1.- Medios de cultivo para microorganismos- Medios de cultivo para cepasmicroorganismos que se utilizan en la industria alimentaria.

1. SACHAROMYCES CEREVISIAE:Medio YPD:

Medio Minimo :

Medio MFS:

2. SACH. SUB ESPEC. CALVERGERSIS

3. XANTHOMONAS SP: meLos medios de cultivo PSA y 523 modificado fueron similares entre s en comparacin con los medios 52 , agar nutriente, MSXM y MSSXM,4. KLUYVEROMYCES FRAGILIS: Suplementacin del medio de cultivo:El suero fue suplementado con la adicin de 0,15% de extracto de levadura y 0,1% de (NH4 )2 SO4, segn lo recomendado por Snchez y Castillo (3).

.- Inculo:El medio usado para preparar el inculo fue el suero desproteinizado y suplementado. Se colocaron 140 ml de este suero en fiolas de 500 ml, se le ajust el pH a 5 y se esteriliz a 120C x 10 min. Una vez enfriado se le agreg el contenido celular crecido, durante 24 horas a 30C en cua de agar/extracto de malta, arrastrado con 10 ml de caldo extracto de malta; las fiolas se incubaron a 30C por 18 horas, con agitacin, esto garantiz una poblacin microbiana alrededor de 10 7 clulas/ml.

.- Condiciones del cultivo:En el proceso de produccin de la lactasa, se utiliz un fermentador marca New Brunswick modelo BioFlo 2000 modular con una capacidad de 2 l. Para lo cual 1350 ml de suero desproteinizado y suplementado se esterilizaron a 120C x 10 min., en el mismo recipiente del fermentador, posteriormente se le agreg 150 ml de inculo, obteniendo un volumen total de trabajo de 1,5 L .Se estable de acuerdo a la literatura revisada siendo los siguientes: temperatura: 27 35C, pH: 4 7, velocidad de agitacin: 100 200 r.p.m y tiempo de fermentacin: 12 24 horas.

5. ACETOBACTER Preparacin del medio de cultivoPara su preparacin, debemos resuspender el cultivo de Acetobacter e inocularlo en 100 mL de medio (3 g/L de peptona, 5 g/L de extracto de levaduras y 25 g/L de manitol), en un matraz Erlenmeyer. Para asegurar la mezcla y el aporte de oxgeno, el medio debe mantenerse agitado durante 48 horas. Construccin del fermentador1. En un recipiente cilndrico, que acta de fermentador, ponemos algodn en la base y rellenamos con serrn. El algodn evitar que las virutas obstruyan la salida del lquido.2. Introducir en el fermentador 200 mL del medio de cultivo que contiene la bacteria y lo dejamos durante 24 horas, protegido de la luz y aireado de forma continua con una bomba de acuario.3. Transcurrido ese tiempo, en la parte superior colocar el recipiente de alimentacin (un embudo de decantacin, por ejemplo) que contendr un vino no azufrado y agua destilada estril en la proporcin 1:4. El valor del pH se debe ajustar previamente a 7,0 con NaOH 1 M.4. Alimentar el vino controlando el caudal mediante una llave (aproximadamente, una gota por minuto), recogindose el producto en un matraz Erlenmeyer de 250 mL.

6. BACILLUES SUBTILIS:MATERIALES Y MTODOSGeneracin de un banco de clulas:Para obtener inculos bajo las mismas condiciones a lo largo de todo el estudio, y disminuir variaciones en los cultivos, segeneraron bancos de clulas con las cepas168, WB700, WB700CH1 y WB700CH2.Las cepas se crecen en medio slido con agar (15 g/l) utilizando los componentesindicados en la siguiente seccin (6.3). Las cajas se incuban a 37C hasta obtenercolonias de tamao mayor a 1mm de dimetro(aprox. 24 horas). De estas cajas setransfirieren de 3 a 5 colonias aisladas a un tubo de ensaye estril conteniendo 1 ml del medio respectivo, resuspendindo las mediante agitacin con la ayuda de un vortex.Esta suspensin se utiliza como semilla para el desarrollo de los preinculos. Con sta se inocularon 100 ml de medio de cultivo y se incuba hasta que se alcanz la fase de crecimiento exponencial, a aproximadamente 22 horas de cultivo, alcanzando una DO 600 nm. Muestras de 2 ml se almacenaron en crioviales con glicerol al 40% a70C. Las cepas, a excepcin de la WB ,700CH2, se crecieron en medio Luria ymineral 10 g/l de glucosa. La cepa WB700CH2 se creci con 10 g/l de xilosa.Medios de cultivo:En la evaluacin del metabolismo de azcares en condiciones aerbicas y anaerbicas se utiliza dos medios de cultivo: medio Luria Bertani (Wang, 1992) y medio mineral (Martnez et al., 1997), ambos suplementados con 10 g/l de azcar.En la evaluacin de crecimiento en mezclas de azcares se utiliz medio mineral con 5 g/l para cada uno de los azcares evaluados.Para la evaluacin de la tolerancia a etanol y furfural, los cultivos se llevaron acabo en condiciones anaerbicas utilizando medio LB suplementado con 10 g/l de glucosa. Las concentraciones de los inhibidores utilizadas se detallan en la seccin de resultados.

7. AMILASAS:Los medios utilizados fueron el Papas Dextrosa Agar (PDA), para el aislamiento primario y como medio formulado y seleccionado previamente para la fermentacin se utilizo el medio 09 con la siguiente composicin Medio 09ComponentesAlmidn,urea,ClNa,% utilizado en la solucin 0,5Todos los medios ensayados tienen como componente bsico ms importante el almidn, ya que el mismo puede ser degradado hasta azcares sencillas. Pero el caldo 09 fue el que mejor resultado manifestMicroorganismos empleados:Cepas salvajes de Aspergillus .8. PROTEASAS:El aislamiento y purificacin de las proteasas de las bacterias es lento cuando se usa un medio infusin cerebro-corazn (BHI). Nosotros hemos previamente identificado los antgenos inmunodominantes de N. brasiliensis usando un ensayo de western-blot. Previamente encontramos actividad proteolitica en el extracto celular crudo de N. brasiliensis HUJEG-1 (ATCC 700358) cultivada en medio BHI. No obstante el rendimiento enzimtico fue pobre y difcil para purificar porque est presente en las clulas bacterianas.OBJETIVO. Desarrollar un nuevo medio de cultivo para incrementar la produccin bacteriana y a bajo costo. Este nuevo medio de cultivo estimula el crecimiento bacteriano masivo y una produccin enzimtica alta. Esta proteasa estn constitutivamente producida por N. brasiliensis HUJEG-1 ATCC 700358 en medio BHI pero la actividad proteoltica fue encontrada en las clulas bacterianas y poco en el filtrado de cultivo.MATERIAL Y METODOS. En este trabajo comparamos el extracto crudo deslipidizado de N. brasiliensis cultivada en medio BHI y el medio nuevo ..RESULTADOS. Nuestro medio nuevo de cultivo (patente en trmite) incrementa 5 veces mas la produccin de masa bacteriana y 7 veces mas la produccin de proteasa. Otros microorganismos tambin crecen en este medioEl medio de cultivo a base de peptona fue hallado 5 veces mejor en cuanto a la induccin de la produccin de la proteasa.

9. CELULASAS

2.Aislamiento Primario.

Se tom un gramo por muestra y se realizaron diluciones seriadas hasta 10-12 en solucin salina y se sembraron mediante diseminacin con esptula de Drigalski en el medio de cultivo propuesto por Stutzenberger et al. (1970) y en el Agar Czapek-Dox (Difco) modificado cambiando la sacarosa por celulosa microcristalina (Merck) o carboximetilcelulosa (CMC, Sigma) al 1% y aadindole nistatin (Squibb) 50 mg/ml de medio. Los cultivos fueron incubados a 50 oC durante 7 das. Se comprob la pureza de las cepas aisladas mediante resiembras en Agar Czapek-Dox modificado y en Agar Czapek-Dox Extracto de Levadura Casaminocidos (CYC) segn Cross (1981)

10. BREVIBACTERIUM SP

11. CORINEBACTERIUM SP

12. GLATAMATO MONOSODICO

13. CELULASASMetodo de Inmovilizacin durante la preparacindel carrier entrampamiento Se prepar una solucin de agar -agar estril (Sigma R , Gum agar) en tres diferentes concentraciones: 2, 4 y 6%, se calienta hasta 45 y se aade 1mL de solucin de espora s de Aspergillus niger (10 6 /mL) diluidas en Tween 80 al 0.1% en solucin salina fisiolgica (SSF) a 45C; la mezcla de aspira con una micropipeta a la misma temperatura y se dejan caer Microgotas (20L) de la mezcla en un tubo de 30cm de longitud con aceite vegetal a 4C. Las esferas formadas se desengrasan con detergente y sesecan con aire estril a 30C.(3) Formulacin de medios de cultivo:se formularon 3 medios: A, B y C,utilizando como nica fuente de carbono el bagazo de caa seco con (4-6%humedad, 60 Mesh), suplementado con sulfato de amonio, sulfato de magnesioy bifosfato de potasio en diferentes concentraciones; se utiliz solucin salina fisiolgica (SSF) como diluyente final. Los medios fueron formulados por triplicado .

14. PULULANASAS

La pululanasa es activa a temperaturas que van desde por debajo de 45 C hasta por encima de 100 C, presentando su temperatura optima en el intervalo de 80 C-90 C, alrededor de 85 C.La pululanasa es activa desde un pH de aproximadamente 3,5 hasta un pH superior a 8, presentandoel pH optimo en el intervalo de pH 5-7, como se La pululanasa posee una actividad residual despues de 24 horas de incubaciona 70 C y pH 6,0, mayor que un valor relativo del 60%, preferiblemente mayor que un valor relativo del 80. La pululanasa posee una actividad residual despues de 1 hora de incubacion a 80 C y pH 6,0, mayor que un valor relativo del 40%, preferiblemente mayor que un valor relativo del 60%.

15. LIPASASAcondicionamiento de microorganismos productores de lipasas en medios de cultivo.dos medios lquidos preparados: Caldo nutritivo (CN) y Medio mineral con sacarosa . 16. ASPERGUILLUSMateriales y Mtodos Origen de las muestras La goma de Anacardium occidentale , conocida en Venezuela como caujil o merey, se colect en poca no lluviosa (Enero-Marzo, 2005) y fue suministrada por el Centro de Investigaciones en Qumica de los Productos Naturales, Facultad de Humanidades y Educacin. La cepa de Aspergillus niger ATCC 11414 , donada por el laboratorio de Tecnologa de Alimentos y Fermentaciones Industriales, Facultad de Ingenieria, La Universidad del Zulia, se conserv en el medio CzapeckDox Agar. Preparacin del medio de cultivo El exudado gomoso de A. occidentale , crudo y pulverizado, se disolvi en agua destilada (1% p/v) con agitacin constante. Se filtr por gasa y se le adicion peptona (1% p/v). Se tomaron alcuotas del medio (pH 6,2) y se ajustaron a determinados pH (4,5 y 6,8) por la adicin de soluciones de HCL (0,1M) y NaOH (0,1M). La presencia de cloruro de magnesio (0,05% p/v) se evalu . El medio slido se prepar por la adicin de agar (1,5% p/v) y se calent a ebullicin. El medio de referencia, Czapeck Dox Agar, preparado por la tcnica tradicional, est constituido por sacarosa (30g), nitrato de sodio (2g), bifosfato de potasio (1g), sulfato de magnesio (0,5g), cloruro de potasio (0,5g), sulfato ferroso (0,01g), agar (15g): Estos reactivos se disuelven en agua destilada (hasta completar 1000mL). La esterilizacin de los medios se realiz en autoclave (15 lb,15 min). Preparacin del inculo La cepa de A. niger ATCC 11414 se cultiv en el medio Czapeck en tubos de ensayo (28C, 5 das), se aadi agua destilada estril (10 mL) . El lquido se decant en una fiola estril (solucin stock). El contaje de las esporas, en una cmara de Neubauer, permiti la preparacin de la solucin del inculo (1x106). El avance del micelio se determin con un inculo, obtenido por un sacabocado, a partir del cultivo del hongo en placa de Petri. Caractersticas morfolgicas El hongo se inocul en placas de Petri en el medio de referencia y en el sustrato a ensayar (Anacardium occidentale- Agar), (AOA) a diferentes condiciones (pH 4,5; 6,2; 6,8, presencia o ausencia de cloruro de magnesio). Las placas se guardaron en estufa (28C, 5 das) para la observacin macroscpica. La morfologa microscpica se determin mediante la tcnica de cultivo en lmina (28C, 3 das). Lactofenol se utiliz como lquido de montaje. Avance del micelio Se usaron las mismas condiciones experimentales descritas para la determinacin de las caractersticas morfolgicas . El inicio del crecimiento del hongo se tom como criterio para determinar el avance del micelio sobre los cuatro radios y posteriormente, se midi el crecimiento a determinados tiempo (3,5 ,7 das). El clculo del rea del micelio se hizo mediante la tcnica tradicional (12).

17. PECTINASAS

a) Medios de cultivo complejos: Cultivo en slido: Constituido por Agar Trypticasa Soya y Agar Trypticasa Soya, suplementado con 1 % de pectina ctrica.Cultivo en lquido: Constituido por Caldo Trypticasa Soya y Caldo Trypticasa Soya suplementado con 1% de pectina ctrica. b) Medio de cultivo experimental:Constituido por sales minerales y cscara de naranja como nica fuente de carbono, variando sus concentraciones

18. AC CITRICO

19. LACTICOMicroorganismo utilizado Para los ensayos de cultivo batch y continuo se utiliz la cepa Lactobacillus plantarum L10, adquirida del Instituto de Tecnologa de Leche y Grasa de la Facultad de Tecnologa de Alimentos de la Universidad Tecnologa Qumica de Praga, Repblica Checa. Conservacin de la cepa La cepa Lactobacillus plantarum L10 se conserv a una temperatura de _80 C en una cmara de congelacin profunda. El medio de conservacin estuvo compuesto de 2/3 partes de suspensin de bacterias lcticas en medio MRS y de 1/3 parte de glicerol como crioprotector. Las clulas en suspensin se colectaron en la fase exponencial de su crecimiento. Composicin del medio de cultivo Los medios de cultivo para los ensayos de cultivo batch y continuo estuvieron compuestos de glucosa como fuente de carbono, extracto de levadura como fuente compleja de nitrgeno y sales. El pH de los medios se ajust a 5,8. Los medios con ms de 40 g/L de glucosa se esterilizaron por separado tanto la fuente de carbono como la fuente de aminocidos (extracto de levadura), a fin de proteger de la posible reaccin de Maillard. Para los ensayos de cultivo batch se utiliz medios de cultivo con diferentes concentraciones de nutrientes, en algunos de ellos se adicion menos cantidad de sales de manganeso. Uno de los objetivos de la investigacin ha sido optimizar la composicin del medio de cultivo para facilitar el proceso de aislamiento y purificacin del producto final, esto implic disminuir el contenido de sales en la composicin de los medios de cultivo y por otra parte se busc minimizar el contenido de glucosa residual en el producto final. En el medio V por esta razn se disminuy el contenido de KH2PO4 para agregar (NH4)2HPO4 (compuesto menos cido) y a la vez eliminar la adicin de acetato de sodio. As mismo, para los ensayos de cultivo continuo en quimiostato se utiliz un medio de cultivo con menos concentracin en sales para facilitar el aislamiento y purificacin del producto final .Mtodos de cultivo Preparacin del inculo La propagacin de las bacterias lcticas se llev a cabo en cultivo esttico a 37 C durante 10_12 horas, luego de ello se inocul en el biorreactor. El inculo se prepar en dos vasos Erlenmeyer de 250 mL conteniendo en cada uno 100 mL de medio de cultivo MRS (52,2 g/L tal como es recomendado por el proveedor). El biorreactor conteniendo dos litros de medio de cultivo se inocul aspticamente con 200 mL de inculo. Cultivo batch Se llevaron a cabo siete ensayos de cultivo batch en biorreactor con un volumen de trabajo de 2200 mL (2000 mL de medio de cultivo y 200 mL de inculo). Los ensayos BI, BII y BIII se llevaron a cabo sin aireacin, utilizando los medios de cultivo I, II y IV respectivamente). Los ensayos BIV, BV y BVI se airearon durante dos horas (flujo de aire 50 L/h) y se cultivaron en los medios II, III y IV. En el caso del cultivo BVII, se burbuje con nitrgeno gaseoso (flujo 25 L/h) durante ocho horas y se utiliz el medio de cultivo II. En todos los cultivos se determinaron los coeficientes de rendimiento de biomasa (YX/S) y cido lctico (YP/S) por sustrato consumido; as como tambin la productividad volumtrica de biomasa (PX) y cido lctico (PP) en la fase exponencial del crecimiento. Adems se determin la conversin de sustrato (C%) y la velocidad de crecimiento especfico (n). Todos los cultivos se llevaron a cabo a 37 C, pH 5,8; y a velocidad de agitacin de 500 rpm.

20. MALICOMedios de cultivo para AzospirillumAnexo A. Medio de cultivo para obtencin de Biomasa Medio de Referencia Dygs (Rodrgues Neto et al., 1986),Componentes Cantidad (g/L)K2HPO4 * 3H2O : 0,5 g/LMgSO4*7H20 : 0,5 g/LGlucosa : 2g/LPeptona Universal : 1,5 g/LExtracto de levadura : 2g/Lcido glutmico : 1,5 g/Lcido mlico : 2g/LpH final ajustado para 6,8.Medios de cultivo para identificacinMedio Batata (Azospirillum sp.)Componentes Cantidad (g/L)Papa : 200 g/Lcido mlico : 2,5 g/LSacarosa : 2,5 g/LSol. Micronutrientes : 2 mLSol. Vitaminas: 1 mLPesar 200 g de papa, pelar, lavar y hervir durante 30 minutos. En seguida, filtrar en gasa yalgodn. Mezclar las cantidades de cido mlico y sacarosa disolviendo en agua 83 destilada,hasta 50 mL y ajustar el pH a 6,5-7,0 con KOH. Adicionar el filtrado de esa solucin y lassoluciones de micronutrientes y vitaminas. Completar el volumen para 1000 mL con aguadestilada.Agar Rojo Congo (Rodrguez-Cceres, 1982)Componentes Cantidad (g/L)K2HPO4 0.5 g/LMgSO4.7H2 0, 0.2 g/LNaCl 0.1 g/LExtracto de levadura 0.5 g/LFeCl3.6H20 0,015 g/Lcido mlico 5,00 g/LKOH 4.8 g/LAgar 20 g/LEl pH se ajusta a 7.0 con 0,1 N KOH, y el medio se autoclava. Luego se adicionan 15 mL de una solucin acuosa 1:400 de Rojo Congo (autoclavado separadamente)21. COLORANTES

22. AROMATIZANTES

23. VITAMINASMEDIO DE CULTIVO -medio MS sin reguladores- MS K :MS con 0.3 mg/L de cido indol-actico y 1 mg/L de kinetina- MS.-R:MS con 1 mg/L de AIBPara preparar 1L de estos medios se realiza el siguiente proceso: Colocar en un agitador magntico una jarra de 1 L de capacidad con unos 400 ml de agua destilada y aadir los elementos minerales y las vitaminas: -100 ml del stock de macronutrientes.-100 ml del stock de Ca, -1 ml del stock de micronutrientes,-10 ml de la solucin hierro EDTA ( 0.2g/L de secuestrene)-10 ml del stock de vitaminas.-Adicionar la cantidad estimada de las soluciones de fitohormonas.-30 g sacarosa y esperar a que se disuelva.-Aadir agua destilada hasta un volumen de 1L-Colocar la mezcla en una jarra y ajustar, en un pHmetro, el pH del medio (con KOH, NaOH HCl) hasta 5.8.-Aadir 7,5 g de agar y disolverlo en el autoclave o en Microondas.-Agitar el medio, dosificarlo en los recipientes de cultivo y colocar las tapas.-Esterilizar el medio en el autoclave durante 20 min a 120oC y 1Kg/cm2 de presin.- Dejar enfriar el medio antes de su utilizacin.Si algn MS

Si algn componente fuera termolbil habra que esterilizarlo por filtracincon una jeringuilla y un filtro de un tamao de poro menor de 0.22m.Este proceso habra que realizarlo en una cmara de flujo laminar y emplear material estril.24. STATERS

25. BIFIANSP

2.- Actividad enzimtica para enzimas- Actividades enzimaticas de los enzimas (Sustratos espeficicos y como se expresan en unidades de actividad enzimatica.)A. PEROXIDASASB. CATALASAC. REDUCTASASD. FOSFATASAE. POLIFENOLOXIDASAF. PROTEASAG. CARBOXIPEPTIDASA,H. AMINO PEPTIDASAI. PAPAINAJ. BROMELINAK. FICINAL. AMILASAM. CELULASAN. ALFA AMILASAO. LACTASAP. GLUCOSA OXIDASAQ. LIPASAR. LIPOXIDASAS. UREASAT. INVERTASA

3.- Clasificacin sistemtica de las enzimas (es con cdigos)

http://www.ibt.unam.mx/alfredo/ClaudiaIbethHernandez.pdf