Enzimas Séricas. Introducción En la práctica clínica el estudio de las enzimas séricas es muy importante para el diagnóstico, control y comprensión de una gran variedad de patologías. Por ejemplo, la detección de altos niveles de amilasa sérica contribuye al diagnóstico de pancreatitis o parotiditis. Las enzimas presentes en el plasma pueden tener o no función en ese medio. En este sentido, se las clasifica como funcionales o no funcionales. Algunas enzimas tienen amplia distribución tisular, tanto que otras son específicas de un determinado tejido. Esta mayor o menor especificidad es importante para el diagnóstico. Una vez en el plasma cada enzima sufre un proceso de depuración que le es característico y por lo tanto resulta de gran utilidad conocer cuál es su vida media. Clasificación Las enzimas que se encuentran en el plasma pueden dividirse para su estudio en dos grupos: enzimas funcionales y enzimas no funcionales. Las enzimas funcionales tienen una función definida y específica en este medio, por lo que el plasma constituye su sitio normal de acción, y su concentración plasmática es equivalente o mayor que la del tejido donde se producen. A este grupo pertenecen la seudocolinesterasa, ceruloplasmina, lipoproteinlipasa, así como las enzimas que intervienen en la coagulación. La determinación de la actividad de estas enzimas tiene interés clínico en le evaluación tanto de la función propia de la enzima en el estudio como de la función del tejido que la sintetiza. Las enzimas no funcionales del plasma no tienen una función conocida en este medio, ya sea porque no dispone de la cantidad necesaria de sustratos, cofactores o activadores a nivel plasmático porque su concentración plasmática es considerablemente menor que los niveles titulares. Sin embargo, normalmente existen niveles circulantes detectables de la mayoría de las enzimas no funcionales debido a la renovación celular natural o pequeños traumatismos espontáneos. Su presencia en plasma en niveles más altos de lo normal sugiere un aumento en la velocidad de destrucción celular y tisular. La determinación de estos niveles de enzimas plasmáticas puede proveer información valiosa para diagnóstico y pronóstico. Sin embargo, niveles elevados de enzimas en plasma no sólo pueden ser interpretados como evidencia de necrosis celular ya que también la realización de ejercicio vigoroso libera cantidades significativas de enzimas musculares. Estas enzimas pueden dividirse en dos grupos: enzimas de secreción y enzimas del metabolismo intermedio. Las enzimas de secreciones se producen en glándulas exócrinas, como páncreas y próstata, así como en tejidos como mucosa gástrica y hueso. En adenocarcinoma y osteosarcoma se observa un aumento importante de la actividad plasmática de las fosfatasas ácida y alcalina. Otro grupo de enzimas no funcionales son las enzimas que participan en el metabolismo intermedio. La concentración tisular de estas enzimas es miles de veces más alta que en el plasma. El daño puede conducir a un aumento en la permeabilidad de la membrana plasmática con su consecuente liberación a la circulación general. Algunas de las enzimas que corresponden a este grupo son: aspartato amino transferasa (AST) o glutámico-oxalacético transaminasa (GOT), alanina amino transferasa (ALT) o glutámico pirúvico transaminasa (GPT), lactato deshidrogenada (LDH), creatín quinasa (CK), amilasa, γ-glutamiltranspeptidasa (γ-GT), 5´nucleotidasa y aldolasa (ALS).

Enzimas séricas de uso clínico más frecuente

ENZIMA ORGANO O ENFERMEDAD DE INTERES

Fosfatasa ácida Carcinoma de próstata Fosfatasa alcalina Enfermedades hepáticas y óseas Amilasa Enfermedades pancreáticas transaminasa glutámico-pirúvico (GPT o ALAT)

Enfermedades hepáticas

transaminasa glutámico-oxalacético (GOT o ASAT)

Hepatopatías y cardiopatías

lactato deshidrogenada (LDH) Hígado, corazón y eritrocito creatín quinasa (CK) Corazón, musculo y cerebro 5´nucleotidasa y aldolasa (ALS) hepatopatías γ-glutamiltranspeptidasa (γ-GT), hepatopatías Aldolasa Musculo, corazón Arginasa hepatopatías Elastasa Enfermedades del colágeno Seudocolinesterasa Hígado (intoxicaciones) Plasmina cuagulopatías Lipasa páncreas Otras Glucosa -6- fosfato deshidrogenada Glutamato deshidrogenada (GLDH) Hidroxibutiratodeshidrogeneasa (HBDH) Lactato deshidrogeneasa (LDH) Los niveles séricos aumentados de LDH se observan en muchas circunstancias como ser anemias megaloblásticas, infarto de miocardio y pulmonar, etc. El gran número de situaciones que aumenta la actividad de LDH hace relativa su utilidad diagnóstica. Sin embargo, es muy útil en el seguimiento de la quimioterapia del cáncer puesto que la respuesta en la terapéutica se acompaña por una disminución del nivel sérico de esta enzima. La determinación de la actividad de LDH es útil en el diagnóstico del infarto de miocardio y pulmonar. Son muy característicos los niveles de LDH elevados en los casos de infarto de miocardio y se observan valores altos ya a las pocas horas del comienzo del aparente infarto. Por si sola, la determinación de LDH no es determinante de lesión de ningún órgano en particular. Hay que tener en cuenta que es necesario evitar la hemólisis de la muestra de sangre, para una correcta determinación. Transaminasas La GOT está elevada en suero en pacientes con enfermedades hepatobiliares, cardiovasculares y miopatías. La GPT está elevada en el suero de enfermos hepáticos.

Fosfatasas Fosfatasa alcalina: se encuentra aumentada en las enfermedades hepáticas. Los niños en crecimiento y las mujeres embarazadas en el tercer trimestre presentan valores “fisiológicamente” elevados de fosfatasa alcalina en suero. La determinación de la fosfatasa alcalina es suero es útil para reconocer las enfermedades óseas, sobre todo la osteítis deformante, hipoparatiroidismo y neoplasias óseas. La elevación de la fosfatasa alcalina sérica en algunas enfermedades hepáticas puede ser distinguida mediante otras pruebas de laboratorio y por sus rasgos clínicos. Fosfatasa ácida: se observan valores elevados en pacientes con carcinoma prostático. Distribución tisular de las enzimas. Las isoenzimas son proteínas que difieren en la secuencia de aminoácidos pero que catalizan la misma reacción, estando presentes en la misma especie. Estas enzimas poseen diferentes propiedades físicas y químicas determinadas genéticamente (punto isoeléctrico, especificidad de sustrato y cofactor, etc), suelen mostrar diferentes parámetros cinéticos (i.e. diferentes valores de KM), o propiedades de regulación diferentes. La existencia de las isoenzimas permite el ajuste del metabolismo para satisfacer las necesidades particulares de un determinado tejido o etapa del desarrollo. Por ejemplo, la creatina quinasa (CK) presente en el cerebro difiere fisicoquímicamente de sus isoenzimas específicas de músculo cardíaco y esquelético. Asimismo, las isoemzimas pueden tener distinta localización subcelular como por ejemplo la glutámico oxalacética transaminasa (GOT) presente en mitocondria difiere de la citosólica. En cambio las diferentes isoenzimas de la láctico deshidrogenada (LDH) están presentes en compartimientos citosólicos. En términos muy generales, las diferencias en el contenido enzimático son puramente cuantitativas, es decir, las mismas enzimas están presentes en su mayoría en diversos tejidos, pero sus actividades relativas muestran grandes diferencias de órgano a órgano. Así, el mapa enzimático es la descripción de un órgano en términos de su contenido enzimático. El mapa enzimático tisular está constituido, por la cantidad de cada una de las distintas enzimas que contienen todas las células de un determinado órgano. Tanto en condiciones normales como patológicas, esto se ve reflejado en un mapa enzimático sérico. Esto es la presencia en el suero de las enzimas presentes en un órgano. Esto es de vital importancia en la clínica, ya que facilita su determinación por su fácil accesibilidad. La medida de los diversos mapas enzimáticos séricos, por su parte, constituye el intento de lograr la especificidad bioquímica de los diferentes órganos. Cuanto mayor sea la cantidad de enzimas que se determinen más completo será el mapa y mejor podrá determinarse el cuadro patológico. Aunque desde el punto de vista biológico son muchas las enzimas objeto de atención, el interés clínico se centra en el estudio de aquellas cuyas variaciones son patognomónicas, es decir, indicadoras de enfermedad o, por lo menos, de determinadas alteraciones funcionales. Es adecuado determinar más de una enzima en el suero, por el hecho de no existir enzimas que sean simultáneamente órganoespecíficas y lo suficientemente sensibles.

Determinación de niveles séricos de enzimas. La pequeña cantidad de enzima (que es una proteína) presente en las células complica la medición de dicha cantidad de enzima presente en un extracto tisular o fluido biológico. Afortunadamente la actividad catalítica de una enzima provee un elemento sensible y específico para su propia determinación. La capacidad de transformar específicamente un gran número de moléculas de sustrato en producto, en un período corto de tiempo, permite amplificar en forma muy eficiente su presencia. El nivel sérico de una enzima dada se cuantifica determinando la actividad de esa enzima presente en una muestra de suero y no así su concentración, debido a que: 1) por lo general están presentes en cantidades muy pequeñas en los líquidos biológicos. 2) no se encuentran en estado puro, sino que se encuentran dentro de una mezcla compleja, que entre muchas otras moléculas, contiene un gran número de otras proteínas. La actividad se expresa generalmente en UI/l (UI= unidad internacional). Para que una prueba enzimática sea válida, debe diseñarse un protocolo donde la concentración de enzima sea el único factor limitante, es decir que el resultado refleje la cantidad de enzima y no se vea afectado por otras sustancias o circunstancias. Debe tenerse en cuenta la posible interferencia por muestras obtenidas con anticoagulantes (resultados falsamente elevados o disminuidos) por hemólisis de la muestra (se eleva falsamente la LDH por ejemplo), por opalescencia o característica lechosa del suero (produce lecturas variables de absorción de luz). Para la determinación de la actividad enzimática, en algunos casos se utiliza la información ya conocida de la reacción catalizada por la enzima, su requerimientos de cofactores y algunas propiedades de alguno de los sustratos o productos de la reacción, generalmente absorbancia de la luz visible o UV por ser una determinación sencilla, fácil y poco costosa. Ejemplos: La LDH cataliza la reducción de piruvato a lactato y la simultanea oxidación de NADH a NAD+

LDH Piruvato + NADH + H+ ↔ Lactato + NAD+

El NADH absorbe en el rango de la luz ultravioleta (340 nm), propiedad utilizada para la determinación enzimática. La mezcla de reacción aporta piruvato y NADH, como sustratos, en un medio de pH adecuado (buffer). La reacción se inicia por el agregado de muestra en estudio que contiene la LDH a dosar. Utilizando un espectrofotómetro se mide la disminución de absorbancia a 340 nm, indicador del consumo de NADH. La velocidad de desaparición del sustrato es proporcional a la cantidad de enzima LDH presente en la muestra.

Si los sustratos o productos carecen de una propiedad espectral de fácil medición, se utiliza el acople de la reacción que cataliza la enzima de interés a una segunda reacción cuyos sustratos o productos pueden determinarse por espectrofotometría. Ejemplo: Las transaminasas son enzimas que participan activamente en el metabolismo de aminoácidos. Catalizan la transferencia el grupo amino de un aminoácido a un cetoácido con la consiguiente transformación del aminoácido original en cetoácido y del cetoácido inicial en aminoácido. Existe una gran variedad de transaminasas de las cuales dos son usadas frecuentemente como indicadores de daño hepático o cardíaco: la glutámico pirúvico transaminasa (GPT) también llamada alanina amintransferasas (ALT o ALAT) y la glutámico oxalacético transaminasa (GOT) también llamada aspártico aminotransferasas (AST o ASAT). GPT

Alanina + α-cetoglutarato → piruvato + glutamato GOT

Aspartato + α-cetoglutarato → oxalacetato + glutamato En estos casos ni los sustratos ni los productos absorben luz en el rango UV o visible, por lo cual la determinación de las transaminasas se realiza través de una reacción acoplada que utiliza como sustrato un producto de la reacción anterior. GPT (fosfato de piridoxal)

Alanina + α-cetoglutarato → Piruvato + glutamato

LDH

Piruvato + NADH + H+ → Lactato + NAD+ La mezcla de reacción aporta alanina, α-cetoglutarato NADH, LDH y fosfato de piridoxal (cofactor de la enzima GPT) en concentraciones no limitantes de un buffer de pH adecuado (7,3). La reacción se inicia por el agregado de la muestra en estudio. La velocidad de la reacción catalizada por la LDH estaría determinada por la producción de piruvato proveniente de la reacción catalizada por la GPT. Por lo tanto la velocidad de desaparición de NADH, determinada midiendo absorción de luz 430 nm, será proporcional a la actividad de GPT presente en la muestra. En la determinación de GOT se acopla a la reacción catalizada por la malato deshidrogenasa (MDH), con un principio idéntico al descrito.

GOT (fosfato de piridoxal)

Aspartato + α-cetoglutarato → Oxalacetato + glutamato

MDH Oxalacetato + NADH + H+ → Malato + NAD+

En otros casos la determinación no se realiza utilizando sustratos fisiológicos, sino compuestos similares sobre los cuales actúa igualmente la enzima. Ejemplo: La determinación de la fosfatasa alcalina (FAL) utiliza un sustrato del cual la enzima remueve el grupo fosfato liberando 4-nitrofenol, compuesto de color amarillo que absorbe luz en el rango visible. Fosfatasa alcalina (dietanolamina)

Fosfato de p-nitrofenilo → p-nitrofenol + Fosfato

Características clínicas Se ha observado:

a- en procesos inflamatorios aparecen en plasma en primer término enzimas de bajo e intermedio peso molecular (por ej: en las hepatitis, encima de entre 40.000 a 140.000 Da).

b- En nivel de enzimas en el suero que se observa en una lesión es generalmente proporcional a la magnitud de membrana celular afectada.

c- En los daños celulares mínimos, primero pasan a la sangre las enzimas citoplasmáticas y en caso de daño extenso o más intenso, lo hacen las enzimas localizadas en las membranas de las organelas (por ej: la glutámico deshidrogenasa (GLDH) mitocondrial).

d- Hay factores que alteran la permeabilidad selectiva de la membrana celular y que provocan una salida al espacio extracelular de enzimas intracelulares. Los más conocidos son:

• Baja concentración de oxígeno (hipoxia) • Baja de concentración en el medio • Alta concentración en el medio • Agentes químicos (iodoacetato, cianuro, tetracloruro de carbono) • Agentes físicos (pH, temperatura osmolaridad) • Algunos virus.

Para los fines diagnostico, una elevación de las enzimas celulares en el plasma es equiparable a una lesión celular. Es importante tener en cuenta que las enzimas cuyos niveles aumentan en suero raramente derivan de una necrosis celular sino que lo hacen por un grado sucesivo de liberación debido a que la biosíntesis enzimática se conserva mientras la célula vive. En los casos extremos de necrosis, después de un breve lapso, las actividades en el suero disminuyen por falta de nuevos aportes debido a una biosíntesis proteica considerablemente disminuida o nula.

Depuración de enzimas plasmáticas no funcionales. Una vez en el plasma, la actividad de las diversas enzimas decrece con una velocidad característica cada una de ellas (tiempo de vida media). Comparadas con otras proteínas del suero, las enzimas séricas poseen un tiempo de vida media muy corto. Esto significa, por una parte, que sus actividades en el suero son representativas del curso temporal de la lesión que les dio origen, y por otra, que en las lesiones agudas, como por ejemplo el infarto de miocardio, las determinaciones enzimáticas deben ser efectuadas según el tiempo transcurrido luego de la lesión: Vías de eliminación de enzimas séricas:

a- Eliminación renal: se cumple para aquellas de bajo peso molecular. Ej: amilasa y algunas fosfatasas

b- Inactivación sérica: existen inactivadores o inhibidores para varias enzimas: Ej: tripsina, quimiotripsina.

c- Para algunas enzimas existe recaptación por parte de los tejidos convalecientes, al restablecerse anatómica y fisiológicamente. Esta pequeñísima parte de las enzimas previamente liberadas sería utilizada, no para su función primitiva, sino como integrante de un “pool” (reservorio) de aminoácidos.

Localización del lugar de la lesión utilizando las determinaciones enzimáticas. Existen tres métodos:

1- Medida de enzimas específicas de órgano: se designa como específicas de órgano a las enzimas que se presentan con actividad relativamente alta en un determinado órgano o tejido. Por lo tanto, sus niveles séricos aumentados indican con seguridad una lesión en este órgano. Por ejemplo la CK es prácticamente específica de músculo, la sorbitol deshidrogenasa (SDH), y la glutamato dehidrogenasa (GLDH) son ampliamente específica de hígado, en tanto que la lipasa lo es de páncreas. El valor informático de la determinación de las enzimas específicas de órgano puede aumentarse considerablemente por la determinación simultánea de la actividad de otras enzimas. Al presentarse síntomas poco claros, sobre todo en casos de urgencia (ej: infarto de miocardio, abdomen agudo) tales mapas enzimático sirven para un rápido diagnóstico diferencial.

2- Determinación de isoenzimas: la determinación de la actividad de varias isoenzimas son metodológicamente más costosas que las medidas de la actividad total

Enzima Vida media promedio transaminasa glutámico-pirúvico (GPT o ALAT)

47±10 horas

transaminasa glutámico-oxalacético t (GOT o ASAT)

17±5 horas

Glutamato deshidrogenasa (GLDH) 18±1 horas lactato deshidrogenada (LDH) 113±60 horas creatín quinasa (CK) 15 horas aproximadamente Fosfatasa alcalina 3-7 dias γ-glutamiltranspeptidasa (γ-GT), 3-4 días Colinesterasa (CHE) 10 días aproximadamente Amilasa 3-6 horas Lipasa 3-6 horas

de una enzima. Sólo se emplea a algunos casos particulares. Por ejemplo bajo la sospecha de carcinoma prostático, resulta de interés la determinación de la actividad de la isoenzima de la fosfatasa ácida que es inhibible por tartrato, ya que esta isoenzima es específica de la próstata. La determinación de la actividad de las isoenzimas de LDH es de gran valor diagnóstico.

ISOENZIMA SUBUNIDADES

Tejidos en donde se

encuentra la isoenzima

mayoritariamente

Niveles normales de cada

isoenzima en el

adulto* LDH-1 HHHH Miocardio, eritrocito 17-27% LDH-2 HHHM Miocardio, eritrocito 27-37% LDH-3 HHMM Células linfoide,

cerebro , riñón 18-25%

LDH-4 HMMM Hígado, músculo esquelético

3-8%

LDH-5 MMMM Hígado, músculo esquelético

≤5%

(*En estos valores puede haber ciertas diferencias por la técnica o por criterios de normalidad propios de laboratorios concretos, a veces en el rango de valores y otras veces por las unidades a las que se hace referencia.)

Las cinco isoenzimas de la LDH tienen el mismo peso molecular y difieren en la carga que contienen. Esta diferencia es el principio de la determinación diferencial, que se realiza por separación electroforética. La fracción con mayor movilidad hacia el ánodo (polo negativo) es la isoenzima de tipo LDH-1 y la de menor movilidad es la LDH-5. Como la vida media de las LDH-1 (HHHH) (específica de corazón) es diez veces mayor que la de la LDH-5 (MMMM), específica de músculo esquelético, después de un infarto de miocardio se puede comprobar la preponderancia de la isoenzima cardio-específica aún cuando la actividad de LDH total retorne a los valores normales.

Existen tres isoenzimas de CK cuya distribución se muestra en la siguiente tabla

% de cada isoenzima en ISOENZIMA Musculo

esquelético Miocardio cerebro

CK3-MM 95 80-85 1-2 CK2-MB 2-3 15-20 1 CK1-BB 1-2 1-2 90 El hallazgo de un nivel elevado de CK total puede deberse al aumento de cualquiera de las fracciones indicadas. Es importante remarcar que traumatismos, ejercicios musculares intensos o inyecciones intramusculares pueden producir el aumento de CK total. En este caso se trata de un aumento a expensas de la fracción MM. La determinación de la isoenzima cardiaca CK (CK-MB) presente en el suero permite diferencias entre un infarto de de miocardio y lesiones de la musculatura esquelética. La determinación de la isoenzima se realiza por inmunoinhibición: se preincuba la muestra con anticuerpos específicos que reconocen a la subunidad B. La unión del anticuerpo a

la sub-unidad B inhibe la actividad de esta isoenzima. Luego se realiza la determinación de la actividad remanente. 3- Mapas enzimáticos: La utilidad de determinar un mapa enzimático reside no tanto en conocer el valor absoluto de la actividad de enzimas investigadas sino en considerar sus valores en términos relativos. Así, un cociente GPT/GOT mayor que uno es altamente indicativo de una lesión hepática; en el caso inverso (cociente menor que uno) es más probable un infarto de miocardio. Es importante remarcar que las conclusiones obtenidas a partir de la medición de un mapa enzimático deben corroborarse con los síntomas clínicos del paciente. Cuestionario de enzimas séricas. 1 - ¿Qué entiende por enzimas séricas? ¿Cuál es su origen? ¿Por qué se encuentran en circulación? 2- ¿Cómo influye el peso molecular y la localización intracelular de una enzima que se encuentra aumentada en plasma? 3 – ¿Cuáles son las enzimas de origen hepático qué aumentaran en el plasma en: a- proceso inflamatorio agudo? b- daño celular grave? c –necrosis celular? 4. - ¿Qué importancia tiene la interpretación de sus variaciones la vida media de una enzima sérica? 5 - ¿Qué es una enzima órgano específica y para que sirve su determinación en suero? ¿Qué es un mapa enzimático? 6.- Una determinación aislada de enzima sérica ¿tiene valor diagnóstico? 7. - ¿Cuáles son las transaminasas más comunes dosadas? ¿Por qué?¿ Qué reacción catalizan? 8 - ¿Qué reacción catalizan la láctico deshidrogenasa (LDH)? ¿Cuántas isoenzimas conoce? ¿En qué se diferencia una de la otra y en qué órgano predominan? CASOS CLÍNICOS CASO 1: Una mujer de 22 años de edad fue ingresad en el hospital por presentar nauseas, vómitos, fiebre y dolor abdominal. Expresó que se encontraba bien hasta 3 días antes de su hospitalización cuando se presentaron los síntomas en forma repentina. La paciente confesó que ingería habitualmente grandes cantidades de alcohol y que durante las dos semanas precedentes había bebido más de lo usual. Además, informó que su novio había sido hospitalizado recientemente por hepatitis. Se sospechó hepatitis aguda infecciosa. Sin embargo, el examen físico de la paciente no puso de manifiesto ictericia y la muestra de orina era de color normal. Las pruebas de laboratorio revelaron los siguientes datos. Bilirrubina plasmática tota: 0,8 mg/dl (valores normales hasta 1 mg/dl) ASAT: 35 UI/ml (valor normal hasta 20 UI/ml) ALAT: 30 UI/ml (valor normal hasta 20 UI/ml) LDH: 110 UI/ml (valor normal hasta 120 UI/ml)

Amilasa sérica 900 UI/ml (valor normal hasta 200 UI/ml) Lipasa sérica: 400 UI/ml (valor normal hasta 200 UI/ml) a - ¿Por qué los valores obtenidos para las actividades enzimáticas séricas no apoyan el diagnóstico inicial de hepatitis infecciosa aguda? b.- ¿Por qué la elevación de la amilasa sérica sugiere un diagnóstico alternativo de pancreatitis aguda? c - ¿Cuál es el mecanismo que explica la elevación de los niveles enzimáticos en una enfermedad como la hepatitis? d. . ¿de qué forma el dato correspondiente a la concentración inicial normal de bilirrubina plasmática ayuda en este caso a establecer el diagnóstico?

CASO 2: Un varón de mediana edad, obeso, fue conducido a un servicio de urgencia por un agente de policía, que refirió que el paciente se había envuelto en un accidente de tránsito. Parecía haber sufrido un desvanecimiento y había causado un choque de automóviles. El paciento explicó que justamente antes de producirse el choque respiraba entrecortadamente y se encontraba mareado. La exploración del individuo hizo sospechar de un accidente vascular cerebral o un infarto de miocardio. El paciente fue ingresado para su observación y se extrajo una muestra de sangre para la determinación de CPK (creatina fosfoquinasa)

a- ¿En qué tejidos puede encontrarse CK y a partir de cuales se libera con facilidad a la circulación sanguínea?

b- ¿Debe esperarse un aumento de actividad sérica plasmática de CK tras un accidente vascular cerebral?

c- Un aumento de la actividad CK, ¿Podría ayudar a distinguir entre una lesión de origen cerebral y una de origen cardíaco?