EPIGENÈTICA · - 3 - PRESENTACIÓ L’objectiu d’aquests treball de recerca és introduir el...
54
- 1 - EPIGENÈTICA MÉS QUE GENÈTICA, UN ALTRE FACTOR QUE ENS DETERMINA. NÚRIA PEÑUELAS PEÑARROYA Tutor: Jesús Pedrós 12 de gener 2012
Transcript of EPIGENÈTICA · - 3 - PRESENTACIÓ L’objectiu d’aquests treball de recerca és introduir el...
- 1 -
EPIGENÈTICA MÉS QUE GENÈTICA, UN ALTRE FACTOR QUE ENS DETERMINA.
NÚRIA PEÑUELAS PEÑARROYA Tutor: Jesús Pedrós
12 de gener 2012
- 2 -
ÍNDEX
-PRESENTACIÓ..................................................................................................2
-EPIGENÈTICA...................................................................................................3
- Definició...................................................................................................3
- Mecanismes epigenètics............................................................................4
-ESTUDI EXPERIMENTAL.............................................................................12
- Introducció..............................................................................................12
- Material i instrumentació........................................................................15
- Mètodes...................................................................................................20
- Resultats..................................................................................................40
- Discussió.................................................................................................47
-AGRAÏMENTS.................................................................................................49
-BIBLIOGRAFIA...............................................................................................50
- 3 -
PRESENTACIÓ
L’objectiu d’aquests treball de recerca és introduir el tema de l’epigenètica, descriure
els mecanismes epigenètics i investigar sobre un d’aquests, la metilació del DNA, per a
determinar si aquest influeix en l’envelliment dels arbres.
Primer de tot vaig documentar-me sobre aquesta nova ciència llegint molts articles
científics sobre l’epigenètica, un tema que està constantment en desenvolupament, i per
tant, es troba abastament a la literatura científica. D’aquesta manera, vaig poder
descriure les característiques generals dels mecanismes epigenètics.
A més a més, per poder avançar sobre el tema, vaig decidir dur a terme un estudi
experimental sobre la taxa de metilacions en el DNA dels arbres segons la seva edat.
Vaig realitzar aquesta experiència amb l’assessorament de la investigadora del CREAF
(Centre de Recerca Ecològica i Aplicacions Forestals) Laura Rico, així com també
utilitzant les seves instal·lacions i materials.
D’aquesta manera el treball ha quedat dividit en dos blocs principals. El primer
correspon a l’estudi bibliogràfic, on s’explica el terme d’epigenètica, quins són els
mecanismes epigenètics, la seva possible herència i les seves implicacions. En el segon
bloc, es realitza un estudi d’un d’aquests mecanismes en concret i s’identifica la seva
relació amb l’edat d’individus de Pinus syilvestris, el pi roig. Finalment es fa una
síntesis dels resultats, tot relacionant els mecanismes epigenètics amb el
desenvolupament foliar i l’edat.
- 4 -
EPIGENÈTICA
Fins fa pocs anys es creia que els éssers vius únicament estaven determinats pel seu
DNA heretat dels seus dos progenitors. No obstant això, recentment, s’han dut a terme
diversos estudis en que es posa de manifest la existència d’uns mecanismes, anomenats
epigenètics, que s’adquireixen durant la vida dels organismes mitjançant una sèrie de
circumstàncies determinades. Aquests mecanismes no modifiquen els gens en si, però si
que n’alteren la seva expressió. Per tant, estem parlant, d’unes modificacions que
permetran a l’individu tenir unes característiques o unes altres, o el que és el mateix, ser
d’una manera o d’una altra. Això ens porta a pensar que no només som els nostres gens,
sinó també el tipus de vida que portem. La epigenètica, doncs, és la branca de la
biologia que estudia aquests fenòmens i les seves implicacions.
Definició
El terme “epigenètica” introduït per Conrad Hal Waddington l’any 1939 (1), sorgeix de
la combinació del prefix grec “epi”, literalment traduït per “sobre” i genètica, que prové
del mateix idioma i significa descendència. Aquest terme, doncs, expressa la interacció
entre l’ambient i la informació genètica dels individus.
La ciència de l’epigenètica fa referència a l’estudi de les alteracions del DNA que no
interfereixen en la seva seqüència de parells de bases, descrites per Watson i Crick (2),
però si que ho fan en la seva expressió. Es a dir, aquestes variacions, no afecten a la
seqüència continguda en el material genètic, però sí que modulen la expressió gènica a
través de determinats mecanismes. Això implica l’expressió selectiva de gens
determinats de manera que es modifica la influencia d’aquests gens en el comportament
de les cèl·lules (3). Això s’explica amb el fet que els gens són els encarregats de
codificar proteïnes, les quals després desenvolupen una determinada funció en
l’organisme. Per tant, si el gen no s’expressa, aquesta proteïna no es sintetitza, i com a
conseqüència, hi ha una modificació més o menys important en el funcionament de les
cèl·lules de l’individu en qüestió.
- 5 -
Mecanismes epigenètics
Aquests mecanismes són un tema d’actualitat en el món de la ciència, de fet,
constantment s’estan fent nombrosos estudis en referència a la manera en que apareixen,
quan i perquè ho fan, quina és la seva funció i si aquests fenòmens influeixen en la
descendència, cosa que encara s’està investigant. En són un exemple, els estudis
referents a bessons, que, considerant aquests com a grup idoni per abordar l’estudi de
malalties hereditàries, poden revelar el tipus d’herència de certs mecanismes epigenètics
(4). D’altra banda, la relació entre la epigenètica i el càncer està sent estudiada per molts
investigadors arreu del món i sembla ser que els mecanismes epigenètics tenen un paper
important en el desenvolupament del càncer. Per exemple, A. Qureshi i Mark F. Mehler,
consideren que hi ha una estreta relació entre la presència de mecanismes epigenètics i
la aparició de tumors al sistema nerviós. Tanmateix, recalquen que cal avançar més en
els coneixements sobre aquesta disciplina recent per tal de millorar els diagnòstics i
l’eficàcia dels tractaments d’aquest tipus de càncer (5). També cal esmentar la relació
que existeix entre l’estat de metilació dels gens, un mecanisme epigenètic freqüent, i els
agents externs, com són el tabac, l’alcohol, una dieta vegeteriana, etc. i que aquesta
proporció de DNA metilat pot derivar en càncer d’esòfag (6).
Aquests mecanismes epigenètics són molt diversos i sobretot molt complexes i alhora
impliquen diferents processos en diferents sistemes. Els més coneguts i estudiats són la
modifició d’histones, la metilació del DNA i els RNA no codificants.
1. Modificació d’histones
Les histones són proteïnes complexes sobre les quals s’enrotlla la cadena de DNA
empaquetat o fibra de cromatina (Figura:1), formant el conjunt anomenat nucleosoma.
El nucleosoma doncs, és la unitat estructural de la cromatina format per un octàmer
d’histones (7). (Fig.:2 )
- 6 -
Figura 1. Formació de la cromatina Figura 2. Nucleosoma (format per histones
(DNA empaquetat) i cromatina o DNA empaquetat)
Per tal de dur a terme els processos d’expressió, reparació i replicació genètica, el grau
d’empaquetament del DNA s’ha de poder modificar. És per això que les histones són
susceptibles a patir transformacions químiques que augmenten o disminueixen la seva
afinitat pel DNA.
En són un exemple l’acetilació i la fosforilització d’histones. Aquetes modificacions
químiques neutralitzen la càrrega positiva de les histones i per tant, disminueixen la
afinitat d’aquestes proteïnes pel DNA, una molècula de carrega negativa (8). Com a
resultat d’aquesta disminució d’afinitat, els nucleosomes es relaxen i s’obren (Fig. 3),
deixant pas als mecanismes de transcripció (Fig. 4) (3).
- 7 -
Figura 3. Relaxació dels nucleosomes gràcies als grups acetil que neutralitzen la
carrega positiva de les histones.
Figura 4. Si els nucleosomes estan relaxats, el DNA queda lliure per tal de ser
transcrit.
Les histones acetilades i fosforilades s’associen a un estat transcripcionalment actiu de
la cromatina, ja que en permeten l’obertura, en canvi, les histones que no presentin
aquests grups, no permetran l’obertura del nucleosoma i amb això, impediran la
transcripció del material genètic que s’hi enrotlla. (Fig. 5)
- 8 -
Figura 5. Histones no acetiladesTranscripció inactiva.
Aquests processos són considerats epigenètics ja que no interfereixen en els components
que constitueixen el DNA, però sí que modifiquen aspectes externs a les cadenes de
nucleòtids, com en aquest cas és el grau d’empaquetament.
2. Metilació del DNA
La metilació del DNA és potser, la modificació epigenètica més estudiada i
generalitzada. Aquesta, juga un paper important en la regulació de l’expressió genètica
(9).
La metilació del DNA en cèl·lules eucariotes, consisteix en la adició d’un grup metil
(Fig. 6) al carboni situat en posició 5 de la citosina, una de les bases nitrogenades que
constitueixen els nucleòtids del DNA (Fig. 7). Aquesta reacció està catalitzada, o és
duta a terme, per l’enzim DNA metil transferassa (DNA-MTase) i és la més freqüent en
el DNA eucariota (10).
Figura 6. Grup metil.
- 9 -
Figura 7. Citosina amb un grup metil al carboni 5.
En la majoria dels estudis, l’increment en la metilació del DNA està associat al
silenciament genètic i la disminució de la metilació a la activació de la transcripció (3).
Com a conseqüència de la combinació d’aquests dos darrers processos epigenètics, la
metilació del DNA i la modificació d’histones, apareix la repressió transcripcional
estable d’un gen, es a dir, el gen queda totalment privat de la seva transcripció, ja que
presenta el seu DNA metilat i les seves histones desacetilades. (Fig. 8 i 9)
Figura 8. 1- DNA no metilat (transcripcionalment actiu) 2- DNA metilat
(transcripcionalment inactiu) 3-DNA metilat i histones desacetilades (inactivació
estable del gen)
- 10 -
Figura 9. A- Procés de silenciament. B- Característiques dels gens actius i dels
inactius.
No obstant això, s’ha de tenir en compte que aquesta actuació conjunta no sembla ser
vàlida en invertebrats. De fet, evidències estructurals i funcionals demostren que la
modificació d’histones i de DNA no interfereix en l’expressió del genoma d’aquest gran
grup d’animals (11).
3. RNA no codificants
També poden ser esmentats com a mecanismes epigenètics els silenciaments
transcripcionals generats per les unions de fragments llargs de RNAs no codificants al
lloc de transcripció del DNA. Aquestes unions impedeixen l’agregació de la RNA-
polimerasa, l’enzim necessari per a la transcripció dels gens. D’aquesta manera el gen
no es pot transcriure i per tant, es manté inactiu. Aquests fragments, fins i tot, són
capaços d’inactivar cromosomes sencers. Segons Jannie T. Lee aquest mecanisme basat
en RNA no codificants pot arribar a ser el regulador epigenètic més important (12).
- 11 -
Aquest tipus de mecanisme epigenètic juga un paper molt important en un procés bàsic
pel funcionament intern del nostre cos, perquè intervé en la inactivació del cromosoma
X dels mamífers (13).
Per tal d’explicar aquest exemple, primer de tot, és necessari recordar que en els
mamífers el sexe ve determinat per un parell de cromosomes heteromorfs coneguts com
a cromosoma X i cromosoma Y. Les femelles presenten dos cromosomes X (XX) un
d’origen patern i l’altre d’origen matern, i els mascles presenten un cromosoma X i un
cromosoma Y(XY), d’origen matern i patern respectivament. Per tant, en el cas de les
dones es disposa de dos cromosomes iguals, és a dir, dues fonts d’informació idèntiques
per a les mateixes proteïnes. Una conseqüència d’això seria que les femelles tinguessin
el doble de la quantitat normal de determinades proteïnes, ja que totes les proteïnes que
són presents al nostre cos i que duen a terme funcions essencials són codificades pels
gens. Això no succeeix degut a un procés de silenciament transcripcional d’un dels dos
cromosomes X en les femelles dels mamífers (14).
Aquest procés és aleatori, es a dir, la inactivació és pot donar tan en el cromosoma
patern com en el matern, i varia en cada cèl·lula de l’embrió (15). Es du a terme en les
primeres etapes del desenvolupament embrionari de les femelles, aproximadament
durant la implantació, i es estable durant el desenvolupament posterior (14).
Tal com suggereixen Hendrik Marks et al. aquest procés es realitza amb la intervenció
d’un RNA no codificant, considerat un mecanisme epigenètic, anomenat XIST (X
inactive-specific transcripts o transcrits inespecifics del X inactiu) (16).
Resumint, existeix una gran varietat de mecanismes epigenètics molt diferents i variats,
ja que un mecanisme epigenètic és qualsevol procés que pugui interferir en l’expressió
dels gens sense modificar-ne els àcids nucleics que els constitueixen, i per tant poden
ser molt nombrosos i diferents entre si. D’alguns d’aquests, encara no se n’ha fet un
estudi rigorós i conseqüentment no es poden establir les seves característiques.
- 12 -
Herència epigenètica
Pel que fa a l’herència d’aquests mecanismes, encara és un tema poc conegut, tot i que
molt estudiat. Actualment se sap que en el cas de les plantes i els fongs, aquests
mecanismes d’alguna manera influeixen en la descendència. Això significa que aquests
dos regnes d’éssers vius depenen tan dels seus gens com del tipus de vida que van
portar els seus progenitors, el qual queda gravat en forma de mecanismes epigenètics
que passen d’una generació a una altra (17).
Respecte als mamífers, la herència epigenètica no està clara. En alguns estudis realitzats
es mostren evidències que indiquen que aquest tipus d’herència pot ser possible. Per
exemple, en l’estudi que Hugh D. Morgan et al. realitzen sobre una població de ratolins
demostren que el color d’aquests animals depèn d’una modificació epigenètica del DNA
dels progenitors (18). Cal destacar també la relació que s’estableix entre herència
epigenètica i la diabetis en humans. Aquesta malaltia, que no permet la incorporació de
glucosa en l’organisme, apareix com a conseqüència de les marques epigenètiques que
es produeixen en el DNA de l’embrió durant el temps de l’embaràs (17). Així mateix,
s’estan duent a terme molts estudis sobre aquest tema que permeten explorar algunes de
les conseqüències d’aquesta suposada herència epigenètica en animals i plantes (19),
(20).
Aquests nous avenços en el coneixement de l’herència epigenètica suposarien que les
característiques adquirides durant la vida mitjançant mecanismes epigenètics, sí que es
transmetrien de generació en generació. Això és justament el que afirmava Jean-
Baptiste Lamarck en la seva teoria de l’ús i el desús dels òrgans que ha estat
considerada totalment errònia durant molt de temps. Tot i que aquests nous
descobriments no suporten el concepte general de Lamarck, sí que obren la possibilitat
de que factors externs al material genètic, puguin jugar un paper importantíssim en
l’evolució dels organismes (21). Així doncs, la teoria de Lamarck pot ser considerada,
juntament amb la de Darwin per tal d’explicar l’evolució: herència genètica i
epigenètica (22).
- 13 -
ESTUDI EXPERIMENTAL
Existeix una relació entre la taxa de metilacions i l’edat dels arbres, entre els
mecanismes epigenètics i l’envelliment?
1. INTRODUCCIÓ
Com he explicat anteriorment, l’epigenètica és un camp molt recent en la història de la
ciència. Per aquesta raó no s’han fet encara tants estudis epigenètics com en altres
camps de la ciència molt més estudiats com la genètica mateixa, i per tant encara hi ha
molts enigmes per desxifrar. Actualment s’està fent molta investigació i recerca sobre el
tema per tal de descobrir i conèixer com funcionen realment aquests mecanismes
epigenètics, i quines són les seves causes i conseqüències.
Fins ara, es coneix que aquests mecanismes modifiquen, tant activant com inactivant,
l’expressió dels gens i per tant l’estructura i el funcionament de l’organisme ja que
aquest presentarà o no unes determinades proteïnes. El que no es coneix encara del tot,
és quan i perquè apareixen aquests mecanismes.
L’epigenètica pot adquirir un paper fonamental en ecologia, una ciència que fins ara,
gairebé no l’ha tingut en compte. S’han dut a terme estudis que indiquen que en alguns
casos, els canvis epigenètics induïts durant la vida d’un organisme, per exemple, d’una
planta poden ser heretats per les generacions futures. Això implica millorar els
coneixements dels mecanismes que modifiquen el fenotip de les plantes, i entendre’ls
com a resposta a les modificacions ambientals (23).
La existència d’aquests mecanismes epigenètics queda clara al llarg de la vida d’un
ésser humà atès que s’acumula normalment per terme mig 1 mutació per cada 100.000
parells de bases en la seqüència del DNA, una freqüència insuficient per explicar les
àmplies disfuncions cel·lulars que pateixen les persones quan envelleixen. Així doncs,
és evident que existeixen altres fenòmens a part de les mutacions de bases de DNA que
- 14 -
contribueixin a l’envelliment (3). En canvi, l’envelliment en altres organisme com ara
les plantes perennes sempre s’ha plantejat com un enigma en el món de l’ecologia, ja
que en alguns estudis es considera la possibilitat que aquests vegetals no envelleixin
mai, si més no, els seus meristems (teixits no diferenciats). Es creu que les probabilitats
de morir a causa d’agents externs que les perjudiquen, com són l’activitat humana o els
mateixos factors ambientals (sequeres, focs, plagues,...), són molt més altes que no pas
les de morir pel simple deteriorament associat a l’edat de l’arbre (24). Per tant, és
imprescindible conèixer millor els mecanismes que desencadenen l’envelliment en les
plantes perennes per arribar a fer afirmacions que podrien ser de gran importància i
impacte en tot el món de la ciència en general. De fet els fenòmens associats a
l’envelliment dels organismes constitueixen un dels objectes d’estudi cabdals en
ciència.
Per tal d’avançar en aquest camp, vaig plantejar-me dur a terme un treball experimental
que ens permetés conèixer quan apareixen els mecanismes epigenètics en els arbres i si
van lligats al seu envelliment. Paral·lelament tenia com objectiu analitzar parts del
genoma d’un organisme, cosa que fa poques dècades, abans del descobriment de la PCR
al 1993, no es podia ni imaginar (25).
Per assolir aquests objectius i conèixer les característiques d’alguns d’aquests fenòmens
epigenètics, vaig aprofitar una recerca que duien a terme al centre d’investigació del
CREAF (Centre de Recerca Ecològica i Aplicacions Forestals) sobre els canvis
fisiològics i bioquímics que succeeixen a mesura que els arbres de pi roig (Pinus
sylvestris) envelleixen. En aquest estudi vaig afegir l’objectiu d’esbrinar si existeix una
relació significativa entre el percentatge de metilació del DNA i l’edat dels arbres, i
d’altra banda si varia el percentatge de metilació segons l’edat de la fulla, es a dir,
depenent de si es tracta d’una fulla jove o d’una fulla madura del mateix arbre.
L’experiència, doncs, consistia en analitzar el DNA de les fulles joves i les fulles
madures d’arbres de diferents edats. D’aquesta manera preteníem esbrinar els canvis
epigenètics lligats, per una banda, al desenvolupament de la fulla i, per l’altra, a
l’envelliment progressiu de l’arbre.
A més a més, com en tot experiment científic rigorós, vaig haver de documentar-me per
tal de comprovar que no s’havia fet cap estudi igual al que pretenia fer. I el més
- 15 -
important, aprendre d’altres estudis anteriors, similars a aquest tema, i extreure’n els
coneixements necessaris per dur a terme el meu. Especialment, en vaig trobar un de
molt semblant que em va donar molta informació sobre els procediments adequats per
dur a terme estudis epigenètics d’aquest tipus (26).
Amb tot això, els objectius proposats varen ser els següents:
- Primer de tot, comprovar si existeixen aquests mecanismes epigenètics, en
concret, la metilació del DNA.
- Esbrinar si existeix una diferència notable entre individus de diferents edats en
relació al percentatge de metilacions que presenten i si presenten una pauta
significativa.
- Mostrar, a més a més, si durant el desenvolupament foliar, des de la fulla jove a
la fulla madura, també es produeixen canvis en les metilacions del DNA, i si
aquests canvis són significatius.
- I per últim, si existeixen aquestes relacions, caracteritzar-les i suggerir quines
implicacions poden tenir.
Les hipòtesis de les que partia eren que els exemplars tindrien un cert percentatge de
metilacions en els seus genomes i que els individus d’edats majors presentarien un
percentatge més alt que els de menor edat, ja que són mecanismes que es van acumulant
al llarg de la vida d’un ésser viu i que per tant, el més probable és trobar-ne més
quantitat en arbres vells que no pas en joves. Paral·lelament, en el cas del
desenvolupament foliar, la hipòtesis era que les fulles madures presentarien un nivell
més alt de metilacions que no pas les fulles joves.
Per tal d’assolir els objectius esmentats i verificar les hipòtesis anteriors, es van dur a
terme una sèrie de mètodes llargs i costosos, els quals explico detalladament a
continuació.
- 16 -
2. MATERIALS I INSTRUMENTACIÓ
2.1. Mostres
Per dur a terme aquesta investigació, es van utilitzar mostres de 27 exemplars de Pinus
sylvestris (Fig. 10), cadascun d’una edat determinada. Es van recollir fulles a la
primavera, és a dir, fulles joves, i a l’estiu es van tornar a agafar mostres dels mateixos
arbres, és a dir, fulles madures. Per tant, disposàvem de 27 mostres de fulles joves
d’arbres de diferents edats de Pinus sylvestris i a més, també disposàvem de 27 fulles
madures dels mateixos arbres.
Els arbres dels quals s’extreien les mostres havien de presentar unes característiques
molt especifiques: havien de presentar el mateix genotip i ser de tamanys similars, per
tal de que els nostres resultats depenguessin exclusivament de les diferències
epigenètiques. D’altra banda, era necessari disposar d’arbres d’un ampli rang d’edats,
dels quals no disposàvem en el centre del CREAF. Per aquesta raó varem utilitzar unes
mostres cedides per un centre que col·labora amb el CREAF a Edinburg (Escòcia).
Figura 10. Pinus sylvestris
L’especie Pinus sylvestris o també conegut vulgarment com a pi roig, pertany a la
familia de les pinàcies (27). Pot arribar a uns 35 o 40 metres d’alçada i als 500 o 600
anys d’edat en bones condicions ecològiques. En aquestes circumstàncies presenta un
- 17 -
tronc cilíndric amb una ramificació escassa, que queda reduïda a la part superior (Fig.
11) (28).
Figura 11. Pinus sylvestris.
2.2. Material de suport
- Gel d’agarosa
Per a preparar el gel, primer s’ha de pesar la quantitat necessària d’agarosa, (Fig. 12)
introduir-la en un erlenmeyer que conté aigua, i escalfar la mescla. Cal barrejant-la de
tant en tant per tal de diluir-la totalment i que quedi transparent (Fig.13).
Figura 12. Bàscula amb agarosa Figura 13. Diluint agarosa amb aigua en un
erlenmeyer.
- 18 -
Després, s’intrudueix bromur d’etidi a la solució, un compost que permet la visibilitat
del DNA en els raigs ultraviolats. D’aquesta manera quan s’hi introdueixi una mostra de
DNA en aquest gel, serà visible a la llum ultraviolada.
I per últim es diposita en un recipient en forma rectangular i es posen unes canyetes
perquè al solidificar-se el gel, quedin uns petits pous on posteriorment s’introdueix el
DNA que es vol analitzar (Fig. 14).
Figura 14. Gel d’agarosa líquid amb canyetes.
2.3. Maquinària de laboratori.
- Ultracentrifugadora o centrífuga.
Aparell que permet separar els components d’una mostra segons les seves densitats,
gràcies a la força centrífuga que exerceix l’aparell al rotar.
- 19 -
- Aparell d’electroforesi.
Aparell per dur a terme l’electroforesi, una tècnica que serveix per a separar molècules
segons la seva mobilitat en un camp elèctric, depenent de la seva massa i/o càrrega
elèctrica. Es pot realitzar sobre un suport sòlid de paper, una matriu porosa com és el gel
o bé en dissolució (electroforesis lliure).
- Visualitzador de gels amb radiació ultraviolada.
Instrument que permet la visió de molècules visibles a la llum ultraviolada com pot ser
el bromur d’etidi.
- Termociclador.
- 20 -
Aparell que permet dur a terme el procés de PCR amb una facilitat espectacular,
mitjançant uns programes que ja té estipulats.
- Balança.
Instrument de mesura per pesar mostres o productes.
- Vòrtex
Aparell que serveix per assegurar la homogeneïtat de les mescles o per a descongelar
mostres amb rapidesa gràcies l’escalfor produïda pel fregament que exerceix l’aparell.
- 21 -
- Autoclau
Sistema d’esterilització per assegurar l’esterilitat d’alguns aparells del laboratori,
mitjançant un recipient ple d’aigua a altes temperatures i alta pressió.
3. MÈTODES
3.1.Trituració de les mostres
Primer de tot, les fulles de pi roig es van haver de triturar per tal de tenir el material en
pols i facilitar l’extracció del DNA, que es troba dins els nuclis de les cèl·lules. Per tal
de trencar a petits trossets les fulles s’han de col·locar en uns eppendorfs i a cada un
posar-hi una petita boleta de tungstè (Fig. 15). Aleshores, aquests eppendorfs
s’introdueixen a un aparell especialitzat que sacseja bruscament les mostres, de manera
que la bola polvoritza les fulles fins al punt d’arribar a la màxima trituració.
Figura 15. Boles de tungsté
- 22 -
Aquest procés de trituració no el vaig poder fer al centre del CREAF, atès que per
realitzar aquesta tècnica es necessita una màquina especialitzada de la que no
disposàvem en aquest centre. De manera que vam haver d’anar a un centre veí, el
CRAG (Centre de Recerca en Agrigenòmica, Universitat Autònoma de Barcelona), on
ens van facilitar l’aparell adequat.
Pel que fa a les mostres, cal recordar que convé que sempre estiguin a una temperatura
molt baixa, per tal d’evitar alteracions vàries del DNA de les cèl·lules. Per aquesta raó
submergíem sovint els eppendorfs en nitrogen líquid per evitar l’escalfament que es
produeix durant la trituració.
Al veure que no s’aconseguien els resultats esperats vam haver d’augmentar el temps
de trituració, tanmateix, no vam aconseguir obtenir unes mostres totalment en pols. Així
doncs, vam haver d’utilitzar uns petits morters que ens van proporcionar al mateix
centre on érem, per tal de triturar-les a mà.
Tot i que les mostres no haurien de presentar teixits cel·lulars, sinó que haurien d’estar
totalment desestructurades, vam decidir començar el procés amb les mostres que
teníem, ja que per aquesta experiència es necessita poca quantitat de DNA.
3.2. Extracció del DNA de les mostres.
Una vegada triturades les mostres, havíem d’extreure’n el DNA, i per fer-ho, vam seguir
el protocol establert pel manual de QIAGEN (DNeasy Plant Handbook).
3.2.1 Lisació
Primer de tot, vaig afegir a les diferents mostres que teníem contingudes en eppendorfs
400 microlitres de buffer* AP1* i 4 microlitres de RNAasa A utilitzant micropipetes, i
vaig deixar-les reposar en aigua calenta a 65 graus centígrads durant aproximadament
10 minuts (Fig. 16). Durant aquests 10 minuts s’han d’anar removent les mostres a fi
d’aconseguir repartir millor la temperatura a tot arreu de la mostra i facilitar el procés.
- 23 -
Figura 16. Bany d’aigua a 65 graus
*Buffers: Dissolucions tamponadores que estabilitzen el pH en un valor determinat.
*AP1: Nom comercial. Molts buffers són fabricats en grans laboratoris que mantenen
secreta la seva composició.
Aquest procediment té com a objectiu lisar les cèl·lules, es a dir, dur a terme el
trencament de les membranes cel·lulars i d’aquesta manera facilitar l’accés al DNA, que
es troba al nucli de les cèl·lules.
3.2.2. Precipitació de proteïnes i polisacàrids
Després, s’han d’afegir 130 microlitres del buffer AP2 (Fig. 17) i deixar refredar les
mostres en gel durant 5 minuts.
Aquest pas té com a funció precipitar proteïnes i polisacàrids diversos que es troben a
l’interior de les cèl·lules. Amb això aconseguim despullar encara més el DNA, es a dir,
descartem tot el que conté la cèl·lula que no sigui el DNA, que és el que estem intentant
purificar.
- 24 -
Figura 17. Introduint el buffer AP2
Tot seguit, s’introdueixen els eppendorfs que contenen les fulles triturades i els buffers
acabats d’afegir a la centrífuga durant 5 minuts a 14.000 rpm (revolucions per minut).
Després de la centrifugació, amb una micropipeta s’extreu el líquid sobrenedant (Fig.
18) amb compte de no agafar la part de la mostra precipitada, ja que es tracta de teixits
no totalment triturats que cal descartar.
Figura 18. Mostres de les que disposem en aquest pas.
Aquest líquid conté membranes cel·lulars trencades i diverses estructures cel·lulars que
es trobaven a dins les cèl·lules, juntament amb els nuclis que contenen el DNA. Per tant
ara cal extreure el DNA d’aquesta mescla.
3.2.3. Purificació del DNA
A continuació, vaig afegir aquest líquid que conté el DNA i altres substàncies cel·lulars
a un eppendorf especial que té una membrana transversal amb afinitat per a diverses
estructures cel·lulars. (Fig. 19) D’aquesta manera quan l’eppendorf es posa a la
- 25 -
centrífuga (2 min a 14000 rpm) i la mescla es dirigeix al fons, aquesta membrana reté
els components que no ens interessen, i, en canvi, deixa passar tant el DNA com els
buffers que hi havíem posat prèviament.
Figura 19. Eppendorf amb membrana.
Aleshores calia agafar el líquid dipositat al fons amb compte de no recollir el dipòsit
conegut amb l’anglicisme àmpliament emprat de pellet, ja que es tracta de petits residus
de teixit que han aconseguit travessar la membrana transversal.
Aleshores, cal introduir aquest líquid, extret de la part inferior del eppendorf i lliure de
teixits i membranes cel·lulars, en un altre eppendorf en el qual s’hi afegeix un nou
buffer anomenat buffer AP3/E que conté etanol.
Al afegir aquest buffer amb etanol el DNA adquireix una textura fibrosa similar al
cabell d’àngel. Això és degut a que el DNA no és soluble en etanol i conseqüentment
- 26 -
les fibres de DNA, que en aigua es troben disperses, precipiten i es fan visibles (Fig.
20). Amb això, podem comprovar la presència de DNA en la mostra.
Figura 20. DNA en solució amb etanol.
Per continuar, vaig introduir aquest líquid que contenia diversos buffers, etanol i DNA,
en un nou eppendorf amb una membrana transversal que, contràriament a l’anterior,
presentava afinitat pel DNA. De manera que al abocar-hi el líquid i centrifugar-lo durant
1 minut a uns 8.000 rpm, el DNA que contenia el líquid es queda retingut a la
membrana del mig i totes les altres substàncies travessen la membrana i queden a baix
de tot de l’eppendorf (Fig. 21) .
Figura 21. Eppendorf amb membrana amb afinitat per al DNA
- 27 -
Tot i que el procediment establert que seguíem no ho indicava, vam considerar adient
repetir el procés per tal d’optimitzar la extracció del DNA, així que vam recollir la
mostres del fons de l’eppendorf i la vam introduir a la part superior per a tornar-la a
centrifugar (Fig. 22). D’aquesta manera ens asseguràvem de que tot el DNA quedava a
la membrana del mig i el líquid que hi havia a baix contenia exclusivament residus
sense interès.
Figura 22. Mostres a la centrífuga
Per acabar, seguint sempre el protocol de QIAGEN, cal netejar el DNA retingut a la
membrana de l’eppendorf amb 500 microlitres de buffer AW i centrifugar les mostres
durant 1 min. a 8000 rpm. Posteriorment s’afegeixen 500 microlitres més del buffer AW
i es centrifuga durant 2 minuts a 14.000 rpm. D’aquesta manera vam aconseguir la
purificació del DNA retingut a la membrana de l’eppendorf.
Finalment, vam afegir buffer AE, a fi d’eluir el DNA que estava retingut a la membrana
i junt amb el qual, quedaria la mostra d’ara en endavant.
3.4. Digestió amb els enzims HpaII i MspI
Una vegada purificat el DNA de les cèl·lules de Pinus sylvestris ha de ser digerit, es a
dir, trencat en loci (regions) determinats, mitjançant uns enzims específics que
reconeixen unes determinades seqüències de nucleòtids. Aquests són els anomenats
enzims de restricció, que tallen el DNA per una seqüència concreta.
En aquesta experiència vam utilitzar els enzims HpaII , MspI i Eco RI.
- 28 -
S’utilitza l’enzim EcoRI que reconeix la seqüència GAATTC. Aquesta seqüència
apareix diverses vegades en fragments llargs de DNA de manera que l’enzim talla quan
la reconeix i permet obtenir seqüències de mida més apropiada per a les nostres anàlisis.
Els altres dos enzims reconeixen la mateixa seqüència (CCGG: citosina-citosina-
guanina-guanina), però amb sistemes de metilació diferents.
El MspI és sensible a la metilació de la citosina externa d’una de les dues cadenes. Això
vol dir que quan la citosina presenta aquest estat de metilació (Fig. 23) l’enzim no és
actiu i, per tant, no fragmentarà aquesta seqüència. En canvi, si que hi haurà escissió en
qualsevol altra situació.
Figura 23. Citosina externa metilada.
L’enzim HpaII, en canvi, és sensible a la metilació de la citosina interna de les dues
cadenes de DNA alhora, o el que és el mateix, aquesta doble metilació (Fig. 24)
impedeix l’activitat de l’enzim.
Figura 24. Citosines internes metilades.
- 29 -
Aquesta digestió serà una digestió doble, perquè d’una banda hi actuaran el MspI o bé
l’HpaII, i paral·lelament, l’EcoRI.
Així doncs, es preparen dues mostres de cadascun dels 54 DNA (27 de fulles joves i 27
de fulles madures) que s’han purificat en el procediment anterior. A una de les mostres
se l’hi afegeix l’enzim MspI juntament amb l’EcoRI i a l’altra, l’enzim HpaII junt amb
l’EcoRI (Fig. 25). De manera que tindrem 108 mostres, es a dir el doble de les 54
inicials.
Figura 25. La mostra inicial del DNA es divideix en dues parts i es digereix amb
enzims diferents. I així successivament amb les 54 mostres que tenim.
Quan la digestió ha finalitzat, les mostres presentaran diversos fragments de diferent
llargària, es a dir, de diferent número de bases, segons l’enzim que hagi actuat.
Aleshores, comparant la quantitat i la longitud dels fragments podrem esbrinar quina és
la freqüència en que apareix la citosina metilada en el DNA, i per tant, saber quina és la
proporció de metilació en el genomes de cada fulla que estem analitzant.
- 30 -
El procés de digestió s’ha de dur a terme amb un buffer que sigui compatible amb tots
els enzims que hi actuen. Per això s’han de consultar les informacions que els grans
laboratoris ens proporcionen (Fig. 26) per tal de triar-ne un d’adequat.
Figura 26. Instruccions de màxima activitat dels enzims.
En definitiva a cada mostra de DNA hi vam afegir el buffer seleccionat, l’enzim EcoR1,
un dels dos enzims HspaII o MspI, i, per últim, també hi vam afegir aigua per tal que el
volum final fos 50 microlitres, un volum establert per facilitar els càlculs (Fig. 27).
DNA 30 l
BUF 10X 5 l
EcoR1 1 l
2on Enzim (HpaII o MspI) 1 l
H2O 13 l
Total: 50 l
Figura 27. Proporcions dels components de la mostra..
Amb l’objectiu de facilitar processos posteriors, vam traslladar les mostres a unes
plaques d’eppendorfs petits (Fig. 28 ). D’aquesta manera les mostres ja es trobaven en
el material adequat per altres processos com el de la PCR.
- 31 -
Figura 28. Plaques d’Eppendorfs
L’ordre a l’hora de barrejar els components és important i cal preocupar-se’n per
intentar aconseguir els resultats més exactes possibles. Els enzims s’han d’afegir els
darrers amb la finalitat de reduir el temps d’exposició a temperatura ambient. A més a
més, és convenient que es trobin sempre amb el seu buffer corresponent (Fig. 29).
Figura 29. Preparant la barreja de buffer + enzims + aigua que s’afegeix a les mostres
de DNA
Es van incubar les mostres a 37 graus centígrads durant tota la nit.
En acabar el procés de digestió, les mostres tindran el DNA fragmentat en fragments de
diferents longituds. Ara bé, sempre es convenient en experiments científics comprovar
si els pasos seguits han donat els resultats esperats. Per aquesta raó, vam decidir dur a
terme el procés de l’electroforesi amb l’objectiu de comprovar que les mostres digerides
contenien petits fragments.
- 32 -
L’electroforesi, consisteix en la migració del DNA a través d’un gel, a causa del camp
elèctric al que és sotmès. La idea central d’aquest procés és que els fragments de DNA
es desplaçaran més o menys depenent de quina sigui la seva longitud. D’aquesta manera
podrem diferenciar si la mostra es troba fragmentada o no.
Així doncs, vam agafar una mostra de DNA suposadament fragmentat i la vam introduir
en un gel d’agarosa que prèviament havíem preparat, per tal de dur a terme el procés de
electroforesi.
Abans d’introduir el DNA digerit en el gel, però, cal afegir a la mostra un buffer de
càrrega que fa que el DNA tingui color i un pes major, així el DNA s’adhereix millor al
gel i durant l’electroforesi, no es desplaça amb tanta facilitat (Fig. 30).
Figura 30. Aparell d’electroforesi amb el gel d’agarosa que conté el DNA (Blau)
Després vam observar el gel en l’aparell de visió de llum ultraviolada i efectivament, el
DNA de la mostra s’havia desplaçat a través del gel formant diferents bandes, i, per tant,
quedava demostrada la fragmentació del DNA (Fig. 31).
- 33 -
Figura 31. DNA fragmentat (esquerra), comparat amb el genoma sencer que forma
una única banda (dreta)
3.5. Lligació
Una vegada el DNA s’ha fragmentat amb els enzims de restricció (HpaII, MspI i Eco
RI) es troba en fragments amb extrems cohesius. Això és degut al tipus de tall que
realitzen aquests 3 enzims (Fig. 32 i 33).
Figura 32. Tipus de tall que realitza l’Eco R1,
deixant extrems cohesius.
Figura 33. Tipus de tall que realitzen els enzims HpaII i MspI.
Tot seguit doncs, cal completar aquests extrems amb nous nucleòtids.
- 34 -
Per dur a terme aquest procés primer s’ha de preparar una barreja amb el buffer
corresponent, juntament amb nucleòtids que posteriorment formaran part dels extrems
dels fragments i l’enzim DNA ligasa que permet la unió d’aquests últims als extrems de
DNA de la mostra (Fig. 34).
Figura 34. Procés de lligació
Vam barrejar els components en les proporcions que havíem calculat i hi vam afegir el
DNA fragmentat en extrems cohesius (Fig. 35). I ho vam deixar reposar primer a
temperatura ambient durant 3 hores i després a la nevera a uns 4 graus centígrads durant
tota la nit.
DNA 20 l
Buf. 10x 3 l
Nucleòtids 2 l
T4 DNA ligasa 0’2 l
H20 4,8 l
Total: 30 l
Figura 35. Components de la mescla per a dur a terme la lligació.
- 35 -
3.6. PCR (polymerase chain reaction)
Un cop tenim el DNA en fragments complets, hem d’augmentar-ne la quantitat de
fragments, ja que com més quantitat de mostra hi hagi més fàcil és analitzar-la i obtenir
resultats.
En conseqüència, vam dur a terme un procés anomenat “reacció en cadena de la
polimerasa”, conegut àmpliament com PCR. Aquest procés consisteix en la
amplificació d’una petita quantitat de DNA en un gran nombre de còpies exactes (Fig.
36).
Figura 36. Augment exponencial de la quantitat de DNA
Aquest procés fou descobert per Kary Banks Mullis l’any 1983, i ha suposat un gran
avenç en la biologia molecular, ja que facilita enormement la manipulació i observació
d’una petita mostra d’DNA.
Per dur a terme aquest procés primer vam fer els càlculs dels components que es
necessiten. Primer de tot cal buscar un buffer adequat i clorur de magnesi (MgCl2), que
facilita el procés. També es necessiten nucleòtids, que són els que compondran les
noves cadenes de DNA i l’enzim polimerasa (Taq DNA Polimerasa), que és
l’encarregat d’anar adherint els nucleòtids i anar formant una nova cadena. A més també
són imprescindibles per a la replicació uns primers determinats, que són petits segments
de RNA que l’enzim DNA-pol necessita per començar a copiar la cadena de DNA.
- 36 -
Vam preparar la barreja amb tots aquests components i la vam introduir en els diferents
eppendorfs que contenien el DNA fragmentat amb extrems completats (Fig. 37).
Figura 37. Trasllat de la barreja amb components (buffer+ MgCl2+ nucleótids+ DNA-
pol+ primers) amb una pipeta multivies que facilita els procediments que impliquen
gran nombre de mostres.
Més tard, vam introduir totes les mostres en el termociclador (Fig. 38), un aparell que
facilita molt el procés de la PCR, ja que mitjançant uns programes que ja té estipulats
aconsegueix les sèries de temps i temperatures necessàries en aquest procés.
Figura 38. Termociclador amb les mostres.
- 37 -
La PCR és un procés que té lloc a diferents temperatures ja que engloba diferents
passos.
Primer de tot s’ha de donar la separació de les dues cadenes de DNA (Fig. 39), ja que la
replicació del DNA és semiconservativa i per tal de replicar-se, a cada cadena del DNA
se li uneix una nova cadena complementària. La separació de les dues cadenes es dóna a
una temperatura de 94 graus centígrads durant 30 segons.
Figura 39. La doble cadena de DNA es separa en dues cadenes simples.
Tot seguit, els primers s’han d’unir a les cadenes de DNA ara ja separades (Fig. 40).
Aquest procés d’unió de primers es dóna a una temperatura de 56 graus centígrads
durant 1 minut.
Figura 40. Els primers s’uneixen a les cadenes simples de DNA.
- 38 -
I per últim, mitjançant l’enzim polimerasa, que permet la unió dels nucleòtids, es forma
una nova cadena complementaria a la existent (Fig. 41). Aquest últim procés té lloc a
una temperatura de 72 graus centígrads durant 1 minut.
Figura 41. Formació de les cadenes complementàries i la consegüent obtenció de dos
segments iguals a l’inicial.
Aleshores, el termociclador, que ja està programat, repeteix aquests tres passos 29
vegades, per tal d’assegurar un gran nombre de còpies (Fig. 42).
Figura 42. Es repeteixen tots els passos en els 29 cicles.
- 39 -
3.7. PCR selectiva
Aquest procés, al cap i a la fi, consisteix en els mateixos passos que la primera PCR,
però, a diferència de la primera, els primers complementaris als fragments tallats per
l’enzim EcoRI, ara estan marcats amb fluorocrom, per tal de fer-los visibles.
En les mostres que s’han obtingut després de la digestió doble, hi ha gran quantitat de
fragments que poden ser de tres tipus:
1. Fragments digerits pels dos extrems pels enzims HpaII i MspI (HpaII/MspI------
HpaII/MspI). Aquests són molt freqüents i massa curts, cosa que fa impossible
la seva distinció amb la tècnica que utilitzem.
2. Fragments digerits per un extrem per l’enzim EcoRI i per l’altre, per un dels dos
enzims HpaII o bé, MspI. (EcoRI------ HpaII/MspI).
3. Fragments digerits pels dos extrems per l’enzim EcoRI. (EcoRI ---- EcoRI).
Aquests fragments primerament són molt poc abundants i llargs, i a més, no són
d’interès perquè aquest enzim no ens dona informació sobre el loci fragmentat.
Els únics fragments que són significatius són els de tipus 2 (EcoRI------ HpaII/MspI).
Per tal de seleccionar-los, marquem amb fluorocrom els primers corresponents a
l’enzim EcoRI, de manera que descartem els de tipus 1. A més, també es descarten els
de tipus 3, ja que els temps programats de la PCR afavoreixen l’amplificació de
fragments curts i eviten la dels fragments llargs.
Així doncs, només es faran visibles els fregaments de tipus 2 (EcoRI------HpaII/MspI)
marcats amb fluorocrom i replicats per la PCR.
D’altra banda, en aquesta PCR s’augmenta la temperatura del segon pas per tal
d’incrementar l’especificitat del procés, en concret, es passa de 56 graus C. a 65 graus
C. i la temperatura es va reduint 0’7 graus C. a cada procés. Així s’aconsegueix la còpia
exclusiva dels segments que estrictament presenten les bases desitjades.
- 40 -
Processos PCR selectiva
94 graus centígrads 30 segons
65 graus centígrads 1 minut - 0’7 graus centígrats/cicle
72 graus centígrads 1 minut
3.8. Lectures dels fragments de DNA a l’analitzador genètic.
Finalment, quan ja teníem les mostres de DNA fragmentat i replicat, havien de ser
llegides per un aparell especialitzat (ABI313l0xl genetic analyser). Com que no
disposàvem d’aquest aparell al centre del CREAF, vam haver de portar les mostres al
CRAG (Centre de Recerca Agrigenómica , Universitat Autònoma de Barcelona).
A fi que l’aparell visualitzés les mostres, vam fer una barreja amb 2 �l de les mostres
de DNA, 12 l de Hi Di Formamida que permet la visibilitat del DNA i 0,3 �l de
LIZ600ST, que és una mostra estàndard formada per fragments de DNA coneguts que té
un perfil que ens servirà de base de comparació. Així quan es superposen els dos perfils,
podem saber la longitud dels diferents fragments de la mostra que ens interessa.
3.9. Tractament estadístic
Les taxes de metilació varen ser relacionades amb l’edat dels arbres duent a terme
regressions lineals i no lineals i les metilacions de fulles joves i madures es van
comparar amb una ANOVA (Anàlisi de la variància) (paquet informàtic Statistica).
- 41 -
4. RESULTATS
4.1. Fragments dels diferents loci (regions).
Els resultats s’obtenen en unes gràfiques que presenten pics. De cada mostra s’obtenen
dues gràfiques, la que representa el DNA digerit per HpaII+EcoR1 i la que representa el
DNA digerit per MspI+EcoR1 (Fig. 43).
Figura 43. Gràfiques amb nombre de nucleòtids a abscisses i quantitat de fragments a
ordenades.
Aquestes dues gràfiques corresponen a dues mostres de DNA idèntiques però digerides
cada una amb un enzim diferent. Els pics indiquen la presència d’una quantitat
considerable de fragments d’una determinada longitud. En l’exemple de la figura el pic
assenyalat correspon a gairebé 1000 fragments de 158 nucleòtids, i es pot observar que
només és present en el perfil superior. Això vol dir que aquest fragment de 158 bases
només va ser digerit per un dels dos enzims.
- 42 -
Els pics doncs, indiquen que hi ha presència de segments d’aquella longitud, i que per
tant, aquella regió del DNA, és un locus significatiu i ha de ser considerat a l’hora
d’analitzar els resultats.
4.2. Estat de metilació de la citosina
Aleshores vam construir una taula a partir del model realitzat per Salmon et al. que ens
indica l’estat de metilació de la citosina a partir de l’absència o la presència de pics (Fig.
44) (29).
Activitat enzimàtica Presència de fragments Estat de metilació
CCGG
site HpaII MspI EcoRI/HpaII EcoRI/MspI
non-methylated
locus
CCGG
CCGG + + 1 1
full-methylated
locus
CmCGG
GGCmC - + 0 1
hemi-methylated
locus
mCCGG
GGCC + - 1 0
hyper-methylated
locus
mCmCGG
GGCmCm - - 0 0
Figura 44. (mC)citosina metilada; (-) inactiu, sensible a l’estat de metilació; (+) actiu;
(1) presencia de pic; (0) absència de pic.
L’estat de metilació de la citosina pot ser de 4 tipus:
1. Non-metilated locus. Si el fragment està present en les dues digestions, és a dir,
presenta un pic a cada perfil, la seqüència CCGG no està metilada.
- 43 -
2. Full metilated locus. Si el pic només és present en el perfil de la digestió del
EcoR1/MspI, la seqüència presenta metilació completa (fully-metilated), es a
dir, presenta metilades les dues citosines internes de cada cadena de DNA.
3. Hemi-metilated locus. Si el pic només apareix en el perfil de la digestió del
EcoR1/HpaII, significa que només esta metilada la citosina externa d’una sola
cadena, i no pas la seva complementària.
4. Hyper-metilated locus. Si no hi ha presència en cap de les dues digestions, es a
dir, si cap dels dos perfils presenta pic. Això significa que el loci està
hipermetilat, es a dir, que la seqüència CCGG presenta les dues citosines de les
dues cadenes metilades.
En els perfils obtinguts de l’anàlisi de totes les mostres es van localitzar 298 loci. A
partir d’aquí es van fer unes gràfiques on s’establien les presències o absències de pics
en els perfils obtinguts, que amb l’ajuda de la taula anterior (Fig. 44) ens indiquen
l’estat de metilació de cada loci.
A continuació, es van calcular els percentatges dels diferents estats de metilació de cada
mostra (Fig. 45).
- 44 -
Figura 45. Taula que mostra els percentatges de no-metilació, hiper-metilació, hemi-
metilació, metilació completa, i metilació total.
- 45 -
Tenint en compte el total de mostres de DNA examinades, el percentatge de metilació
fou aproximadament del 70%, és a dir, un 70% dels fragments obtinguts presentava
algun tipus d’estat de metilació: un 21.1% de metilació completa, un 35,2% de hiper
metilació, i un 13,5% de semi metilació.
Per tant, es pot confirmar la existència d’aquests mecanismes, en concret la metilació
del DNA i que, a més a més, és molt significativa la proporció en que es troba en
aquests individus de Pinus sylvestris.
Tot seguit, es va analitzar la relació entre el percentatge de metilació total (hemi, hiper i
completa) i l’edat dels arbres tot considerant les fulles joves (de primavera) i madures
(d’estiu) per separat (Fig. 46).
Figura 46. Creixement amb tendència exponencial de la metilació en fulles madures a
mesura que els arbres envelleixen. Edat en anys a abscisses i tant per cent de metilació
a ordenades. Fulla jove (primavera); Fulla madura (estiu).
En aquesta gràfica s’observa un augment del tant per cent de metilació de les fulles
madures al llarg del temps amb una tendència exponencial. Així mateix, també
s’observa que el tant per cent de metilació de les fulles joves és independent de l’edat de
l’arbre.
Age
To
tal
met
hyl
ated
lo
ci (
%)
0 100 200 300 400 500 60050
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
springsummer
R=0.486 R2=0.233 p<0.05
- 46 -
Per tant, podem afirmar que al llarg de la vida dels individus de l’espècie Pinus
sylvestris hi ha un augment exponencial en la metilació del seu DNA.
Així mateix, també es van comparar les fulles joves, recollides a la primavera, i les
fulles madures, recollides a l’estiu, i es van trobar diferències significatives entre elles.
Els percentatges de metilació completa en fulles joves és del 22.69% i en madures del
19.49%, el percentatge d’hiper metilació és del 40.23% en fulles joves i 30.15% en
fulles madures i, per últim, el percentatge de hemi-metilació són del 9.98% en fulles
joves i 16,97% en madures. En tots els casos, aquestes diferències son estadisticament
significatives (p<0.05, T-student) (Fig. 47).
0
Season p<0.001
Fu
ll m
eth
yla
ted
lo
ci
(%)
0
10
20
30
40
50
Season p<0.05
He
mi-
me
thyl
ate
d l
oc
i (%
)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Hyp
er-
me
thyl
ate
d l
oc
i (%
)
Season p=0
Season p<0.001
Figura 47. Diferències entre fulles joves i madures en relació als percentatges de
metilació completa, hiper-metilació i semi-metilació. Fulles joves en blanc i fulles
madures en negre.
- 47 -
Tot i que els percentatges de hemi-metilació van ser superiors en fulles madures que en
fulles joves, el tant per cent de metilació total continua sent més alt en fulles joves que
en fulles madures.
Així doncs, es pot afirmar també, que hi ha una diferència notable entre les fulles
madures i les fulles joves. Les fulles joves, independentment de l’edat de l’arbre en
qüestió, tenen un percentatge major de metilacions en el seu DNA que no pas quan són
madures (Fig. 48).
Figura 48. Diferències en els tants per cents de metilació total entre fulles joves i
madures . Fulles joves en blanc, fulles madures en negre.
Spring Summer
To
tal
Me
thyl
ate
d lo
ci (
%)
0
20
40
60
80Season p<0.010
- 48 -
5. DISCUSSIÓ
Ja fa més de vint anys, Riggs (30) i Holliday & Pugh (31) van suggerir que la metilació
del DNA influencia l’expressió gènica. Des d’aleshores s’ha demostrat que la metilació
efectivament impedeix la transcripció dels gens (32). No obstant, encara no està del tot
clar si la metilació del DNA juga un paper bàsic o no en la regulació dels gens durant el
desenvolupament.
En aquest estudi experimental s’ha avaluat la metilació global dels genomes de 27
individus de Pinus sylvestris fent servir un mètode basat en l’ús enzims sensitius a la
metilació, HpaII i MspI. Aquesta tècnica és una eina excel·lent àmpliament usada per a
avaluar la metilació dels genomes (33).
En primer lloc, vam trobar que els genomes de les fulles joves presentaven un
percentatge més alt de metilació que no pas les madures, independentment de l’edat de
l’arbre. Aquest resultat coincideix amb molts altres estudis sobre la metilació durant el
desenvolupament. Aquesta disminució de la metilació durant el desenvolupament foliar
permet la expressió de gens específics que poden dirigir un canvi morfologic determinat
que hagi de realitzar la fulla al madurar (34). Finnegan et al. han dut a terme estudis on
posen de manifest que la metilació és essencial per a un desenvolupament foliar normal
i correcte (35).
Aquesta variació entre el grau de metilació del DNA de fulles joves i fulles madures
suggereix la presència de mecanismes que duguin a terme la desmetilació. Els processos
de desmetilació encara no són prou coneguts, ni tampoc s’ha identificat encara cap
enzim en plantes capaç de realitzar-los. (34).
En segon lloc, vam trobar que els genomes de les fulles dels arbres de major edat
estaven significativament més metilats que no pas els de les fulles dels arbres joves.
Aquesta major metilació seria encara més important si haguéssim comparat els teixits
meristemàtics, es a dir, teixits encara no diferenciats, d’arbres de diferents edats atès que
Fraga et al., afirmen que les diferències entre els teixits meristemàtics de pins de
- 49 -
diferents edats són molt més significatives que no pas les que es troben entre els teixits
ja diferenciats (34).
A diferencia de les angiospermes, que presenten unes variacions de metilació del 10-
15% durant l’envelliment i la maduració, el pi roig estudiat va presentar un canvi del
25% en passar dels 100 als 550 anys d’edat, i nomes d’un 7% en la maduració de les
fulles. Això ve a confirmar els resultats d’un treball similar dut a terme en un altre pi, el
Pinus radiata. (34)
Degut al fet que la metilació del genoma està associada a la regulació gènica, podem
suggerir que aquests canvis en els percentatges totals de metilació durant l’envelliment
podrien ser els desencadenants de canvis fenotípics en les plantes al llarg del seu
envelliment (34).
Els resultats d’algunes investigacions (17) (8) suggereixen que abans de la duplicació
del DNA intervindria algun sistema encara no identificat que eliminaria totes les
marques epigenètiques (metilació del DNA, fosforilació i metilació d'Histones). Aquest
sistema de neteja no sempre actuaria de manera perfecta, de manera que una quantitat
més o menys petita de les marques epigenètiques passarien d’una cèl·lula a les
descendents. Això vindria a explicar la raó per la que els arbres presenten un tant per
cent més elevat quan són vells, ja que aquests petits errors s’acabarien acumulant al
llarg de la vida dels individus.
Així doncs, convé ressaltar les tendències contraries dels dos processos estudiats,
l’envelliment i el desenvolupament foliar. Durant l’envelliment dels arbres hi ha un
augment del grau de metilació de les fulles, en canvi, durant el desenvolupament de
cada fulla en particular hi ha una disminució d’aquest. Hi ha treballs que suggereixen
que els mecanismes implicats ens els dos processos probablement són diferents (34).
En tot cas, els resultats d’aquest treball permeten suggerir que els canvis dels
percentatges de metilació en el DNA poden actuar com a marcadors de l’envelliment i
del desenvolupament foliar, l’un augmentant i l’altre disminuint respectivament.
- 50 -
AGRAÏMENTS
Agraeixo especialment a la doctora Laura Rico del CREAF el seu suport tècnic, sense el
qual aquest treball experimental no hagués estat possible, així com també els seus
aclariments i interès. A més a més, vull agrair l’entusiasme del meu tutor Jesús Pedrós,
que amb els seus profitosos suggeriments i la seva incondicional dedicació, ha fet
d’aquest treball una experiència única.
- 51 -
BIBLIOGRAFIA
1. Waddington CH. Preliminary Notes on the Development of the Wings in Normal andMutant Strains of Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1939;25:299–307.
2. James D. Watson, Fancis Crick. Molecular Structure of Nucleic Acids: A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid. Scientific journal Nature. 1953;171:737–8.
3. Macías Sánchez KL, Zazueta Novoa V, Mendoza Macías CL, Rangel Serrano A, Padilla Vaca F. Epigenética, más allá de la Genética. Acta Universitaria. 2008;18(1):50–6.
4. Adriana Estrella González Ramírez, Alejandro Díaz Martínez, Adriana Díaz Anzaldúa. La epigenética y los estudios en gemelos en el campo de la psiquiatría. Salud Mental. 2008;31(3):229–37.
5. Irfan A. Qureshi, Mark F. Mehler. Epigenetics, Nervous System Tumors, and Cancer Stem Cells. Cancers. 2011;3(3):3525–56.
6. Srinivas Chava, M.D. Kaliq, Pasupuleti Nagarjuna. Epigenetics and Esophageal Cancer: Role of Altered Methylation in Specific Genes. International Journal of Cancer Research. 2011;7:233–43.
7. Luger K, ArminW. Ma¨ der, Robin K. Richmond, David F. Sargent, Timothy J. Richmond. Crystal structure of the nucleosomecore particle at 2.8A°resolution. NATURE. 1997;389:251–60.
8. González Romero, Rodrigo, Ausió, Juan, Méndez, Josefina, Eirín López, José M. El papel clave de las histonas. Investigación y ciencia. 2011;423:36–43.
9. Vanaja Donkena K, Y. F. Young C, J. Tindall D. Oxidative Stress and DNA Methylation in Prostate Cancer. Obstetrics and Gynecology International. 2010;2010:Article ID 302051, 14 pages.
10. Santos K., Mazzola TN, Carvalho H. The prima donna of epigenetics: the regulation of gene expression by DNA methylation. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 2005 Oct;38(10):1531–41.
11. M Mandrioli, F Borsatti. Histone methylation and DNA methylation: a missed pas de deux in invertebrates? ISJ. 2005;2:159–61.
- 52 -
12. Jeannie T.Lee. Lessons from X-chromosome inactivation: long ncRNA as guides and tethers to the epigenome. GENES & DEVELOPMENT. 2009;23:1831–42.
13. E.P Nora and E. Heard. Chromatin Structure and Nuclear Organization Dynamics during X-Chromosome Inactivation. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology [Internet]. 2011;Available from: http://symposium.cshlp.org/content/early/2011/03/21/sqb.2010.75.032.abstract
14. Marién Pascual de Pedro. Estudio epigenético del asma alérgica mediante el análisis de patrones de metilación. Tesi doctoral Universidad de Salamanca [Internet]. 2010 [cited 2011 Jun 17];Available from: http://gredos.usal.es/jspui/handle/10366/76514
15. Silvia Baquedano Coarasa, Alejandro Usón Ferrando. Inactivación del cromosoma X. Available from: https://docs.google.com/viewer?a=v&pid=gmail&attid=0.1&thid=13346dd1fd895c9a&mt=application/pdf&url=https://mail.google.com/mail/?ui%3D2%26ik%3Dc95324406e%26view%3Datt%26th%3D13346dd1fd895c9a%26attid%3D0.1%26disp%3Dsafe%26realattid%3Df_gua5du7z0%26zw&sig=AHIEtbQrAywNSDieLUSnZ5_09lwpxSBUPQ&pli=1
16. C J Brown, W P Robinson. XIST expression and X-chromosome inactivation in human preimplantation embryos. Am. J. Hum. Genet. 1997;61:5–8.
17. The University of Utah. EPIGENETICS AND INHERITANCE. Available from: http://learn.genetics.utah.edu/content/epigenetics/inheritance/
18. Hugh D. Morgan, Heidi G.E Sutherland, David I.K Martin, Emma Whitelaw. Epigenetic inheritance at the agouti locus in the mouse. nature genetics. 1999;23:314–8.
19. Eva Jablonka. Transgenerational epigenetic inheritance: Prevalance, Mechanisms, Implications for the study of heredity and evolution. The Quarterly Review of Biology [Internet]. 2009 Jun;84(2). Available from: http://www.jstor.org/pss/10.1086/598822
20. Daniel Zilberman, Steven Henikoff. Epigenetic inheritance in Arabidopsis: selective silence. Current Opinion in Genetics & Development. 2005;15:557–62.
- 53 -
21. Michael Balter. Was Lamarck Just a Little Bit Right? Science. 2000;288(5463):38.
22. Juan Sandoval, Manuel Esteller. Epigenetics and Reinventing Lamarck. Genetic Engineering & Biotechnology News. 2011;31(17):46–9.
23. Oliver Bossdorf, Christina L. Richards, Massimo Pigliucci. Epigenetics for ecologists. Ecology Letters. 2008;11:106–15.
24. Josep Peñuelas, Sergi Munné-Bosch. Potentially immortal? New Phytologist. 2010;187:564–7.
25. Ricardo Cruz-Coke M. Historia de la genética latinoamericana en el siglo XX. Revista médica de Chile. 199AD dic;127(12).
26. Catarina Fonseca Lira-Medeiros, Christian Parisod, Ricardo Avancini Fernandes, Camila Souza Mata, Monica Aires Cardoso, Paulo Cavalcanti Gomes Ferreira. Epigenetic Variation in Mangrove Plants in Contrasting Natural Environment. Plos One. 2010;5.
27. Història Natural dels Països Catalans. Enciclopèdia Catalana S.A.; 1988. 100-101 p.
28. Eva Hermoso Prieto. Caracterización mecánica de la madera estructural de Pinus sylvestris L. Thesis (Doctoral) [Internet]. 2001;Available from: http://oa.upm.es/644/
29. Armel Salmon, Jérémy Clotault, Eric Jenczewski, Véronique Chable, Maria J. Manzanares-Dauleux. Brassica oleracea displays a high level of DNA methylation polymorphism. Plant Science. 2008;174:61–70.
30. Riggs AD. X-inactivation, differentiationand DNA methylation. Cytogenet. Cell Genet. 1975;14:9–25.
31. Holliday R, Pugh JE. DNA modification mechanisms and gene activity during development. Science. 1975;187:226–32.
32. Aharon Razin. CpG methylation, chromatin structure and gene silencing—a three-way connection. The EMBO Journal. 1998;17:4905–8.
33. Fujiwara H. Nonisotopic cytosine xtension assay: a highly sensitive method to evaluate CpG island methylation in the whole genome. Analytical Biochemistry. 2002;307(2):386–9.
- 54 -
34. Mario F. Fraga, Roberto Rodríguez, Maria Jesús Cañal. Genomic DNA methylation–demethylation during aging and reinvigoration of Pinus radiata. Tree Physiology. 2002;22:813–6.
35. E. J. Finnegan, R. K. Genger, W. J. Peacock, E. S. Dennis. DNA methylation in plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 1998;49:223–47.
