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“Caracterización del efecto biológico de la infección con Salmonella sobre el linfocito B.” T E S I S QUE PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS EN INMUNOLOGÍA PRESENTA ÁNGEL DENISSE CASTRO EGUILUZ MÉXICO, D. F. 2009 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Sección de Estudios de Posgrado e Investigación DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGÍA DIRECTORES DE TESIS: DR. VIANNEY F. ORTIZ NAVARRETE DR. SERGIO ESTRADA PARRA
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“Caracterización del efecto biológico de la infección con Salmonella sobre el
linfocito B.”
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTOR EN CIENCIAS EN INMUNOLOGÍA
PRESENTA
ÁNGEL DENISSE CASTRO EGUILUZ
MÉXICO, D. F. 2009
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICASSección de Estudios de Posgrado e Investigación
DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGÍA
DIRECTORES DE TESIS:
DR. VIANNEY F. ORTIZ NAVARRETE
DR. SERGIO ESTRADA PARRA
El presente trabajo se realizó gracias al
apoyo de CONACYT, con el número de
registro de becario 200897.
Gracias Dios por el amor eterno con que me has amado y
por traerme a este camino donde he podido descubrir
cuán grandes son tus pensamientos.
Porque al hombre que le agrada, Dios le da
sabiduría, ciencia y gozo.
Eclesiastés.
Gracias mamá y papa y por su amor incondicional, por su
cuidado, por darme la oportunidad de cumplir mis anhelos,
y por enseñarme la excelencia de la sabiduría que proviene
de lo alto.
Gracias hermana porque eres la mejor amiga que Dios me
ha dado, gracias por tu constante cariño.
Gracias Oscar por amarme con un amor perfecto. No
existen palabras que expresen el significado que has
aportado a mi vida. Te amo.
A mi esposo que adoro con todo mi corazón
i
Índice General.
Índice de figuras ………………………………….………………………………………...iii
Lista de abreviaturas………………………………...……………………………………...iv
Resumen………………………………………………………………...…………...............1
Abstract…………………………………………………………...........................................2
Antecedentes…………………………………………………………………………….......3
Infección con Salmonella…………………………………………………………....3
Respuesta inmune frente a Salmonella………………….…………………………...3
Inmundad innata……………………………………………………..3
Presentación de antígeno…………………………………………….4
Localización intracelular de Salmonella…………………………………………….5
Infección de linfocitos B por Salmonella……………………………………………7
Justificación………………………………………………………….....................................9
Objetivos………………………………………………………….......................................10
Objetivo General…………………………………………………………...............10
Objetivos específicos……………….…………………………………………........10
Material y Métodos………………………………………………………….......................11
Líneas celulares………………………………………………………….................11
Cepas de Salmonella………..………………………………………………….........11
Hibridomas…………………………………………………....................................11
Anticuerpos…………………………………………………...................................11
1. Caracterización de la VCS en linfocitos B……………………..……………......12
Infección de linfocitos B…………………………….……………………...12
Extracción de vesículas………………………………………………….....13
Tinción de vesículas……………………………………………………......13
Análisis de vesículas……………………………………………………......14
Unidades formadoras de colonias……….……………………………….....14
2. Caracterización de las poblaciones de precursores de linfocitos B de médula ósea
de ratones infectados con Salmonella typhimurium……….……………………….14
Infección de ratones……….……………………………………………......14
ii
Tinción de células provenientes de médula ósea……………………….…..14
Purificación de precursores de linfocitos B de médula ósea……………….15
Unidades formadoras de colonias………………………………………......15
3. Caracterización de los efectos de la infección con Salmonella sobre la
diferenciación de los linfocitos B a células plasmáticas…………………………...15
Purificación de linfocitos B………………………………………………...15
Infección de células………………………………………………………...16
Activación de células……….……………………………………………....16
Tinción de células……….…………………………………………….........17
Análisis de las células……….……………………………………………...17
4. Identificación de la capacidad de los linfocitos B infectados con Salmonella para
presentar antígeno en moléculas de MHC-I……………………………………......17
Purificación de linfocitos B infectados con Salmonella typhimurium …….17
Obtención de linfocitos T citotóxicos……….………………………….......18
Ensayo de presentación a linfocitos T citotóxicos……….………………....18
Tinción de células……….……………………………………………….....18
Análisis de las células……….……………………………………………...18
Resultados………………………………………………………….....................................19
1. En linfocitos B no hay un control de la infección con Salmonella y la VCS no se
remodela……………..…………………………………………………………......19
2. Los precursores de linfocitos B de médula ósea se encuentran infectados con
Salmonella typhimurium…………………………………………...………….........21
3. Los linfocitos B infectados con Salmonella son capaces de diferenciarse hacia
células plasmáticas…………………………………………………….…………...26
4. Los linfocitos B infectados con Salmonella no inducen una respuesta citotóxica
por parte de los linfocitos T CD8…………………………………………………..28
Discusión………………………………………………………….......................................30
Conclusión………………………………………………………….....................................35
Bibliografía…………………………………………………………...................................36
iii
Índice de figuras.
Figura 1. Expresión de marcadores en la vacuola que contiene Salmonella…………….…6
Figura 2. Salmonella infecta linfocitos B…………………………………………………...7
Figura 3. Las células B no controlan la infección con Salmonella……………………..…19
Figura 4. En células B Salmonella se encuentra en un compartimiento lisosomal tardio...20
Figura 5. Identificación de precursores de células B……………………………...………22
Figura 6. Los precursores de linfocitos B se infectan con Salmonella……………………23
Figura 7. El porcentaje de células Pro B disminuye en ratones infectados
con Salmonella…………………………………………………………………...24
Figura 8. Las células Pro B y B näive se infectan con Salmonella…………...…………...25
Figura 9. Las células plasmáticas se encuentran infectadas con Salmonella……………...26
Figura 10. Los linfocitos B infectados con Salmonella se diferencian a
células plasmáticas……………………………………………………………..27
Figura 11. Los linfocitos B infectados con Salmonella no inducen una respuesta por
linfocitos T CD8……………………………...………………………………...28
iv
Lista de Abreviaturas.
Arf6 Factor 6 de ribosilación dependiente de ADP
APC Células presentadoras de antígeno profesionales
BFA-A Brefeldina A
BSA Albúmina sérica bovina
DMEM Medio Esencial Mínimo, modificado por Dulbecco
DO600 Densidad óptica a 600 nm
FACS Separación celular activada por fluorescencia
GFP Proteína verde fluorescente
IFN-! Interferón-gamma
IL Interleucina
IP Intraperitoneal
LB Luria Bertani
LPS Lipopolisacárido
MFI Media de intensidad de fluorescencia
MHC-I Complejo principal de histocompatibilidad clase I
MHC-II Complejo principal de histocompatibilidad clase II
MOI Multiplicidad de infección
OVA Ovoalbúmina
PAMPs Patrones moleculares asociados a patógenos
PBS Solución reguladora de fosfatos
PMA Forbol 12-miristato 15-acetato
PRRs Receptores de reconocimiento a PAMPs
RE Retículo endoplásmico
rpm Revoluciones por minuto
SFB Suero fetal bovino
SS Salmonella-Shigella
TAP Transportador asociado con procesamiento de antígeno
TLR 4 Receptor tipo Toll 4
v
UbC Ubiquitina C
UFC Unidades formadoras de colonias
VNS Vacuola que no contiene Salmonella
VCS Vacuola que contiene Salmonella
VO Vía Oral
1
Resumen.
Durante la infección con Salmonella se ha observado que los linfocitos B no utilizan
la vía alterna de procesamiento de antígenos exógenos por moléculas de MHC-I, a pesar de
que son capaces de infectarse. Por lo tanto, en linfocitos B caracterizamos la vacuola que
contiene a Salmonella (VCS) y encontramos una desregulación de moléculas de MHC-I y
de Arf6 a las 3 h post-infección. A tiempos tardíos la VCS presenta características
lisosomales, con una mayor expresión de moléculas de MHC-II. Por lo tanto en linfocitos B
no hay una remodelación de la VCS, como ocurre en los macrófagos.
Reportamos previamente en ratón, que los linfocitos B de bazo y médula ósea son
un reservorio para la bacteria durante la infección con Salmonella. Investigamos el efecto
de la infección en los precursores de linfocitos B en médula ósea y encontramos que los
linfocitos B y sus precursores son blancos de infección, lo cual altera su maduración.
Siendo los linfocitos B un blanco de Salmonella, es posible que ésta interfiera con la
función biológica de las células B; por un lado en su capacidad de convertirse en células
productoras de anticuerpos, o bien por otro lado, en su capacidad de inducir una respuesta
por parte de los linfocitos T citotóxicos. Con respecto a la primera, investigamos si la
infección afecta la diferenciación de los linfocitos B hacia células plasmáticas,
sorprendentemente encontramos que los linfocitos B conservan esta capacidad de
convertirse en células plasmáticas productoras de anticuerpo. Sin embargo, no pueden
inducir una respuesta citotóxica por parte de los linfocitos T.
La evidencia presentada en este trabajo nos lleva a concluir que los linfocitos B de
médula ósea son un nicho de sobrevivencia para Salmonella, y la función biológica de éstos
no se incapacita por la infección.
2
Abstract.
During Salmonella infection, we have previously observed that B lymphocytes are
unable to use the alternative processing pathway to present exogenous antigens on MHC-I
molecules, even though they become infected. To understand this observation, we
characterized the Salmonella Containing Vacuole (SCV), and found that in B cells, at 3 h
post-infection there is a downregulation of MHC-I molecules and Arf6, and at later time
points, the SCV presents lysosomal characteristics with a higher expression of MHC-II
molecules. These data suggests that B lymphocytes do not remodel the SCV, as
macrophages do.
We previously reported that, in mice, spleen and bone marrow derived B cells are a
reservoir for bacteria during Salmonella infection. So, we investigated the effect of
Salmonella infection on B cell precursors. Here we show that, within the bone marrow, B
cells and its precursors are targeted for infection by Salmonella, and this event disturbs the
B cell progenitors’ maturation.
Since B cells are targets for the bacteria, it is possible that it interferes with the
biological function of these cells. On one hand, it may interfere with B cells’ ability to
become antibody producing plasma cells and on the other hand, with B cells’ ability to
induce a cytotoxic T cell effector response. Concerning the former, we analyzed if infection
disrupts B cell’s differentiation into plasma cells. Surprisingly, Salmonella infected B cells
maintain their ability to become antibody producing plasma cells. However, they are
incapable of inducing T cells’ cytotoxic response.
Taken together, the evidence presented here allows us to conclude that B cells
within the bone marrow may be a bacterial niche during chronic Salmonella infection, and
the biological function of these cells is not blunted by infection.
3
Antecedentes.
Infección con Salmonella.
Salmonella es responsable de causar enfermedades en humanos que van desde
gastroenteritis hasta infecciones sistémicas. Salmonella typhi es la causante de la fiebre
tifoidea en el humano, mientras que en el ratón Salmonella typhimurium provoca una
enfermedad sistémica (1, 2). La infección del ratón por S. typhimurium, así como la del
humano por S. typhi, se caracterizan por inflamación en el sitio de entrada de la bacteria,
generalmente en las placas de Peyer. Después de que Salmonella penetra la barrera epitelial
infecta preferentemente células fagocíticas en la lámina propia. Si se trata de gastroenteritis
causada por Salmonella, la infección se auto-limita y no procede más allá de la lámina
propia. En la salmonellosis adaptada al huésped, como en la fiebre tifoidea, los fagocitos
infectados con Salmonella acceden al torrente sanguíneo y de esta manera la bacteria se
disemina al hígado y bazo (1).
Respuesta inmune frente a Salmonella.
Inmunidad innata.
Los macrófagos son células de gran importancia para la eliminación de Salmonella,
tanto en la fase temprana de la infección, como en la tardía. En la fase temprana los
macrófagos participan dentro de la inmunidad innata como la primera línea de defensa
contra la infección (3). En su superficie expresan diversos PRRs (receptores de
reconocimiento a patrones moleculares asociados a patógenos) que reconocen moléculas
que se encuentran en la superficie de la bacteria, de esta manera los macrófagos endocitan a
la bacteria, ya sea vía estos receptores ó por macropinocitosis (3-5). Una vez endocitada la
bacteria, los macrófagos la procesan para posteriormente presentarla a linfocitos T, los
cuales ejercen su función, ya sea citotóxica o de síntesis de citocinas, para la eliminación de
la bacteria. Aquí es donde los macrófagos fungen como un puente entre la inmunidad
innata y la adquirida (6).
4
Presentación de antígeno.
Existen evidencias de microorganismos que son antígenos exógenos pero residen en
vesículas dentro de las células que infectan, y por lo tanto son capaces de inducir una
respuesta de linfocitos T citotóxicos, de manera que péptidos provenientes de estos
antígenos exógenos, son presentados en moléculas de MHC-I (7-13). Por ejemplo,
Kovacsovics observó que péptidos que se encuentran en el citoplasma de la célula,
provenientes de vesículas fagocíticas, son procesados por el proteasoma y de ahí son
transportados al lumen del retículo endoplásmico (RE) por TAP y posteriormente se
acoplan a moléculas de MHC clase I (8).
Otros estudios han demostrado que se pueden presentar péptidos provenientes de
bacterias intracelulares, como Salmonella, por moléculas de MHC clase I, sin que éstas
accedan al citosol (7, 9), pues al bloquear el transporte por el aparato de Golgi y la
actividad del proteasoma, mediante BFA-A y lactacistina, se sigue llevando a cabo la
presentación de péptidos exógenos por moléculas de clase I. Además se ha observado que
péptidos antigénicos contenidos en vesículas fagocíticas son regurgitados al medio
extracelular y de ahí pueden acoplarse a moléculas de MHC–I vacías en la superficie de las
mismas células, o de macrófagos vecinos e inducir una respuesta de linfocitos T CD8; esta
vía se inhibe con citocalacina D, la cual impide que se lleve a cabo la fagocitosis,
concluyendo que este mecanismo es dependiente de fagocitosis (7).
Para explicar este fenómeno de presentación cruzada de antígenos, se han descrito
diversas vías alternas de procesamiento. Durante la formación de la copa fagocítica, el RE
se fusiona con el fagosoma que se está formando, así los fagosomas tempranos pueden
contener proteínas de RE, incluyendo todos los componentes necesarios para la
presentación de antígeno por moléculas de MHC-I, como TAP, tapasina, UbC, Sec-61 y
MHC-I (14-16). El antígeno puede seguir tres vías alternas. En la vía fagosoma-citosol-RE
(8, 16), el antígeno o fragmentos del antígeno son secretados al citosol, ubiquitinados,
procesados por el proteasoma, transportados al RE por TAP y unidos a las moléculas de
MHC-I para ser transportados a la superficie de la célula. En la ruta vacuolar (9, 16), el
antígeno no abandona el fagosoma, sino que es procesado por enzimas en el lumen del
fagosoma y unidos a moléculas de MHC-I, ya sea sintetizadas de novo o recicladas, para
5
posteriormente ser transportado a la membrana de la célula. En la vía fagosoma-citosol-
fagosoma (16, 17), el antígeno sale del lumen del fagosoma al citosol, es ubiquitinado por
UbC, procesado por proteasomas asociados a la vacuola, transportados por TAP al lumen
del fagosoma y unidos a moléculas de MHC-I para ser transportados a la superficie celular.
En nuestro grupo se demostró (18) que macrófagos de la línea celular IC21, pre-
activados con IFN-!, al infectarlos con S. typhimurium secretan péptidos que cargan
moléculas de MHC-I vacías en la superficie de células RMA-S, utilizadas como blancos
para la captación de los péptidos; y estos complejos MHC-péptido son reconocidos por
linfocitos T CD8, provenientes de ratones infectados con la bacteria. El fenómeno no se
inhibe por la acción de Brefeldina A, ni por cloruro de amonio o cloroquina. Esto sugiere
que Salmonella se encuentra en una vesícula con características no ácidas, y que no
requiere de moléculas de MHC-I sintetizadas de novo.
Localización intracelular de Salmonella.
Previamente, en la tesis de maestría (19) se caracterizó la vacuola que contiene a
Salmonella, a partir de macrófagos pre-activados con IFN-! e infectados con Salmonella
typhimurium que expresa la proteína verde fluorescente (GFP). La caracterización se llevó
a cabo a través de la identificación de moléculas de histocompatibilidad, así como de
moléculas características de la vía endocítica. Dentro de estos macrófagos infectados se
encontraron 2 tipos de vesículas. Unas que no contienen Salmonella (VNS) y otras que
contienen Salmonella (VCS). Estos dos tipos de vesículas presentan características
diferentes en cuanto a la expresión de los marcadores utilizados.
Dentro de lo que más llamó nuestra atención fue en primer lugar la expresión de
MHC-I y MHC-II (Figura 1). A 3 horas post-infección la VCS tiene una mayor expresión
de MHC-I (Figura 1a) que la VNS, y en el caso de MHC-II (Figura 1b) pasa lo opuesto, es
decir, la VNS tiene una mayor expresión de MHC-II que la VCS. Otro antecedente
importante es el de la expresión de Lamp1 (Figura 1c), molécula característica de
lisosomas, ésta se expresa en menor nivel en la VCS, a partir de 1 hora post-infección. Un
dato sorprendente fue el de la expresión de Arf6 (Figura 1d), pues a 1 hora post-infección la
VCS presenta una elevada expresión de esta molécula en comparación con la VNS.
6
Todos estos antecedentes sugieren que la VCS se encuentra remodelada, tiene una
mayor expresión de moléculas de MHC-I, por su baja expresión de Lamp1 tiene
características no lisosomales, y podemos decir que recicla a membrana celular por su
expresión de Arf6. Es probable que se trate de la vacuola encargada de presentar péptidos
de Salmonella en moléculas de MHC-I, por la vía alterna de procesamiento antes descrita
por nuestro grupo (18).
a b
Figura 1. Expresión de marcadores en la vacuola que contiene Salmonella. Se obtuvieron vesículas provenientes de macrófagos en estado basal (No IFN-!); activados 48 horas con IFN-! (IFN-!); a 1h post-infección (vacuola que no contiene Salmonella, 1h VNS; y vacuola que contiene Salmonella, 1h VCS); a 3 horas post-infección (3h VNS y 3h VCS); y a 18h post-infección (18h VNS). Las vesículas se tiñeron con anticuerpos dirigidos contra a. MHC-I, b. MHC-II, c. Lamp 1 y d. ARF 6. Se muestra la media de intensidad de fluorescencia (MFI) para cada una de las moléculas analizadas (n=3) (Tomada a partir de la referencia 19).
c d
7
Infección de linfocitos B por Salmonella.
Otros experimentos realizados en nuestro laboratorio (20) mostraron que los
linfocitos B, de la línea celular A20, se infectan con Salmonella typhimurium, y se observó,
mediante microsopía confocal, que la bacteria se encuentra en compartimientos que
colocalizan con el marcador lisosomal Lamp1, desde tiempos tempranos post-infección, y
permanece allí hasta tiempos tardíos; es decir, permanece dentro de una vesícula con
características lisosomales. Además, esta línea celular no controla la infección tan
eficientemente como los macrófagos de la línea celular IC21 activados con IFN-!. Aunado
a ello, los linfocitos B no utilizan la vía alterna descrita anteriomente, donde el
procesamiento conlleva a la secreción de péptidos al medio extracelular (18).
Por otro lado, resultados también incluidos en la tesis de maestría (19), señalan que
los linfocitos B se infectan con Salmonella durante la infección in vivo (21). En la figura 2
se muestra la cinética de infección en ratones BALB/c, observando que tanto los linfocitos
B del bazo como los de médula ósea permanecen infectados por tiempos prolongados. Lo
que demuestra que el linfocito B es un reservorio de la bacteria y probablemente también
sea un nicho donde ocurra multiplicación bacteriana.
Figura 2. Salmonella infecta linfocitos B. UFCs de Salmonella a partir de macrófagos y linfocitos B provenientes de bazo y médula ósea de ratones infectados a 3, 5, 15, 30 y 60 días post-infección. a. UFCs a partir de células de bazo de ratones infectados por vía intraperitoneal (IP). b. UFCs a partir de células de bazo de ratones infectados por vía oral (VO). c. UFCs a partir de células de médula ósea de ratones infectados por vía IP d. UFCs a partir de células de médula ósea de ratones infectados por vía VO.
c
b
d
a
8
Nuestros datos muestran que los linfocitos B provenientes de bazo y médula ósea se
encuentran infectados, con una carga bacteriana similar a la de los macrófagos, y la bacteria
permanece en estas células hasta los 60 días post-infección. Sugerimos entonces que los
linfocitos B pueden participar como reservorio de Salmonella en la infección in vivo.
9
Justificación.
Dados los antecedentes y los resultados generados en la tesis de maestría, el
linfocito B es un reservorio de Salmonella durante la infección. Las células infectadas in
vitro no utilizan la vía alterna de procesamiento y presentación de antígeno por moléculas
MHC-I que se ha descrito para los macrófagos, la bacteria reside dentro de una vesícula
lisosomal, donde permanece viable por largos periodos de tiempo. Por lo tanto es
importante caracterizar la vacuola que contiene a Salmonella en linfocitos B, para conocer
si diferencias en esta vesícula conllevan al bloqueo de los mecanismos de procesamiento y
presentación de antígenos exógenos por la vía de MHC-I. Además es importante conocer el
efecto que tiene la infección sobre el desarrollo de linfocitos B en médula ósea y sobre su
diferenciación hacia células plasmáticas.
10
Objetivos.
Objetivo general.
Caracterizar los efectos de la infección por Salmonella sobre la biología del linfocito B.
Objetivos específicos.
1. Caracterizar la VCS en linfocitos B.
2. Definir si las poblaciones de precursores de linfocitos B de médula ósea se
encuentran infectadas con Salmonella typhimurium.
3. Caracterizar los efectos de la infección con Salmonella sobre la diferenciación de
los linfocitos B a células plasmáticas.
4. Identificar la capacidad de los linfocitos B infectados con Salmonella para presentar
antígeno en moléculas de MHC-I.
11
Material y Métodos.
Líneas celulares.
Se utilizó la línea celular de linfocitos B A20. Las células se mantuvieron a 37°C
5% CO2. Se cultivaron en medio DMEM (Gibco) suplementado con 6% suero fetal bovino
(SFB) (Gibco) y 200 µg/ml de ampicilina.
Cepas de Salmonella.
Se utilizó Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 14028, transformada
con plásmido con proteína verde fluorescente (GFP), resistente a ampicilina. Se creció en
cajas de Petri con agar LB (Luria Bertani) con 200 µg/ml de ampicilina, a 37°C.
Hibridomas.
Para la obtención de la citocina IFN-! se utilizó el sobrenadante del cultivo del
hibridoma L1210 (de ratón). Para obtener el anticuerpo "-Lamp1 se utilizó el sobrenadante
del cultivo del hibridoma ID4B (de rata). Para la obtención del anticuerpo "-MHC-I (H-2
Kd) se utilizó el sobrenadante de cultivo del hibridoma Y3 (de ratón), y también el
hibridoma MKDG (de ratón) para obtener el anticuerpo "-MHC-II (I-Ad). Éstos se
cultivaron en medio DMEM (Gibco) suplementado con 10% de SFB (Gibco), en
condiciones de 5% CO2 a 37°C.
Anticuerpos.
Para caracterizar la VCS se utilizaron anticuerpos purificados, provenientes de la
inmunización de conejos con las moléculas Rab5, Rab7, Nramp y Arf6. Éstos se utilizaron
en una dilución 1:50. Para su detección se adicionó el anticuerpo secundario "-conejo-PE
12
(Zymed) en una dilución 1:200. También se utilizaron los anticuerpos secundario !-ratón-
PE y !-rata-PE (Zymed) a una dilución 1:200.
Para identificar y purificar las poblaciones de precursores de linfocitos B se
utilizaron los anticuerpos comerciales (BD Pharmingen) dirigidos contra las siguientes
moléculas: B220-PE (dilución 1:300), CD43-biotina (dilución 1:300), CD19-APC (dilución
1:600), IgM-biotina (dilución 1:200), IgD-FITC (dilución 1:100) y CD138-PE (dilución
1:100). Para detectar los anticuerpos biotinilados, se utilizó el complejo Estreptavidina-
PerCP (BD Pharmingen) a una dilución 1:600.
Para diferenciar linfocitos B a células plasmáticas se utilizó lipopolisacárido (LPS)
de Escherichia coli O111:B4 [10 µg/ml] cuando se indica, o bien se utilizaron IL-4 [200
U/ml] e IL-21 [50 ng/ml], recombinantes (PeproTech) y los anticuerpos purificados !-IgM
[5 µg/ml] y !-CD40 [1 µg/ml] (BD Pharmingen). Para detectar las células plasmáticas se
utilizó el anticuerpo !-CD138-PE (BD Pharmingen) a una dilución de 1:100.
Para identificar linfocitos T citotóxicos se utilizaron los anticuerpos !-CD8-FITC
(eBioscience) a una dilución 1:200; y para detectar su activación !-CD107a-PE (BD
Pharmingen) a una dilución 1:300 y !-CD69-PECy7 (BD Pharmingen) a una dilución
1:300.
1. Caracterización de la VCS en linfocitos B.
Infección de linfocitos B.
La Salmonella-GFP se incubó en caldo LB con 200 µg/ml de ampicilina, a 37°C, en
agitación a 180 rpm, hasta alcanzar la fase logarítmica (DO600 nm de 0.6), para realizar la
infección. Los linfocitos B de la línea celular A20 se preactivaron por 48 horas con 4% de
IFN-" (sobrenadante de hibridoma L1210). Después de estas 48 horas se incubaron 10
minutos con Salmonella typhimurium MOI 1:30, en presencia de ampicilina [200 µg/ml].
Posteriormente se centrifugaron las células a 1200 rpm por 5 minutos a 25°C. Después se
incubaron las células a 37°C por 5 minutos, pasado este tiempo se resuspendió el paquete
celular en medio DMEM con 200 µg/ml de ampicilina y se dejó incubando otros 20
13
minutos a 37°C. Se lavaron las células 2 veces con PBS-gentamicina [40 µg/ml] para
eliminar la bacteria libre. Después se dejaron incubando las células en medio DMEM con
gentamicina y ampicilina hasta alcanzar 1, 3 y 18 horas post-infección. En cada tiempo se
tomaron 20 x 106 células para la extracción de vesículas totales.
Extracción de vesículas.
Para realizar la extracción de vesículas, se siguió la metodología descrita por
Ramachandra et al. (22), con ciertas modificaciones. Resumiendo, 20 x 106 células se
centrifugaron a 1400 rpm por 5 minutos. Se descartó el sobrenadante y las células se
resuspendieron en 2 ml de buffer (tris [10mM]-EDTA [1mM] y sacarosa [0.25M]) con
inhibidores de proteasas (1/4 tableta de Complete). Se rompieron las células con un
homogenizador Dounce. El lisado se centrifugó a 1400 rpm por 5 minutos a 4°C. Se
colocaron 100 µl/pozo del sobrenadante con vesículas en una placa de 96 pozos. Se
centrifugó a 3600 rpm por 10 minutos a 4°C. Se descartó el sobrenadante y se
resuspendieron las vesículas en solución FACS (PBS, 10% SFB, 0.1% BSA, 0.1%
saponina, 1% de suero de chivo y 1.6 µg/ml de gamma-globulina humana) para proseguir
con la tinción.
Tinción de vesículas.
Las vesículas se incubaron a 4°C por 30 minutos, con anticuerpos dirigidos contra
Rab5 (de conejo, purificado), Rab7 (de conejo, purificado), MHC-I (de ratón, sobrenadante
de hibridoma), MHC-II (de ratón, sobrenadante de hibridoma), Nramp (de conejo,
purificado), Lamp1 (de rata, sobrenadante de hibridoma), y Arf6 (de conejo, purificado). Se
utilizaron como controles los anticuerpos irrelevantes AFG120.1.2 (de ratón) y anticuerpos
dirigidos contra OVA (de conejo). Posteriormente se lavaron las vesículas dos veces con
solución FACS. Se incubaron 30 minutos a 4°C con los anticuerpos secundarios acoplados
a PE dirigidos contra conejo, ratón y rata, dependiendo. Después de dos lavados se fijaron
con PBS-formaldehído 2%.
14
Análisis de vesículas.
Las vesículas teñidas se analizaron en el citómetro de flujo FACScalibur,
adquiriendo 50000 eventos por muestra. El análisis se llevó a cabo mediante el programa
Win-MDI, considerando las que contienen Salmonella (VCS) como positivas en el canal de
fluorescencia FL-1, y las que no contienen Salmonella (VNS) negativas en este canal.
Unidades formadoras de colonias.
En los tiempos señalados post-infección, se tomaron 100 µl del sobrenadante con
vesículas, se lisaron con PBS-Tritón 10 % y se sembró sobre las placas por duplicado en
agar SS (Salmonella-Shigella) con ampicilina (200 µg/ml) en diluciones 10-1 y 10-2. Se
dejaron incubando toda la noche a 37°C y a la mañana siguiente se contaron las UFC.
2. Caracterización de las poblaciones de precursores de linfocitos B de
médula ósea en ratones infectados con Salmonella typhimurium .
Infección de ratones.
La bacteria Salmonella typhimurium se incubó en caldo LB, a 37°C, en agitación a
180 rpm, hasta alcanzar la fase logarítmica (DO600 nm de 0.6), para realizar la infección. Se
infectaron ratones BALB/c con 50 UFC de Salmonella typhimurium, por vía IP. A los 3, 5,
15, 30 y 60 días post-infección, se sacrificaron los animales y se obtuvo un homogenizado
de células de médula ósea.
Tinción de células provenientes de médula ósea.
Las células de médula ósea se suspendieron en PBS con 2% SFB y 5 % de suero de
rata. Posteriormente se incubaron 20 minutos a 4°C con anticuerpos !- B220, !-CD43, !-
15
CD19, !-IgM y !-CD138. Se lavaron 2 veces y se resuspendieron en PBS-2%
formaldehído.
Purificación de precursores de linfocitos B de médula ósea.
Las células se purificaron mediante un citómetro de flujo (FACSVantage, BD),
tomando en cuenta los siguientes parámetros para definir cada población (23).
Pre-Pro B B220+ CD43+ CD19-
Pro B B220+ CD43+ CD19+
Pre B B220+ CD43- CD19+ IgMlo
B Inmaduras B220+ CD43- CD19+ IgMhi
B “Näive” B220+ CD43- CD19+ IgMhi IgD+
Células Plasmáticas CD138+
Unidades formadoras de colonias.
Cada población de células purificadas se lisó con PBS-Tritón 10 % y se sembró en
las placas por duplicado en agar SS (Salmonella-Shigella) en diluciones 10-1 y 10-2. Se
dejaron incubando toda la noche a 37°C y a la mañana siguiente se contaron las UFC.
3. Caracterización de los efectos de la infección con Salmonella sobre la
diferenciación de los linfocitos B a células plasmáticas.
Purificación de linfocitos B.
A partir de células de bazo de ratón BALB/c, se eliminaron los eritrocitos con
cloruro de amonio (Pharmingen) incubando 10 minutos a 37°C, posteriormente se lavaron
las células 2 veces con PBS. Se resuspendieron las células a una concentración de 108
16
células/ml, en PBS con 2% de SFB y 5% de suero de rata. A partir de esta suspensión de
células, la purificación se llevó a cabo mediante el sistema de separación negativa de
linfocitos B EasySep (StemCell Technologies). Brevemente, el procedimiento consiste en
lo siguiente.
1. Colocar la suspensión celular en un tubo de poliestireno de 12 x 75 mm (Becton
Dickinson). Añadir el bloqueador FcR de ratón, mezclar e incubar 15 minutos a 4°C.
2. Agregar el cocktail de anticuerpos para selección negativa de células B. Mezclar e
incubar a 4°C por 15 minutos.
3. Añadir el cocktail de selección con biotina e incubar 15 minutos a 4°C.
4. Añadir las nanopartículas magnéticas, las cuales están asociadas a anticuerpo !-
biotina. Incubar 15 minutos a 4°C.
5. Llevar la suspensión a un volumen de 2.5 ml con PBS-SFB.
6. Colocar el tubo en el magneto (StemCell Technologies) y dejarlo por 5 minutos.
7. Invertir el tubo en un movimiento, vaciando el contenido que no se adhirió al
magneto en un tubo nuevo, donde se encuentra una suspensión enriquecida con células
B.
Infección de células.
Salmonella-GFP se incubó en caldo LB con 200 µg/ml de ampicilina, a 37°C, en
agitación a 180 rpm, hasta alcanzar la fase logarítmica (DO600 nm de 0.6), para realizar la
infección. Los linfocitos B purificados se incubaron 1 hora a 37°C con Salmonella
typhimurium-GFP MOI 1:60, en presencia de ampicilina. Posteriormente se lavaron las
células 2 veces con PBS-gentamicina (40 µg/ml) para eliminar la bacteria libre. Después se
purificaron los linfocitos B infectados (GFP+) mediante el citómetro de flujo
(FACSVantage, BD).
Activación de células.
Los linfocitos B infectados se resuspendieron en medio DMEM (Gibco) con
200µg/ml de ampicilina y 40 µg/ml de gentamicina. 5x105 linfocitos B infectados con
17
Salmonella-GFP se incubaron por pozo en placas de 96 pozos durante 3 días en presencia
de LPS [10 µg/ml] ó !-IgM [5 µg/ml] + !-CD40 [1 µg/ml] + IL-4 [200 U/ml] + IL-21 [50
ng/ml], para promover su diferenciación hacia células plasmáticas (24). El anticuerpo !-
IgM se colocó en los pozos 2 horas antes de la incubación de las células para sensibilizar el
pozo con el anticuerpo, posteriormente se colocaron las células y los demás estímulos
descritos previamente.
Tinción de células.
Después de 3 días las células se cosecharon y se incubaron con !-CD138 por 20
minutos, posteriormente se lavaron con PBS 2 veces y se fijaron con PBS 2%
formaldehido.
Análisis de las células.
Las células teñidas se analizaron en el citómetro de flujo (FACScalibur, BD),
adquiriendo 20000 eventos por muestra. El análisis se llevó a cabo mediante el programa
Summit (Beckman Coulter).
4. Identificación de la capacidad de los linfocitos B infectados con
Salmonella para presentar antígeno en moléculas de MHC-I.
Purificación de linfocitos B infectados con Salmonella typhimurium.
Se purificaron linfocitos B de bazo de ratón y se infectaron con Salmonella
typhimurium-GFP, como se describió en el inciso anterior. Después se purificaron los
linfocitos B infectados (GFP+) mediante el citómetro de flujo (FACSVantage, BD). Se
resuspendieron las células en medio de cultivo DMEM en presencia de gentamicina, y se
dejaron incubando 24 horas.
18
Obtención de linfocitos T citotóxicos.
Se infectaron ratones BALB/c con Salmonella typhimurium (20 UFCs, vía IP). A
los 7 días se obtuvo el bazo de estos ratones. A partir de estas células de bazo se purificaron
linfocitos T CD8 mediante el sistema de selección negativa de linfocitos T CD8 (EasySep,
StemCell Technologies), de la manera que se describió anteriormente para linfocitos B.
Ensayo de presentación a linfocitos T citotóxicos.
Los linfocitos T CD8 obtenidos se incubaron con los linfocitos B infectados con
Salmonella por 6 horas, en una relación 2:1 (6x106 linfocitos T CD8 y 3x106 linfocitos B),
en presencia del anticuerpo !-CD107a (25) (dilución 1:300). También se cultivaron con
linfocitos B sin infectar, y linfocitos B que estuvieron en cultivo con la bacteria, pero no se
infectaron. Como control positivo se activaron linfocitos T CD8 con PMA [2 ng/ml] y
ionomicina [200 ng/ml], en presencia del anticuerpo !-CD107a por 6 horas.
Tinción de células.
Después de 6 horas de cultivo, se cosecharon las células y se tiñeron con los
anticuerpos !-CD19-APC, !-CD8-FITC y !-CD69-PECy7 por 30 minutos, se lavaron 2
veces con PBS y se fijaron con PBS-formaldehído 2%.
Análisis de las células.
Las células teñidas se analizaron en el citómetro de flujo (FACScalibur, BD). Se
adquirieron 20000 eventos por muestra. El análisis se llevó a cabo mediante el programa
Summit (Beckman Coulter).
19
Resultados.
1. En linfocitos B no hay un control de la infección con Salmonella y la
VCS no se remodela.
Los linfocitos B son, al igual que los macrófagos, blancos de la infección por
Salmonella typhimurium. En nuestro grupo demostramos anteriormente que in vitro las
células B no son capaces de utilizar la vía alterna de presentación de antígenos de
Salmonella en moléculas de MHC-I (20), además de que la bacteria permanece en un
compartimiento con características lisosomales. Sin embargo no conocemos la vía
endocítica que sigue Salmonella dentro de los linfocitos B. Investigamos las características
moleculares de la vacuola que contiene a Salmonella (VCS) en estas células. Se infectaron
con Salmonella-GFP los linfocitos B de la línea celular A20 y se obtuvieron las vesículas
como se describe en Material y Métodos.
El nivel de infección de los linfocitos B se mantuvo desde el inicio hasta 18 horas
post-infección (Figura 3a), sin que observáramos control por parte de la célula B sobre la
infección. Se analizó el porcentaje de vesículas que contienen Salmonella (GFP+),
encontramos que la bacteria se encuentra en menos del 2% de las vesículas (Figura 3b), y
en estas vesículas que contienen Salmonella, la cantidad de bacteria se incrementa con el
tiempo (Figura 3c).
Figura 3. Las células B no controlan la infección con Salmonella. a) UFC de Salmonella en células A20 infectadas, a 30 minutos, 1, 3 y 18 horas post-infección. b) Porcentaje de VCS de células A20 a 1, 3 y 18 horas post-infección. c) UFC de Salmonella en 100 µl de vesículas provenientes de células A20 infectadas a 1, 3 y 18 horas post-infección. Cada barra representa la media + Desviación Estándar.
a b c
20
Procedimos con la caracterización de la VCS mediante el análisis de la expresión de
marcadores de la vía endocítica. Para esto medimos moléculas de MHC clase I y clase II,
Rab 5 como marcador de endosomas tempranos, Rab 7 como marcador de endosomas
tardíos, Nramp como marcador de fagosomas y Arf6 como marcador de vesículas de
reciclaje (Figura 4).
Figura 4. En las células B Salmonella se encuentra en un compartimiento lisosomal tardío. Cuantificación de a) MHC-I, b) MHC-II, c) Rab5, d) Rab7, e) Lamp 1 y f) Arf 6; en vesículas provenientes de células A20 sin activar y sin infectar (No IFN-!); de células activadas con IFN-! e infectadas con Salmonella-GFP a 1 hora post-infección (1h); 3 horas post-infección (3h) y 18 horas post-infección (18h). Se grafica la media de intensidad de fluorescencia (MFI) para la VNS (vacuola que no contiene Salmonella) y la VCS (vacuola que contiene Salmonella).
a b
c d
e f
21
Podemos observar que la VCS tiene una elevada expresión de MHC-I a 1 hora post-
infección, que disminuye a 3 horas post-infección y más a 18 horas post-infección; mientras
que en la VNS la expresión es baja y no observamos cambios con el tiempo (Figura 4a).
La expresión de MHC-II se incrementa importantemente en la VCS hasta las 18
horas post-infección; y la VNS mantiene una expresión basal de la molécula (Figura 4b). A
1 hora post-infección la VCS se encuentra en un endosoma temprano, con una elevada
expresión de Rab5 (Figura 4c), en tiempos más tardíos pierde la expresión de Rab5 y
vemos una mayor expresión de Rab7, lo que sugiere que la bacteria madura hacia un
endosoma tardío (Figura 4d). A las 18 horas post-infección encontramos a Salmonella en
un compartimiento lisosomal con una mayor expresión de Lamp1, que no observamos en la
VNS (Figura 4e).
Arf6 es un marcador de vesículas que reciclan a membrana celular. Detectamos su
expresión en la VCS a 1 hora post-infección, pero esta expresión no difiere de la expresión
basal observada en vesículas provenientes de células sin activar, sin infectar (Figura 4f); y
en tiempos posteriores no detectamos su expresión en la VCS.
2. Los precursores de linfocitos B de médula ósea se encuentran
infectados con Salmonella typhimurium.
Anteriormente describimos que las células B de médula ósea se infectan con
Salmonella typhimurium (Figura 2). No conocemos si la bacteria llega en forma libre a
médula ósea y posteriormente infecta a las células, o bien si es acarreada a médula ósea por
linfocitos B o macrófagos infectados procedentes de bazo. De cualquier manera sabemos
que hay células infectadas en médula ósea, estas células pueden morir por apoptosis
inducida por Salmonella y de esta manera liberarse e infectar otras células. La médula ósea
es el principal órgano hematopoyético en el adulto, de manera que la bacteria que se
encuentra en médula ósea podría infectar precursores de células y repercutir en su
desarrollo. Por esta razón buscamos si los precursores de linfocitos B de médula ósea se
encuentran infectados con Salmonella.
Identificamos en médula ósea de ratones BALB/c sin infectar las poblaciones de
cada precursor de célula B (23), como se muestra en la Figura 5. Las células
22
B220+CD43+CD19- corresponden a la población Pre pro B (1.8%); las células
B220+CD43+CD19+ corresponden a la población Pro B (2.5%); las células B220+CD43-
CD19+IgM-/lo corresponden a la población Pre B (11.4%); y las células B220+CD43-
CD19+IgMhi corresponden a la población de células B inmaduras (4.5%).
De acuerdo con estos parámetros, identificamos cada población en células de
médula ósea, provenientes de ratones BALB/c infectados con Salmonella typhimurium, a
diferentes tiempos post-infección para conocer si su proporción se afecta por la infección.
Además purificamos células de las poblaciones correspondientes a cada precursor de
linfocitos B, las lisamos y las sembramos en agar SS (Salmonella-Shigella) para saber si se
encuentran infectadas con Salmonella.
Analizamos a las células Pre pro B (Figura 6a), que son los precursores más
tempranos y observamos que al inicio de la infección con Salmonella su número
disminuye, posteriormente se recuperan a los 15 días post-infección, pero vuelven a
disminuir en tiempos tardíos post-infección (Figura 6a, izquierda). Las células Pre pro B se
Figura 5. Identificación de precursores de células B. Células de médula ósea de ratón Balb/c se tiñeron con anticuerpos dirigidos contra B220, CD43, CD19 e IgM. A partir de la región B220+CD43+, las células CD19- se consideran Pre pro B y las CD19+ Pro B. A partir de la región B220+CD43-, las células CD19+IgM-/lo se consideran Pre B y las CD19+IgMhi se consideran B inmaduras.
23
encuentran infectadas (Figura 6a, derecha), y a los 3 días post-infección la cantidad de
UFCs es muy elevada, mayor que en los linfocitos B totales de médula ósea (Figura 2c).
Figura 6. Los precursores de linfocitos B se infectan con Salmonella. Precursores de células B de médula ósea de ratones no infectados (NI), y de ratones infectados a 3, 5, 15, 30 y 60 días post-infección se cuantificaron (gráfica izquierda) y se lisaron para obtener el número de UFCs de Salmonella (gráfica derecha), para a) células Pre pro B, b) células Pre B, y c) células B Inmaduras. Se muestra la media + Desviación estándar.
a
b
c
24
En cuanto a las células Pro B, encontramos que en médula ósea de ratones
infectados su porcentaje disminuye considerablemente (Figura 7), desde la infección
temprana (Figura 7a) y esta disminución no se recupera en tiempos posteriores (Figura 7b).
De manera que no fue posible recuperar suficientes células purificadas para cuantificar
UFCs de Salmonella en tiempos tardíos post-infección. Sin embargo, a los 5 días post-
infección encontramos que esta población está infectada (Figura 8). Posiblemente no
encontramos esta población en tiempos posteriores ya sea porque estas células están
madurando rápidamente, como sugiere el incremento de células B inmaduras en la Figura
6c, o porque mueren por muerte inducida por Salmonella. Es necesario indagar más a fondo
si alguna de estas posibilidades es cierta.
a
Figura 7. El porcentaje de células Pro B disminuye en ratones infectados con Salmonella. Células de médula ósea de BALB/c infectados con Salmonella a) al día 5 post-infección y b) al día 15 post-infección. Panel izquierdo: gráfica de puntos donde se seleccionó la población de células B220+CD43+ (R18). Panel derecho: a partir de R18, se muestran en un histograma las poblaciones CD19- (R21) y CD19+ (R20); la última corresponde a las células Pro B.
b
25
Las células Pre B se encuentran infectadas, aunque a un nivel menor que las Pre pro
B (Figura 6b), y el número de células disminuye de manera no significativa a los 3 días
post-infección y se recupera rápidamente en los días posteriores.
Al igual que los demás precursores, las células B inmaduras se infectan desde el día
3, las UFCs recuperadas incrementan al día 4 post-infección y se mantiene la infección
hasta el día 60 (Figura 6c), también observamos que el número de estas células incrementa
con la infección, esto podría sugerir que la infección podría estar acelerando el proceso de
maduración de las células B.
Dentro de la población de células B inmaduras (B220+ CD43- CD19+ IgMhi)
podemos encontrar también linfocitos B “näive”, por lo tanto buscamos si esta población en
médula ósea se encuentra infectada. Observamos que de hecho los linfocitos B “näive” en
médula ósea están infectados (Figura 8). Este resultado podría sugerir que la bacteria es
transportada por estas células posiblemente del bazo a la médula ósea, aunque es necesario
realizar otros ensayos para concluir con solidez esta especulación.
Una vez que los linfocitos B se activan, éstos se diferencían a células plasmáticas,
las cuales se encargan de producir anticuerpos. Una forma de conocer si la infección con
Salmonella afecta la función efectora de los linfocitos B, es midiendo si las células B
infectadas pueden diferenciarse a células productoras de anticuerpo. Así que purificamos
células plasmáticas de médula ósea, pues sabemos que los plasmocitos migran a médula
ósea, para conocer si se encuentran infectadas. Recuperamos altos números de colonias de
Salmonella a partir de las células plasmáticas desde el inicio de la infección, hasta días
Figura 8. Las células Pro B y B “näive” se infectan con Salmonella. A partir de médula ósea de ratones Balb/c a 5 días post-infección con Salmonella, se purificaron células Pro B y células B “näive”. Se lisaron para obtener el número de UFCs de Salmonella. Se muestra la media + Desviación estándar.
26
tardíos (Figura 9). No sabemos con certeza a partir de este resultado si los linfocitos B
infectados se convierten en células plasmáticas, o bien si las células plasmáticas ya
diferenciadas se infectan con Salmonella. Para averiguarlo es necesario responder el
siguiente objetivo.
3. Los linfocitos B infectados con Salmonella son capaces de diferenciarse
hacia células plasmáticas.
No sabemos si los linfocitos B infectados con Salmonella tienen la capacidad de
diferenciarse a células plasmáticas, o bien si la presencia de la bacteria interfiere con la
biología de la célula, incapacitando su función efectora de producción de anticuerpos. Para
conocer cuál de las dos posibilidades es cierta, activamos células B infectadas con
Salmonella para inducir su diferenciación hacia células plasmáticas.
Como se describe en material y métodos, se infectaron linfocitos B de bazo con
Salmonella-GFP y se purificaron los linfocitos B infectados (GFP+) por citometría de flujo.
Se cultivaron las células en presencia de LPS ó !-IgM+!-CD40+IL-4+IL-21; como control
se cultivaron células en medio sin estímulo. Simultáneamente estimulamos linfocitos B
provenientes del cultivo con la bacteria, pero que no se infectaron (GFP-, purificados por
citometría de flujo; se comprobó la ausencia de bacteria por UFCs). Después de 3 días de
Figura 9. Las células plasmáticas se encuentran infectadas con Salmonella. A partir de células de médula ósea de ratones no infectados (NI), y de ratones infectados a 3, 5, 15, 30 y 60 días post-infección se cuantificaron las células plasmáticas (gráfica izquierda), se purificaron y se lisaron para obtener el número de UFCs de Salmonella (gráfica derecha). Se muestra la media + Desviación estándar.
27
activación se cosecharon las células y se cuantificaron las células plasmáticas por su
expresión de CD138.
En la Figura 10 observamos que antes de su activación hay un porcentaje basal de
células plasmáticas, que es igual para las células infectadas y no infectadas (5%). Después
de 3 días de activación, en ausencia de estímulo las células infectadas se diferencían a
células plasmáticas, de manera que encontramos que el 15% de las células son CD138+; no
pasa lo mismo con las células no infectadas (8%). Cuando estimulamos a las células con
LPS, encontramos que la proporción de células plasmáticas es de 18% para ambos casos,
células infectadas y sin infectar, esto es un incremento discreto para las primeras, pero un
incremento sustancial para las últimas. El estímulo de !-IgM+!-CD40+IL-4+IL-21 induce
en los linfocitos B infectados un incremento de hasta el 24% en su diferenciación a células
plasmáticas, mientras que en los linfocitos no infectados (17.5%) no se observan
diferencias con respecto al estímulo con LPS.
Figura 10. Los linfocitos B infectados con Salmonella se diferencían a células plasmáticas. Se grafica el porcentaje de células plasmáticas (CD138+) al tiempo 0 después de la purificación de células (T0 S/A), después de 3 días de cultivo sin estímulo (3 Días post-activación S/A), después de 3 días de activación con LPS (3 Días post-activación LPS), y después de 3 días de activación con !-IgM+!-CD40+IL-4+IL-21 (3 Días post-activación !-IgM); para linfocitos B sin infectar (barras negras) y linfocitos B infectados con Salmonella (barras blancas). Se muestra la media + Desviación Estándar de 2 experimentos realizados por duplicado.
28
4. Los linfocitos B infectados con Salmonella no inducen una respuesta
citotóxica por parte de los linfocitos T CD8.
Los linfocitos B son células presentadoras de antígeno profesionales (APC), además
de los macrófagos y las células dendríticas. En los macrófagos se ha descrito su capacidad
para procesar y presentar antígenos de Salmonella de manera cruzada, es decir, en
moléculas de MHC-I, para su detección por parte de los linfocitos T citotóxicos (26). En
linfocitos B, aunque se ha descrito que tienen la capacidad de hacer presentación cruzada
de antígenos (27), no sabemos si es capaz de presentar antígenos de Salmonella en
moléculas de MHC-I.
Esta ocasión quisimos saber si ex vivo linfocitos B infectados con Salmonella tenían
la capacidad de presentar antígenos de Salmonella en moléculas de MHC-I. Para esto
cultivamos linfocitos T CD8 provenientes de ratones infectados con Salmonella, con
linfocitos B infectados con Salmonella, como se describe en Material y Métodos.
Figura 11. Los linfocitos B infectados con Salmonella no inducen una respuesta por linfocitos T CD8. Se grafica el porcentaje de células T CD8 que expresan CD107a (barras grises) y las que expresan CD107a y CD69 (barras negras). Células T CD8 purificadas se trataron por 6 horas en presencia de los siguientes estímulos. Control: se cultivaron con medio solamente. B Sin Infectar: se cocultivaron con linfocitos B sin infectar. B No Infectados: se cocultivaron con linfocitos B que estuvieron en presencia de Salmonella, pero no se infectaron (GFP-). B Infectados: se cocultivaron con linfocitos B infectados con Salmonella (GFP+). PMA/ionomicina: se activaron con PMA y ionomicina. Cada barra representa la media + Desviación Estándar.
29
Detectamos la activación y consecuente degranulación de linfocitos T CD8 por la expresión
superficial de CD107a (25), además corroboramos su activación por la presencia de CD69.
En la Figura 11 observamos que menos del 2% de los linfocitos T CD8 en reposo
expresan CD107a. Cuando estas células se cultivan con linfocitos B en reposo sin infectar,
observamos que hay un incremento en las células que expresan este marcador (6%). Sin
embargo, cuando cultivamos a los linfocitos T citotóxicos con linfocitos B que estuvieron
en contacto con la bacteria pero que no se encuentran infectados, no observamos un cambio
en el porcentaje de células que expresan CD107a (6%). No observamos un incremento en
las células T CD8 activadas, detectadas por la presencia de CD69, y que se degranulan
(menos del 1%), ni en el porcentaje de las células que se degranulan (6% CD107a+) cuando
se cultivan en presencia de linfocitos B infectados con Salmonella, lo que nos dice
indirectamente que los linfocitos B que se infectan con Salmonella son incapaces de
presentar antígenos de esta bacteria en moléculas de MHC-I. Al comparar con el control
positivo, donde activamos linfocitos T CD8 con PMA y ionomicina, observamos en éstos
que el porcentaje de células que se degranulan son 17 y las que además expresan CD69 son
8%. De manera que los linfocitos B no tienen la capacidad de inducir una respuesta
citotóxica por parte de los linfocitos T CD8.
30
Discusión.
Previamente demostramos que los linfocitos B se infectan con Salmonella (20).
Este hallazgo nos llevó a preguntarnos los efectos que la infección tendría sobre la función
biológica de estas células.
En primer lugar analizamos el compartimiento que ocupa Salmonella dentro de los
linfocitos B. Encontramos que las células no sólo no controlan la infección con Salmonella,
sino además por el incremento en las UFCs podemos inferir que la bacteria se está
replicando dentro de las vesículas que la contienen. Al analizar la expresión de marcadores
endocíticos en las vacuolas provenientes de estas células, observamos que en linfocitos B
Salmonella se encuentra en un compartimiento tardío lisosomal, rico en moléculas de
MHC-II. La presencia de estas moléculas sugiere que Salmonella está siguiendo el tráfico
convencional que llevan las vacuolas que contienen antígenos exógenos (28). Al comparar
con la vacuola que contiene a Salmonella en macrófagos, observamos que en éstos hay una
remodelación de dicha vacuola, la cual permanece en un compartimiento tardío no
lisosomal, rico en moléculas de MHC-I y que recicla a membrana plasmática (19).
En macrófagos se lleva a cabo una vía alterna de procesamiento en la cual se
secretan antígenos de Salmonella y éstos se unen a moléculas de MHC-I vacías en la
superficie de las células (18), posiblemente esta vacuola que recicla a membrana plasmática
es la responsable de que se lleve a cabo esta vía de procesamiento. Anteriormente
describimos que los linfocitos B A20 no llevan a cabo esta vía de procesamiento (20),
suponemos que esto es porque en éstas células no se remodela la vacuola que contiene a
Salmonella y sigue el tráfico que conlleva a su presentación por moléculas de MHC-II, esto
concuerda con la elevada expresión de moléculas de MHC-II que encontramos en estas
vesículas.
Por ser Salmonella un patógeno intracelular, es necesario que se establezca una
respuesta citotóxica en contra de las células infectadas para lograr un eficiente control y
eliminación de la infección (12, 26, 29). Para esto es necesario que las células T CD8
identifiquen y reconozcan a las células infectadas y esto sólo se puede lograr si dicha célula
infectada tiene la capacidad de mostrar en las moléculas de MHC-I antígenos provenientes
de Salmonella (29). Nos cuestionamos si las células B de ratón tienen la capacidad de
31
presentar antígenos de Salmonella en moléculas de MHC-I. Aunque tenemos el antecedente
que in vitro no llevan a cabo la vía alterna de procesamiento que describimos para
macrófagos (18), se han descrito otras vías de procesamiento que conllevan a la
presentación de antígenos exógenos por moléculas de MHC-I (16), además se ha reportado
que los linfocitos B pueden realizar la presentación cruzada de antígenos de Micobacterium
tuberculosis fusionados a la proteína de choque térmico HSP70, en moléculas de MHC-I
(27).
No sabemos si los linfocitos B infectados con Salmonella pueden utilizar algunas de
las vías de presentación cruzada descritas anteriormente (16), que finalmente llevan a la
presentación de antígenos por MHC-I para ser reconocidas por los linfocitos T citotóxicos.
Por esta razón infectamos con Salmonella linfocitos B y los cultivamos con linfocitos T
CD8 provenientes de ratones infectados. Medimos la activación de los linfocitos T por la
expresión de CD69, y su degranulación por la expresión de CD107a en su superficie (25).
No observamos una respuesta por parte de las células T citotóxicas cuando se cultivaron
con linfocitos B infectados, esto sugiere que los linfocitos B no presentan antígenos de
Salmonella en moléculas de MHC-I, o bien pudieran no estar induciendo la activación de
las células T por una deficiente expresión de moléculas de coestimulación. La capacidad de
respuesta de estas células T CD8 es adecuada puesto que se activaron con los estímulos de
PMA y ionomicina que las llevaron a degranularse. Si lo mismo ocurre in vivo, es decir, si
los linfocitos B infectados con Salmonella no presentan antígenos de esta bacteria en MHC-
I, entonces no pueden ser detectados por los linfocitos T CD8, por lo tanto no serían
detectadas estas células infectadas, permitiendo que la bacteria sobreviva y posiblemente se
replique dentro de este nicho. De hecho sabemos que Salmonella permanece en los
linfocitos B por largos periodos de tiempo, cuantificamos bacteria tanto en linfocitos B de
bazo como de médula ósea hasta los 60 días post-infección, más aún detectamos la
presencia de la bacteria en estas células de ratones infectados hasta 150 días post-infección
(datos no mostrados). La ausencia de su reconocimiento por los linfocitos T citotóxicos
puede explicar la permanencia de la bacteria en las células B de manera crónica. En este
punto haría falta identificar la expresión de moléculas de coestimulación en linfocitos B
infectados (6, 30), así como la vía de procesamiento de Salmonella que utilizan estas
células in vivo.
32
La médula ósea es un órgano hematopoyético, pero ya no es considerada solamente
como tal, sino también como un órgano linfoide secundario, al cual arriban linfocitos B que
se activaron después de su interacción con las células T en centros germinales y llegan a
médula ósea a terminar su diferenciación hacia células plasmáticas productoras de
anticuerpos (31, 32, 33, 34). Más aún se ha descrito que linfocitos T activados y de
memoria migran a médula ósea y son capaces de responder contra antígenos provenientes
de sangre y tener una respuesta efectora en este órgano (35).
Hay reportes que indican que la médula ósea se infecta con Salmonella typhi
durante la fiebre tifoidea en humanos (36, 37, 38). De hecho, el mielocultivo es más
sensible que el hemocultivo para detectar la infección con Salmonella typhi, a pesar del
tiempo de enfermedad o el tratamiento con antibióticos (36, 39). De acuerdo con estos
reportes, nosotros describimos que en la infección in vivo en ratón encontramos Salmonella
typhimurium en linfocitos B tanto de bazo como de médula ósea (19).
La presencia de linfocitos B infectados con Salmonella en médula ósea puede llevar
a la infección y destrucción de células progenitoras (40). Las células madre
hematopoyéticas son resistentes a la infección bacteriana porque no tienen los receptores y
mecanismos de internalización para la adquisición de bacteria; sin embrago, las células
parcialmente diferenciadas, incluyendo progenitores linfoides poseen estos mecanismos y
pueden infectarse (40). De acuerdo con esto encontramos a todos los progenitores de
células B infectados con Salmonella.
El primer estadio de maduración que analizamos fue de células pre-pro-B. Esta
población parece ser más vulnerable a la infección con Salmonella que los demás
precursores. Al inicio de la infección encontramos una dramática disminución en el número
de estas células, seguida de la recuperación de los números en días posteriores. Esta
disminución inicial puede deberse a muerte de las células inducida por Salmonella, y la
recuperación de esta población puede ser un efecto compensatorio donde se favorece la
ontogenia de células B. La población de las células pro-B, el siguiente estadio de
maduración, se pierde con la infección, de manera que no fue posible seguir una cinética de
infección en estas células. La pérdida de esta población pudiera deberse a la inducción de
su maduración, esta suposición se apoya además en el hecho de que en el último estadio de
maduración, que corresponde a las células B inmaduras, observamos un incremento del
33
200% en el número de éstas. Este sustancial incremento de células inmaduras concuerda
con un incremento de 2 logaritmos en la carga bacteriana proveniente de estas células.
Pensamos que si Salmonella indujera muerte celular en estos progenitores, observaríamos
también una disminución en las células B inmaduras, más aún cuando hay una aparente
multiplicación de la bacteria. Esto nos lleva a sugerir que en estas poblaciones Salmonella
pudiera no estar induciendo muerte, sino una aceleración de la maduración. En este
contexto, se ha reportado que la señalización a través del receptor tipo Toll (TLR) 4 en
precursores tempranos de células B promueve la maduración de células B (41). De acuerdo
con esta evidencia, los precursores de células B de ratones infectados pueden estarse
diferenciando en respuesta al estímulo mitogénico (LPS), y el incremento que observamos
en el número de células B inmaduras podría entonces resultar de proliferación dependiente
de TLR-4.
Como describimos anteriormente, la médula ósea, además de progenitores de
células B, contiene linfocitos B “näive” que migraron de bazo (42). También encontramos a
estas células infectadas con Salmonella. Sabemos que los linfocitos B de bazo se infectan
con Salmonella, éstos podrían viajar a médula ósea transportando la bacteria y por
consiguiente ser los responsables de su diseminación causando la infección que observamos
en los precursores analizados.
La activación de los linfocitos B lleva al desarrollo de células productoras de
anticuerpo, también llamadas células plasmáticas (31, 33). Cuando se activan los linfocitos
B y comienzan su diferenciación en el centro germinal de los folículos linfoides
secundarios, pueden migrar a médula ósea, donde perfeccionan su diferenciación hacia
células plasmáticas (31, 34). Encontramos células plasmáticas infectadas con Salmonella en
médula ósea así como en bazo. Al inducir su diferenciación, comprobamos que los
linfocitos B infectados con Salmonella son capaces de convertirse en células plasmáticas.
Sorprendentemente la bacteria no interfiere con la función efectora de los linfocitos B.
Sugerimos que el mecanismo de invasión podría ser el siguiente. En bazo se
infectan los linfocitos B con Salmonella, algunos de estos linfocitos B migran a médula
ósea como células B näive y diseminan la infección en este órgano causando que la
bacteria invada progenitores de células B causando de manera colateral su pronta
maduración y desarrollo; por otro lado, otras células B de bazo infectadas con Salmonella
34
se activan, comienzan su proceso de diferenciación y migran a médula ósea donde terminan
de transformarse en células plasmáticas. Falta abordar la capacidad de estas células
plasmáticas infectadas de producir anticuerpos.
Una interrogante que queda es el mecanismo mediante el cual el linfocito B
internaliza a Salmonella. Con respecto a este punto, recientemente Souwer et al. (43)
reportaron que linfocitos B de humano internalizan a Salmonella a través de su receptor de
célula B (BCR). Sin embargo estos datos deben tomarse con cautela debido a que el modelo
que estos autores utilizan no se asemeja a la infección natural. Utilizan una línea celular de
linfocitos B humanos, los cuales se cultivan en presencia de Salmonella typhimurium
opsonizada con un anticuerpo tetramérico que consta de dos especificidades, una reconoce
IgM y la otra antígenos de la bacteria. Como la fracción !-IgM se une al BCR de los
linfocitos B y esto conlleva a la internalización de Salmonella, los autores concluyen que se
requiere el reconocimiento de la bacteria por el BCR para posteriormente endocitarla. Pero
estos datos no demuestran que sólo las clonas de linfocitos B específicas para antígenos de
Salmonella se infecten con esta bacteria. Nosotros no negamos que los linfocitos B que
tienen un BCR específico para Salmonella utilicen este mecanismo para internalizarla, no
obstante pensamos que la bacteria es capaz de infectar clonas de linfocitos B no específicas
para Salmonella a través de otro mecanismo. En nuestro grupo hemos observado que en
linfocitos B Salmonella induce su internalización a través de macropinocitosis (datos no
publicados), de la misma manera que lo hace en macrófagos, este mecanismo es
independiente del BCR y aunque no hemos investigados si este evento ocurre en los
precursores de células B, pensamos que podría explicar la internalización de la bacteria en
células inmaduras que aún no expresan BCR.
En este trabajo encontramos que Salmonella inhibe su presentación en moléculas de
MHC-I por un lado, y por el otro no afecta el efecto biológico del linfocito B. Esto puede
facultar a la bacteria para pasar desapercibida por el sistema inmunológico, permitiendo la
función normal de su célula blanco y así sobrevivir por largos periodos de tiempo dentro de
su huésped.
35
Conclusión.
El linfocito B es un nicho de sobrevivencia de Salmonella. Dentro de éste la bacteria
permanece en una vacuola que no se remodela y tiene características de fagolisosoma
tardío, rico en moléculas de MHC-II. El linfocito B es incapaz de inducir una respuesta por
parte de las células T citotóxicas, de manera que Salmonella permanece imperceptible al
sistema inmunológico. Además los precursores de linfocitos B de médula ósea se infectan
con Salmonella y son inducidos a madurar. La función efectora de los linfocitos B no se ve
afectada por la infección, pues son capaces de convertirse en células plasmáticas.
36
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Short communication
B cell precursors are targets for Salmonella infection
Denisse Castro-Eguiluz a,d, Rosana Pelayo b, Victor Rosales-Garcia f, Roberto Rosales-Reyes c,e,Celia Alpuche-Aranda c, Vianney Ortiz-Navarrete a,*
aDepartamento de Biomedicina Molecular, Centro de Investigacion y de Estudios Avanzados (CINVESTAV), Mexico, D.F., MexicobUnidad de Investigacion Medica en Enfermedades Oncologicas, Centro Medico Nacional Siglo XXI, Mexico, D.F., MexicocDepartamento de Medicina Experimental, Facultad de Medicina UNAM-HGM, Mexico, D.F., MexicodDepartamento de Inmunologıa, Escuela Nacional de Ciencias Biologicas, IPN, Mexico, D.F., MexicoeUnidad de Investigacion en Enfermedades Oncologicas, Hospital Infantil de Mexico Federico Gomez. Mexico, D.F., MexicofUnidad de Citometrıa Flujo, Centro de Investigacion y de Estudios Avanzados (CINVESTAV), Mexico, D.F., Mexico
a r t i c l e i n f o
Article history:Received 24 February 2009Received in revised form7 April 2009Accepted 9 April 2009Available online xxx
Keywords:SalmonellaB cellsBone marrowProgenitors
a b s t r a c t
We previously reported that, in mice, B cells are a reservoir for bacteria during Salmonella infection. Here,we show that, within the bone marrow, B cells and their precursors are targeted for infection bySalmonella enterica serovar typhimurium. Our data suggest that B cells within the bone marrow may bea bacterial niche during chronic Salmonella infection.
! 2009 Elsevier Ltd. All rights reserved.
1. Introduction
The bone marrow is no longer considered simply a hematopoi-etic organ, but also a secondary-like lymphoid organ. Activated Bcells migrate to this vital compartment following T cell interactionswithin germinal centers and terminally differentiate to antibody-secreting plasma cells [1,2]. Moreover, memory and activated T cellsare known to migrate to the bone marrow, where T cell primingagainst blood borne antigens can take place [3].
Recent findings indicate that the bone marrow becomes infec-ted by Salmonella typhi during typhoid fever. In fact, bone marrowcultures are more sensitive to detecting Salmonella infection thanblood cultures regardless of the duration of illness and antibiotictreatment [4,5]. We have previously shown that splenic B cells areinvaded during in vivo murine infection [6], making it highly likelythat Salmonella-infected B cells may also be found in the bonemarrow.
2. Results and discussion
To determine the persistence of Salmonellawithin B cells, Balb/cmicewere infectedwith Salmonella typhimurium. At 3, 5,15, 30, and60 days post-infection, splenic B cells andmonocytes were purified,lysed with 10% Triton X-100, and plaqued in SS agar to quantifyviable bacteria. The extent of Salmonella that was recovered from Bcells was comparable to that from monocytes (Fig. 1A). In fact, aninfection lasting 60 days was observed in both cell populations.Analysis of longer time points following infection was not per-formed due to the high mortality index seen by day 60.
As part of its infection process, invasive Salmonella has beenreported to induce apoptosis in macrophages, allowing the path-ogen to avoid the bactericidal mechanisms that macrophages soefficiently perform [7]. Measurement of the total number of B cellsin the spleen of infected mice at the same post-infection timepoints showed no substantial differences between infected andnon-infected animals (Fig. 1B), suggesting that cell death due toSalmonella infection is either too little to detect or that populationdynamics is fast in this particular model.
To investigate whether infected B cells may be found in thebone marrow, we infected Balb/c mice with GFP-expressingSalmonella. Within the total bone marrow, infected CD19! B cellsconstituted 1.25%, infected CD11b! myeloid cells made up 1.73%,
* Correspondence to: V. Ortiz-Navarrete, Departamento de Biomedicina Molec-ular, Centro de Investigacion y de Estudios Avanzados (CINVESTAV), Av. IPN No.2508, Colonia San Pedro Zacatenco, Delegacion Gustavo A. Madero, Mexico, D.F. C.P.07360, Mexico. Tel.: !52 55 5747 3324; fax: !52 55 5747 3938.
E-mail address: [email protected] (V. Ortiz-Navarrete).
Contents lists available at ScienceDirect
Microbial Pathogenesis
journal homepage: www.elsevier .com/locate/micpath
ARTICLE IN PRESS
0882-4010/$ – see front matter ! 2009 Elsevier Ltd. All rights reserved.doi:10.1016/j.micpath.2009.04.005
Microbial Pathogenesis xxx (2009) 1–5
Please cite this article in press as: Castro-Eguiluz D, et al., B cell precursors are targets for Salmonella infection, Microbial Pathogenesis (2009),doi:10.1016/j.micpath.2009.04.005
and 0.61% was composed of infected CD138! plasma cells(Supplemental Figure 1).
Bone marrow infection may lead to the destruction of progen-itor cells [8]. Although quiescent hematopoietic stem cells areresistant to bacterial infection due to a lack of the essential recep-tors and internalization mechanisms for bacterial uptake, partiallydifferentiated cells, including lymphoid progenitors, possess thesemechanisms and may become infected [8]. Thus, we would expectto find infected B cell precursors within this compartment. Fromthe bone marrow of infected mice, we purified B cell precursors,namely pre-pro B cells, pre-B cells, and immature B cells, as well asplasma cells. Once isolated, these cells were lysed and plaqued toquantify the presence of Salmonella within each cell fraction.
The total number of pre-pro B-enriched cells was reduceddramatically at day 3 post-infection; however, the number of cellsrecovered by day 15 (Fig. 2A, left panel). Pre-pro B cells becameinfected with Salmonella by day 3 post-infection (Fig. 2A, rightpanel). At later time points, only 103 bacteria were recovered eventhough the infection was maintained for up to 60 days. TheB220!CD43!CD19" population defined as pre-pro B cells isheterogeneous and comprises only fraction A [9,10]. As such, thispopulation also contains NK cells, pDCs, and IKDC precursors[11,12], which are also likely to become infected by Salmonella.Indeed, the B220!CD43!CD19"CD11c! plasmacytoid dendritic cellpopulation, along with B220!CD43!CD19"CD11c" cells, whichincluded the pre-pro B-enriched fraction, was infected (Fig. 3A).Therefore, all precursors contained in fraction A were a target forSalmonella infection.
B220!CD43!CD19! pro B cells undergo development througha well-defined pathway. We assessed these cells throughoutSalmonella infection and discovered that their number decreaseddramatically (data not shown), with no recovery seen even by day60 post-infection. Due to the small cell numbers, it was very diffi-cult to obtain enough cells to measure intracellular Salmonellacolony forming units (CFUs). As such, only pro B cells from infectedmice at 5 days post-infection were analyzed (Fig. 3B) and found tobe infected. It is likely that the observed low cell numbers might bedue to Salmonella-induced cell death. Alternatively, infection maypromote a high rate of maturation, as suggested by the increasednumber of immature B cells (Fig. 2C).
B220!CD43"CD19!IgMlo/" pre-B cells also became infected bySalmonella (Fig. 2B, right panel). The bacteria recovered was 4logarithms less than that in pre-pro B cells despite maintenance ofthe level of infection throughout all the time points analyzed. Weinitially observed a slight reduction in pre-B cells after infection,but the cell numbers recovered swiftly (Fig. 2B, left panel).
In contrast to pre-pro B cells and pre-B cells, we found that thenumber of immature B cells increased significantly at 3 days post-infection (Fig. 2C, left panel). Cells were infected (Fig. 2C, right
panel) and by day 5 post-infection the bacterial load increased 2logarithms while the infection was maintained until day 60. TheB220!CD43"CD19!IgMhi immature B cell population could containmature B cells that migrated from the spleen [13]. Fig. 1 shows thatsplenic mature B cells became infected with Salmonella, and thatthese infected spleen-derived mature B cells may reach the bonemarrow. Indeed, Salmonella-infected naive B cells were found in thebone marrow of infected mice (Fig. 3B), indicating that this pop-ulation could be responsible for disseminating the bacteria to thebone marrow, causing the observed infection in all the B cellprecursors analyzed.
This infection may not arrest B cell development, therebyallowing the cells to differentiate to the next stages of maturation.As a result, cells at varying stages of maturation were infected. Thepre-pro B cell-enriched fraction appeared to be more vulnerable toinfection than the other stages. This population decreased innumber at the beginning of the infection, suggesting that the cellscould be dying from Salmonella-induced cell death. The subsequentrecovery could be a result of a compensatory B cell ontogeny. In thiscontext, studies have shown that signaling through Toll-likereceptor (TLR) 4 in early B cell precursors could promote B cellmaturation [14]. According to this evidence, these precursors maybe differentiating in response to mitogenic stimuli, and the highernumber of immature B cells could result from TLR4-dependentproliferation of this B cell subset [15].
Next, plasma cells were analyzed for Salmonella infection(Fig. 2D, right panel). These experiments revealed 106 CFUs by day3 post-infection, which decreased to 105 CFUs by day 60. Thus,bone marrow plasma cells may hold a significant bacterial loadthroughout the course of infection; however, we did not observeany differences in plasma cell numbers (Fig. 2D, left panel).Within the bone marrow, other B cell subsets express CD138 [16],making it possible that we included some B cell precursors in ouranalysis. Furthermore, as can be seen in Supplementary Figure 1,a significant decrease in CD138! cells was observed in infectedmice compared to non-infected control animals. This decreasecould coincide with what we observed in pre-pro B cells (Fig. 2A)as the remaining 0.61% of the CD138! cells (SupplementaryFigure 1A) may correspond to Salmonella-infected plasma cells.Additionally, we analyzed the splenic CD138! population thatincluded only plasma cells and found Salmonella infection (datanot shown). Altogether, these results demonstrate that plasmacells also become infected during Salmonella infection. Becauseplasma cells have been shown to migrate to the bone marrow,where they eventually die of apoptosis [17], these findingssuggest that these cells may be involved in further disseminatingthe bacteria. Whether these Salmonella-infected cells becomeimpaired in the production and secretion of antibody remains tobe investigated.
60301553NI107
108
109
Days post-infection
# C
D1
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Fig. 1. B cells were infected in vivo. A. Salmonella CFUs from 107 CD19! B cells or Mac-1! monocytes were purified from the spleen of Salmonella-infected Balb/c mice at 3, 5, 15, 30,and 60 days post-infection. B. The number of B cells from the spleen of non-infected (NI) mice or Salmonella-infected mice at 3, 5, 15, 30, and 60 days post-infection. Eachexperiment was performed three times per time point with two mice in each experiment. Data are represented as the mean# SD.
D. Castro-Eguiluz et al. / Microbial Pathogenesis xxx (2009) 1–52
ARTICLE IN PRESS
Please cite this article in press as: Castro-Eguiluz D, et al., B cell precursors are targets for Salmonella infection, Microbial Pathogenesis (2009),doi:10.1016/j.micpath.2009.04.005
The percentage of infected cells was low in the bone marrow(Supplementary Figure 1). To understand whether this per-centage was due to a low phagocytic capacity in these cells, weassessed their ability to phagocytize latex beads of varying sizesas well as Salmonella (Supplemental Table 1). These studiesrevealed that all cells were capable of phagocytizing 0.1 mmbeads. Pre-pro B cells were very efficient at acquiring beads aslarge as 2 mm (87%), while pre-B cells and immature B cells wereunable to acquire beads larger than 0.1 mm. Of the total B cells,19% could phagocytize 2-mm beads. Plasma cells had an increasedability to engulf all beads that was even greater than monocytes
(47% versus 23% for 2-mm beads, respectively). Collectively, theseresults indicate that uptake mechanisms are lost in B cells duringthe intermediate maturation stages, but are later regained inmature B cells and increased in plasma cells. Although Salmonellais approximately 2 mm and cells are capable of engulfing 2-mmbeads, the percentage of cells that actually acquired Salmonellaremained small (2–3%) with the exception of pre-B cells, whichseemed unable to phagocytize the bacteria (0%). In summary,these findings suggest that the low percentage of infection in vivocorresponded to our in vitro observations and was not due toa lack of phagocytic capacity.
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Fig. 2. B cell precursors and plasma cells remained infected for long periods. A. Left panel. The number of pre-pro B cells from non-infected (NI) mice and Salmonella-infected miceat 3, 5, 15, 30, and 60 days post-infection. Right panel. Salmonella CFUs from pre-pro B cells. B. Pre-B cells. C. Immature B cells. D. Plasma cells. Each experiment was performed twiceper time point with two mice in each experiment. Data are represented as the mean! SD.
D. Castro-Eguiluz et al. / Microbial Pathogenesis xxx (2009) 1–5 3
ARTICLE IN PRESS
Please cite this article in press as: Castro-Eguiluz D, et al., B cell precursors are targets for Salmonella infection, Microbial Pathogenesis (2009),doi:10.1016/j.micpath.2009.04.005
3. Conclusion
Our data demonstrate that S. typhimurium survives within Bcells, B cell precursors, and plasma cell populations in the bonemarrow, suggesting that this immunological compartment may bea niche for Salmonella infection in vivo.
4. Materials and methods
4.1. Bacterial strains and growth conditions
Green fluorescent protein (GFP)-expressing Salmonella entericaserovar typhimurium (ATCC 14028) was grown in Luria Bertanibroth (Sigma) at 37 !C overnight. When necessary, 1 mg/ml ampi-cillin was used for selection. Salmonella–Shigella (SS, BD Bioxon)agar was used to quantify Salmonella colony forming units (CFUs).
4.2. Antibodies
The following antibodies were used: APC anti-mouse CD19 (BDPharmingen), rat anti-mouseMac-1hybridomasupernatant (M1/70),APC donkey anti-rat IgG (eBioscience), PE anti-mouse CD138 (BDPharmingen), PE anti-mouse CD45R/B220 (BD Pharmingen), Biotinanti-mouse CD43 (BD Pharmingen), Streptavidin-PerCP (BD Phar-mingen), Biotin anti-mouse IgM (Sigma), and R-PE-Streptavidin(Zymed).
4.3. Mouse strains and infection
Balb/c mice were infected intraperitoneally with GFP-express-ing Salmonella (50 CFUs). At 3, 5, 15, 30, and 60 days post-infection,mice were sacrificed prior to isolation of the spleen and bonemarrow from femurs. Splenocytes and bone marrow cells werecultured in RPMI 1640 (GIBCO) medium supplemented with 10%fetal bovine serum at 37 !C in 5% CO2.
4.4. Determination of infection in B cell precursors and plasma cells
Splenocytes and bone marrow cells were stained with anti-bodies against CD19 (B cells), Mac-1 (myeloid cells), and CD138(plasma cells). B cells, myeloid cells, and plasma cells were sortedon a FACSVantage flow cytometer (Becton Dickinson; MountainView, CA). Purified cells were then lysed with PBS containing 10%Triton X-100 (Sigma Aldrich), plaqued in SS agar, and incubatedovernight at 37 !C.
To determine the infection of B cell precursors, bonemarrow cellswere isolated from mice infected with GFP-expressing Salmonella at
the indicated post-infection time points. Cells were stained withantibodies against B220, CD43, CD19 and IgM. Cellswere sortedusinga FACSVantage flow cytometer as follows: B220"CD43"CD19#, topurify the pre-pro B-enriched fraction; B220"CD43#CD19"IgMlo topurify pre-B cells; and B220"CD43#CD19"IgMhi, to purify immatureB cells. These purified populations were subsequently lysed andplaqued as described above.
4.5. Percentage of infection
Bone marrow cells isolated from Balb/c mice infected with GFP-expressing Salmonella at 3 days post-infection were stained withantibodies against Mac-1, CD19, and CD138. They were analyzedusing a FACSCalibur cytometer (Becton Dickinson), and thepercentage of infection was calculated.
4.6. Phagocytosis assay
Three million bone marrow cells from non-infected Balb/c micewere cultured in RPMI 1640 (GIBCO) medium supplemented with10% fetal bovine serum at 37 !C in 5% CO2. These cells were incubatedwith FITC–labeled latex beads of varying sizes [e.g., 0.1, 0.5, 1, and2 mm (Molecular Probes)] or with GFP-expressing Salmonella ata multiplicity of infection of 30:1 or 60:1. After 2 h, the cells werewashed 3 times with PBS, and then incubated with Salmonella in thepresence of 4 mg/ml gentamicin. Cells were stained with the anti-bodies described above to identify macrophages (Mac-1"), B cells(CD19"), plasma cells (CD138"), pre-pro B cells (B220"CD43"CD19#),pre-B cells (B220"CD43#CD19"IgMlo), and immature B cells(B220"CD43#CD19"IgMhi).
Acknowledgements
Thisworkwas supported bygrant 3595A-M9608 (toV.O.N.) fromCONACYT. ADCE was supported by CONACYT scholarship 200897.
Supplementary data
Supplementary data associated with this article can be found, inthe online version, at doi:10.1016/j.micpath.2009.04.005.
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Fig. 3. Non-B cell lineage precursor cells were infected in the bone marrow. Bone marrow-derived cells from Salmonella-infected Balb/c mice at 5 days post-infection were stainedwith antibodies against B220, CD43, CD19, CD11c, IgM, and IgD. Cells were then sorted to obtain the following populations: A. Dendritic cell precursors (B220"CD43"CD19"CD11c");Pre-pro B cells (B220"CD43"CD19#CD11c#); B. Pro B cells (B220"CD43"CD19"); and Naive B cells (B220"CD43#CD19"IgM"IgD"). After sorting, each population was lysed with 10%Triton X-100 and plaqued in SS agar. Salmonella CFUs were graphed for each population.
D. Castro-Eguiluz et al. / Microbial Pathogenesis xxx (2009) 1–54
ARTICLE IN PRESS
Please cite this article in press as: Castro-Eguiluz D, et al., B cell precursors are targets for Salmonella infection, Microbial Pathogenesis (2009),doi:10.1016/j.micpath.2009.04.005
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Please cite this article in press as: Castro-Eguiluz D, et al., B cell precursors are targets for Salmonella infection, Microbial Pathogenesis (2009),doi:10.1016/j.micpath.2009.04.005
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