Enzimas Proteina Enzima Biotecnologia Sustratos Sólidos Consideraciones practicas Manual Produccion...

CNPEM: LNLS CTBE LNBio LNNano 1

Seleccin de cepas de Bacillus sp. potenciales para la produccin de hidrolasas.

Becario Rubn Montoya Lpez

Estudiante de Ingeniera Bioqumica de la Universidad Autnoma de Aguascalientes, Mxico.

Orientador Dr. Sindlia Freitas Azzoni / CTBE

Campinas, SP.

2012


AGRADECIMIENTOS

Debo comenzar agradeciendo infinitamente la gran oportunidad que me fue otorgada

para participar en el 21 Programa de Becas de Verano del CNPEM, esta ha sido una de

las mejores experiencias de mi vida.

Al apoyo y comprensin recibido por el Comit Gestor del 21 Programa Becas de

Verano del CNPEM especialmente a Tatiane Madruga y Roberto Medeiros por su gran e

incondicional ayuda y atenciones.

A mi asesor, la Dr. Sindlia Freitas por darme la oportunidad de trabajar en su

laboratorio, compartir sus conocimientos y por su asesora para la realizacin del

proyecto. Fue un gran honor para m el haber estado en su equipo de trabajo.

A Aline Tavares, por trabajar a la par conmigo en este proyecto, tambin a Aline Moreira

por todo su apoyo y asesora durante el trabajo en laboratorio y para Mateus Silva, de

quien agradezco de sus consejos.

A todo el personal del CTBE, a los investigadores por sus consejos y especialmente al

personal de apoyo a Vania y Rebeca cuya ayuda fue de gran importancia para el

desarrollo del proyecto.

A todos mis compaeros y grandes amigos becarios del programa por compartir grandes

momentos y experiencias juntos, por su compaa y apoyo durante esta gran vivencia.

A mis padres Rubn y Lourdes por todo lo que me han enseado, por estar conmigo

incondicionalmente siempre que los necesito, a ellos les debo lo que soy.


NDICE

ndice........................................................................... 3

ndice de Figuras...................................................................................... 4

ndice de Tablas...................... 5

1.0 Resumen.............. 6

2.0 Introduccin........ 7

2.1 Definicin de las hidrolasas...... 7

2.2 Hidrlisis de la celulosa........ 7

2.3 Microorganismos potenciales para la produccin de celulasas..... 8

2.4 Ventajas de las celulasas bacterianas en comparacin a las de origen fngico........ 9

2.5 Aplicaciones industriales de las celulasas.................................. 10

2.6 Materiales lignocelulsicos como fuentes renovables de carbono.... 10

2.7 Bioetanol de segunda generacin... 12

3.0 Objetivos... 14

3.1 Objetivo general............ 14

3.2 Objetivos especficos. 14

4.0 Materiales y Mtodos.... 15

4.1 Cepas de Bacillus sp. ..... 15

4.2 Screening cualitativo de produccin de celulasas...... 15

4.3 Fermentacin sumergida .... 16

4.3.1 Mantenimiento de las cepas de Bacillus sp. ... 16

4.3.2 Medios de cultivo ... 16

4.3.3 Preparacin de inculo.. 17

4.3.4 Condiciones estndar de fermentacin... 17

4.3.5 Preparacin del extracto enzimtico.... 17

4.4 Mtodos analticos.... 17

4.4.1 Seguimiento de la cintica de crecimiento durante las fermentaciones 17

4.4.2 Actividad enzimtica sobre Papel filtro (FPasa)..... 18

4.4.3 Actividad enzimtica sobre Carboximetilcelulosa (CMCasa) ...... 19

4.4.4 Actividad enzimtica sobre Xilana (Xilanasa)..... 19

4.4.5 Determinacin de azucares reductores por el mtodo de DNS... 19

4.4.6 Determinacin del contenido de protena por el mtodo de Bradford. 20

4.4.6 Actividad enzimtica proteoltica....... 20

4.5 Screening cuantitativo de produccin de celulasas..... 21

4.5.1 Seguimiento de la cintica de crecimiento durante las fermentaciones... 21

4.6 Variacin de las condiciones de fermentacin para la produccin de celulasas y

hemicelulasas........ 21

4.6.1 Efecto de la agitacin..... 21

4.6.2 Efecto de la presencia Cu+2 en el medio.... 22

4.6.3 Efecto de la fuente de carbono. 22

4.6.4 Efecto de la fuente de nitrgeno..... 22

4.7 Optimizacin de las condiciones de reaccin para la medicin de actividad de las

celulasas y hemicelulasas de Bacillus sp. BH19 y BH62.. 23


NDICE DE FIGURAS.

Figura 2.2.1 Mecanismo de la hidrlisis de la celulosa 8

Figura 2.6.1 Estructura de la lignocelulosa 11

Figura 2.6.2 Residuos agroindustriales en Brasil 12

Figura 2.7.1 Transformacin de la biomasa lignocelulsica en biocombustibles 13

Figura 5.1.1 Anlisis cualitativo de la produccin de celulasas, tincin de Rojo Congo.. 24

Figura 5.1.2 Cintica de crecimiento de las cepas de Bacillus sp. en medio mineral CMC 1%........................................................................................................ 26

Figura 5.1.3 Electroforesis del ADN genmico de muestras con O. D. ... 27

Figura 5.2.2.1 Efecto de Cu+2 sobre el crecimiento en las cepas de Bacillus sp 29

Figura 5.2.4.1 Efecto de la fuente de nitrgeno sobre el crecimiento de BH19 y BH62 32

Figura 5.3.1 Comparacin del efecto de temperatura y pH sobre la actividad de

CMCasa en Bacillus sp. BH19 34

Figura 5.3.2 Efecto de la temperatura sobre la actividad de CMCasa de una muestra de Bacillus sp. BH19 a pH ptimo 6.0. 34

Figura 5.3.3 Efecto de la temperatura sobre la actividad de CMCasa en una muestra de Bacillus sp. BH62 a un pH ptimo 6.0 35

Figura 5.3.4 Efecto de temperatura sobre la actividad de Xilanasa en Bacillus sp. BH19 a pH ptimo 6.0.. 35

Figura 5.3.5 Efecto de la temperatura sobre la actividad de Xilanasa en Bacillus sp.

BH62 a pH ptimo 7.0.... 36

5.0 Resultados y Discusiones...... 24

5.1 Screening cualitativo y cuantitativo de produccin de celulasas.. 24

5.2 Variacin de las condiciones de fermentacin para la produccin de celulasas y

hemicelulasas....... 27

5.2.1 Efecto de la agitacin..... 27

5.2.2 Efecto de la presencia Cu+2 en el medio...... 29

5.2.3 Efecto de la fuente de carbono..... 30

5.2.4 Efecto de la fuente de nitrgeno...... 31

5.3 Optimizacin de las condiciones de reaccin para la medicin de actividad de las

celulasas y hemicelulasas de Bacillus sp. BH19 y BH62... 33

6.0 Conclusiones ..... 37

7.0 Referencias Bibliogrficas... 38


NDICE DE TABLAS.

Tabla 2.3.1 Genes de inters industrial en Bacillus sp ............................................ 9

Tabla 2.6.1 Algunos de los desechos lignocelulsicos producidos por distintas industrias y con potencial aplicacin para biotransformacin 12

Tabla 4.1.1 Cepas de Bacillus sp preseleccionadas.. 15

Tabla 5.1.1 Comparacin cuantitativa de las cepas de Bacillus sp. mediante su capacidad para desarrollarse en fermentacin sumergida 25

Tabla 5.1.2 Relacin entre O. D. y el ADN total extrado durante el desarrollo de

Bacillus sp. BH19 en medio LB.. 27

Tabla 5.2.1.1 Velocidades especficas de crecimiento (h-1) de las cepas de Bacillus

sp. registradas en la fermentacin de medio mineral con CMC 1% con

distintas velocidades de agitacin.. 28

Tabla 5.2.3.1 Efecto de la fuente de carbono sobre la produccin de celulasas y

hemicelulasas medido mediante la actividad de CMCasa y Xilanasa

respectivamente.... 30

Tabla 5.2.3.2 Actividad proteoltica registrada en las muestras de 24 horas de fermentacin en las cepas BH19, BH51 y BH62 en todos las fuentes de carbono probadas.. 31

Tabla 5.2.4.1 Efecto de la fuente de nitrgeno sobre la actividad Xilanasa (U/ml)

registrada en las cepas BH19 y BH62 .................................... 32

Tabla 5.3.1 Comparacin entre la actividad enzimtica determinada bajo condiciones ptimas respectivas y condiciones estndar (pH 4.8, 50C). 36


1.0 RESUMEN.

Las celulasas y hemicelulasas son las enzimas hidrolticas responsables de la

degradacin de la lignocelulosa, la fuente de carbono renovable ms abundante en la

naturaleza. La aplicacin de este material para la produccin de combustibles lquidos

ha motivado intensos estudios en la bsqueda de nuevos microorganismos productores

de enzimas y el desarrollo de procesos de produccin basados en stos

microorganismos. El gnero Bacillus es reconocido industrialmente atractivo por sus

altas tasas de crecimiento, gran capacidad para la secrecin de enzimas extracelulares,

as como su desarrollo bajo condiciones ambientales extremas, anlisis del genoma de

sus especies han descrito su potencial para la produccin de las enzimas hidrolticas.

En este contexto fueron estudiadas cinco cepas de Bacillus sp. a partir de un una previa

seleccin de 25 cepas potenciales de un banco de 107 cepas aisladas de jugos despus

del proceso de pasteurizacin. En general las cinco cepas presentaron una baja

actividad, sin embargo Bacillus sp. BH19 y BH62 fueron seleccionadas con el mayor

potencial para la produccin de hidrolasas al desarrollarse adecuadamente en medio

mineral con carboximetilcelulosa como fuente nica de carbono tanto en placa con

medio slido y en fermentacin sumergida. Fueron investigados los efectos que tienen

algunos factores nutricionales y ambientales de los cuales se encontr que el salvado de

trigo y de soya como fuente de carbono inducen una mayor produccin de celulasas y

hemicelulasas, as mismo las fuentes de nitrgeno orgnicas junto con

carboximetilcelulosa como fuente de carbono promueven un mayor desarrollo y

produccin de estas enzimas. En un rango de agitacin de 0 a 150 rpm no se present

una diferencia significativa en el desarrollo y produccin de hidrolasas. Dadas las bajas

actividades que se registraron fue realizada una optimizacin en las condiciones de

reaccin para la medicin de actividad de celulasas y hemicelulasas, encontrndose que

las mencionadas por los protocolos estndar no son las mejores para las muestras de

las cepas aqu estudiadas, lo cual pudo haber interferido en la subestimacin de las

actividades enzimticas.


2.0 INTRODUCCIN

2.1 Definicin de las hidrolasas.

Las hidrolasas constituyen un grupo de enzimas cuya accin consiste transferir el

grupo escindido del sustrato al hidroxilo del agua. En este grupo se incluyen las

esterasas, tiolesterasas, fosfatasas, pirofosfatasas, peptidasas y las glicosidasas (Pea

A., 1988). Las glicosidasas catalizan la hidrlisis del enlace glucosdico de los

polisacridos liberando carbohidratos simples. Actualmente las glicosidasas de mayor

inters biotecnolgico son las -1,4-glucanasas (Celulasas) y las -xilosidasas

(hemicelulasas) que catalizan la degradacin de los polmeros naturales renovables ms

abundantes de la naturaleza, celulosa y hemicelulosa (Palls V., 2008).

2.2 Hidrlisis de la celulosa.

La accin enzimtica para llevar a cabo la hidrlisis de la celulosa implica la

operacin secuencial y la accin sinergsta de un grupo de celulasas que presentan

diferentes sitios de enlace, debido a la naturaleza compleja de la celulosa (Figura 2.2.1).

El sistema de celulasa tpico incluye tres tipos de enzimas: la endo--1,4-glucanasa (E.

C. 3.2.1.4) la exo--1,4-glucanasa (E.C. 3.2.1.91) y la -1,4-glucosidasa (E.C. 3.2.1.21)

(Lee J., 1997).

El mecanismo propuesto para la degradacin de la celulosa se resume en tres

etapas: Primero la endo--1,4-glucanasa acta al azar sobre los enlaces -1,4-

glucosidicos internos presentes entre las unidades de glucosa que forman la molcula

de la celulosa y convierte las cadenas largas a oligosacridos los cuales mantienen la

configuracin de su estructura. La accin de esta enzima es sobre las regiones

amorfas de la molcula de celulosa o sobre la superficie de las microfobrillas, y tiene

como resultado la disminucin de la longitud de la cadena de celulosa y la creacin de

nuevos extremos reactivos que sirven de sustrato en la Segunda etapa para la posterior

accin de la exo--1,4-glucanasa que corta la cadena -1,4-glucano a partir del extremo

no reductor de la molcula de celulosa y de las celodextrinas, lo que provoca la

remocin de unidades de celobiosa o glucosa (Ryu D. y Mandels M., 1980).

Una vez degradada las zonas amorfas de la celulosa, tiene lugar la Tercera etapa

de la hidrlisis, en donde la regin cristalina comienza a ser hidrolizada, como resultado


de la accin sinergsta de las endo y exo glucanasas. Finalmente las molculas de

celobiosa son hidrolizadas por la -glicosidasa a glucosa.

2.3 Microorganismos potenciales para la produccin de celulasas.

Las celulasas son producidas por una variedad de bacterias y hongos aerbicos o

anaerbicos, mesfilos o termfilos. Sin embargo solo algunos de ellos producen

celulasas extracelulares capaces de hidrolizar la celulosa. A partir de los hongos

aerbicos, tales como: Trichoderma reesei, Penicillium pinophilum, Fusarium solani y

Taloromyces emersonii de los cuales se han obtenido los complejos celulolticos que

presentan un sistema enzimtico completo de celulasas (Erikson K. y Wood T., 1985).

Otros microorganismos productores de celulasas incluyen a las bacterias

aerbicas mesoflicas y termoflicas (Cellulomonas sp., Cellvibrio sp y Thermomonospera

sp.), y las bacterias anaerbicas mesoflicas y termoflicas (Acetivibrio cellulolyticus,

Ruminococcus albus y Clostridium thermocellum) (Beguin P. y Aubert J., 1993).

Bacterias del genero Bacillus aerobias y termoflicas producen enzimas celulolticas con

actividad bsicamente endo--1,4-glucanasa y exo--1,4-glucanasa; pero tienen la

caracterstica particular de presentar resistencia a ser inhibidas por la glucosa o

celobiosa que es liberada al medio luego de la hidrlisis (Erikson K. y Wood T., 1985).

En el caso especfico del genero Bacillus sus especies son atractivas

industrialmente por varias razones incluyendo sus altas tasas de crecimiento que

permiten tiempos de fermentacin cortos, su gran capacidad de secrecin extracelular

Figura 2.2.1. Mecanismo de la hidrlisis de la celulosa, accin sinrgica de las celulasas (Karmakar M., 2011).


de enzimas, esta capacidad secretoria presenta un potencial para la produccin

heterologa de protenas, adems estas bacterias son consideradas GRAS (generaly

regarded as safe) por la FDA (Schallmey M. et al 2004). Algunos de los potenciales

genes de inters industrial responsables de la degradacin de polisacridos se muestran

en la Tabla 2.3.1.

Gen Posicin en el cromosoma. Enzima

abfA 2939 -L-arabinofuranosidasa bglC 1940 endo-1,4--glucanasa bglH 4023 -glucosidasa bglS 4011 endo-1,3- y -1,4--glucanasa yhlE 1095 Glucanasa yjeA 1281 endo-1,4--xilanasa ynfF 1943 endo-xilanasa

Actualmente el mercado mundial de las enzimas se estima en 1.6 millones de

dlares, se ha determinado que las enzimas de Bacillus sp. representan cerca del 50%

de este mercado. La mayor produccin de estas enzimas (37%) pertenece a serin-

proteasas alcalinas, el segundo grupo ms importante son las amilasas con un 13% del

mercado seguida por otras enzimas pectatoliasas y las -glucanasas (Schallmey M. et al

2004).

2.4 Ventajas de las celulasas bacterianas en comparacin a las de origen fngico.

Tanto hongos como bacterias han sido fuertemente explotados por sus

habilidades para producir una amplia variedad de celulasas y hemicelulasas. Sin

embargo se ha tenido mayor nfasis en el uso de hongos debido a su capacidad para

producir importantes cantidades de celulasas y hemicelulasas que son secretadas al

medio siendo sencilla su extraccin y purificacin. No obstante el aislamiento y

caracterizacin de nuevas glicosidasas en eubacterias est siendo ampliamente

estudiado. Estos organismos presentan una serie de ventajas, la primera, es que tienen

tasas de crecimiento mayores que los hongos permitiendo una mayor produccin de

enzimas. En segunda, las glicosidasas bacterianas son ms complejas y son

expresadas en complejos multienzimticos aumentando su actividad y sinergismo. Los

factores favorables ms importantes son la baja demanda de nutrientes para su

crecimiento y la capacidad de desarrollarse en una amplia variedad de ambientes,

Tabla 2.3.1. Genes de inters industrial en Bacillus sp. Adaptada de Schallmey M. et al (2004).


teniendo cepas celulolticas altamente resistentes a factores de estrs ambientales,

entre las cuales se encuentran cepas termoflicas o psicroflicas, alcalfilas o acidfilas y

cepas que son halfilas. Estas bacterias no solo pueden sobrevivir en estos ambientes,

sino que producen enzimas que son estables bajo condiciones extremas que podran

mantenerse en procesos de bioconversin incrementando las tazas de actividad

enzimtica, fermentacin y recuperacin de producto (Maki M. et al, 2009).

2.5 Aplicaciones industriales de las celulasas.

Las celulasas tienen un amplio rango de aplicaciones potenciales en

biotecnologa y muchas endoglucanasas termoestables tienen un gran potencial para

usos industriales. En la mayora de los casos son usadas junto con hemicelulasas,

pectinasas, ligninasas y otras enzimas relacionadas (Karmakar M., 2011).

Especficamente tienen importantes aplicaciones en la agricultura, en la industria

papelera, en textiles especialmente en la mejora de la calidad de telas as como en

detergentes que proporcionan mejor limpieza sin degradar las fibras; en la industria de

alimentos mejorando texturas, sabores y aromas; en la mejora de las fermentaciones de

cervezas, vinos y otras bebidas alcohlicas; pero principalmente en la industria de la

bioconversin de materiales celulsicos en alimentos para ganado altos en energa con

mejores tasas de digestin y absorcin de nutrientes, en la produccin de protena

unicelular, lpidos, cidos orgnicos, etanol solventes y otros productos qumicos con un

alto valor agregado como biocombustibles (Chander R. K. et al. 2011).

2.6 Materiales lignocelulsicos como fuentes renovables de carbono.

La biomasa lignocelulsica es producida mediante fotosntesis la cual convierte la

energa solar en energa qumica, almacenndola en carbohidratos mediante la fijacin

del carbono atmosfrico, por lo cual la lignocelulosa es considerada el recurso natural

renovable ms abundante en el planeta, con cerca de 200 billones de toneladas

producidas anualmente (Zhang Y., 2008).

La lignocelulosa proporciona la estructura de las plantas encontrndose en las

races, tallos y hojas; como se muestra en la Figura 2.6.1 est formada de tres

componentes principales: celulosa (38-50%), lignina (15-30%) y hemicelulosa (23-32%),

esta proporcin vara entre especies (Sierra R. et al, 2008). La celulosa es un polmero

de D-glucosa unida por enlaces glucosdicos -1,4 que se estructuran en largas cadenas

lineales (microfobrillas) unidas por puentes de hidrgeno y fuerzas de van der Waals


intramoleculares, formando una estructura cristalina resistente a la hidrlisis y regiones

amorfas suceptibles a la degradacin enzimtica (Ovando C. & Waliszewski N., 2005), la

lignina es un polmero de unidades de fenil propano unidas mediante enlaces ter la cual

acta como pegamento en las fibras de celulosa, adems acta como barrera

impidiendo la degradacin enzimtica. La hemicelulosa es un polmero complejo de

heteropolisacridos formado por pentosas (D-xilosa y L-arabinosa) y hexosas (D-

glucosa, D-manosa y D-galactosa) que forman cadenas ramificadas y los cidos 4-O-

metilglucurnico, D-galacturnico y D-glucornico, los azucares estn unidos por

enlaces -1,4 y ocasionalmente por enlaces -1,3 (Perez, et al, 2002).

Actualmente se analiza la posibilidad de crear cultivos con el objetivo de sustituir y

mejorar a la sacarosa de la caa de azcar y almidn de semillas de maz como fuente

renovable de carbono mediante una produccin sustentable de biomasa

ligninocelulsica, sin embargo otras fuentes importantes de carbono renovable estn

disponibles en los desechos lignocelulsicos los cuales son producidos en grandes

cantidades por distintas industrias incluyendo la forestal, la de pulpa y papel, agricultura,

alimentos y algunos desechos comunes de basurero (Tabla 2.6.1). Estos materiales

potencialmente valiosos fueron considerados como basura en muchos pases en el

pasado, e inclusive hoy en da lo siguen siendo en algunos pases en vas de desarrollo

provocando problemas ambientales. Muchos esfuerzos han intentado convertir estos

Figura 2.6.1 Estructura de la lignocelulosa, La celulosa, la hemicelulosa y la lignina forman estructuras llamadas microfibrillas, organizadas en macrofibras que regulan la estabilidad de la pared celular de las plantas (Adaptacin de Rubin E., 2008).


residuos lignocelulsicos en productos valiosos como biocombustibles, productos

qumicos y alimento para animales con alto valor nutricional (Dashtban M. et al, 2009).

En Brasil son producidas aproximadamente 350 millones de toneladas de

residuos agroindustriales y agrcolas siendo producidos principalmente de la caa de

azcar y la soya, (Figura 2.6.3), seguidos luego por residuos de maz (Pereira N. et al,

2008).

2.7 Bioetanol de segunda generacin.

En la actualidad Estados Unidos y Brasil son los lderes en la produccin de

combustibles basados en almidn y sacarosa a partir de cultivos de maz y de caa de

azcar respectivamente, stos son conocidos como biocombustibles de primera

generacin cuya produccin utiliza tecnologa convencional de fermentacin, no

obstante estas fuentes de carbono renovables no sern suficientes para satisfacer la

Desechos lignocelulsicos Produccin mundial anual

Desechos agrcolas

mundiales

Millones de toneladas por

ao

Paja de maz 203.62

Paja de cebada 58.45

Paja de avena 10.62

Paja de arroz 731.34

Paja de trigo 354.35

Paja de sorgo 10.32

Bagazo 180.73

Tabla 2.6.1 Algunos de los desechos lignocelulsicos producidos por distintas industrias y con potencial aplicacin para biotransformacin (Dashtban M. et al, 2009).

Figura 2.6.2 Residuos agroindustriales de los principales cultivos nacionales de Brasil (Pereira N. et al, 2008).


creciente demanda (Greene N. 2004) as mismo son considerados como recursos

controversiales para la bioconversin al contraponerse al abastecimiento alimenticio. La

biomasa lignocelulsica es el recurso natural con un gran potencial para la produccin

de biocombustibles dada su gran abundancia, disponibilidad y bajo valor econmico, sin

embargo los altos costos de las tecnologas requeridas son una de las mayores

limitaciones para la produccin y comercializacin de biocombustibles de segunda

generacin (Zhang Z., 2010).

La produccin de biocombustibles utilizando materiales lignocelulsicos (Figura

2.7.1), involucra la recoleccin de la biomasa, la descomposicin de los polmeros de la

pared celular en azucares simples (pretratamiento y sacarificacin) y la posterior

conversin de estos azucares en los biocombustibles (Rubin E. 2008).

Aunque existen mtodos fisicoqumicos que permiten utilizar la biomasa en la

produccin de biocombustibles, una alternativa conveniente es propuesta por los

mtodos biolgicos que utilizan organismos celulolticos para obtener azucares

fermentables mediante procesos energticamente econmicos (Lynd et al, 2002). Por tal

motivo en la actualidad muchos esfuerzos de investigacin se estn enfocando en la

produccin costeable de enzimas hidrolticas para poder ser aplicadas en la produccin

del bioetanol. En el presente trabajo se realiz una seleccin de cepas con el mejor

potencial para la produccin de hidrolasas, en especfico celulasas y hemicelulasas.

Figura 2.7.1. Transformacin de la biomasa lignocelulsica en biocombustibles, (Rubin E, 2008).


3.0 OBJETIVOS.

3.1 Objetivo general.

En este proyecto se pretende determinar y comparar el potencial celuloltico y

hemiceluloltico de seis cepas de Bacillus sp. previamente aisladas de jugos despus del

proceso de pasteurizacin, dichas cepas han sido preliminarmente identificadas como

posibles productoras de celulasas y hemicelulasas. Para este trabajo se pretende hacer

un anlisis ms detallado de este potencial mediante la medicin de actividad celuloltica

y hemiceluloltica de las cepas sometidas a diversas condiciones de cultivo (temperatura,

pH, aireacin, fuente de carbono, fuente de nitrgeno, presencia de iones, uso de otros

compuestos que pudieran aumentar la actividad) finalmente determinar cul o cules de

stas son las mejores y bajo qu condiciones para poder hacer un anlisis ms preciso y

detallado mediante cultivos en biorreactor.

3.2 Objetivos especficos.

Hacer una comparacin cualitativa y cuantitativa del desarrollo de las cepas de

Bacillus sp. y seleccionar aquellas que sean las mejores.

Determinar cuantitativamente en funcin de las actividades de FPasa, CMCasa y

Xilanasa el potencial celuloltico y hemiceluloltico de las cepas de Bacillus sp.

mediante cultivo en medios con distintas fuentes de carbono: bagazo de caa de

azcar explotado con vapor y deslignificado (BED), bagazo de caa de azcar

explotado con vapor no deslignificado (BEX) y bagazo de caa de azcar

pretratado hidrotrmicamente (HT).

Determinar cuantitativamente el efecto que tienen el pH, la aireacin, la

temperatura, as como la utilizacin de diversas fuentes de nitrgeno sobre la

produccin de celulasas y hemicelulasas.


4.0 MATERIALES Y METODOS.

4.1 Cepas de Bacillus sp.

Para la seleccin de los linajes con el posible potencial de produccin de

hidrolasas se parti de los resultados de un aislamiento de 107 cepas de Bacillus sp.

que fueron encontradas en jugos de frutas despus de haber sido sometidos a la

pasteurizacin. Una preseleccin fue hecha a partir del anlisis de actividad enzimtica

en funcin de la cantidad de azucares reductores totales y la actividad enzimtica de

xilanasa presentes despus de 72 horas de crecimiento en medio Luria Bertani estril

con 0.5% de distintas fuentes de carbono como sustrato incubando en placas de pozo

profundo a 37C con una agitacin de 250 RPM. Las diferentes fuentes de carbono

utilizadas fueron: bagazo de caa de azcar explotado con vapor no deslignificado

(BEX), bagazo de caa de azcar explotado con vapor (BED), pulpa de bagazo,

eucalipto explotado, espelta de avena, xilana, avicel, -celulosa, y pectina. De estos

experimentos fueron observadas 25 cepas con el mayor potencial para la degradacin

de celulosa y hemicelulosa. Para el presente trabajo fueron seleccionadas cinco cepas

las cuales presentaron en general una mayor actividad celuloltica y hemiceluloltica para

cada uno de los sustratos utilizados (Tabla 4.1.1).

Cepa

Bacillus sp.

Bagazo explotado

Eucalipto explotado

Bagazo molido

Xilana comercial Avicel

Bagazo (pulpa)

-celulosa Pectina

Actividad (U/mL)

BH 02 0.0980 0.0328 0.0177 1.2215 0.0189 0.4462 -0.0323 -0.2605 0.3427

BH 05 0.4569 0.4428 0.3302 0.1496 0.2518 0.4247 0.4440 1.6897 0.0764 BH 19 0.2128 0.2949 0.1554 0.7280 0.2316 0.3656 0.2787 0.3725 0.2603 BH 51 0.4853 0.3861 0.7220 0.4253 0.4904 0.3965 0.5441 0.8528 0.1541 BH 62 0.0533 0.0373 0.0772 0.9585 0.1929 0.2071 0.1677 0.1226 0.4162

4.2 Screening cualitativo de produccin de celulasas.

La deteccin de las cepas de Bacillus sp. con mejor produccin de celulasas fue

realizada a partir del anlisis cualitativo de actividad celuloltica mediante la aplicacin

del tinte Rojo Congo propuesto por Ariffin H. et. al. (2006). Para ello las cinco cepas

fueron inoculadas en un medio mineral con CMC 1% (Conteniendo (g/L): KH2PO4 1.0,

MgSO47H2O 0.5, FeSO47H2O 0.01, MnSO4H2O 0.01, NH4NO3 0.3, CMC 10, Agar 12)

Tabla 4.1.1. Cepas de Bacillus sp preseleccionadas. Cinco de las mejores veinticinco preseleccionadas cepas de acuerdo a la mayor actividad registrada en los distintos tipos de sustrato. La tabla muestra la absorbancia (540 nm) de los azucares reductores del medio (Anlisis por DNS).


con un pH ajustado a 7.0 con NaOH 1M. Las placas de CMC fueron incubadas a 37C

durante 5 das permitiendo la secrecin de celulasas. Una vez terminado ese tiempo las

placas fueron tratadas con 10 ml una solucin acuosa de Rojo Congo (0.5% p/v) durante

15 minutos. La solucin de tinte fue retirada de las placas y posteriormente fueron

cubiertas por 10ml de NaCl 1M durante 10 minutos para desteir la zona con actividad.

La formacin de una halo decolorado indica la degradacin de la celulosa (Teather R.

M., y Wood P. J., 1982). La cepa con mayor radio del halo fue considerada como la de

mayor actividad celuloltica.

4.3 Fermentacin sumergida.

4.3.1 Mantenimiento de las cepas de Bacillus sp.

Las 5 cepas fueron almacenadas mediante crioconservacin, para lo cual cada

una de ellas fue inoculada en un medio mnimo M9 e incubada a 37C con agitacin

orbital a 250 RPM hasta alcanzar una OD de 0.6 a 1.0, posteriormente las bacterias

fueron centrifugadas descartando el sobrenadante y resuspendidas en medio mnimo

M9 con glicerol 10%, en seguida estas se alicuotaron en viales de 2mL y almacenaron

en nitrgeno lquido. Para la preparacin de inculos a partir de picadura en colonia

fueron preparadas placas con medio LB (NaCl 1%, Bacto-Triptona 1%, Extracto de

levadura 0.5% y Agar 1.5%) las cuales fueron inoculadas con diluciones de las bacterias

criopreservadas permitiendo la formacin de colonias aisladas.

4.3.2 Medios de cultivo.

1. Medio de cultivo mineral: El medio de cultivo estndar utilizado para las

fermentaciones realizadas se prepar de la siguiente forma (g/L): KH2PO4 1.0,

MgSO47H2O 0.5, FeSO47H2O 0.01, MnSO4H2O 0.01, NH4NO3 0.3, CMC 10, aforando

a 1000 mL con agua destilada y con un pH ajustado a 7.0 con NaOH 1M (Ariffin H. et. al.

2006).

2. Medio Luria Bertani (LB) para preparacin de inculo: Para el desarrollo del

inculo utilizado para cada una de las fermentaciones las cepas fueron crecidas en

medio LB conteniendo (g/L): NaCl 10, Bacto-Triptona 10, Extracto de levadura 5,


aforando a 1000 mL con agua destilada con un pH ajustado a 7.0. Agar a una

concentracin de 1.5% fue utilizado en medio slido.

4.3.3 Preparacin de inculo.

Para cada fermentacin realizada con las cinco cepas la preparacin del inoculo

fue realizada de la misma forma. En condiciones estriles fue tomada una colonia

aislada de una placa con medio LB mediante un palillo de madera estril y este fue

inoculado en 50 ml de medio LB en matraz Erlenmeyer de 250 mL, el cultivo fue

incubado a 37C con agitacin orbital a 250 rpm dejando crecer toda la noche (14 horas

hasta alcanzar una O.D. de hasta 2.0). Luego las bacterias fueron centrifugadas y

resuspendidas en 10 mL de medio LB fresco.

4.3.4. Condiciones estndar de fermentacin.

Cada una de las fermentaciones realizadas se llev a cabo en matraces

Erlenmeyer de 125 ml conteniendo 30 ml del medio mineral estril y fueron inoculados

con la cantidad suficiente del inculo concentrado en medio LB fresco para ajustar una

densidad ptica de 0.2 al inicio de la fermentacin, la incubacin se realiz a 37C con

agitacin orbital a 150 rpm durante mximo 72 horas.

4.3.5 Preparacin del extracto enzimtico.

Durante la fermentacin fueron tomadas muestras de 1 mL a intervalos de tiempo

regulares, cada una de las muestras fueron centrifugadas a 13,000 rpm durante 5

minutos a 4C, los sobrenadantes obtenidos fueron utilizados para la determinacin de

las actividades enzimticas (Abou-Taleb K. et. al., 2009). Las muestras fueron

almacenadas a -20C hasta ser analizadas.

4.4 Mtodos analticos y mediciones.

4.4.1 Seguimiento de la cintica de crecimiento durante las fermentaciones.

Para el seguimiento de la cintica de crecimiento de las bacterias se recurri a la

medicin de la densidad ptica (O. D.) de las muestras en funcin de la absorbancia del


medio para las fermentaciones con medios translucidos (Medio mineral con CMC

nicamente). Para el caso de las fermentaciones con medio mineral y los distintos

bagazos la tcnica de O.D. no fue la adecuada por lo que se propuso la estandarizacin

de un mtodo ms rpido para la cuantificacin del crecimiento bacteriano presente en

el medio de cultivo basado en la cuantificacin de ADN genmico total de las diversas

muestras.

Para el ensayo se inocul la cepa BH19 en 30 mL de medio LB incubado a 37C

con agitacin orbital a 250 rpm durante 6 horas, cada hora se tom una muestra, se

determin su O. D. (600 nm) y posteriormente fue realizada la extraccin de ADN

genmico total mediante el mtodo de Hai-Rong Cheng & Ning Jiang (2006) en el cual 1

ml del cultivo fue centrifugado a 13, 000 rpm durante 5 minutos descartando el

sobrenadante y posteriormente lavando las clulas con 400 L de Buffer STE (NaCl

100 mM, Tris/HCl 10 mM, EDTA 1mM, pH 8.0) dos veces, en seguida las clulas fueron

centrifugadas nuevamente y las bacterias fueron resuspendidas en 200 L de buffer TE

(Tris/HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0). Luego se agregaron 100 L de Fenol saturado

con Tris (pH 8.0) seguido de 120 segundos de agitacin en vortex para producir la lisis

celular. Subsecuentemente las muestras fueron centrifugadas a 13, 000 rpm durante 5

minutos a 4C para separar la fase acuosa de la fase orgnica. 160 L del sobrenadante

fueron transferidos a nuevos microtubos. Posteriormente se realizaron varias

extracciones con cloroformo para purificar las muestras, luego se agreg 1 L de

ARNasa e incub a 37C por 20 minutos, finalmente se realiz otra purificacin con

cloroformo y la solucin de ADN fue utilizada directamente para su cuantificacin y

determinacin de pureza mediante NanoDrop 2000 de ThermoScientific. Fue realizada la

electroforesis en gel de agarosa 1% para observar la integridad de las muestras

4.4.2 Actividad enzimtica sobre papel filtro (FPasa).

La actividad de FPasa fue medida de acuerdo al mtodo descrito por Mandels M.

y Weber J. (1969) con algunas modificaciones. La actividad se determin utilizando

trozos de papel filtro Watman no.1 en buffer citrato 50 mM (pH 4.8) como sustrato. La

mezcla de reaccin consisti en 5 mg de papel filtro en 100 L de buffer citrato (50 mM,

pH 4.8) y 50 L del extracto enzimtico, estas muestras fueron incubadas a 50C

durante 60 minutos, luego la reaccin fue detenida con la adicin de 300 L de reactivo

de DNS, en seguida fue determinada la cantidad de azucares reductores que fueron


liberados por la enzima durante el periodo de incubacin. Una unidad de actividad de

FPasa fue determinada como 1 mol de glucosa liberada por mL de enzima por minuto.

4.4.3 Actividad enzimtica sobre Carboximetilcelulosa (CMCasa).

La actividad de la CMCasa fue determinada de manera similar a la actividad de

FPasa de acuerdo con el mtodo descrito por Mandels M. y Weber J. (1969) con

algunas adaptaciones. La actividad se determin utilizando una solucin acuosa de

CMC 0.5% diluida con buffer citrato 50 mM (pH 4.8) como sustrato. La reaccin fue

llevada en placa de PCR de 96 pocillos y la mezcla de reaccin consisti en 50 L de

solucin acuosa de CMC 0.5%, 40 L de buffer citrato y 10 L del extracto enzimtico.

Posteriormente las muestras fueron incubadas en termociclador a 50C durante 30

minutos, la reaccin fue detenida al instante mediante la adicin de 100 L de reactivo

de DNS. En seguida fue determinada la cantidad de azucares reductores liberados en el

periodo de incubacin, una unidad de actividad de CMCasa fue determinada como 1

mol de glucosa liberado por ml de enzima por minuto.

4.4.4 Actividad enzimtica sobre Xilana (Xilanasa).

La actividad de la Xilanasa fue determinada de manera similar a la actividad de

CMCasa. La actividad se determin utilizando una solucin acuosa de Xilana 0.5%

diluida con buffer citrato 50 mM (pH 4.8) como sustrato. La reaccin fue llevada en placa

de PCR de 96 pocillos y la mezcla de reaccin consisti en 50 L de solucin acuosa de

Xilana 0.5%, 40 L de buffer citrato y 10 L del extracto enzimtico. Posteriormente las

muestras fueron incubadas en termociclador a 50C durante 30 minutos, la reaccin fue

detenida al instante mediante la adicin de 100 L de reactivo de DNS. En seguida fue

determinada la cantidad de azucares reductores liberados en el periodo de incubacin,

una unidad de actividad de Xilanasa fue determinada como 1 mol de xilosa liberado

por ml de enzima por minuto.

4.4.5 Determinacin de azucares reductores por el mtodo de DNS.

Este ensayo se realiz de acuerdo con el mtodo planteado por Miller G. L. (1959)

con algunas modificaciones. Luego de haber agregado el reactivo de DNS a cada una

de las muestras para detener la reaccin enzimtica, stas fueron llevadas a bao mara

en ebullicin durante 5 minutos, en seguida la reaccin fue detenida al pasar las


muestras a un bao de hielo. Fue medida la absorbancia de las muestras a 540 nm y se

calcul la cantidad de glucosa o xilosa liberadas en cada muestra mediante una curva

patrn de glucosa o xilosa estndar.

4.4.6 Determinacin del contenido de protena por el mtodo de Bradford.

El contenido de protena fue determinado mediante el Ensayo de Protena de Bio-

Rad (Bio-Rad Protein Assay) basado en el mtodo de Bradford M. (1976). La reaccin

fue llevada en placa de 96 pocillos en la cual se agregaron 80 L de muestra

debidamente diluida con 20 L del reactivo de Bradford. Posteriormente la mezcla fue

incubada a temperatura ambiente durante 5 minutos. La absorbancia de las muestras

fue medida a 595 nm utilizando agua mili-Q como blanco.

4.4.7 Actividad enzimtica proteoltica.

Dados algunos problemas concurridos durante las determinaciones de las

actividades enzimticas se realiz un ensayo para cuantificar la actividad proteoltica

presente en el extracto enzimtico para verificar la posibilidad de interferencia debido a

estas enzimas. La actividad proteoltica fue determinada en base a la metodologa

propuesta por Charney J. y Tomarelli R. M. (1947) con algunas modificaciones y

adaptaciones. La actividad se determin utilizando una solucin de azocaseina 0.5% en

buffer acetato 50 mM (pH 5) como sustrato y en base a la formacin de derivados

coloridos en medio alcalino a partir de la hidrlisis del sustrato. La reaccin se llev a

cabo en microtubos de 1.5 mL, la mezcla de reaccin consisti en 50 L de azocasena

en buffer acetato (50 mM, pH 5, estabilizado previamente por 10 minutos a 37C) y 50

L del extracto enzimtico, luego sta se incub a 37C por 40 minutos. Posteriormente

la reaccin se detuvo mediante la adicin de 50 L de cido tricloro-actico para

precipitar el sustrato no digerido, en seguida las muestras fueron centrifugadas a 10,000

rpm durante 15 minutos y 100 L de sobrenadante fueron transferidos a una placa de 96

pocillos para posteriormente adicionar 100 L de KOH 5N para la formacin de

compuestos coloridos (para cada muestra se prepara un blanco al cual se adiciona el

cido tricloro-actico antes de adicionar el extracto enzimtico), las muestras fueron

analizadas en espectrofotmetro a 428 nm. La actividad proteoltica se expres como la

diferencia de absorbancia entre las muestras analizadas con sus respectivos blancos,

siendo: 1 Unidad= Absorbancia /0.01/ tiempo de reaccin por mL de extracto enzimtico.


4.5 Screening cuantitativo de produccin de celulasas.

Fue realizada una fermentacin en medio mineral CMC 1% con las cinco cepas

bacterianas para el seguimiento de la cintica de crecimiento, la determinacin de la

velocidad especifica de crecimiento () mediante la medicin de O. D. en cada una de

stas as como la determinacin de la actividad celuloltica (FPasa y CMCasa) utilizando

las condiciones de fermentacin estndar, el tiempo de desarrollo fue de 64 horas. Para

ello fueron tomadas muestras a 16, 40 y 64 horas de cultivo.

4.6 Variacin de las condiciones de fermentacin para la produccin de celulasas y hemicelulasas.

Durante el desarrollo del trabajo experimental en base a trabajos previos realizados

acerca de la produccin de celulasas y hemicelulasas en diferentes cepas de Bacillus

(Abou-Taleb K. A. et. al., 2009; Shankar T. et. al., 2011; Nasr S., et. al., 2009; Heck J. X.

et. al., 2002; Otajewo F. D. 2011; Ariffin H. et. al., 2006; Kummar S. G. et. al., 2009; Li-

Jung Yin, et. al., 2011; Immanuel G. et. al., 2006; Kotchoni O. S., et. al., 2003; Wizna H.,

et. al., 2007 y Femi-Ola T. et. al., 2008) fueron determinadas las condiciones que

podran aumentar la produccion de las hidrolasas, en base a ello fueron analizados los

siguientes efectos:

4.6.1 Efecto de la agitacin.

Fueron inoculadas las cepas BH62, BH51 y BH19 en condiciones de fermentacin

estndar con CMC 1% y una modificacin de la fuente de carbono por BED 1%, as

mismo la agitacin del medio fue cambiada por las siguientes: sin agitacin, 50 rpm, 100

rpm y 150 rpm, esto para conocer las condiciones apropiadas de aireacin para la

mxima produccin de celulasas y hemicelulasas. Fueron tomadas muestras a las 6, 12,

24, 48 y 72 horas de la fermentacin y en cada una de estas fue determinada la

actividad enzimtica sobre carboximetilcelulosa (CMCasa) y sobre Xilana (Xilanasa), asi

mismo fue medida la O. D. de las muestras y determinada la cintica de crecimiento en

los cultivos con CMC 1%


4.6.2 Efecto de la presencia de Cu+2 en el medio.

Fue evaluado el efecto de la presencia de iones de cobre sobre la produccin de

celulasas y hemicelulasas. Las cepas BH62, BH51 y BH19 fueron inoculadas en

matraces Erlenmeyer de 125 ml con 30 ml medio mineral CMC 1% complementado con

5 mM de CuSO4 (Akel H. et. al., 2009; Servinic N. y Demircan E., 2011; Shafee N. et. al.,

2000) incubados a 50 rpm a 37C. Fueron tomadas muestras a las 24, 48 y 72 horas de

la fermentacin y en cada una de estas fue determinada la actividad enzimtica sobre

carboximetilcelulosa (CMCasa) y sobre Xilana (Xilanasa), as mismo fue medida la O. D.

de las muestras y observada la cintica de crecimiento en los cultivos.

4.6.3 Efecto de la fuente de carbono.

Fueron inoculadas las cepas de Bacillus sp. BH19, BH51 y BH62 en condiciones

de fermentacin estndar. Para este experimento la fuente de carbono del medio mineral

fue sustituida por su equivalente 1% de : bagazo de caa de azcar explotado con vapor

y deslignificado (BED), bagazo de caa de azcar explotado con vapor no deslignificado

(BEX) y bagazo de caa de azcar pretratado hidrotrmicamente (HT).Salvado de Soya

(FS), Salvado de Trigo (FT) y licor del pretratamiento hidrotrmico de bagazo (LQ)

(Tambin se trabaj con CMC 1% como control) esto con el objetivo de obtener una

mayor induccin de produccin de celulasas y hemicelulasas con alguna fuente de

carbono especfica. Fueron tomadas muestras a las 6, 12, 24, 48 y 72 horas. En este

experimento fue determinada la actividad CMCasa y Xilanasa. Adems en las muestras

de 24 horas fue determinada la actividad proteoltica.

4.6.4 Efecto de la fuente de nitrgeno.

Fueron seleccionadas e inoculadas las cepas de Bacillus sp. BH19 y BH62 en

condiciones de fermentacin estndar. Para este experimento fueron utilizados los

bagazos con pretratamiento (BED, BEX y HT) como fuente de carbono la fuente de

carbono (1%). Del medio mineral la fuente de nitrgeno (NH4NO3) fue sustituida por dos

fuentes de nitrgeno orgnicas y dos inorgnicas: Triptona y extracto de levadura, as

como NH4Cl y (NH4)2SO4 respectivamente en una composicin del 0.2%. Esto con el

objetivo de encontrar una mejor produccin de celulasas y hemicelulasas mediante el

sinergismo de una fuente de carbono y una de nitrgeno en especfico. En este


experimento fue determinada la actividad CMCasa y Xilanasa. La cantidad de protena

total del extracto enzimtico tambin fue determinada.

4.7 Optimizacin de las condiciones de reaccin para la medicin de actividad de las celulasas y hemicelulasas de las cepas de Bacillus sp. BH19 y BH62.

Para muestras de extractos enzimticos que mostraron actividad endoglucanasa y

xilanasa en las cepas de Bacillus sp. BH19 y BH62, fueron probadas diferentes

condiciones de reaccin en cuanto a pH y temperatura. Para ello se realiz un gradiente

de pH/temperatura, para la fijacin del pH fueron utilizados los siguientes buffers (50

mM): citrato pH 3.5, citrato pH 4.8, citrato pH 6.0, fosfato pH 7.0 y fosfato pH 9.0 y el

gradiente de temperatura facilitado por termociclador a 40.4, 45.8, 51.1, 56.2 y 60C.

Una vez determinado el pH optimo, fue analizado un rango de temperatura de reaccin

mayor (60.1, 65.6, 70.9, 76 y 80C).


5.0 RESULTADOS Y DISCUSIONES

5.1 Screening cualitativo y cuantitativo de produccin de celulasas.

La tcnica de zona clara en medio de carboximetilcelulosa (Carboximethilcellulose

clear zone) exhibe cualitativamente la habilidad de las cepas para producir celulasas

dado a que el colorante Rojo Congo presenta fuertes interacciones con polisacridos

unidos por enlaces -1,4 as como significantes interacciones con -1,3-D-glucanos, al

producirse la hidrlisis de estos compuestos las interacciones entre el colorante y los

polisacridos se pierden, perdindose a su vez la coloracin en el halo correspondiente

al rea en el que la bacteria secret las celulasas, el dimetro del halo es equivalente al

potencial celuloltico del microorganismo (Teather R. y Wood P., 1982), en funcin a lo

anterior luego de 120 horas de desarrollo de las cepas de Bacillus sp. (Figura 5.1.1) se

encontr que la mejor en produccin de celulasas en sustrato solido es BH19, BH05 y

BH62, seguidas por las cepas BH51 y BH02 estas ltimas con baja actividad.

A

A

B

A

C

A

D

A

E

A

F

A

5 mm 15 mm 19 mm

6 mm 12 mm ----

Figura 5.1.1. Zona clara de colorante Rojo Congo en medio mineral con carboximetilcelulosa 1%. A Bacillus sp. BH02, B Bacillus sp. BH05, C Bacillus sp. BH19, D Bacillus sp. BH51, E Bacillus sp. BH62

y F Control. En la parte inferior se indica la longitud en milmetros del halo producido por cada cepa.


El screening cualitativo fue realizado en condiciones de fermentacin en sustrato

slido, por su parte en el caso del screening cuantitativo se prob el potencial mediante

fermentacin sumergida, de esta forma fue comparada la capacidad de las cepas de

Bacillus sp para desarrollarse bajo stas condiciones que son mayormente sencillas en

el caso de un escalamiento del proceso. Los ensayos de actividad enzimtica sobre

papel filtro (FPasa) y sobre carboximetilcelulosa (CMCasa) no mostraron resultados

favorables, pues ninguna de las cepas de Bacillus sp. registr la liberacin de azucares

reductores al medio. A pesar de no detectarse actividad enzimtica en las muestras, fue

posible observar un aumento en la poblacin bacteriana para todas las cepas en el

intervalo de 16 y 40 horas de crecimiento (Tabla 5.1.1), posterior a ello a las 64 horas se

registr un crecimiento estacionario.

CEPA 16 Horas 40 Horas 64 Horas (h-1)

BH02 0.100 0.180 0.197 0.024

BH05 0.087 0.182 0.186 0.031

BH19 0.102 0.141 0.164 0.013

BH51 0.165 0.323 0.347 0.028

BH62 0.213 0.545 0.565 0.039

Tal como se observa en la Tabla 5.1.1 y Figura 5.1.2 no se tuvo un aumento

importante en la poblacin microbiana para ninguna de las cepas, por lo tanto es posible

que la actividad enzimtica que pudiera registrarse en este cultivo es demasiada baja

para poder ser determinada. Por tanto en este caso solo fue considerada velocidad

especfica de crecimiento para comparar el potencial celuloltico de las cepas (Tabla

5.1.1) para lo cual se encontr que la cepa BH62 presenta la mayor velocidad especfica

de crecimiento 0.039 h-1 seguida de BH05 con 0.031 h-1 y por BH51 con 0.028 h-1, bajo

estas condiciones de cultivo la cepa BH19 presenta un crecimiento muy lento, en

relacin a ello Stainer R. Y. (1992) reporta que en promedio para algunas cepas de

Bacillus sp. cultivadas en medio complejo, condiciones de aerobiosis y una temperatura

de incubacin de 40C alcanzan una velocidad especifica de crecimiento de 1.61 h-1,

valor muy por encima del encontrado en estas condiciones de cultivo lo que indica la

Tabla 5.1.1. Comparacin cuantitativa de las cepas de Bacillus sp. mediante su capacidad para desarrollarse en fermentacin sumergida en medio mineral CMC 1% en funcin de su velocidad especifica de crecimiento. La tabla muestra los valores de O. D. y registrados a cada intervalo de tiempo determinado. La ltima columna registra la velocidad especfica de crecimiento.


dificultad que tienen las cepas de Bacillus sp. para desarrollarse en un medio que

contiene solo celulosa como fuente de carbono.

Por tanto de acuerdo a los resultados presentados anteriormente se determin

que las cepas de Bacillus sp. con mayor potencial para la produccin de celulasas y

hemicelulasas fueron: BH62, por presentar la mayor velocidad especfica de crecimiento

y uno de los mejores dimetros en el ensayo de zona clara en medio con CMC 1%,

BH51, por ser el segundo con mayor velocidad especifica de crecimiento y por ltimo la

cepa BH19 al tener el mayor dimetro en la prueba de zona clara en medio con CMC

1%. El anlisis de la variacin de condiciones de cultivo fue realizado nicamente con

estas tres cepas al presentar la mayor viabilidad a la produccin de celulasas y

hemicelulasas.

Dentro de esta parte del desarrollo experimental fue probada la tcnica de

seguimiento del crecimiento microbiano en funcin de la cantidad de ADN genmico total

presente en las muestras, Treimo J. et. al. (2006) ha aplicado esta metodologa para

medir el crecimiento bacteriano de una forma sencilla. La Tabla 5.1.2 muestra la

comparacin entre la cintica de crecimiento comparando el incremento de la poblacin

bacteriana en funcin de la medicin de la densidad ptica (O. D.) as mismo la cantidad

de ADN genmico total extrado de cada muestra, en esta se observ que no existe

correlacin alguna entre la cantidad de ADN total extrado para las muestras tomadas en

cada intervalo de tiempo y estas a su vez no tienen correlacin alguna entre la turbidez

Figura 5.1.2. Cintica de crecimiento de las cepas de Bacillus sp. crecidas en medio mineral con CMC 1% en funcin de la O. D. medida de las muestras tomadas en 16, 40 y 64 horas de fermentacin.


de las muestras y la cantidad de ADN total, la Figura 5.1.3 muestra la integridad del ADN

extrado. De esta forma se determin que esta metodologa no es apropiada para el

seguimiento del crecimiento bacteriano en muestras de fermentaciones con bagazo.

Dada la dificultad que representa la medicin del crecimiento bacteriano no se determin

la cintica de crecimiento bacteriano para los siguientes experimentos, nicamente fue

determinada en aquellos casos en los que el medio es translucido.

5.2 Variacin de las condiciones de fermentacin para la produccin de celulasas y hemicelulasas.

5.2.1 Efecto de la agitacin.

Al igual que en el caso del anlisis cuantitativo del potencial para la produccin de

celulasas y hemicelulasas durante el screening de las cepas en las muestras tomadas

para este experimento no se encontr ninguna actividad, lo que hace suponer que las

condiciones a las que se realiz el experimento no son las adecuadas para inducir la

secrecin de una cantidad considerable de celulasas y hemicelulasas como para ser

detectadas por los mtodos analticos utilizados, en este caso la agitacin no tuvo efecto

alguno sobre esta situacin. Solo pudo ser comparado el crecimiento de las bacterias

mediante la determinacin de la velocidad especfica de crecimiento (Tabla 5.2.1.1). Sin

embargo, los resultados obtenidos no aportan informacin alguna ya que no existe una

Tiempo (h) O. D. (600 nm) ADN

(ng/mL)

0 0.200 2017.1

1.2 0.752 1883.5

2.1 1.730 1867.5

3.2 2.470 1831.8

4 2.630 1923.5

Tabla 5.1.2 Relacin entre O. D. y el ADN total extrado durante el desarrollo de Bacillus sp. BH19 en medio LB.

Figura 5.1.3. Electroforesis del ADN genmico extrado en: A Tiempo cero, B 1.2 horas de crecimiento, C 2.1 horas de crecimiento, D 3.2 horas de crecimiento y E 4 horas de crecimiento, MPM es el marcador de peso molecular de 1 Kb como referencia.


diferencia significativa entre la velocidad especfica de crecimiento, la cual sigue siendo

muy baja.

CEPA No Rotacin 50 RPM 100 RPM 150 RPM

BH19 0.030 0.036 0.017 0.013 BH51 0.008 0.020 0.000 0.028 BH62 0.041 0.036 0.028 0.039

En relacin al efecto de la rotacin Abou-Taleb K. A. et. al. (2009) encontr que

para las cepas Bacillus alcalophillus S39 y Bacillus amyloliquefaciens C2 la mxima

actividad fue encontrada con una agitacin de 150 rpm, de la misma forma Amwarali K.

(2006) menciona que en las cepas de Bacillus Amyloliquefaciens UMAS existe un

marcado incremento en la actividad celuloltica en el medio de fermentacin en

condiciones adecuadas de agitacin en comparacin a condiciones de no agitacin pues

encontr que en condiciones de agitacin la actividad celuloltica era el doble en

comparacin a la registrada en la fermentacin sin agitacin registrando una actividad

de 2.97 U/ml y 1.38 U/ml respectivamente. Immanuel G. et. al. (2006) y Nasr S. et. al.

(2001) utilizaron predeterminadamente una agitacin de 200 rpm y 150 rpm

respectivamente para la produccin de celulasas en cepas de Bacillus sp. Por tanto para

la produccin de celulasas es conveniente utilizar una agitacin orbital de 150 rpm, pues

como fue observado por los mencionados, la aeracin favorece la secrecin de

celulasas.

5.2.2 Efecto de la presencia de Cu+2 en el medio.

La nica fuente de carbono utilizadas en los medios de cultivo en los anteriores

experimentos fue carboximetilcelulosa y bagazo explotado por vapor y deslignificado,

por tanto para que sea posible el crecimiento de las bacterias tal como fue registrado es

necesaria la produccin de las celulasas, sin embargo esta actividad no fue posible

determinar en los experimentos anteriores, esta situacin hizo pensar en la posibilidad

de que las celulasas del extracto crudo estn siendo degradadas por proteasas

secretadas por la misma bacteria ya que especies del genero Bacillus sp. presentan una

importante produccin de proteasas de una forma muy eficiente (Boominadhan U.,2009).

Tabla 5.2.1.1. Velocidades especficas de crecimiento (h-1

) de las cepas de Bacillus sp. registradas en la fermentacin de medio mineral con CMC 1% con distintas velocidades de agitacin.


Akel H. (2009) demostr que la presencia de 5 mM de CuSO4 y CdCl2 provocan un fuerte

efecto inhibitorio en la actividad de las proteasas de una cepa de Bacillus

hipertermoflica. De la misma forma el efecto de reduccin de actividad proteoltica fue

demostrado por Servinic N. y Demircan E. (2011) en una cepa de Bacillus sp quienes

reportan la disminucin de esta actividad con la presencia de los iones Cu+2, Mg+2, Ba+2 y

Zn+2. Shafee, N. et. al. (2000) menciona que a las 24 h de incubacin los iones Cu+2 y Li+

se presenta una notable disminucin de la actividad proteoltica en una cepa de Bacillus

cereus. Otros inhibidores de proteasas como PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) y

EDTA fueron analizados, sin embargo el primero tiene una vida media de 40 minutos,

por lo que no es viable, y la segunda de acuerdo con que Kotchoni O. S. (2003) el EDTA

tiene en fuerte efecto inhibitorio en celulasas de Bacillus sp. en relacin a lo anterior

Mawadza C. (2000) menciona que la actividad celuloltica en cepas de Bacillus sp. no se

ve afectada por algunos iones como K+, Mg+2, Ca+2 y Cu+2. Sin embargo de acuerdo a

los resultados obtenidos el uso de CuSO4 inhibi el crecimiento de las cepas BH51 y

BH62 tal como se observa en la Figura 5.2.2.1, en el caso de BH19 no se present un

efecto inhibitorio total sobre su desarrollo, a pesar de ello en la determinacin de

actividad CMCasa y Xilanasa no se encontr actividad alguna. Por tanto el uso de

CuSO4 5 mM no tiene efectos importantes de mejora sobre la actividad celuloltica y

hemiceluloltica.

Figura 5.2.2.1 Efecto de Cu+2

sobre el sobre el crecimiento en las cepas de Bacillus sp.


5.2.3 Efecto de la fuente de carbono.

La fuente de carbono mostr un efecto importante para la produccin de celulasas

y hemicelulasas ya que contrario a los experimentos anteriores, en ste fue posible

encontrar actividad enzimtica en algunos de los tratamientos (Tabla 5.2.3.1).

La mayor actividad hidroltica fue encontrada en muestras de 24 horas de

fermentacin, sto coincide con lo determinado por Ariffin H. et. al. (2006) quien

encontr en la cepa Bacillus pumilus EB3 que la mayor actividad celuloltica fue

registrada a las 24 horas de crecimiento, menciona de ello que las celulasas son un

producto asociado al crecimiento, es decir, se produce durante la fase de crecimiento

exponencial.

El salvado de trigo, salvado de soya y el licor de pretratamiento hidrotrmico son

las mejores fuentes de carbono para la produccin de celulasas en estas cepas,

contrario a ello Nars S. et. al. (2011) y Abou-Taleb K. et. al. (2006) reportaron en cepas

de Bacillus sp. una mayor induccin de la produccin de celulasas en medios de cultivo

que contienen CMC 1%, reportaron a su vez una baja actividad en medios con celulosa.

En relacin a la actividad presentada en el licor de pretratamiento trmico, no se tiene

total certeza sobre los resultados, ya que en un estudio preliminar por HPLC la

composicin del licor encontr que sus constituyentes fuentes de carbono ms

abundantes son nicamente 0.506 g/L de glucosa y 0.098 g/L de xilosa, por tanto es

preciso determinar la posible presencia de xilooligosacaridos para describir mejor este

efecto.

Tiempo de Fermentacin 12 Horas 24 Horas 48 Horas

Cepa Sust. CMCasa (U/mL)

Xilanasa (U/mL)

CMCasa (U/mL)

Xilanasa (U/mL)

CMCasa (U/mL)

Xilanasa (U/mL)

BH19 FS 0 0 0.178 0.171 0 0.166 BH19 FT 0 0 0.170 0.150 0 0 BH19 LQ 0.223 0 0.247 0 0 0.151 BH51 LQ 0.177 0 0 0 0 0 BH62 LQ 0 0 0 0.168 0 0.174 BH62 FS 0 0 0.240 0 0 0

Tabla 5.2.3.1. Efecto de la fuente de carbono sobre la produccin de celulasas y hemicelulasas. *En la tabla solo fueron incluidos los tratamientos que mostraron actividad, en el resto de los tratamientos no se encontr actividad.


En relacin a la actividad proteoltica en muestras de 24 horas de fermentacin no

fueron encontradas actividades significativas que evidenciaran el efecto de la

degradacin de las celulasas (Tabla 5.2.3.2), en la mayora de los casos la actividad

proteoltica fue nula, solo en la Cepa BH19 con fermentacin de Salvado de trigo se

encontr la actividad mxima con 0.748 U/ml, de acuerdo con Boominadhan U. (2009)

una actividad con esta magnitud no presenta efectos sobre la deteccin de actividades

enzimticas, la baja actividad fue de esperarse ya que en el medio no hay componentes

que induzcan esta actividad enzimtica. En tanto los problemas de medicin de actividad

enzimtica no estn relacionados a una posible degradacin proteoltica.

5.2.4 Efecto de la fuente de nitrgeno sobre la produccin de celulasas y hemicelulasas.

Como se observa en la Figura 5.2.4.1 la presencia de ciertas fuentes de nitrgeno

en el medio de cultivo es un factor determinante en el crecimiento de las cepas de

Bacillus sp. En comparacin con las fuentes inorgnicas, las fuentes de nitrgeno

orgnicas estimularon un mejor desarrollo en el crecimiento, sin embargo ambas

presentaron mucho mejores efectos en comparacin a la fuente de nitrgeno

preestablecida originalmente en el medio de cultivo (NH4NO3), ya que en anteriores

fermentaciones ninguna haba logrado tener un crecimiento en la poblacin bacteriana

considerablemente grande. Una mayor poblacin bacteriana presenta mejores

actividades hidrolticas.

En relacin a la actividad celuloltica y hemiceluloltica los resultados no fueron

favorables, ya que la actividad CMCasa nicamente fue encontrada en la cepa BH19

con fermentacin en medio con triptona y CMC 1%, la actividad registrada fue de 0.1914

U/ml. En la actividad de Xilanasa se tuvieron mejores resultados, pues fue encontrada

actividad en las fermentaciones con las fuentes de nitrgeno orgnicas en medio con

CMC 1%, la mayor actividad registrada fue principalmente en las primeras 24 horas de

Actividad Proteoltica (U/mL)

CMC BED BEX HT FS FT LQ

BH19 0.197 0.000 0.043 0.000 0.130 0.749 0.000

BH51 0.323 0.000 0.014 0.000 0.009 0.241 0.000

BH62 0.000 0.000 0.000 0.063 0.000 0.002 0.000

Tabla 5.2.3.2 Actividad proteoltica registrada en las muestras de 24 horas de fermentacin en las cepas BH19, BH51 y BH62 en todos las fuentes de carbono probadas.


fermentacin, sin embargo a las 12 horas de crecimiento ms cepas registraron

actividad (Tabla 5.2.4.1). La influencia de las fuentes de nitrgeno sobre el desarrollo y

aumento en la actividad celuloltica concuerda con Abou-Taleb et. al. (2009), Shankar T.

(2011) y Nasr S. et. al. (2011) quienes en cepas de Bacillus sp. encontraron que las

fuentes orgnicas de nitrgeno, principalmente el extracto de levadura aumentan

considerablemente la produccin de celulasas. En cuanto a las fuentes inorgnicas la

mejor fue NH4Cl, coincidiendo con Abou-Taleb et. al. (2009) y Nasr S. et. al. (2011)

quienes encontraron que la mejor es NH4Cl seguida de (NH4)2SO4.

Tiempo de Fermentacin CEPA / Sustrato 12 Horas 24 Horas

BH19 CMC-Triptona 0.2989 0 BH19 CMC-Yeast Ext. 0.1898 0.4793 BH19 CMC-NH4Cl 0 0.5058 BH19 CMC-(NH4)2SO4 0.1564 0 BH19 HT-Yeast Ext. 0.1877 0 BH62 CMC-Triptona 0.1975 0.5377 BH62 CMC-Yeast Ext. 0.2011 0.4516 BH62 BEX-Yeast Ext. 0.1728 0

Figura 5.2.4.1. Efecto de las fuentes de nitrgeno sobre el crecimiento de las cepas de Bacillus sp. BH19 y BH62.

Tabla 5.2.4.1. Efecto de la fuente de nitrgeno sobre la actividad Xilanasa (U/ml) registrada en las cepas BH19 y BH62.* El resto de los tratamientos no fue puesto en la presente ya que no se encontr actividad alguna.


5.3 Optimizacin de las condiciones de reaccin para la medicin de actividad de las celulasas (CMCasa) y hemicelulasas (Xilanasa) de las cepas de Bacillus sp. BH19 y BH62.

Para la medicin de actividad enzimtica fueron utilizados protocolos estndar

con condiciones de pH y temperatura preestablecidos, sin embargo, durante la medicin

de la actividad en las muestras tomadas para cada experimento no se detect actividad

en la mayora de las muestras, una hiptesis fue una muy baja actividad o un posible

problema con los protocolos de medicin, a pesar de ello el visible aumento de la

poblacin bacteriana sugera la presencia de las hidrolasas, siguiendo el desarrollo

experimental varias condiciones de fermentacin fueron implementadas a lo largo del

trabajo con el objetivo de optimizar el desarrollo bacteriano en bsqueda del aumento en

la actividad enzimtica, no obstante ninguna de las condiciones probadas gener una

diferencia significativa ya que en stas slo unas cuantas muestras presentaban

actividad sin permitir establecer una correlacin verdadera.

Las enzimas tienen un pH y temperatura ptimos en las cuales se presenta la

mayor actividad sobre un sustrato (Devlin M.T, 2004), en base a esto se decidi realizar

una caracterizacin de pH y temperatura para determinar las condiciones especficas a

las cuales la actividad endoglucanasa (CMCasa) o hemicelulasa (Xilanasa) se llevan a

cabo de forma ptima, puesto que las condiciones preestablecidas en los protocolos

(pH 4.8 y 50C) no mostraron los resultados esperados. El gradiente de temperatura / pH

se realiz con muestras de fermentaciones de las cepas BH19 y BH62 las cuales

presentaron actividad en ensayos previos.

En una primera prueba utilizando un gradiente de temperaturas de entre 40 y

60C con pH de entre 3.5 y 9 se encontr que el pH ptimo es 6.0 y la temperatura 60C,

registrando una actividad mxima de 0.309 U/mL (Figura 5.3.1), sin embargo debido a

que la temperatura ptima se posicion en un extremo del rango, fue analizado un

intervalo hasta 80C usando el pH 6, observndose que el valor optimo real es a 65C

con una actividad de 0.344 U/mL (Figura 5.3.2)


Figura 5.3.1. Comparacin del efecto de temperatura y pH sobre la actividad de CMCasa en Bacillus sp. BH19.

Figura 5.3.2. Efecto de la temperatura sobre la actividad de CMCasa de una muestra de Bacillus sp. BH19 a pH ptimo pH 6.0.


En el caso de la actividad CMCasa en la cepa BH62, slo se encontr actividad

en las reacciones a pH 6.0, junto con ste una temperatura de 45.8C resultaron ser las

condiciones ptimas alcanzndose una actividad de 0.218 U/mL (Figura 5.3.3).

Para la actividad hemiceluloltica de la muestra de la cepa BH19 se encontr un

valor de pH ptimo de 6.0 y una temperatura de 60C presentando una actividad de

0.395 U/mL (Figura 5.3.4), no obstante con el pH ptimo en el rango de temperatura de

40-60C no se registr una variabilidad muy grande entre sus actividades, sin embargo

es necesario probar un rango de temperatura mayor y menor a los aqu utilizados.

.

Figura 5.3.3. Efecto de la temperatura sobre la actividad de CMCasa en una muestra de Bacillus sp. BH62 a un pH ptimo 6.0.

Figura 5.3.4. Efecto de temperatura sobre la actividad de Xilanasa en Bacillus sp. BH19 a pH ptimo 6.0.


As mismo, en la muestra de BH62 se determin que un pH 7.0 y una

temperatura de 60C son las condiciones ptimas para la reaccin, habindose

registrado una actividad de 0.427 U/mL. Al igual que en la muestra de BH19 no se

observ una gran diferencia entre la actividad a diferentes temperaturas (Figura 5.3.5).

En sntesis como lo muestra la Tabla 5.3.1, existe una gran diferencia entre las

actividades determinadas a condiciones de temperatura y pH optimas en comparacin

con las cuantificadas bajo condiciones estndar, siendo en la mayora de los casos

imposible registrar alguna actividad.

Tabla 5.3.1. Comparacin entre la actividad enzimtica determinada bajo condiciones ptimas respectivas y condiciones estndar (pH 4.8, 50C).

Figura 5.3.5. Efecto de la temperatura sobre la actividad de Xilanasa en Bacillus sp. BH62 a pH ptimo 7.0.


6.0 CONCLUSIONES.

La actividad hidroltica de las cinco cepas de Bacillus sp. preseleccionadas de una

previa caracterizacin de 25 potenciales es baja en las condiciones de operacin

analizadas, sin embargo dos de ellas BH19 y BH62 presentan la mayor zona de

despolimerizacin de carboximetilcelulosa y la mayor velocidad especfica de

crecimiento en fermentacin sumergida en medio mineral con carboximetilcelulosa

mostrando el mayor potencial para la produccin de hidrolasas.

De las variaciones de las condiciones de operacin, la agitacin, en las

velocidades que fueron utilizadas no tiene efectos significativos sobre el crecimiento y la

produccin de hidrolasas en las cepas de Bacillus sp. BH19 y BH62, as mismo el uso de

Cu+2 para la inhibicin de proteasas potenciales a la degradacin de las celulasas inhibe

el crecimiento de la cepa BH62, y en BH19 disminuye el crecimiento sin efectos sobre

una mayor actividad celuloltica. El salvado de trigo y el salvado de soya como fuente de

carbono indujeron una mayor produccin de hidrolasas, el licor de pretratamiento

hidrotrmico de bagazo de caa tambin indujo la produccin de estas enzimas. El

factor con ms influencia en el desarrollo de las cepas Bacillus sp. es la fuente de

nitrgeno, siendo las de origen orgnico, triptona y extracto de levadura las que inducen

un mayor crecimiento y usando carboximetilcelulosa como fuente de carbono se genera

la mayor actividad de celulasas y hemicelulasas.

Los valores de pH y temperatura ptimos de las enzimas hidrolticas producidas

por Bacillus sp. BH19 y BH62 son distintos a las condiciones establecidas en los

protocolos estndar de determinacin de actividades celulolticas. Esto se present

como un parmetro importante ya los posibles problemas presentados en la

determinacin de actividades enzimticas serian causa de una subestimacin. La

determinacin de las condiciones ptimas para la medicin de actividades enzimticas

abre la brecha para una exploracin ms profunda en la caracterizacin especfica de la

actividad hidroltica de las cepas de Bacillus en trabajos posteriores.


7.0 REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.

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