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Espectroscopía de emisiónmolecular - Aplicaciones

φf = Q = fotones emitidos / fotones absorbidos = If / Iabs

Relacion experimental entre lafluorescencia y la concentración

I f = φf · Iabs = φf · (1 - 10-εlc)

Iabs = Iinc· (1 - T) = Iinc· (1 - 10-A) = 1 - 10-εlc

si εlc → 0 ; (1 - 10-εlc) → 2.303 εlc

Y por lo tanto, If = 2.303 φf Iinc εlc

la aproximacion se cumple al 5% si A < 0.05

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Métodos de análisis

Directos: para cuantificar un analito ya fluorescente

Indirectos:

a) por formacion de complejos fluorescentes entre elanalito y una molecula auxiliar.

b) por reaccion química que forma un compuestofluorescente.

c) por disminucion de la fluorescencia (quenching) debidoa la presencia del analito.

Metodos directos:

Los iones de lantánidos y actinidos suelen mostrar fluorescencia.P.ej. Ce, Pr, Nd, U, etc.Ce (III) λex = 260nm, λem = 350 nm. U(VI) λex = 520nm, λem = 620 nm.

Algunas moleculas de interes biomédico presentanfluorescencia. P. ej. Riboflavina (vitamina B12), NADH,FAD/FADH2, clorofila, aminoacidos aromáticos, porfina, etc

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Metodos indirectos:a) iones inorgánicos por formacion de complejos fluorescentes

Ca2+ dependent fluorescenceemission spectra of fluo-3

Familia del Calcium Green

EDTA

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Determinación de calcio

• Calceina (λex = 450 nm, λem = 520 nm).

• fura-2, indo-1, fluo-3, fluo-4, Calcium Green-1.

• -Ondas de concentración de Ca2+ en ovocitos, asociados con lameiosis.

Function and characteristics of repetitive calcium wavesassociated with meiosis, Alex McDougall and Christian Sardet,Current Biology 1995, 5:318-328

Metodos indirectos:b) moléculas orgánicas por reacción química

- aminas

- aminoácidos

- proteínas

(Y en combinacioncon HPLC)

λex = 340 nm, λem = 455 nm

λex = 390 nm, λem = 475 nm

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Metodos indirectos:b2) actividad enzimática

Metodos indirectos:c) por quenching de fluorescencia

Complejo de Zr-alizarinaexcitation 470 nm (azul)emision 520 nm (verde)Sensibilidad al F- 0.001 ug/ml

Interferentes: Be, CO, Cr, Cu, Fe,Ni, Th, etc.

Cu2+ Bathocuporine 6x10-3 ppmFe3+ Rhodamine B 2x10-3 ppmNi2+ Na(PAN) 6x10-5 ppmPb2+ Eosin 1x10-1 ppm

F- Alizarina 1x10-3 ppm

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Quenching estatico

La emision decae con la concentración de quencher.

Sistemas de mediciónsensores

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Sanguchitos de cubreobjetos rellenos con una solución 10 mM de [Ru(bpy)3]Cl2, sumergidoen agua dentro de una capsula de Petri.Las fotos se toman a traves de un filtro anaranjado que deja pasar solamente lafluorescencia, se divide pixel a pixel por la iluminacion de excitacion correspondiente a cadapunto, se usa la curva de calibracion de Temperatura vs. fluorescencia y se muestran en falsocolor con ImageJ, despues de aplicar un filtro gaussian de 5 pixeles.

(a) Durante el calentamiento se ve un gradiente de temperatura de 1 grado aprox.(b) Placa sin calentamiento, termalizada, se ven variaciones maximas de 0.18 ºC

Video de un sanguchito de cubreobjeto de 22 x 18 mm durante el calentamiento

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Optodos en el mar Negro

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Ver el video de las variaciones en el tiempo en:http://www.mpi-bremen.de/Binaries/Binary14293/black_sea_fluctuations.gif

Límites analíticos de la técnica

Tiempos caracteristicos de emision: 10-9 - 10-8 s

Repeticion posible de emision: 108 - 109 fot/s/molec

Con instrumental adecuado se detecta una

MOLECULA UNICA.

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“Single molecule fluorescence”

time

V

H

γ

Stepping rotation of F1-ATPase visualized through angle-resolved single-fluorophore imaging.Proc Natl Acad Sci U S A 2000 Jun 20;97(13):7243-7Adachi K, Yasuda R, Noji H, Itoh H, Harada Y, Yoshida M, Kinosita K Jr.

F1FO ATP Synthase: ADP + Pi ATP

F1FO-ATPase: ATP ADP + Pi

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La emision del fluoroforo Cy3 pegado a la subunidad γ de la ATPasacambia la polarizacion al rotar en pasos de 120 grados. Cada pasoimplica la hidrolisis de una molecula de ATP.

Secuenciacion de DNA

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Excitacion en 2 fotones

Se precisa mucha potencia ...

Absortividad en 2P es muy baja : 1-100 GM (10-50 cm4s-1fot-1)

Asi que la densidad de luz debe ser enorme

I ~ 1030 fot.cm-2s-1

Pinst ~ 100 GW/cm2

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Corrimiento anti-stokes

Emission630nm

Excitacion800 nm

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seccionamiento

seccionamiento

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Upconversion

Upconversion

core = NaYF4 - 2% Er3+ - 30% Yb3+

shell = NaYF4

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Tinta de seguridad

Fluorometro con fibra optica

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Punta de la fibra

Espectro de emision

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Deteccion de DNA

Espectroscopía de emisiónmolecular - Conclusiones

- la espectroscopía de emisión presenta muy alta sensibilidadanalítica.

- es posible aumentar la selectividad de la técnica mediantemétodos adecuados.

- los equipos tradicionalmente fueron caros, pero su costo estábajando muy rapidamente.

- es posible hacer medidas de buena calidad con instrumental decampo basado en equipos de uso masivo (cámaras, celulares, etc)

- la microscopía de fluorescencia permite no sólo la detecciónsino la medición de parámetros químicos y físicos con altasensibilidad y robustez.