafo. Este problema es NP-Completo

Algoritmos Greedy

Aplica al modelo SCS y Reconstruction

Subgrafo AcíclicoAplica al modelo Multiconting

Algoritmo Greedy En cada paso intenta maximizar la

solución del subproblema analizad. No retrocede una vez tomada cada decisión.

Algoritmo Greedy Construimos un grafo dirigido a

partir del multigrafo formado por los fragmentos de F, dejando entre cada par de nodos únicamente las aristas mas pesadas, ya que estamos buscando el camino mas pesado

Algoritmo Greedy Entrada: Grafo orientado con n vértices. Salida: Camino hamiltoniano en el grafo de entrada//InicioPara i<-1 hasta n

in[i] <-0 //cuantos ejes entran en iout[i] <-0 // cuantos ejes salen de iMakeSet(i)

//ProcesoOrdenar los ejes de acuerdo a a su peso, con el mas pesado primeroPara cada eje (f,g) en ese orden

Si in[g] = 0 y out[f] = 0 y FindSet(f) =/= FindSet(g)seleccionamos el eje (f,g)in[g] <- 1out[f] <- 1Union(FindSet(f), FindSet(g))

Si queda una sola componenteterminar

Retornar los ejes seleccionados

Algoritmo Greedy La solución encontrada es a lo sumo

2,75 veces peor que la optima, y se conjetura que lo es 2 veces.

Este algoritmo, no siempre encuentra una solución.

TGCAT ATGC GCC3

22

Algoritmo Subgrafo Acíclico Este algoritmo restringe la hipótesis,

asumiendo que los fragmentos están libres de errores, que se conoce la orientación y que fueron obtenidos de un buen secuenciamiento.

Se entiende por buen secuenciamiento, básicamente, a que los fragmentos cubren a la molécula en su totalidad y que se garantiza el overlap.

Algoritmo Subgrafo Acíclico Dado un multigrafo con los fragmentos en los

nodos, obtenemos un grafo dirigido, quedándonos con las aristas de mayor peso entre los nodos, ya que queremos encontrar el camino mas pesado.

Luego quitamos todas las aristas que tengan un peso menor al t-contig deseado. De forma tal que quede un subgrafo acíclico

Luego se busca un camino hamiltoniano máximo en el subgrafo acíclico. Esto es polinomial y se puede resolver con un algoritmo greedy.

Algoritmo Subgrafo Acíclico Ejemplo:

Consideremos que queremos llegar al string S y tenemos los fragmentos w, z, u, x e y

S = AGTATTGGCAATCGATGCAAACCTTTTGGCAATCACTw = AGTATTGGCAATC z = AATCGATGu = ATGCAAACCTx = CCTTTTGGy = TTGGCAATCACT

Y se pide un t-contig de 3

Algoritmo Subgrafo Aciclico El subgrafo acíclico de de los

overlap’s quedaría de la siguiente forma:

4

9

3 3 4

Heurística Buscar overlap

Para cada par de fragmentos, calcular el match prefijo-sufijo.

Usar el algoritmo de programación dinámica de alineamiento semiglobal sin penalidad.

Ordenar los fragmentos Construir el camino con un algoritmo greedy o

heurística Cada camino tiene su correspondiente camino

complementario No es necesario incluir fragmentos incluidos en otros Los ciclo y cubrimientos abundantes pueden indicar

repeticiones. Alineamiento y consenso

Bibliografía Brown, T. A., Genomes, 2002, 2nd.

Edition, BIOS Scienfic Publishers, Ltd. Griffiths A., Miller J., Suzuki D. & Lewontin

R, An Introduction to Genetic Analysis, 2000, 7th ed. Freeman & Company

Meidanes Prevner Baxevanis