Enzimas de Restriccion
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ENZIMAS DE RESTRICCINENZIMAS DE RESTRICCIN
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Vector de clonacin digerido con EcoRI y
PvuII
ADNLigasa
Extremos cohesivos Extremos romos
Sitio de corte
ADN cromosmico
Sitio de corteSecuencias de reconocimiento
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Tipos de enzimas de restriccin
Tipo IIs: Reconocen secuencias no palindrmicas, 4-7 pb. Sitio de corte en la secuencia y hasta 20 pb de distancia
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Restriccin-modificacin
mG-A-A-T-T-CC-T-T-A-A-G
mEcoRIEcoRI
mG-A-A-T-T-CC-T-T-A-A-Gm
mG-A-A-T-T-CC-T-T-A-A-Gm
EcoRIEcoRI
G-A-A-T-T-CC-T-T-A-A-GEcoRIEcoRI
G-A-A-T-T-CC-T-T-A-A-G
G A-A-T-T-CC-T-T-A-A G
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Plantas: metilacin m5CG y m5CNG.
Uso de endonucleasas con diferente sensibilidad a metilacin:McClelland M. 1983. The frequency and distribution of methylatable DNA sequences in leguminous plant protein coding genes. J. Mol. Biol. 19: 346-354
Vertebrados: metilacin de la C en secuencias CG en el C5, generando 5-metilcitosina: m5CG. Secuencias (islas) CpG, implicadas en regulacin de la transcripcin.HpaII, MspI: isosquizmeros, reconocen C/CGG
La metilacin del ADN en eucariotas superiores est relacionada con la regulacin de la transcripcin. El uso de algunas enzimas de restriccin especficas permite distinguir entre ADN metilado y no metilado, obtenindose de esta manera informacin sobre la posible regulacin de la expresin de un gen por metilacin del ADN
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Metilacin del ADN y digestin con enzimas de restriccin
Sistema dam: metila la A de la secuencia GATC en el N6, generando 6-metiladenina: Gm6ATC.PvuI, BamHI, BclI, BglII, XhoII, MboI y Sau3AI (/GATC)ClaI: AT/CG*ATXbaI: T/CTAG*A
Sistema dcm: metila la C interna de la secuencia CC(A/T)GG en el C5, generando 5-metilcitosina: Cm5CWGGEcoRII: /CCWGG, BstNI: CC/WGGStuI: AGG/C*CT
DpnI: Es una enzima de restriccin que corta en la secuencia GATC slo si est metilada por dam (Gm6ATC). Utilizada en algunos protocolos de PCR para eliminar ADN plasmdico proveniente de la bacteria sin afectar al sintetizado in vitro.
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ENZIMAS DE RESTRICCIN
Reconocen secuencias concretas
Simetra (palndromes)
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Ejemplos de palndromes
Dabale arroz a la zorra el abad La ruta natural A man, a plan, a canal: Panama
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Enzimas de restriccin
Reconocen secuencias concretas Simetra (palndromes) Nmero de nucletidos en la secuencia
44
N1N2N3N4N5N6N1N2N3N4 N1N2N3N4N5N6N7N8
46 48
256 4096 65536
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Sitios de corte de las endonucleasas de restriccin del tipo II
Tipo IIs: MboII
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Extremos protuberantes
GAATTCCTTAAG
G-3CTTAA-5
5-AATTC3-G
EcoRI
5 protuberantes
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Extremos protuberantes
CTGCAGGACGTC
CTGCA-3G-5
5-G3-GACGTC
PstI
3 protuberantes
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Extremos romos
CCCGGGGGGCCC
CCC-3GGG-5
5-GGG3-CCC
SmaI
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Extremos compatibles (I)
GAATTCCTTAAG
GAATTCCTTAAG
EcoRI
GAATTCCTTAAG
EcoRI
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Extremos compatibles (II)
GTCGAGCAGCTC
GTCGACCAGCTG
SalI
CTCGAGGAGCTC
XhoI
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Extremos romos (siempre compatibles)
CCCATCGGGTAG
CCCGGGGGGCCC
SmaI
GATATCCTATAG
EcoRV
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Extremos no compatibles rellenados, transformados en romos (siempre compatibles)
GAATTCCTTAAG
EcoRI
CTCGAGGAGCTC
XhoI
G-3CTTAA-5AA T-3T
5-TCGAG3-CTCG3-A
GAATTCTTAA
TCGAGAGCTC
Degradado de cadena sencilla
+ dNTPs
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Rellenado parcial
Extremos no compatibles transformados en compatibles
AAGCTTTTCGAA
HindIII
TCTAGAAGATCT
XbaI
A-3TTCGA-5AG-3
5-CTAGA3-CC3-T
AAGTTCGA
CTAGATCC+ dATP, + dGTP
+ dCTP, + dTTP
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Precauciones
Actividad star
Metilacin
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Aspectos prcticos
Unidad: Cantidad de enzima que digiere 1 g de ADN en 1 hora a la temperatura y condiciones ptimas.
Inhibicin: Adicin de 20 mM EDTA.
Inactivacin: Por calor o tratamiento con fenol-CIA
Dos enzimas de restriccin pueden utilizarse simultneamente siempre que compartan las mismas condiciones de digestin (temperatura, pH, concentracin de sales)