Enzimología 1.ppt [Modo de compatibilidad] · 2013-04-10 · Michaelis y Menten describen la...
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Cinética química
Clasificación de la reacciones químicasq
Número de molec. que reaccionan: Cinética:
• monomoleculares• bimoleculares• trimoleculares
• orden 0• primer orden• segundo orden• trimoleculares
• …• segundo orden• tercer orden
1er orden: la velocidad es proporcional a la concentración d ide reactivo
A B
[A]0
dA [A]
[ ]0
tkdtdAv *=−=
[A][A]02
tt tt2
tkAA *
30321
][][log −=A 303.2][ 0
pend = -kln [A]ln [A]
tt
2do orden: la velocidad es proporcional al producto de la concentración de 2 reactivos (o a la segunda
i d d ll )potencia de uno de ellos)
A + B P
][dA ][dB ][dP dA][][][
dtdAv −=
][][
dtdB
−=][][
dtdP
+= [ ][ ]BAkdtdA
=−][][
2 A P
[ ]2][][ Ak
dtdA
=−][dt
Las reacciones químicas deben salvar barreras energéticaspara transcurrir. Los catalizadores aceleran la velocidad de rx.
nerg
ía
Ea
E
A´Ea
B ΔG
Coordenada de reacciónCoordenada de reacción
Equilibrio químico
A + B C + D
[ ][ ][ ][ ][ ][ ]BA
DCRTlnG ΔG 0 +Δ= [ ][ ]BA
[ ][ ]DC[ ][ ][ ][ ]BA
DCKeq =
En el equilibrio cuando ΔG = 0En el equilibrio, cuando ΔG = 0
ΔG° = -2,3 RT log Keqg q
Si A + B C + D
Entonces en el equil. [C]*[D] > [A][B]
G° 0y ΔG° < 0
Si A + B C + DSi A + B C + D
Entonces en el equil. [C]*[D] < [A][B]q [ ] [ ] [ ][ ]
y ΔG° > 0
Enzimas
Son catalizadores biológicos
Permiten que ocurran reacciones químicas dentro de los organismosg
Son en su mayoría proteínas pero también hay i d ARNenzimas de ARN
No afectan ΔG° ni la cte de equilibrioNo afectan ΔG ni la cte. de equilibrio
Son altamente específicas
Se denominan por la reacción catalizada más el fijsufijo asa
Línea del tiempo en el estudio de enzimasenzimas
• Fines siglo 17, ppios del 18: digestion de carne por jugo gástrico,Fines siglo 17, ppios del 18: digestion de carne por jugo gástrico, digestión de almidón a azúcares por saliva
• 1858: Pasteur habla de la fermentación como un principio vital• 1877: Kühne acuña el término enzima (de ενζυμον “en la levadura”)• 1877: Kühne acuña el término enzima (de ενζυμον, en la levadura )• 1897: Buchner* publica su trabajo sobre enzimas en extractos de
levaduras muertas (zimasa).1912 Mi h li M t d ib l ió d l id d• 1912. Michaelis y Menten describen la ecuación de velocidad para reacciones catalizadas enzimáticamente
• 1926. Sumner* muestra que la ureasa es una proteína y la cristaliza• 1930: Northrop* y Stanley* confirman esto con sus trabajos en
pepsina, tripsina y quimotripsina• 1965. Phillips y col. cristalizan y resuelven la estructura de la lisozima1965. Phillips y col. cristalizan y resuelven la estructura de la lisozima
por difracción de rayos X• 1982. Cech* y Altman* descubren las ribozimas.
* Recibieron el Premio Nobel por sus trabajos
Aplicaciones de las enzimasp
• Alimentación:amilasas (prod de azúcares de almidón)amilasas (prod. de azúcares de almidón)fermentaciones Proteasas: comida infantil, reducción de turbidez en cervezascelulasas y pectinasas (clarificantes)Renina: prod de quesoRenina: prod. de queso
Aplicaciones de las enzimasp
• Industria del papel: amilasas, celulasas y ligninasas
• Biocombustibles: ligninasas, celulasas, lipasas• Jabones de lavar: proteasas, amilasas, lipasasJabones de lavar: proteasas, amilasas, lipasas• Biología molecular: enz. de restricción, ligasas,
etcetc.• Múltiples reacciones en la industria
farmacéuticafarmacéutica.
Clasificación EC
consta de 4 elementos, por ejemplo 2.7.1.11
Primer elemento: clase
1.oxidorreductasas2 t f2.transferasas3.hidrolasas
4.liasas5.isomerasas
6.ligasas
Segundo elemento: subclaseSegundo elemento: subclase
Tercer elemento: sub subclaseTercer elemento: sub subclase
C t l t ° d i d t d lCuarto elemento: n° de serie dentro de la sub subclase
2.7.1.562.7.1.56Fosfofructokinasa
Fru6P + ATP Fru1,6bisP + ADP
2.7.1.90
Fru6P + PPi Fru1,6bisP + Pi
Fosfofructokinasa dep. de PPi oF t 6P i f f t 1 f f t fFructosa 6P, pirofosfato 1-fosfo transferasa
¿Como se mide la cantidad de enzima?
Actividad enzimática
Unidad internacional (UI o U)
Cantidad de ez. que causa la qtransformación de 1 µmol de
sustrato por minuto en condicionessustrato por minuto, en condiciones óptimas de medida
UI: µmol/min
Act. Específica: µmol/min*mg prot
N° de recambio o act molar: s-1N de recambio o act. molar: s
CEC: katal o catalUnidades: mol * s-1, mol*s-1*kg-1Unidades: mol s , mol s kg
¿Cómo se puede seguir una reacción catali adareacción catalizada enzimáticamente?enzimáticamente?
A BMedida directa A BSe puede medir abs, rotación óptica, luminiscencia, fluorescencia, producción o consumo de CO2, O2, etc.
A B + C DA B + C DMediante reacciónacoplada
B + NADH C + NAD+
EjemplosPiruvato kinasa
Piruvato + ADP PEP + ATP
Piruvato kinasa
PEP + HCO3- OAA + Pi
OAA + NADH malato + NAD+
Piruvato + ADP PEP + ATPluciferina + ATP luciferil adenilato + PPiluciferil adenylate + O2 oxiluciferina + AMP + luz
Glucosa oxidasa
Glucosa + O2 + H2O ác. glucónico + H2O22 H2O2 + 4-aminophenazona + 4-OH benzoato quinonimina
(roja)(roja)
Cinética enzimática
Leonor Michaelis – Maud Menten(1879-1949) - (1879-1960)
Sacarosa Glc + Fru+66 5° -22°66.5 22
4000
3500
4000
vida
d 2500
3000
Act
iv
1500
2000
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500500
1000
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
[Sacarosa] (mM)
AA
BB
Modelo de M y M:Aproximación al equilibrio
S P
k+1 k+2 k+3E + S ∏ ES ∏ EP ∏ E + P (1)
k k kk-1 k-2 k-3
k+1 kpE S ES E P (2)E + S ∏ ES E + P (2)
k-1
k+1 kppE + S ∏ ES E + P (2)
k-1
Si k+1 y k-1 >> kp
Se tienen condiciones de equilibrio químico
v = kp [ES] (3)
[E]t = [E] + [ES] (4)[ ]t [ ] [ ] ( )
[ ]ESkv p
[ ][ ]
[ ] [ ]ESEEp
t += (5)
[ ][ ] [ ]SkSE v = k [E][S](6)
[ ][ ][ ] [ ] [ ][ ]E
KSES
kk
ESSEK
s1
1s =∴==
+
−v+1 = k+1 [E][S]yv-1 = k-1 [ES][ ]
[ ]S
(7)
[ ][ ]EKSkv s
p(7)[ ] [ ] [ ][ ]E
KSE
KE
s
t +=
Ks
[ ]S
[ ] [ ]s
t S1K
Ekpv
+= (8)[ ] [ ]
s
t
K1Ekp +
[ ]sK
Svkp [E]t = Vmax
(9)[ ]s
s
max
KS1
KV
v
+=
sK
[ ] (10)[ ][ ]SK
SV
vsmax +
= [ ]SKV smax +
Ecuación de Michaelis Menten
[ ] VSv max*= [ ]SK
vs +
=
Aproximación al estado estacionario (Briggs y Haldane)
k+1 kk+1 kpE + S ∏ ES E + P (2)
k-1
Si k+1 y k-1 son de la misma magnitud k t NO tique kp entonces NO se tienen
condiciones de equilibrio químico
k+1 kppE + S ∏ ES E + P (2)
k-1
v = kp [ES] (3)
[ ]ESkv p
[ ][ ]
[ ] [ ]ESEEp
t += (5)
R ió d f ióReacción de formación
k 1k+1 E + S ES (12)
Reacciones de descomposiciónkk-1
ES E + S (13)
ykpp
ES E + P (14)
vf = k+1 [E][S] (15)
vd = k-1 [ES] + kp [ES] (16)
= (k-1 + kp)[ES]( -1 p)[ ]
[ ] 0ES∂[ ] 0t
=∂
k+1 [E][S] = (k-1 + kp)[ES] (17)
[E][S]k 1[ ])k(k
[E][S]kESp1
1
+=
−
+(18)
1k1 + p1 kkK − +p1m kkK +
=− 1
mk
K+
= (19)
[ ] [E][S]ES =[ ]mK
ES =
[ ](5)
[ ]ESkv p=
[ ][ ]EKSkv s
p= (20)(5)[ ] [ ] [ ]ESEE t +
=[ ] [ ] [ ][ ]E
KSEE
s
t += (20)
Ks
[ ] VSv max*= [ ]SK
vm +
=
Determinación de Km y VMAX
Transformación de Lineweaver y BurkeTransformación de Lineweaver y Burke
[ ][ ] [ ]S
1VK
VSVKS
v1 mm *1
*+=
+= [ ] [ ]SVVSVv maxmaxmax *
1/v
1/V1/Vmaxpendiente: Km/Vmax
1/[S]1/[S]-1/Km
Transformación de Eadie-HofsteeTransformación de Eadie Hofstee
v
Vmax
pendiente: -Km
Vmax/Km
v/[S]
Transformación de Woolf y Hanesy
[S]/v[ ] [ ] mKSS 1[ ] [ ]max
m
max VKS
VvS
+=1
Km/VmaxKm/Vmax-Km
[S]
Sitio activo
SModelo de llave y cerradura
de Fischer
S
Enzima Enzima
Modelo de ajuste inducido de Koshlandj
Especificidad y eficiencia catalítica: el caso de la PEP Pasa
Sustrato Vmax(U/mg)
Km(mM)
Constante de especificidad(V /K )(Vmax/Km)
PEP 380 0.05 7600pNPP 1193 0.57 2093ATP 452 0.50 904ADP 714 0.74 964Glc1P 304 0.24 12676PGluconato 452 0.59 766Glc6P 80 2.01 40
Especificidad: los residuos del sitio activo determinan la eficiencia catalítica
Enzima/Sustrato Vmax(U/ )
Km( M)
Constante de ifi id d(U/mg) (mM) especificidad
(Vmax/Km)M til l tMetilmalonatoWT 2.44 0.12 21T207S 2.13 0.06 35.5M306I 2.05 0.44 4.7EtilmalonatoWT 0.61 1.12 0.54T207S 6.11 0.14 43.6M306I 4.91 0.17 29